Штамм бактерий paenibacillus sp. для получения биопрепарата против заболеваний пшеницы, вызываемых фитопатогенными грибами

Авторы патента:

 


Владельцы патента RU 2539738:

Закрытое акционерное общество научно-производственное предприятие "Биомедхим" (ЗАО НПП "Биомедхим") (RU)
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии Уфимского научного центра РАН (ФГБУН ИБ УНЦ РАН) (RU)

Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии. Штамм бактерий Paenibacillus sp. ИБ-1 обладает антагонистической активностью в отношении фитопатогенных грибов. Штамм депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов под регистрационным номером ВКМ В-2823D и может быть использован для получения биопрепарата для защиты растений от болезней, вызываемых фитопатогенными грибами. Изобретение позволяет сократить сороки культивирования и повысить выход биомассы микроорганизма. 4 табл., 4 пр.

 

Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии и касается штамма, который оказывает антагонистическое действие на возбудителей заболеваний пшеницы корневыми гнилями и повышает урожайность пшеницы. Новый штамм может быть реализован в микробиологической промышленности для получения биопрепарата для защиты от болезней и повышения урожайности злаковых культур.

Известен штамм Pseudomonas sp. ЦМПМ В-348, используемый для получения препарата при защите злаковых от возбудителя обыкновенной корневой гнили Helminthosporium sativum [1]. Однако этот штамм неэффективен для подавления корневой гнили злаков, вызываемой комплексом грибов Fusarium spp. и Helminthosporium sativum.

Известны штаммы Pseudomonas putida, подавляющие рост фитопатогенного гриба Fusarium oxysporum [2], и Pseudomonas putida ВКМ В-1743 Д, подавляющий рост грибов рода Fusarium [3]. Недостатком известных штаммов является узкий спектр антагонистического действия.

Известен штамм Azotobacter chroococcum N В-3173, предназначенный для получения бактериального удобрения [4], повышающий урожайность злаковых культур. Недостатком является отсутствие антагонизма по отношению к фитопатогенным грибам.

Известен штамм Azotobacter chroococcum 92 [5], обладающий способностью подавлять рост некоторых фитопатогенных грибов. Недостатком штамма является узкий спектр антагонистического действия и сравнительно невысокая продуктивность.

Наиболее близким к заявляемому является штамм Azotobacter vinelandii ИБ 1 [6], обладающий способностью подавлять рост фитопатогенных грибов и повышающий урожайность пшеницы. Недостатком штамма является сравнительно высокая продолжительность культивирования и сравнительно невысокая антагонистическая активность.

Технической задачей изобретения является выделение нового природного штамма с широким спектром антагонистического действия на возбудителей грибных заболеваний пшеницы, обладающего высокой продуктивностью при невысокой продолжительности культивирования, нитрогеназной активностью, возможностью перевода почвенных фосфатов в растворимые формы.

Поставленная задача достигается выявлением и использованием штамма Paenibacillus sp. ИБ-1, выделенного из образца пахотной почвы Республики Башкортостан. Штамм депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов под регистрационным номером ВКМ В - 2823D.

1. Культурально-морфологические признаки

1.1. На агаризованной питательной среде, имеющий состав, г/л: KH2PO4 - 0,3; CaHPO4 - 0,2; MgSO4 - 0,3; K2SO4 - 0,2; NaCl - 0,5; FeCl3 - 0,01; CaCO3 - 5,0; сахароза - 20 г; агар - 1,5%; смесь микроэлементов - 1 мл; дистиллированная вода до 1000 мл, pH 6,8-7,2 культура образует круглые колонии диаметром 3-4 мм, с гладкой блестящей поверхностью, выпуклые, прозрачные, с гладкими краями, мягкой тягучей консистенции. На 24-м часу роста клетки - мелкие палочки 0,5×1,5 мкм, подвижные.

