Каррагинан-содержащие водные антимикробные композиции



Каррагинан-содержащие водные антимикробные композиции
Каррагинан-содержащие водные антимикробные композиции
Каррагинан-содержащие водные антимикробные композиции
Каррагинан-содержащие водные антимикробные композиции
Каррагинан-содержащие водные антимикробные композиции
Каррагинан-содержащие водные антимикробные композиции
Каррагинан-содержащие водные антимикробные композиции
Каррагинан-содержащие водные антимикробные композиции
Каррагинан-содержащие водные антимикробные композиции
Каррагинан-содержащие водные антимикробные композиции
Каррагинан-содержащие водные антимикробные композиции
Каррагинан-содержащие водные антимикробные композиции
Каррагинан-содержащие водные антимикробные композиции
Каррагинан-содержащие водные антимикробные композиции
Каррагинан-содержащие водные антимикробные композиции
Каррагинан-содержащие водные антимикробные композиции
Каррагинан-содержащие водные антимикробные композиции
Каррагинан-содержащие водные антимикробные композиции
Каррагинан-содержащие водные антимикробные композиции
Каррагинан-содержащие водные антимикробные композиции
Каррагинан-содержащие водные антимикробные композиции

 


Владельцы патента RU 2540423:

ДЗЕ ПОПЬЮЛЕЙШН КАУНСИЛ, ИНК. (US)

Изобретение относится к медицине и касается водной антимикробной композиции, содержащей эффективное количество антимикробного агента, содержащего каррагинаны, которые представляют собой лямбда каррагинан в количестве по меньшей мере приблизительно 50% сухой массы указанных каррагинанов, где остальная часть указанных каррагинанов является по меньшей мере одним не лямбда каррагинаном, а также физиологически приемлемую водорастворимую соль металла и антиретровирусный агент, выбранный из группы, состоящей из не нуклеозидных ингибиторов обратной транскриптазы и нуклеозидных ингибиторов обратной транскриптазы. Изобретение обеспечивает полное блокирование развития вагинальной инфекции на период до 24 часов. 20 з.п. ф-лы, 11 ил., 1 табл., 20 пр.

 

ПЕРЕКРЕСТНЫЕ ССЫЛКИ НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

Настоящее изобретение заявляет приоритет заявки с порядковым номером 12/587405, поданной 6 октября 2009 г и озаглавленной “Unique combinations of antimicrobial compositions” («Особые комбинации антимикробных композиций»), которая представляет собой частичное продолжение заявки на патент США №10/977001, поданной 29 октября 2004 г, которая, в свою очередь, является продолжением международной заявки № PCT/US03/13456, поданной 30 апреля 2003 г, которая претендует на приоритет даты подачи предварительной заявки на патент США № 60/376400, поданной 30 апреля 2002 г, и предварительной заявки на патент США № 60/377050, поданной 1 мая 2002 г, содержание которых включено в настоящую заявку с помощью ссылки.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Каррагинаны представляют собой полисахариды, получаемые из красных водорослей, широко известных как морские водоросли. Они являются структурными компонентами водорослей и извлекаются из них в форме трех основных типов, а именно йота, каппа и лямбда, хотя кроме перечисленных существуют еще и другие типы, в том числе каппа-II, мю и ню каррагинаны. Каррагинаны широко применяются в пищевой, фармацевтической и косметической отраслях промышленности, в качестве загустителей, гелеобразующих агентов, а также стабилизирующих и диспергирующих агентов. Проводились обширные фармакологические и токсикологические исследования каррагинанов. Было обнаружено, что каррагинаны нетоксичны при введении пероральным, дермальным и ингаляционным путем, даже в очень значительных дозах. В силу этого FDA в 1972 году отнесла каррагинаны к классу веществ “generally recognized as safe” (GRAS)(«признанных в основном безопасными»)2. Последующие обширные исследования пероральной фармакокинетики, проведенные на свиньях, крысах, мышах, песчанках, морских свинках, хорьках, хомяках, собаках и обезьянах 3-11, показали, что расщепление каррагинанов в желудочно-кишечном тракте является в лучшем случае минимальным и их абсорбция практически отсутствует.

В опубликованной международной заявке на патент WO 94/15624 предложено применение сульфатированных полисахаридов, например йота каррагинана, декстран сульфата, каппа каррагинана, лямбда каррагинана, миметиков гепарина, гепарин сульфата, пентозан полисульфата, хондроитин сульфата, лентинан сульфата, курдлан сульфата, де-N-сульфатированного гепарина и фукоидана, для ингибирования межклеточной передачи ВИЧ и за счет этого подавления передачи синдрома приобретенного иммунодефицита человека (СПИДа), а также микроорганизмов Chlamydia половым путем. В публикации сообщается, что йота каррагинаны наиболее эффективны из всех предлагаемых на рынке сульфатированных каррагинанов для профилактики ВИЧ-инфекции и блокирования инфекций, вызываемых Chlamydia, in vitro и in vivo.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Авторы заявки обнаружили, что некоторые каррагинаны или смеси или комбинации различных каррагинанов обладают особыми физическими и химическими свойствами и что при включении их в состав, предназначенный для вагинального введения, они обеспечивают продолжительное антимикробное действие и устраняют или уменьшают вероятность передачи инфекции, передаваемой половым путем (STI).

Соответственно, в первом аспекте настоящее изобретение направлено на водную антимикробную композицию, содержащую эффективное количество антимикробного агента, содержащего каррагинаны (именуемого в настоящей заявке «каррагинаны» или «смесь каррагинанов»), которые представляют собой лямбда каррагинан, в количестве по меньшей мере приблизительно 50% сухой массы указанных каррагинанов, где остальная часть указанных каррагинанов представляет собой по меньшей мере один не лямбда каррагинан, а также физиологически приемлемый агент, регулирующий pH. Для целей настоящего изобретения имеется в виду, что термин «антимикробный» охватывает антибактериальную и/или антивирусную активность.

