Способ определения активности транскрипционных факторов

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой способ определения активности транскрипционных факторов. Изобретение может использоваться в фармакологии для первичного скрининга кандидатных соединений. Способ включает получение стабильно трансфицированных клеток линии HeLa путем введения в их хромосому плазмидного вектора pBI/neo/X (X - любой транскрипционный фактор эукариот), содержащего минимальный промотор цитомегаловируса человека, ген зеленого флуоресцирующего белка, последовательность нуклеотидов, кодирующих сайт связывания транскрипционного фактора, ген устойчивости к неомицину. Определяют активность транскрипционного фактора путем измерения интенсивности витальной флуоресценции полученной культуры клеток в присутствии тестируемого вещества в сравнении с интактной культурой клеток. Предложенное изобретение позволяет быстро и с высокой чувствительностью определять активность транскрипционных факторов эукариот. 2 ил., 1 пр.

 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к области биотехнологии и молекулярной биологии, может быть использовано в фармацевтической промышленности и касается способов определения функциональной активности транскрипционных факторов в эукариотической клетке.

Уровень техники

В настоящее время накоплен значительный экспериментальный материал по изучению биоактивности веществ различного происхождения [1]. Однако, большинство исследований по изучению биологических эффектов этих веществ выполнено с помощью разнообразных, недостаточно стандартизированных методик и тест-систем, полученные при этом результаты часто не сопоставимы.

С практической точки зрения одной из актуальных проблем при оценке биоактивности различных веществ является разработка и валидация адекватных тест-систем, сопоставимых по основным характеристикам с млекопитающими, для последующего использования таких тест-моделей вместо высших животных. Для успешной разработки и адекватного применения таких модельных систем необходимо детально представлять общие механизмы реализации биоактивности на клеточном уровне. В настоящее время эта задача решается с использованием протеомики и транскриптомики [2].

В общем смысле, биоактивность различных химических соединений определяется при контакте их с клеткой-мишенью посредством анализа клеточных ответов. На молекулярном уровне, этот контакт активирует каскады реакций, которые передают в ядро клетки специфические сигналы для изменения экспрессии генов-мишеней и, соответственно, изменения концентрации белков, кодируемых этими генами. Считается, что наиболее исчерпывающий ответ можно получить путем транскрипционного профилирования клеточного ответа (измерением количества транскриптов). Данная методология и техника сегодня доступны в виде гибридизационных микрочипов [3]. Однако, для транскриптомики характерны нерешенные технические проблемы: например, высокий уровень неспецифической гибридизации ведет к уменьшению соотношения сигнал/шум. Другой проблемой является трудность в интерпретации транскриптомных данных.

Клеточный ответ также можно охарактеризовать путем анализа изменения паттернов белковых молекул - протеомики. Однако, протеом человека гораздо более сложен по сравнению с транскриптомом и современная протеомная методология еще далека от главной задачи протеомики - мониторинга всех белков клетки [4].

Таким образом, создание новых способов для изучения биоактивности различных химических веществ и биологических факторов, сочетающих в себе чувствительность транскриптомики и специфичность протеомики, является актуальной задачей.

Областью применения может стать молекулярная и экспериментальная онкология, где эти методы будут использоваться для валидации новых противоопухолевых препаратов и оценки их влияния не только на опухолевые клетки, но и на организм в целом.

Широкое поле для применения новых способов оценки биоактивности открывается и в фармакологии. Первым этапом валидации кандидатных фармакологических субстанций является их тестирование на культуре клеток и на лабораторных животных. Трудность интерпретации транскриптома человека накладывает серьезные ограничения применения существующих методов в этой области.