1.2. На питательной агаризованной среде Берка, имеющей состав, г/л: K2HPO4 - 0,8; KH2PO4 - 0,2; MgSO4 - 0,3; NaCl - 0,2; CaSO4 - 0,1; Fe2(MoO4) - 0,01; глюкоза - 10 г; дистиллированная вода до 1000 мл; агар-агар - 1,5%; pH 6,8-7,0, культура образует круглые колонии диаметром 2-3 мм, с гладкой блестящей поверхностью, выпуклые, прозрачные, бесцветные, с гладкими ровными краями, однородной структуры.

1.3. На жидкой питательной среде Федорова с мелассой, имеющей состав, г/л: K2HPO4 - 0,3; CaHPO4 - 0,2; MgSO4 - 0,3; K2SO4 - 0,2; NaCl - 0,5; FeCl2 - 0,01; CaCO3 - 5,0; меласса - 40 г; смесь микроэлементов - 1 мл; pH 6,8-7,0, выращивание при температуре 28°C и режиме аэрации-перемешивания 180 об/мин в течение 36 часов. Круглые колонии диаметром 0,5 см, выпуклые с ровными краями, слизистой консистенции.

1.4. На питательной среде КГА колонии круглые диаметром 6 мм, выпуклые, белого полупрозрачного цвета, консистенция тягучая мягкая. Пигмента не образуют. На 24-м часу роста - мелкие подвижные палочки.

1.5. На питательной среде Эшби с маннитом в качестве источника углерода колонии слизистые прозрачные диаметром 3 мм, консистенция тянущаяся. На 24-36 часу роста клетки - длинные тонкие палочки 6 мкм, подвижные.

2. Физиолого-биохимические признаки

Штамм является аэробным микроорганизмом, оптимальная температура роста 28°C.

Отношение к источникам углерода: очень хорошо усваивает глюкозу, сахарозу; хорошо усваивает маннит, мальтозу, ксилозу, сорбит, рамнозу, лактозу, декстрин, галактозу, маннозу, глицерин, фруктозу, этанол; слабо усваивает арабинозу, мезоинозитол.

Отношение к источникам азота: растет на безазотистых средах, сохраняя высокую продуктивность не менее 8·1010 кл/мл. Не погибает при нагревании при 50°C в течение 15 мин.

Штамм не обладает фитопатогенной активностью, о чем свидетельствует отсутствие мацерации на ломтиках картофеля при нанесении на них уколом живых клеток штамма.

Штамм хранится на косяках со средой Федорова в холодильнике с пересевом на свежие косяки через 2-4 месяца, а также в лиофильновысушенном состоянии.

Штамм идентифицирован по определителю Bergey Manual of Determinative Bacteriology.

Пример 1. Для сравнения продолжительности культивирования нового штамма Paenibacillus sp. ИБ-1 с известным штаммом Azotobacter vinelandii ИБ-1 проводили выращивание в колбах на качалке при 180-200 об/мин, при температуре 28°C на жидкой питательной среде следующего состава, %: сахароза 3,0; K2HPO4 0,03; CaHPO4 0,02; NaCl 0,05; CaCO3 0,5; K2SO4 0,02. до достижения количества жизнеспособных клеток 80 млрд/мл. Результаты приведены в табл.1.

Пример 2. Изучение антагонистической активности нового штамма Paenibacillus sp. ИБ-1

На чашки Петри с агаризованной средой КГА (картофель тертый 200 г; глюкоза 20 г; агар 20 г; вода водопроводная 1 л) высевают сплошным газоном суспензию спор грибного фитопатогена. Затем в эти же чашки уколом сажают бактерии штамма Paenibacillus sp. ИБ-1. Чашки инкубируют при 28°C в течение 3 суток. Учет проводят по зонам отсутствия или подавления роста гриба вокруг колонии штамма. Результаты приведены в табл.2 и свидетельствуют о широком спектре антагонистического действия нового штамма.