В родственном аспекте, настоящее изобретение направлено на композицию, подавляющую инфекции, передаваемые половым путем (STI), содержащей эффективное количество антимикробного агента, содержащего каррагинаны, которые представляют собой лямбда каррагинан, в количестве по меньшей мере приблизительно 50% сухой массы указанных каррагинанов, где остальная часть указанных каррагинанов является по меньшей мере один не лямбда каррагинан, а также физиологически приемлемый агент, регулирующий pH.

Композиции по настоящему изобретению могут дополнительно содержать другой антимикробный агент и/или лекарственный препарат, подходящий для вагинального введения, и в этом случае каррагинановый компонент может представлять собой лямбда каррагинан, без каких-либо не лямбда каррагинанов. Данный дополнительный агент может быть смешан и/или ассоциирован с каррагинанами, например, в форме комплекса. Соответственно, еще один аспект настоящего изобретения направлен на водную антимикробную композицию, содержащую: (a) физиологически приемлемый агент, регулирующий pH; и (b) эффективное количество антимикробного агента, содержащего комплекс лямбда каррагинана или каррагинанов, которые представляют собой лямбда каррагинан в количестве по меньшей мере приблизительно 50% сухой массы указанных каррагинанов, где остальная часть указанных каррагинанов является по крайней мере одним не лямбда каррагинаном, и антимикробной, физиологически приемлемой водорастворимой соли, содержащей катион металла.

Следующий аспект настоящего изобретения относится к водной антимикробной композиции, содержащей: (a) физиологически приемлемый агент, регулирующий pH; (b) эффективное количество антимикробного агента, включающего комплекс лямбда каррагинана или каррагинанов, которые представляют собой лямбда каррагинан в количестве по меньшей мере приблизительно 50% сухой массы указанных каррагинанов, где остальная часть указанных каррагинанов является по крайней мере одним не лямбда каррагинаном; и c) лигносульфоновую кислоту.

Другой аспект настоящего изобретения направлен на водную антимикробную композицию, содержащую: (a) физиологически приемлемый агент, регулирующий pH; (b) эффективное количество антимикробного агента, содержащего комплекс лямбда каррагинана или каррагинанов, которые представляют собой лямбда каррагинан в количестве по меньшей мере приблизительно 50% сухой массы указанных каррагинанов, где остальная часть указанных каррагинанов является по крайней мере одним не лямбда каррагинаном; и c) лекарственный препарат, который подходит для вагинального введения, например противозачаточное средство или агент для гормонозаметительной терапии.

Следующий аспект настоящего изобретения направлен на водную антимикробную композицию, содержащую эффективное количество антимикробного агента, включающего полианионный микробицид, например каррагинаны, которые представляют собой лямбда каррагинаны, в количестве по меньшей мере приблизительно 50% от сухой массы каррагинанов, где остальная часть каррагинанов является по крайней мере одним не лямбда карргинаном, физиологически приемлемую водорастворимую соль с катионом металла, и не нуклеозидный ингибитор обратной транскриптазы или нуклеозидный ингибитор обратной транскриптазы.

Еще один аспект настоящего изобретения направлен на способ переработки, очистки или стабилизации каррагинанов по настоящему изобретению. Этот способ включает смешивание лямбда каррагинана или каррагинанов в безводной или порошкообразной форме с сухой формой pH-регулирующего агента, с последующей гидратацией каррагинанов, например, добавлением воды или другого водного раствора. Этот способ дает возможность преодолеть ряд недостатков способов известного уровня техники, предназначенных для превращения каррагинанов в высоких концентрациях в гомогенные водные растворы, и облегчает дальнейшую переработку в фармацевтические составы, например, упомянутые выше композиции и комплексы.

ОПИСАНИЕ ИЛЛЮСТРАТИВНОГО МАТЕРИАЛА

Фиг.1 представляет собой график, на котором показана долговременная активность композиции, содержащей каррагинаны, по настоящему изобретению. Мышей заражали 95-100% инфекционной дозой HSV-2 через различные промежутки времени после нанесения композиции. Композиция сохраняет определенный уровень активности против HSV-2 даже через 24 часа. Это позволяет предположить, что защита женщины могла бы быть обеспечена даже по прошествии значительного времени между применением композиции и половым актом.

Фиг.2 представляет собой изображение Саузерн-блотинга гибридизации продуктов RT PCR из РНК, экстрагированной из селезенок. Дорожки 2 и 3 относятся к положительному контролю. Дорожки 4-8 относятся к мышам, которым предварительно вводили композицию, содержащую каррагинаны по настоящему изобретению, за 5 минут до вирусного заражения. Дорожки 9-14 относятся к мышам, которых вагинально заражали ВИЧ.

Фиг.3 представляет собой гистограмму, демонстрирующую зависимость концентрации p24 (ВИЧ) от концентрации композиции, содержащей каррагинаны по настоящему изобретению, другой композиции по настоящему изобретению, содержащей комплекс каррагинанов и водорастворимой соли цинка («цинк-каррагинан»), а также лигносульфоновую кислоту (LSA).

Фиг.4 представляет собой график, демонстрирующий сравнение между композицией по настоящему изобретению, содержащей каррагинаны и LSA, и композицией по настоящему изобретению, содержащей каррагинаны, в системе HSV-2/мышь. Эти результаты показывают, что композиция, содержащая LSA и каррагинаны, более эффективна, чем композиция, содержащая только каррагинаны.

Фиг.5 представляет собой кривую ингибирования репликации вирусов в процентах при действии LSA по данным p24 ELISA.

Фиг.6 является графиком, показывающим эффективность композиции, содержащей каррагинаны, по настоящему изобретению и другой композиции по настоящему изобретению, которая содержит цинк-каррагинан, в предотвращении образования бляшек HSV-2 в клетках Vero, в зависимости от дозы.

Фиг.7 представляет собой график, демонстрирующий эффективность композиции по настоящему изобретению, содержащей каррагинаны, и другой композиции по настоящему изобретению, которая содержит цинк-каррагинан, при защите мышей от инфицирования HSV-2 после вагинального заражения.

Фиг.8 представляет собой график, показывающий сравнение долговременной активности композиции по настоящему изобретению, содержащей цинк-каррагинан, по сравнению с двумя известными продуктами, а именно Conceptrol и Advantage S, при дозе заражающего вируса, равной 104 или 100% инфекционной дозе HSV-2.