Как известно, адаптивная регуляция экспрессии генов происходит, главным образом, на уровне транскрипции и контролируется транскрипционными факторами (ТФ). В ядре ТФ связываются со специфическими последовательностями в регуляторных элементах генов-мишеней и активируют, либо ингибируют транскрипцию. Транскрипционная активность ТФ (т.е. способность инициировать транскрипцию) регулируется различными сигнальными каскадами [5]. Таким образом, анализируя активность единичного ТФ, возможно оценить активность всего соответствующего сигнального каскада. Измерение профиля активности всех ТФ является инструментом для анализа функционального состояния глобальной регуляторной сети клетки.

Для эукариотической клетки характерно наличие от 100 до 300 различных семейств ТФ, однако лишь небольшая их часть является индуцибельными ТФ, откликающимися на токсические компоненты и стресс. Следовательно, интерпретация клеточных ответов на уровне ТФ намного легче по сравнению с интерпретацией профилей экспрессии генов. Функциональная активность многих ТФ хорошо охарактеризована, то есть, следя за изменением активности определенных ТФ, можно получать полную информацию о механизме действия различных химических веществ и биологических факторов [6].

В разработке Romanov S. et al. [7] (ближайший аналог) был предложен метод определения активности различных ТФ эукариот. Принцип этого метода заключается в следующем. Культура клеток гепатоцитов HepG2 трансфицируется плазмидными конструкциями, в которых регуляторным элементом является ТФ-зависимый промотор, под контролем которого находится ген щелочной фосфатазы. В данной системе детектируется не конечный продукт - щелочная фосфатаза, а транскрипт кодирующего ее гена. Гетерогенность транскриптов реализуется путем введения в последовательность репортерного гена сайта для расщепления эндонуклеазой рестрикции на различном расстоянии от старта транскрипции. После действия индуктора происходит тотальное выделение РНК, построение комплементарной ДНК, введение метки в кДНК, гидролиз кДНК эндонуклеазой рестрикции и анализ продуктов расщепления с использованием капиллярного электрофореза. Многочисленность, сложность и трудоемкость стадий анализа делает эту систему ограниченной для применения. Кроме того, нестабильность транскриптов в клетке может приводить к искажению конечного результата.

Задачей настоящего изобретения является разработка быстрого, высокочувствительного, воспроизводимого метода определения активности ТФ эукариот по детекции конечного продукта репортерного гена с использованием флуоресцентного анализа.

Поставленная задача решается путем получения стабильно трансфицированных клеток линии эукариот путем введения плазмидного вектора, содержащего регуляторные элементы для ТФ и ген, кодирующий репортерный белок в хромосому этих клеток.

Плазмидный вектор содержит необходимые регуляторные элементы для определения активности ТФ и ген, кодирующий зеленый флуоресцирующий белок GFP. Плазмидный вектор, имеющий название pBI/neo/X, где X - любой ТФ, получают на основе плазмиды pBI-EGFP (Clontech, США) путем клонирования гена устойчивости к неомицину по сайту рестрикции PvuII и последовательности нуклеотидов, кодирующей сайт связывания определенного транскрипционного фактора по сайту рестрикции SacI. Таким образом, плазмидный вектор pBI/neo/X содержит ген устойчивости к неомицину, ген зеленого флуоресцирующего белка, последовательность нуклеотидов, кодирующую сайт связывания определенного транскрипционного фактора и минимальный промотор цитомегаловируса человека. Схема плазмидного вектора pBI/neo/Х приведена на рисунке 1.

Стабильно трансфицированные клетки линий эукариот получают путем введения ДНК плазмидного вектора pBI/neo/X в хромосому. После добавления к этим клеткам химического вещества или биологического фактора, изменяющего (активирующего или ингибирующего) активность ТФ, происходит активация или ингибирование образования комплекса тестируемого ТФ с сайтом его связывания, что приводит к повышению или снижению уровня транскрипции гена зеленого флуоресцентного белка, приводящее, в свою очередь, к повышению или снижению концентрации зеленого флуоресцирующего белка в клетке, которое детектируется флуоресцентными методами анализа (спекторофлуориметрией или флуоресцентной микроскопией).