Пример 3. Антагонистическое действие нового штамма против комплекса возбудителей корневых гнилей пшеницы испытывают в лабораторных условиях на пшенице сорта "Жница" с естественным уровнем заражения посевного материала, полученного в условиях опытного поля Института биологии УНЦ РАН. Посевной материал дополнительно инфицируют спорами фитопатогенных грибов Fusarium oxysporum и Bipolaris sorokiniana (титр споровой суспензии обоих патогенов составил 5-104 КОЕ/мл). Семена пшеницы обрабатывают суспензией штамма (с титром 109 КОЕ/мл) из расчета 1 мл суспензии на 1 кг семян. Семена переносят на увлажненную до полной влагоемкости полоску фильтровальной бумаги, поверх которой накладывают полоску полиэтилена, сворачивают в рулон, помещают вертикально в лабораторный стакан и оставляют при комнатной температуре. В контрольных опытах обработку семян осуществляют водопроводной водой. Эксперимент выполняют в четырехкратной повторности. Обработку результатов проводят через 7 дней. Эффективность штамма определяют при сопоставлении степени проявления корневых гнилей проростков пшеницы в опыте и контроле. Результаты приведены в табл.3.

Пример 4. Определение ростстимулирующей активности заявляемого штамма.

Некоторые микроорганизмы, обитающие в ризосфере растений, способны синтезировать цитокинины. Цитокинины представляют собой природные соединения, участвующие в гормональной регуляции онтогенеза растений, характеризующиеся способностью индуцировать деление растительных клеток и являющиеся наиболее активными среди открытых рострегулирующих веществ. Наличие цитокининов в культуральной жидкости обуславливает наличие ростстимулирующей активности микроорганизма. Образование заявляемым штаммом цитокининов с концентрацией 330 нг/мл культуральной жидкости обнаружено методом непрямого конкурентного иммуноферментного анализа [7].

Пример 5. Штамм Paenibacillus sp. ИБ-1 обладает нитрогеназной активностью (определяли ацетиленовым методом), сопоставимой по величине с активностями азотфиксирующих микроорганизмов рода Azotobacter (табл.4), предлагаемых для использования под различные сельскохозяйственные культуры [8-11].

Пример 6. Штамм Paenibacillus sp. ИБ-1 способен к переводу малорастворимых фосфатов в растворимые формы, используемые в метаболизме растений.

Дефосфорилирующую активность определяли на среде Муромцева, куда вносили фосфат кальция методом осаждения, предложенным Герретсеном, в модификации Муромцева [12]. Приготовленные питательные среды разливали по чашкам Петри, подсушивали в термостате и сажали уколом исследуемый штамм микроорганизмов. Чашки инкубировали в термостате при 28°C в течение семи суток. О растворении фосфатов судили по образованию вокруг колоний бактерий зон просветления питательной среды. В результате проведенных испытаний было установлено, что штамм Paenibacillus sp. ИБ-1 способен к активному растворению трифосфата кальция, диаметр зоны просветления среды значительно превышает диаметр колонии бактерии

Таким образом, выделен новый штамм Paenibacillus sp. ИБ-1 с широким спектром антагонистического действия на возбудителей грибных заболеваний пшеницы, обладающий высокой продуктивностью при невысокой продолжительности культивирования, нитрогеназной активностью, возможностью перевода почвенных фосфатов в растворимые формы.

Таблица 1
Продолжительность ферментации штамма Paenibacillus sp. ИБ-1 для достижения числа жизнеспособных клеток (КОЕ) 80 млрд/мл
Штамм Время ферментации, ч
Paenibacillus sp. ИБ-1 36
Azotobacter vinelandii ИБ 1 (по прототипу) 60
Таблица 2
Антагонистическое действие штаммов Paenibacillus sp. ИБ-1 и штамма по прототипу на грибные фитопатогены
Вид фитопатогенных грибов Диаметр зоны подавления роста гриба, мм
Штаммы
Paenibacillus sp. ИБ-1 прототип
Fusarium culmorum 29 22
Fusarium gibbosum 28 21
Fusarium graminesrum 20 12
Fusarium nivale 15 8
Fusarium semitectum 24 16
Fusarium solani 18 12
Fusarium avenaceum 28 19
Fusarium moniliforme 28 18
Bipolaris sorokiniana 40 28
Penicillium funiculosum 18 11
Fusarium culmorum 30 22
Fusarium oxysporum 21 13
Alternaria alternata 48 33
Таблица 3
Эффективность нового штамма Paenibacillus sp. ИБ-1 против корневых гнилей пшеницы
Варианты опытов Развитие болезни проростков пшеницы, % Проростки с дефектами, %
Alternaria + Penicillium Bipolaris sorokiniana Fusarium oxysporum
Контроль 28,0 11,0 15,5 8,0
Прототип 15,5 6,1 9,5 3,5
Paenibacillus sp. ИБ-1 12,0 4,5 7,2 3,1
Таблица 4
Нитрогеназная активность предлагаемого штамма Paenibacillus sp. ИБ-1 и свободноживущих азотфиксаторов
Культура Нитрогеназная активность, мкг N2/мл/час
Paenibacillus sp ИБ-1 0,77
Прототип 0,65
Azotobacter chroococcum В 35 [8] 0,26
Azotobacter chroococcum Ш 25 [9] 0,45
Azotobacter chroococcum Ц 40 [10] 0,11
Azotobacter chroococcum Б 1 [11] 0,22