Фиг.9 представляет собой график, демонстрирующий защиту от вирусного заражения при действии композиции, содержащей каррагинаны, по настоящему изобретению и другой композиции по настоящему изобретению, которая содержит цинк-каррагинан.

Фиг.10 представляет собой график количества Nestorone (несторона), высвободившегося из композиции, содержащей каррагинаны по настоящему изобретению.

Фиг.11 представляет собой гистограмму, позволяющую сравнить эффективность композиций каррагинана по настоящему изобретению в различных разбавлениях при защите мышей от инфекции HSV-2. Результаты показывают, что даже если каррагинаны разбавлены в соотношении 1:200, они по-прежнему способны обеспечить 40% защиту от инфекции.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Полианионные микробициды, применяемые в композициях по настоящему изобретению, являются микробицидами, которые мешают прикреплению вирусов и тем самым уменьшают проникновение ВИЧ через слизистые оболочки. Эти полианионные микробициды содержат такие соединения, как PRO 2000, Buffergel, сульфат декстрина, сульфат целлюлозы и наиболее предпочтительно каррагинаны.

Каррагинаны, присутствующие в композиции по настоящему изобретению, содержат лямбда каррагинан. Если в композиции присутствуют не лямбда каррагинаны (в этом случае, каррагинановый компонент композиций может именоваться «каррагинанами» или «смесью каррагинанов»), смесь каррагинанов содержит, по меньшей мере, приблизительно 50% (и предпочтительно по меньшей мере 50%) лямбда каррагинанов от общей сухой массы каррагинанов в композиции. В более предпочтительных вариантах осуществления количество лямбда каррагинана составляет по меньшей мере приблизительно 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 97, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% от общей сухой массы каррагинанов (т.е. лямбда и не лямбда каррагинанов). Другими предпочтительными количествами являются по меньшей мере 75%, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 95%, от приблизительно 85 до приблизительно 99% и от приблизительно 94 до приблизительно 97% лямбда каррагинана.

Лямбда каррагинан можно приобрести в свободной продаже (FMC Corp., Philadelphia). В качестве альтернативы, лямбда каррагинан можно получить из диплоидных морских водорослей (спорофитов), например Gigartina radula, Gigartina skottsbergii, Gigartina chamissoi, Gigartina stellata, Iridaea cordata, Chondrus chrispus и Sarcothalia crispata. Выделение каррагинана из морских водорослей проводят по стандартным методикам. Например, водоросли отделяют, промывают и затем высушивают. Лямбда каррагинан экстрагируют горячим разбавленным гидроксидом натрия, получая пасту, которая содержит лямбда каррагинан в концентрации 4%. Полученную пасту очищают центрифугированием и фильтрованием, получая чистый раствор лямбда каррагинана. Удаляют воду, применяя любую комбинацию выпаривания, осаждения или промывания спиртом и высушивания.

Остальная часть каррагинанов в композициях по настоящему изобретению может содержать по меньшей мере один не лямбда каррагинан. Под «не лямбда каррагинаном» подразумевается любой каррагинан, отличный от лямбда каррагинана, например каппа каррагинан, йота каррагинан, каппа-II каррагинан (который содержит каппа и йота каррагинаны), мю каррагинан и ню каррагинан. Не лямбда каррагинаны также имеются в свободной продаже (например, поставляются FMC Corp.) или могут быть извлечены из морских водорослей по стандартным методикам. Например, каппа-II каррагинан также присутствует в природе и входит в состав перечисленных выше видов водорослей. В предпочтительных вариантах осуществления, не лямбда каррагинаны содержат каппа каррагинан, йота каррагинан и каппа-II каррагинаны, а также смеси двух или нескольких перечисленных продуктов. В более предпочтительных вариантах осуществления, не лямбда каррагинан содержит каппа-II каррагинан. В предпочтительных вариантах осуществления не лямбда компонент каррагинанов составляет менее чем приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или приблизительно 25% от общей сухой массы каррагинанов. В более предпочтительных вариантах осуществления, количество не лямбда компонентов составляет менее приблизительно 25%, менее приблизительно 15%, менее приблизительно 5%, от приблизительно 1 до приблизительно 15% или от приблизительно 3 до приблизительно 6% от общей сухой массы смеси каррагинанов. В других предпочтительных вариантах осуществления, смесь каррагинанов практически или полностью свободна от декстрозы, т.е. ингредиента, который часто присутствует в каррагинанах, применяемых в пищевой промышленности.

Для обеспечения антимикробного действия лямбда каррагинан или каррагинаны, как правило, присутствуют в количествах от приблизительно 1 до приблизительно 5% от общей массы композиции. В предпочтительных вариантах осуществления, каррагинаны присутствуют в количестве приблизительно 3% от общей массы композиции. Под терминами «антимикробный» или «антимикробное действие» подразумевается, что композиция ликвидирует или уменьшает вероятность передачи инфекции, передаваемой половым путем, вызываемой бактериями, другими микробами или вирусами. Композиции по настоящему изобретению применимы для защиты от инфекций, передаваемых половым путем, например, за счет подавления инфекций, вызываемых HIV, HPV, HSV-2 и Neisseria gonorrhoeae. С другой стороны, не имеется в виду, что термины «антимикробный» и «антимикробное действие» сообщают, подразумевают или ограничиваются каким-либо конкретным действием, за счет которого достигается подавление передачи инфекции. Не имея в виду ограничиваться каким-либо конкретным объяснением их действия, можно предположить, что каррагинаны неспецифически связываются с вирусами, бактериями и другими микробами, которые являются этиологическими агентами STI, тем самым блокируя рецепторные сайты. Могут применяться композиции, содержащие лямбда каррагинан или каррагинаны в количестве менее 1% или более 5%, если только они обеспечивают антимикробное действие, и они остаются приемлемыми для вагинального введения. Под «приемлемостью для вагинального введения» подразумевается, что реологические свойства композиции, например вязкость, позволяют применять ее для намеченной цели (например, композиция сохраняет такую вязкость, что ее может наносить пользователь, и она удерживается в своде влагалища, при этом обладая подходящими органолептическими свойствами, например практически не имеет запаха, обладает однородностью, прозрачностью, является бесцветной и безвкусной). Вязкость композиции подбирают таким образом, чтобы она имела возможность равномерно покрывать эпителиальную выстилку свода влагалища. Как правило, вязкость композиции составляет от приблизительно 10000 до приблизительно 50000 сантипуаз, предпочтительно от приблизительно 20000 до приблизительно 50000 сантипуаз и более предпочтительно от приблизительно 30000 до приблизительно 50000 сантипуаз. Каррагинан имеет непрерывное распределение молекулярных масс. В основном смеси каррагинанов по настоящему изобретению могут иметь молекулярную массу вплоть до приблизительно 2×106 дальтон, где менее приблизительно 1% молекул каррагинана имеют среднюю молекулярную массу 1×105 дальтон (определенную с помощью газ-проникающей хроматографии и рассеяния света). Более конкретно, лямбда каррагинан в настоящем изобретении имеет среднемассовую молекулярную массу от приблизительно 600000 до приблизительно 1200000 дальтон. Эти физические свойства придают конечному составу неспособность к абсорбции, что, в свою очередь, обеспечивает более продолжительное антимикробное действие.