Раскрытие изобретения

Для определения активности транскрипционных факторов был разработан протокол, состоящий из двух последовательных стадий: (1) получения стабильно трансфицированных клеток линии эукариот путем введения плазмидного вектора, содержащего регуляторные элементы для определенного транскрипционного фактора и ген, кодирующий зеленый флуоресцентный белок в хромосому и (2) непосредственно определения активности транскрипционного фактора.

На первой стадии проводят:

1. трансфекцию культуры клеток HeLa (АТСС CCL-2) рекомбинантным плазмидным вектором pBI/neo/Х с использованием липофектамина 2000 (Invitrogen, США);

2. получение клонов стабильно трансфицированных клеток HeLa путем добавления антибиотика G-418 (Invitrogen, США);

На второй стадии проводят:

1. добавление к стабильно трансфицированным клеткам вещества, изменяющего активность транскрипционного фактора;

2. измерение флуоресценции зеленого флуоресцирующего белка GFP с использованием флуоресцентного микроскопа или планшетного спектрофлуориметра.

Пример реализации изобретения

Определение изменения активности транскрипционного фактора NF-kB в стабильно трансфицированной линии клеток HeLa после добавления ингибитора транскрипционного фактора NF-kB - целастрола.

1.1. Клетки линии HeLa выращивают в среде DMEM (Invitrogen, США), содержащей 10% эмбриональной бычьей сыворотки (ЭБС), 2 мг/мл глюкозы в 24 луночном планшете (Nunc, США) при температуре 37°C при 5% CO2.

1.2. Трансфекцию проводят с использованием липофектамина 2000 (Invitrogen, США) и плазмидного вектора pBI/neo/ NF-kB. В одной пробирке к 1 мкг рекомбинантного плазмидного вектора добавляют 15 мкл среды MEM без ЭБС. В другой пробирке к 15 мкл среды MEM без ЭБС добавляют 5 мкл липофектамина. Перемешивают осторожным пипетированием, после чего содержимое пробирок объединяют и инкубируют при комнатной температуре 15 мин. Далее полученную смесь ДНК/липофектамин добавляют к клеткам.

1.3. Через 48 часов клетки пересевают в 6ти луночный планшет (Nunc, США) с использованием ростовой среды, описанной в п.1.1 с добавлением антибиотика G418 (Invitrogen, США) в концентрации 500 мкг/мл для селекции стабильно трансфицированных клонов. Ростовую среду с антибиотиком заменяют на новую каждые 48 часов.

1.4. Через 7-10 дней отдельные колонии клеток пересевают в культуральные флаконы (Nunc, США) и размножают.

2.1. Для тестирования определения изменения активности транскрипционного фактора NF-kB в стабильно трансфицированной плазмидным вектором pBI/neo/NF-kB линии клеток HeLa, полученной в пп.1.1-1.4, клетки выращивают в как описано в п.1.1.

2.2. К клеткам добавляют целастрол (Invivogen, США) до конечной концентрации 10 мкМ и инкубируют в течении 6 часов.

2.3. Регистрацию флуоресценции производят на эпифлуоресцентном микроскопе ECLIPSE Е800 с конфокальным модулем Nicon ECLIPSE C1 (Nicon, Япония) с аргоновым лазером. Конфокальные изображения получают с использованием 40Х 1,25 NA объектива, с разрешением 512×512 пикселей и обрабатывают с помощью программного обеспечения к микроскопу EZ-C1 2.00.

2.4. О подавлении активности транскрипционного фактора судят по снижению интенсивности витальной GFP-флуоресценции образца монослойной культуры клеток в присутствии целастрола в сравнении с интактным образцом. Результаты приведены на рисунке 2.

Литература

[1] Azad MA, Wright GD. Determining the mode of action of bioactive compounds. Bioorg Med Chem. 2012. V.20. P.1929-1939.

[2] Dunn DA, Apanovitch D, Follettie M, He T, Ryan T. Taking a systems approach to the identification of novel therapeutic targets and biomarkers. Curr Pharm Biotechnol. 2010. V.11. P.721-734.