Литература

1. Авторское свидетельство СССР 1464468, кл. A01N 63/00, 1988.

2. Патент США 4714614, кл. 424-93, 1987.

3. Патент RU 1805849, кл. A01N 63/00, 1993.

4. Авторское свидетельство СССР 1359272, кл. C05F 11/08, 1985.

5. Авторское свидетельство СССР 9221105, кл. C05F 11/08, 1982.

6. Патент RU 2224791, кл. C12N 1/20, 2004.

7. Кудоярова Г.Р., Веселов С.Ю., Каравайко Н.Н., Гюли-заде В.З., Чередова Е.П., Мустафина А.Р., Мошков И.Е., Кунаева О.Н. Иммуноферментная система для определения цитокининов // Физиология растений. - 1990. - Т.37, вып.1. - С.193-199.

8. Патент RU №2074159, кл. C05F 11/08, 1997.

9. Патент RU №2074158, кл. C05F 11/08, 1997.

10. Патент RU №2074157, кл. C05F 11/08, 1997.

11. Патент RU №2076088, кл. C05F 11/08, 1997.

12. Методы почвенной микробиологии и биохимии / Под ред. Д.Г. Звягинцева. - М.: Изд-во Моск. ун-та, 1991 - 304 с.

Штамм бактерий Paenibacillus sp., депонированный во Всероссийскую коллекцию микроорганизмов под регистрационным номером ВКМ В-2823D, обладающий антагонистической активностью в отношении заболеваний пшеницы, вызываемых фитопатогенными грибами.



 

Похожие патенты:
Изобретение относится к области биотехнологии защиты окружающей среды, в частности к способам очистки почв от нефтяных загрязнений в сокращенные сроки в условиях низких положительных температур.
Изобретение относится к биотехнологии. Штамм Bacillus subtilis - И5-12/23 обладает антагонистической активностью в отношении фитопатогенных грибов и бактерий.
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для подавления жизнеспособности патогенных лептоспир. Способ предусматривает выращивание штаммов бактерий «Bacillus subtilis ТНП-3-ДЕП» и «Bacillus subtilis ТНП-5-ДЕП».

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения полисахаридов, а именно бактериальной целлюлозы. Способ предусматривает культивирование штамма бактерий Gluconacetobacter sucrofermentans H-110 (ВКПМ В-11267) в жидкой фазе послеспиртовой зерновой барды, полученной после механического отделения твердой фазы, в течение 3-5 суток при температуре 28±2°C и рН 3,9-4,4, а также отделение полученной бактериальной целлюлозы от культуральной среды и высушивание при 800С до постоянной массы.
Изобретение относится к области медицинской микробиологии и биотехнологии, в частности к микробиологической лабораторной диагностике инфекционных болезней. Питательная среда содержит триптон, дрожжевой экстракт, глюкозу, хлорид натрия, эритроциты человека 0(I) группы Rh(+), сульфат железа(II), агар «Дифко» и дистиллированную воду при заданных соотношениях компонентов.

Изобретение относится к области микробиологического получения полисахаридов, а именно бактериальной целлюлозы, и может быть использовано в медицине, промышленности.
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в микробиологии. Питательная среда содержит дигидрофосфат калия, гидрофосфат калия, сульфат магния гептагидрат, хлорид натрия, сульфат кальция дигидрат, молибдат натрия, сульфат железа(II), сахарозу, бентонит и воду.