В число других полианионных микробицидов, отличных от каррагинанов, которые также могут применяться в композициях по настоящему изобретению, входит PRO 2000. Этот микробицид представляет собой вагинальный микробицид для профилактики ВИЧ. Кроме него, другие подобные полианионные микробициды содержат Buffergel, представляющий собой микробицидный спермицид, который проявляет буферную активность, поддерживая умеренную защитную кислотность влагалища в присутствии спермы. Кроме того, для целей настоящего изобретения могут также применяться декстрин сульфат, т.е. полианион, который блокирует проникновение ВИЧ на поверхность клетки, и сульфат целлюлозы.

Кроме этого, композиция по настоящему изобретению содержит физиологически приемлемый агент, регулирующий pH, например фосфатный буферный солевой раствор (PBS). Помимо стабилизации pH композиции (например, на уровне от приблизительно 3,5 до приблизительно 8,5 и предпочтительно от приблизительно 5,8 до приблизительно 7,2, например от приблизительно 6,8 до 7,2), агент, регулирующий pH, предотвращает или ослабляет любые изменения в композиции после ее введения в организм, где значение pH может изменяться в значительных пределах. Значение pH в полости влагалища может находиться в пределах от 3,5 до 5,5. Таким образом, наличие агента, регулирующего pH, расширяет диапазон антимикробного действия каррагинанов. Композиции по настоящему изобретению содержат от приблизительно 0,001% до приблизительно 1,0% агентов, регулирующих pH. Кроме этого, составы композиций могут содержать другие активные агенты и/или инертные ингредиенты, в зависимости от намеченного применения (как описано ниже).

Каррагинаны по настоящему изобретению обеспечивают несколько других преимуществ. Они сохраняют устойчивость при действии замораживания, комнатных температур или температуры кипения. Смесь совместима со средой, имеющейся в женском влагалище. Не намереваясь ограничиваться каким-либо конкретным объяснением, можно предположить, что каррагинаны совместимы со средой влагалища и не являются субстратом или не вызывают или не стимулируют каким-либо другим образом рост естественной влагалищной флоры, а также не являются токсичными и поэтому не нарушают естественный баланс флоры во влагалище. Помимо других свойств, присущих каррагинанам по настоящему изобретению, их антимикробная активность сохраняется в течение определенного периода времени, поскольку они не подвергаются системной абсорбции или разрушению до каких-либо абсорбируемых побочных продуктов, вредных для людей.

Другой аспект настоящего изобретения направлен на комплекс между водорастворимой солью металла и каррагинанами. В предпочтительных вариантах осуществления, соль металла является солью цинка (и в этом случае антимикробная композиция именуется «каррагинатом цинка»). Цинк является ингибитором таких патогенов, передаваемых половым путем, как ВИЧ и HSV-2. Было показано, что ацетат и сульфат цинка ингибируют ВИЧ инфекцию в клеточной культуре, и HSV-2 как в клеточной культуре, так и у лабораторных животных. Соли цинка, как было показано, проявляют эффективность при блокировании инфекций, вызванных ВИЧ in vitro 39, вирусом ящура, риновируса человека, вирусами гриппа A и B, вирусом леса Семлики и вирусом Синдбис40. Haraguchi et al39., обнаружили, что хлорид цинка, ацетат кадмия и хлорид ртути ингибируют выработку ВИЧ-1 по данным p24 ELISA и RT. Хлорид цинка не проявляет значительной цитотоксичности, если он присутствует в концентрациях до 550 мкг/мл.

Водорастворимые соли цинка, применимые в настоящем изобретении, содержат как неорганические, так и органические соли, которые проявляют антимикробные свойства, не вызывая неприемлемого раздражения при применении в соответствии с настоящим изобретением. Предпочтительные водорастворимые соли цинка содержат ацетат цинка, пропионат цинка, бутират цинка, формиат цинка, глюконат цинка, глицерат цинка, гликолят цинка, лактат цинка, сульфат цинка, хлорид цинка и бромид цинка. ZnSO4, ZnCl2, ZnBr2, Zn(Ac)2, и т.д. Соответствующие соли меди и серебра также применимы в настоящем изобретении, при условии, что они не обладают раздражающим действием in vivo и не являются причиной разрушения до любых абсорбируемых побочных продуктов, вредных для людей. Так, например, композиции по настоящему изобретению будут содержать от приблизительно 0,03% до 1,5% водорастворимых солей металла, предпочтительно от приблизительно 0,3% до 1,0%. Антимикробная активность таких композиций выше, чем составов, содержащих каррагинаны в качестве единственного антимикробного агента. В вариантах осуществления настоящего изобретения, содержащих определенные соли цинка, наблюдается значительное увеличение антимикробной активности. Не имея в виду ограничиваться каким-либо конкретным объяснением, можно предположить, что антимикробная активность состава повышается, благодаря тому, что скорость, с которой соли металла абсорбируются организмом, является относительно управляемой и в то же время раздражающее действие соли металла снижается.