[3] Mendrick DL. Transcriptional profiling to identify biomarkers of disease and drug response. Pharmacogenomics. 2011. V.12. P.235-249.

[4] Govorun VM, Archakov AI. Proteomic technologies in modern biomedical science. Biochemistry (Mosc). 2002. V.67. P.1109-1123.

[5] Spitz F, Furlong EE. Transcription factors: from enhancer binding to developmental control. Nat Rev Genet. 2012. V13. P.613-626.

[6] Lackner DH, Bähler J. Translational control of gene expression from transcripts to transcriptomes. Int Rev Cell Mol Biol. 2008. V.271. P.199-251.

[7] Romanov S, Medvedev A, Gambarian M, Poltoratskaya N, Moeser M, Medvedeva L, Gambarian M, Diatchenko L, Makarov S. Homogeneous reporter system enables quantitative functional assessment of multiple transcription factors. Nat Methods. 2008 V.5. P.253-260.

Способ определения активности транскрипционных факторов, отличающийся тем, что на первой стадии получают стабильно трансфицированные клетки линии HeLa путем введения в их хромосому плазмидного вектора pBI/neo/X (X - любой транскрипционный фактор эукариот), содержащего минимальный промотор цитомегаловируса человека, ген зеленого флуоресцирующего белка, последовательность нуклеотидов, кодирующих сайт связывания транскрипционного фактора, ген устойчивости к неомицину, затем на второй стадии определяют активность транскрипционного фактора путем измерения интенсивности витальной флуоресценции полученной культуры клеток в присутствии тестируемого вещества в сравнении с интактной культурой клеток.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способу получения инсерционных мутаций в случайных или псевдослучайных положениях в хромосомной или внехромосомной нуклеиновой кислоты клетки-мишени.

Изобретение относится к области генной инженерии и может быть использовано в биотехнологической промышленности. .
Изобретение относится к области молекулярной генетики и генетической инженерии и может быть использовано для мутагенеза и маркирования ДНК хромосомы и плазмид бактерий.

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен способ изменения признака пола у птиц.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к выделенным моноклональным антителам, в частности CDR-привитым гуманизированным антителам, которые связываются с эпитопом молекулы RAGE человека и, в частности обладают способностью ингибировать связывание RAGE с различными лигандами.

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой выделенную полинуклеотидную молекулу с функцией rEVE, рекомбинантный вектор экспрессии, экспрессионный шаттл-вектор, клетку-хозяина, а также способы с использованием вышеуказанной выделенной полинуклеотидной молекулы.

Настоящее изобретение относится к иммунологии и биотехнологии. Предложено IL-1β-связывающее антитело или его IL-1β-связывающий фрагмент, включающее вариабельную область тяжелой цепи и легкой цепи.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к антителам, которые специфично связываются с рецепторами эпидермального фактора роста (EGFR), а также к ДНК, которые кодируют вариабельные области тяжелой цепи указанных антител, ДНК, которые кодируют вариабельные области легкой цепи указанных антител.

Изобретение относится к области биотехнологии и касается изолированного полипептида, фармацевтической композиции, включающей такой полипептид, а также способа лечения рака.

Синтез нмо // 2517602
Изобретение относится к биотехнологии, в частности к бактериальной клетке, стабильно культивируемой в среде, где клетка адаптирована для продукции олигосахаридов.

Настоящее изобретение относится к иммунологии и биотехнологии. Предложены варианты выделенного моноклонального антитела, специфичного к hGM-CSF, где каждый вариант характеризуется тяжелой и легкой цепью.

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии и медицины. Предложен способ создания антитела и его функциональных фрагментов, направленных против опухолевого антигена, экспрессируемого на поверхности опухоли, устойчивой по меньшей мере к одному противоопухолевому соединению, основанный на применении для иммунизации измельченного гомогената, и/или суспензии, и/или клеточного лизата, происходящих из такой опухоли.