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен способ приготовления модифицированного природного каучука.
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в сельском хозяйстве. Штамм Trichoderma harzianum Rifai депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов под регистрационным номером ВКПМ F-180.
Изобретение относится к биотехнологии и экологии, а именно к защите окружающей среды. Биопрепарат для очистки объектов окружающей среды от нефтезагрязнений и ПАУ представляет собой консорциум микроорганизмов, состоящий из следующих штаммов бактерий: Rhodococcus qingshengii БАК-ПАУ-1 ВКПМ АС-1946, Pusillimonas ginsegisoli БАК-ПАУ-2 ВКПМ В-11370, Shinella granuli БАК-ПАУ-3 ВКПМ В-11371, взятых в равных соотношениях.
Изобретение относится к биотехнологии, а именно к средствам защиты человека и сельскохозяйственных животных от кровососущих комаров. Штамм Bacillus thuringiensis var.
Изобретение относится к области биотехнологии защиты окружающей среды, в частности к способам очистки почв от нефтяных загрязнений в сокращенные сроки в условиях низких положительных температур.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к рекомбинантному штамму бактерий Rhodococcus rhodochrous ВКПМ Ас1960, обладающему конститутивной ацилирующей активностью и полученному путем замещения в хромосоме штамма Rhodococcus rhodochrous ВКМ Ас-1515Д гена, кодирующего нитрилгидратазу на ген, кодирующий ациламидазу из штамма Rhodococcus erythropolis 37 ВКПМ Ас-1793, а также к способу синтеза N-замещенных акриламидов из акриламида и аминов с его использованием в качестве биокатализатора.

Группа изобретений относится к сельскому хозяйству и может быть использована при микробиологической защите растений. Средство для микробиологической защиты растений включает смесь культуральных жидкостей Trichoderma viride, Azotobacter chroococcum, Bacillus megaterium, Beauveria bassiana, Metarhizium anisopliae с необходимым количеством воды.
Группа изобретений относится к биохимии, в частности к получению аллергена туберкулопротеина - полуфабриката аллергена туберкулезного очищенного в стандартном разведении.
Изобретение относится к биотехнологии. Штамм Bacillus subtilis - И5-12/23 обладает антагонистической активностью в отношении фитопатогенных грибов и бактерий.

Способ повышения плодородия почвы включает предпосевную обработку семян люцерны жидким биопрепаратом, возделывание и скашивание зеленой массы люцерны. Для обработки семян используют жидкий бактериальный биопрепарат на основе штамма Sinorhizobium meliloti Якутский №2 ГНУ ВНИИСХМ RCAM00826.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения полисахаридов, а именно бактериальной целлюлозы. Способ предусматривает культивирование штамма бактерий Gluconacetobacter sucrofermentans H-110 (ВКПМ В-11267) в жидкой фазе послеспиртовой зерновой барды, полученной после механического отделения твердой фазы, в течение 3-5 суток при температуре 28±2°C и рН 3,9-4,4, а также отделение полученной бактериальной целлюлозы от культуральной среды и высушивание при 800С до постоянной массы.
Изобретение относится к области медицинской микробиологии и биотехнологии, в частности к микробиологической лабораторной диагностике инфекционных болезней. Питательная среда содержит триптон, дрожжевой экстракт, глюкозу, хлорид натрия, эритроциты человека 0(I) группы Rh(+), сульфат железа(II), агар «Дифко» и дистиллированную воду при заданных соотношениях компонентов.
Группа изобретений относится к биотехнологии. Предложена пробиотическая композиция, содержащая пробиотический компонент, в качестве которого используют Bifidobacterium longum R175 и один или два вида бактерий, выбранных из группы бактерий, состоящей из Lactobacillus rhamnosus R11, Lactobacillus helveticus R52 и Lactobacillus plantarum R1012, и композицию-носитель.
Изобретение относится к биотехнологии, а именно к средствам защиты человека и сельскохозяйственных животных от кровососущих комаров. Штамм Bacillus thuringiensis var.
Наверх