Комплексы по настоящему изобретению можно получать стандартными способами, в которых ионы металла замещают катионы, которые присоединены к скелету полисахарида в природных продуктах. Например, цинк каррагинан (этот термин относится к комплексу катионов цинка и каррагинанов по настоящему изобретению) является соединением, которое синтезируют по методике, в результате которой цинк (II) оказывается присоединен к сульфатным группам каррагинанов нековалентной связью. Каррагинан является полисахаридом, состоящим из повторяющихся фрагментов D-галактозы и 3,6-ангидро D-галактозы, расположенных в линейном порядке. Полимер содержит большое количество сульфатных фрагментов, включая 3 группы SO3 на каждый дисахаридный фрагмент. Связывание цинка с каррагинанами осуществляют с помощью химической реакции, разработанной для замены натрия, связанного с природным каррагинаном, на цинк. В этой реакции в качестве источников катиона цинка применяют водный раствор хорошо растворимой соли цинка (например, ацетата цинка). Каррагинаны подвергают диализу в паре с концентрированным раствором ацетата цинка, давая возможность положительно заряженным ионам цинка диффундировать и образовать комплекс с отрицательно заряженными сульфатными группами каррагинанов. Затем избыток цинка удаляют диализом в паре с водой.

Включение комплекса катионов цинка (II) с каррагинаном в состав по настоящему изобретению можно добиться применением каррагината цинка II. Карагинат цинка получают путем замещения катионов, имеющихся в природном каррагинане (натрия, калия, кальция), катионами цинка. Каррагинат цинка обычно получают диализом раствора каррагинана в паре с концентрированным раствором ацетата цинка II. Затем избыток катионов цинка удаляют диализом в паре с водой, после чего концентрируют и, например, подвергают лиофильной сушке. Применение каррагината цинка II позволяет избежать применения анионов, например лактата или ацетата, в настоящем изобретении.

Другой способ включает (a) замачивание каррагинанов в приблизительно 2,5% растворе лактата цинка (или другой подходящей растворимой соли цинка) в смеси 50:50 спирт:вода в течение двух часов, (b) выделение и (c) промывание спиртом с последующим высушиванием. Может возникнуть необходимость повторения стадий (a)-(c) несколько раз для достижения желаемого содержания металла в каррагинанах. Обычно для достижения содержания цинк каррагинана более 50% в единицах эквивалентов требуется два цикла.

Описанные выше методики позволяют получить соединение, которое является водорастворимым и проявляет активность против вирусов, имеющих оболочку, например ВИЧ и HSV-2. В отличие от неорганических или простых органических солей цинка цинк каррагинан сохраняет предпочтительные реологические свойства и имеет высокую молекулярную массу (до 2000000 дальтон), что дает возможность включать его в состав вагинального продукта, который является не раздражающим и не подвергается абсорбции. Данное соединение именуется «комплексом» благодаря наличию молекулярных взаимодействий между металлом и каррагинанами, которые делают невыгодным или препятствуют диссоциации с высвобождением свободных катионов металла. Рассматриваемые комплексы соли металла и отрицательно заряженного сульфатированного полисахарида отличаются от смесей водорастворимых солей металлов и каррагинанов с точки зрения их физических, химических и/или антимикробных свойств.

В другом аспекте настоящего изобретения, заявители обнаружили, что комбинация комплекса нерастворимой в воде соли металла и каррагинанов с определенными антиретровирусными агентами обеспечивает неожиданные преимущества и синергетические свойства. Наиболее конкретно, было найдено, что упомянутая определенная комбинация ингредиентов обеспечивает неожиданные результаты при подавлении инфекций, передаваемых половым путем, и, в частности, при блокировании влагалищных инфекций SHIV-RT (вирус иммунодефицита человека/человекообразных обезьян-обратная транскриптаза). Антиретровирусными агентами являются лекарственные средства, применяемые для лечения инфекций, вызванных ретровирусами, в первую очередь ВИЧ. Существует ряд различных классов антиретровирусных препаратов, которые действуют на различных стадиях жизненного цикла ВИЧ, и в их число входят, например, не нуклеозидные ингибиторы обратной транскриптазы (NNRTI), нуклеозидные ингибиторы обратной транскриптазы (NRTI), ингибиторы интегразы, ингибиторы слияния и антагонисты CCR5.

NNRTI представляют собой соединения, которые присоединяются к обратной транскриптазе и препятствуют превращению РНК в ДНК под действием этого фермента, в результате чего генетический материал ВИЧ не может включаться в здоровый генетический материал клеток и появляется возможность предотвратить образование новых вирусов в клетках. В число упомянутых NNRTI входят такие лекарственные препараты, как невирапин, делавирдин, эфавиренц, этравирин, MIV-150, MIV-160, MIV-170, дапивирин (TMC-120) и UC-781. Наиболее предпочтительно, NNRTI мог бы представлять собой MIV-150, т.е. NNRTI, разработанный компанией Medivir для применения в качестве антивирусного терапевтического средства. MIV-150 представляет собой прочно связывающийся ингибитор фермента HIV-RT, характеризующийся быстрым образованием и небольшой скоростью диссоциации продукта связывания, что делает его эффективным в очень низких концентрациях при инактивации химических изолятов ВИЧ. Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, авторы заявки обнаружили, что определенная комбинация каррагинанов по настоящему изобретению с водорастворимыми солями металлов, предпочтительно цинка, и NNRTI, например MIV-150, является эффективной для полного блокирования вагинальной SHIV-RT инфекции. Кроме того, было обнаружено, что эта определенная комбинация значительно более эффективна, чем взятые по отдельности комбинация каррагинанов с водорастворимыми солями металлов, например, цинка; или каррагинанов с NNRTI, или каррагинаны сами по себе. В предпочтительном варианте осуществления, комбинация каррагинанов по настоящему изобретению, водорастворимых солей металлов и NNRTI предпочтительно содержит описанные выше каррагинаны, в том числе лямбда каррагинаны в количестве по меньшей мере приблизительно 50% от сухой массы каррагинанов, где остальная часть каррагинанов представляет собой по меньшей мере один не лямбда каррагинан, и наиболее предпочтительно, комбинацию 95% лямбда каррагинана и 5% каппа каррагинана, причем композиция в целом, имеющая форму геля, содержит от 1% до 5% каррагинана, предпочтительно приблизительно 3% каррагинана; далее, композиции содержат водорастворимые соли металлов, предпочтительно соли цинка, наиболее предпочтительно в форме ацетата цинка и лактата цинка, в количестве от приблизительно 0,1 масс.% до 1,5% металла, например, цинка от массы всей композиции, наиболее предпочтительно приблизительно 0,3% от массы композиции; а также содержат NNRTI, наиболее предпочтительно MIV-150, в количествах от 5 мкМ до 5000 мкМ (или от 0,000185% до 0,185%) и предпочтительно от 10 мкМ до 250 мкМ (или от 0,00074% до 0,00925%) NNRTI, например, MIV-150, наиболее предпочтительно приблизительно 50 мкМ (или 0,00185%) MIV-150.