Предлагаемое изобретение относится к области биологии и химии и касается выделенной нуклеиновой кислоты, кодирующей флуоресцентный белок со свойствами биосенсора, кассеты экспрессии, обеспечивающей экспрессию такого флуоресцентного белка, клетки, продуцирующей такой белок, и непосредственно флуоресцентного белка со свойствами биосенсора.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к полипептидам, которые являются ингибиторами клетки метанопродуцента и биологическими маркерами для детекции фага φmru, а также к полинуклеотидам, которые кодируют эти полипептиды. Раскрыты векторы экспрессии и клонирующие векторы, содержащие эти полинуклеотиды, и клетки-хозяева, содержащие эти векторы. Описаны конъгированные или слитые молекулы, которые являются ингибиторами клетки метанопродуцента и биологическими маркерами для детекции фага φmru, а также антитела, которые связываются с вышеуказанными полипептидами. Также раскрыт фаг φmru, выделенный с использованием описанных полипептидов. Изобретение также охватывает фармацевтические композиции и способы ингибирования клетки-метанопродуцента, с использованием описанных полипептидов, конъюгированных или слитых молекул. Использование изобретения позволяет лизировать клетки метанопродуцентов, обитающих в рубце жвачных животных, и/или доставлять ингибиторы клеток метанопродуцентов. 18 н. и 6 з.п. ф-лы, 8 ил., 6 пр.

Изобретение относится к области биотехнологии и генетической инженерии и может быть использовано в ветеринарии для создания вакцин, регулирующих половую функцию животных. Предлагается рекомбинантная ДНК, кодирующая гибридный вакцинный белок GHbc, состоящий из нуклеокапсидного белка вируса гепатита В человека, слитого с гонадолиберином. Ген гибридного белка GHbc получен методом ПЦР и встроен в полилинкерный район плазмидного вектора pUC9. 2 н.п.ф-лы, 4 ил., 4 пр.

Изобретения относятся к области иммунологии. Представлены одноцепочечное антитело, специфичное к раково-эмбриональному антигену, химерный мононуклеарный Т-клеточный рецептор, вектор, клетка-хозяин и способ диагностики или лечения заболеваний, характеризующихся наличием антигенов, способных связываться с химерным рецептором. Описана генетическая конструкция, кодирующая химерные мономолекулярные Т-клеточные рецепторы, в которых эффекторный фрагмент Т-клеточного рецептора объединен с антиген-распознающей частью, представляющей собой вариабельные фрагменты двух различных антител к раково-эмбриональному антигену (РЭА). Представленные изобретения могут быть использованы в Т-клеточной терапии рака. 5 н. и 2 з.п. ф-лы, 4 ил., 3 пр., 1 табл.

Настоящее изобретение относится к иммунологии и биотехнологии. Предложены варианты нуклеиновых кислот, каждый из которых кодирует аминокислотную последовательность тяжелой цепи иммуноглобулина IgG1. Указанная цепь содержит на С-конце СН3-домена глицин-лизиновый дипептид, кодируемый кодоном ggaaaa, ggcaaa или gggaaa. Описаны: плазмида, кодирующая тяжелую цепь иммуноглобулина; клетки-варианты, обеспечивающие экспрессию иммуноглобулина IgG1; способ получения иммуноглобулина в клетках млекопитающего; способ улучшения экспрессии иммуноглобулина в клетках млекопитающего; - использующие варианты нуклеиновой кислоты. Использование изобретения обеспечивает предупреждение экспрессии побочного продукта массой 80 кДа, что может найти применение при производстве иммуноглобулинов. 7 н. и 11 з.п. ф-лы, 7 ил., 3 табл., 6 пр.