NRTI являются соединениями, которые содержатся в ДНК вируса, останавливая процесс ее синтеза. Это приводит к появлению неполноценных ДНК, из которых не могут возникать новые вирусы. К указанной группе соединений относятся такие лекарственные препараты, как абакавир, тенофовир и зидовудин.

Авторами заявки было обнаружено, что NNRTI и NRTI демонстрируют определенные неожиданные свойства, в случае применения в композициях по настоящему изобретению.

В другом аспекте настоящего изобретения, для достижения еще большего антимикробного эффекта, с лямбда каррагинаном или каррагинанами комбинируют лигносульфоновую кислоту (“LSA”) (эта комбинация именуется в тексте заявки LSA-каррагинан). LSA в широких масштабах применяется в промышленности в качестве стабилизатора, диспергирующего агента и улучшителя. Кроме того, она применяется в качестве источника волокнистой массы в корме для крупного рогатого скота, а также в качестве эмульгирующего и диспергирующего агента при производстве некоторых видов пищи для потребления человеком. Это вещество имеется в стенках клеток высших растений. Волокна клеточных стенок, как правило, состоят из полисахаридов, а именно целлюлозы, как наиболее распространенного полисахарида на земле. Помимо целлюлозы, вторичная клеточная стенка содержит другой очень распространенный материал, именуемый лигнином, причем именно этот полисахарид придает растениям жесткость. При варке древесной щепы в растворе бисульфата кальция при нагревании под давлением лигнин превращается в раствор водорастворимой лигносульфоновой кислоты (LSA), известный как отработавший сульфитный щелок 31,32. LSA является низкомолекулярным соединением со средней молекулярной массой приблизительно 5000 дальтон. Поскольку лигнины являются очень сложными природными полимерами, содержащими большое число случайных связей, их точная химическая структура неизвестна, но считается, что она является структурой сульфонированного полимера, в которой основной единицей является фрагмент пропилбензола, подобный фрагменту кониферилового спирта31. Применимость коммерческих лигносульфонатов основана на их диспергирующих, связывающих, комплексообразующих и эмульгирующих свойствах. Ароматическая циклическая структура лигносульфоновой кислоты придает растениям способность противостоять нападению микробов. Было показано, что LSA обладает in-vitro активностью против ВИЧ.

Составы, включающие каррагинаны и LSA, можно получать добавлением LSA к каррагинанам, как правило, при массовом отношении LSA-общее количество каррагинанов от приблизительно 20:1 до приблизительно 1:20. Как и в случае композиций, содержащих соли металлов, можно смешать с каррагинанами твердую соль с буферным действием, обычно в массовом соотношении от приблизительно 1:1 до приблизительно 10:1. Затем полученную смесь превращают в водный раствор. pH состава каррагинан-LSA может быть доведен до значения от приблизительно 6,0 до приблизительно 8,0 добавлением кислоты, например HCl, или основания, например NaOH. LSA в водном растворе имеет рыжеватую или коричневую окраску. Интенсивность этой окраски возрастает пропорционально используемой концентрации. Поэтому в композицию можно включить средство, придающее белизну, например диоксид титана. Это средство для придания белизны, как правило, присутствует в количестве от приблизительно 0,1 до приблизительно 3.0% от общей массы композиции. Средство для придания белизны может также вносить вклад в антимикробный эффект.

Не имея в виду ограничиваться каким-либо конкретным объяснением, можно предположить, что помимо той антивирусной активности, которую LSA проявляет сама по себе, LSA действует также в качестве диспергирующего агента для каррагинанов, а также распутывает и удлиняет их молекулы, обеспечивая, таким образом, большую плотность материала и более высокую антимикробную эффективность. С другой стороны, каррагинаны обеспечивают предпочтительные реологические свойства, необходимые для удобного и эффективного вагинального (и даже ректального) введения, которого нельзя добиться за счет LSA самой по себе, т.к. она по своей природе является довольно водянистой. В некоторых вариантах осуществления, комбинация каррагинанов и LSA действует синергетически при предупреждении или подавлении инфекций, передаваемых половым путем.

Композиции по настоящему изобретению наряду с pH-регулирующим агентом и лямбда каррагинаном или каррагинанами могут содержать в водном составе лекарственные средства, подходящие для вагинального введения. Предпочтительными лекарственными средствами являются противозачаточные средства, например стероидные гормоны, раскрытые в патенте США № 5972372, выданном Saleh и соавторам (“Saleh”), содержание которого включено в настоящую заявку посредством ссылки. Примеры противозачаточных средств, применимых в настоящем изобретении, включают прогестины, ACTH, андрогены, эстрогены, гонадотропин, гормон роста человека, менотропины, прогестерон, прогестины (например, левоноргестрел, норэтиндрон, 3-кето-дезогестрел и гестоден), прогестоген, урофоллитропин, вазорпессин и их комбинации. Предпочтительные агенты включают прогестагенные соединения (например, норэтиндрона ацетат и NESTORONETM (“NES”) (т.е. 16-метилен-17.альфа.-ацетокси-19-норпрегнен-3,20-дион)), а также прогестины (например, левоноргестрел (LNG)).

Предпочтительным контрацептивным агентом является Nestorone, т.е. 16-метилен-17α-ацетокси-19-норпрегн-4-ен-3,20-дион (далее именуемый “NES”), который в литературе имел обозначение “ST-1435”. В сравнительных исследованиях с использованием классического биоанализа по измерению прогестагенной эффективности было установлено, что NES имеет прогестагенную активность, в 100 раз превышающую соответствующую активность прогестерона и в 10 раз превышающую активность левоногестрела53. Поэтому для того чтобы добиться подавления овуляции, требуются меньшие количества NES. Эта эффективность в сочетании с отсутствием андрогенной, эстрогенной и глюкокортикоид-подобной (отложения гликогена в печени) активности, а также отсутствие влияния на липидный обмен и данные клинических химических анализов делают применение NES в контрацептивах особенно предпочтительным53-55. Однако было показано, что NES подвергается быстрому метаболизму и инактивации при пероральном введении, что, в случае использования препарата кормящими женщинами, делает более удобным введение с помощью имплантов или влагалищных колец56,57. Предпочтительная доза введения NES в виде комбинации со смесью Κ/ λ каррагинанов в форме геля составляет от приблизительно 75 до приблизительно 100 мкг в день, что позволяет достичь уровня NES в плазме приблизительно 200 пмоль/л, и добиться хороших показателей кровотечения во время менструации. Другие предпочтительные средства, подходящие для вагинального введения, содержат агенты для гормонозаместительной терапии, например вещества класса эстрогенов (например, этинилэстрадиол), а также другие стероидные соединения.

Не намереваясь ограничиваться каким-либо конкретным объяснением, можно предположить, что каррагинаны обладают двойным действием, придавая композиции микробицидные свойства и в то же время представляя собой систему доставки контрацептивного агента или агента для гормонозаместительной терапии с продолжительным высвобождением, что улучшает эффективность агента.

Любые из композиций, описанных в настоящей заявке, могут дополнительно содержать по меньшей мере один физиологически инертный ингредиент, например, физиологически приемлемый консервант. Консерванты содержат алкиловые эфиры пара-гидроксибензойной кислоты, например метил параоксибензоат, пропил параоксибензоат, производные гидантоина, парабены, например метилпарабен, пропионаты, триклозана трикарбанилид, масло чайного дерева, спирты, фарнезол, фарнезола ацетат, гексахлорофен и четвертичные аммониевые соли, например соли бензалкония, соли цинка и алюминия, бензоат натрия, бензиловый спирт, бензалконий хлорид и хлорбутанол. Консервант обычно присутствует в количестве приблизительно до 0,3% от общей массы композиции. Кроме подавления развития микроорганизмов, которые могут непреднамеренно попадать в состав при производстве, консерванты предотвращают любые неблагоприятные воздействия, которым могли бы подвергнуться активные агенты композиции из-за наличия нормальной флоры организма, когда композиция введена в организм. Это позволит увеличить период времени, в течение которого действующие агенты композиции сохранят свою активность.

В предпочтительных вариантах осуществления, композиции по настоящему изобретению, например, содержащие каррагинаны в качестве единственного антимикробного агента, содержащие или не содержащие лекарственные средства, подходящие для вагинального введения, а также композиции, которые содержат дополнительный антимикробный агент, например катион металла или LSA, вводят вагинально. Настоящее изобретение охватывает также ректальное введение. Композициям по настоящему изобретению целесообразно придавать форму, например, гелей, кремов, пен, пленок и суппозиториев в соответствии со стандартными методиками фармацевтической промышленности. Предпочтительными являются гели. Эти составы предпочтительно вводят перед сексуальной активностью, например половым актом, как правило, приблизительно за один час до этого времени. Применение составов на основе каррагинана предупреждает или подавляет передачу инфекций, передаваемых половым путем (STI), у людей, например Nisseria gonorrhoeae, папилломавируса, HSV-2 и HIV.

Еще один аспект настоящего изобретения направлен на способ получения состава на основе каррагинана. Состав получают, как правило, смешиванием твердой буферной соли и лямбда каррагинана или смеси каррагинанов в массовом соотношении от приблизительно 1:1 до приблизительно 10:1. Затем смесь твердой буферной соли и каррагинана растворяют в воде или в водном растворе, получая состав. После этого pH состава доводят до значения от приблизительно 6,0 до приблизительно 8,0. Это достигается, как правило, добавлением кислоты, например HCl, или основания, например NaOH. Вязкость состава, как правило, составляет от приблизительно 20000 до приблизительно 100000 спуаз предпочтительно от приблизительно 30000 до приблизительно 35000 спуаз. В состав можно добавить хотя бы один физиологически приемлемый консервант. Примеры таких консервантов раскрыты в настоящей заявке. Консервант может входить в состав в количестве, указанном в различных фармакопеях, и в том числе в массовом отношении к каррагинанам от приблизительно 80:1 до приблизительно 10:1, предпочтительно от 40:1 до приблизительно 15:1.

Твердые буферные соли содержат твердые соли щелочных металлов и уксусной кислоты, лимонной кислоты, фосфорной кислоты и молочной кислоты. В случае фосфорной кислоты твердые буферные фосфаты щелочных металлов содержат твердые смеси тризамещенных и дизамещенных фосфатов щелочных металлов, предпочтительно в безводной форме, где щелочные металлы содержат, не ограничиваясь этим, калий и натрий. Могут применяться любые физиологически приемлемые буферы. Однако в случае применения водорастворимых солей цинка фосфаты являются менее предпочтительными, и более предпочтительными в этих составах являются ацетаты, цитраты и лактаты. В предпочтительных вариантах осуществления, эти буферные растворы содержат смеси уксусной кислоты и ацетата натрия; лимонной кислоты и цитрата натрия; а также молочной кислоты и лактата натрия.

Не намереваясь ограничиваться каким-либо конкретным объяснением, можно предположить, что каррагинаны являются сухими порошками, которые чрезвычайно гигроскопичны при действии воздушной среды. Поглощение атмосферной влаги сухим ингредиентом вызывает образование комков в материале. Проблема, возникающая при последующем введении этого материала в основной водный раствор, заключается в том, что не удается добиться полной интеграции каррагинанов в гомогенный водный раствор. Кроме того, можно предположить, что при смешивании каррагинанов с по меньшей мере одной твердой буферной солью эта твердая буферная соль абсорбирует атмосферную влагу, которую поглощали бы каррагинаны, находящиеся на открытом воздухе, тем самым предотвращая или существенно уменьшая слипания каррагинанов в комки. Далее, можно предположить, что описанный способ способствует увеличению растворимости каррагинанов в воде и позволяет добиться стабилизации pH.