Изобретение относится к области генетической инженерии, молекулярной биологии и медицины. Предложен носитель для направленной доставки нуклеиновых кислот в клетки, экспрессирующие рецептор CXCR4, состоящий из последовательности-лиганда к рецептору CXCR4 с последовательностью аминокислот KPVSLSYRSPSRFFESH, линкерного участка из двух молекул ε-аминогексановой кислоты, соединяющей последовательность-лиганд с последовательностью для компактизации нуклеиновых кислот, последовательности, обеспечивающей компактизацию нуклеиновых кислот и выход комплекса из эндосом CHRRRRRRHC. Изобретение может быть использовано для направленной доставки генетических конструкций в клетки с рецептором CXCR4 на поверхности, таких как злокачественные опухолевые и стволовые клетки, с целью коррекции генных дефектов, воздействия на процессы реализации генетической информации и предотвращения заболеваний. 2 з.п. ф-лы, 7 ил., 4 пр.

Изобретение относится к области биотехнологии и касается рекомбинантного штамма бактерий Escherichia coli - продуцента биологически активного флагеллина. Охарактеризованный штамм получен трансформацией культуры клеток E. coli BL21[DE3] рекомбинантной плазмидной ДНК рЕТ151FliC, полученной на основе вектора рЕТ151FliC, в который был встроен ген fliC, кодирующий биологически активный флагеллин, имеющий нуклеотидную последовательность, представленную в Seq ID No 3. Штамм депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) ФГУП ГосНИИГенетика под № В-11369. Представленное решение обладает более высокой продуцирующей способностью в отношении рекомбинантного флагеллина, являющегося эффективным адъювантом. 1 ил., 2 табл., 3 пр.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к клостридиальным нейротоксинам с измененной персистентностью. Заявлен полипептид, содержащий HC-домен, первый и, по меньшей мере, один дополнительный LC-домены с аминокислотными последовательностями, по меньшей мере на 90% идентичными соответствующим последовательностям нейротоксичного компонента ботулотоксина серотипа А, В, С1, D, Е, F или G. Также представлены нуклеиновая кислота, вектор экспрессии и клетка-хозяин, предназначенные для экспрессии указанного полипептида. Также предложены способ получения и применение указанного полипептида, в том числе в составе фармацевтической композиции, для лечения состояния, ассоциированного с гиперактивной холинэргической иннервацией мышцы или экзокринной железы, и для косметических процедур, связанных с морщинами. Изобретение позволяет направленно изменять период активности клостридиальных нейротоксинов. 9 н. и 3 з.п. ф-лы, 1 табл., 4 пр.

Группа изобретений относится к области биотехнологии. Настоящее изобретение обеспечивает синтетические 5'UTR области, содержащие первый полинуклеотидный фрагмент в виде второго интрона гена кальциевой АТФазы саркоплазматического/эндоплазматического ретикулума и второй полинуклеотидный фрагмент, представленный частью 5' нетранслируемой области (5'UTR) гена казеина. Синтетические 5'UTR области применяются для усиления экспрессии трансгена, при этом 5'UTR области расположены между промотором и последовательностью, представляющей интерес в экспрессионном векторе. В настоящем изобретении также предложены векторы, содержащие 5'UTR области, и способ усиления экспрессии трансгена при их применении. 9 н. и 16 з.п. ф-лы, 17 ил., 2 табл., 3 пр.

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой способ определения активности транскрипционных факторов. Изобретение может использоваться в фармакологии для первичного скрининга кандидатных соединений. Способ включает получение стабильно трансфицированных клеток линии HeLa путем введения в их хромосому плазмидного вектора pBIneoX, содержащего минимальный промотор цитомегаловируса человека, ген зеленого флуоресцирующего белка, последовательность нуклеотидов, кодирующих сайт связывания транскрипционного фактора, ген устойчивости к неомицину. Определяют активность транскрипционного фактора путем измерения интенсивности витальной флуоресценции полученной культуры клеток в присутствии тестируемого вещества в сравнении с интактной культурой клеток. Предложенное изобретение позволяет быстро и с высокой чувствительностью определять активность транскрипционных факторов эукариот. 2 ил., 1 пр.

Наверх