Приведенные ниже примеры предназначены для дополнительной иллюстрации некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения и не служат цели ограничения объема изобретения, каким бы то ни было образом.

Пример 1: Получение 500 литров состава на основе каррагинанов

При получении лямбда каррагинана или смеси каррагинанов (1) ингредиенты состава следует взвешивать индивидуально в чистом сухом сосуде для взвешивания; (2) «действительная», а не указанная в методике масса ингредиента должна быть зафиксирована в производственном журнале даже, несмотря на незначительную разницу между двумя этими величинами; (3) не следует использовать любой контейнер для объемных ингредиентов, содержащий артефакт(ы) или загрязнения, и этот контейнер следует закрыть, опечатать, пометить как «загрязненный» и удалить из зоны производства; (4) при проведении производственного процесса не следует переносить порцию продукта из одного сосуда в другой до завершения обработки и прохождения составом тестирования для контроля качества; и (5) во время получения состава реакционный сосуд следует держать закрытым, чтобы избежать потери воды в результате испарения, особенно во время любых стадий, требующих нагревания.

Кроме того, было доказано, что каррагинаны устойчивы в твердом состоянии и в виде продукта, при ряде неблагоприятных условий, включая замораживание или обработку в автоклаве, в течение 24 месяцев.

Приведенное ниже описание имеет отношение к методике, которая применялась для получения состава, содержащего смесь лямбда (λ) и каппа-II (Κ-II) каррагинанов (смесь каррагинанов (Κ-II/λ)). При получении смеси каррагинанов Κ-II/λ из 100 мл лабораторных объемов загрузки и при масштабировании методики от лабораторных объемов, равных 15 и 30 литрам, до производственных методик с 500-литровыми загрузками становится нелегко добиться желаемого постоянства состава от партии к партии. Неожиданно оказалось, что приведенный способ позволяет преодолеть эти затруднения и дает возможность получать смеси Κ-II/λ каррагинанов, имеющие постоянное качество в разных партиях.

Оборудование:

Реакционный сосуд - IKA, EMA 9/500AIUTL, представляет собой реактор с водяной рубашкой, который дает возможность быстро нагревать и охлаждать раствор в процессе получения состава.

Ингредиенты:

Смесь Κ-II/λ каррагинанов;

Фосфатный буферный солевой раствор (PBS) [содержащий: NaCl-120 ммоль/л, KCl-2,7 ммоль/л, фосфатный буфер (одноосновный фосфат кальция и двухосновный фосфат натрия)-10 ммоль/л]-(Sigma Aldrich, Saint Louis MO);

Метиловый эфир п-гидроксибензойной кислоты (метилпарабен) - (Nipa Laboratories, Pontypridd, UK);

Хлористоводородная кислота (HCl) - Merck, Darmstadt, Germany;

Очищенная вода - Clean Chemical Sweden AB, Borlange, Sweden.

Методика:

(1) Взвешивают приведенные ниже количества ингредиентов:

Ингредиент Количество
Очищенная вода (3 порции) 484,0 кг
Смесь каррагинанов Κ-II/λ 15,0 кг
Смесь для получения фосфатного буферного солевого раствора (PBS) 4,8 кг
Метилпарабен 0,5 кг
Хлористоводородная кислота (10%) 0,5 кг

(2) Осторожно и тщательно смешивают друг с другом сухие ингредиенты, т.е. смесь каррагинанов Κ/λ и сухую основу фосфатного буферного солевого раствора (PBS).

(3) Осматривают реактор, чтобы убедиться, что смесительная емкость является чистой, сухой и свободной от артефактов, и что нижний кран закрыт.

(4) Добавляют в реакционный сосуд 100 л (1-ю порцию) очищенной воды и начинают перемешивание: при скорости вращения мешалки 500 об/мин и якоря 20 об/мин. Воду добавляют 3-я порциями. Первой порции достаточно для растворения метилпарабена. Вторая порция способствует снижению температуры, достаточному разбавлению HCl, чтобы избежать кислотного гидролиза каррагинана и при этом сохранить достаточно низкий уровень раствора, такой, чтобы при добавлении смеси каррагинан/PBS использовавшееся для этого сито можно было опустить в сосуд для смешивания и при этом оно не вступило в соприкосновение с находящимся на дне раствором, но была ниже входного люка, с тем чтобы не потерять выделяющиеся из смеси пылеобразные частицы. Третья порция воды позволяет получить конечную концентрацию.

(5) Продолжают перемешивание и добавляют 0,5 кг метилпарабена и 0,5 кг HCl. Закрывают входной люк сосуда и нагревают воду до температуры 75-85°C. По достижении указанной температуры перемешивание продолжают в течение по меньшей мере 10 минут для растворения метилпарабена.

(6) Прекращают нагревание и добавляют 250,0 кг (2-ю порцию) очищенной воды. Охлаждают раствор до 25-35°C. Добавление воды ускоряет охлаждение. Раствор необходимо охладить для того, чтобы он не образовывал пара во время последующего добавления ингредиентов. Помимо предотвращения потери воды, когда сосуд открыт при последующем добавлении, пар мог бы вызвать образование комков в смеси каррагинан/PBS и прилипание к ситу, которое применяется при добавлении.

(7) Открывают входной люк и начинают медленно, при несильном встряхивании, добавлять смесь каррагинан/PBS через сито. Добавление занимает приблизительно 20 минут. Одновременно с добавлением смеси увеличивают скорость перемешивания до максимальной, что составляет 1200 об/мин для мешалки и 20 об/мин для якоря. Вязкость раствора экспоненциально возрастает по мере добавления каррагинанов. При недостаточной скорости перемешивания каррагинаны образуют комки, окруженные оболочкой из частично гидратированного материала, которые впоследствии не смачиваются и не переходят в раствор, что делает данную загрузку продукта непригодной к употреблению. (Упомянутые комки представляют собой небольшие объемы сухого каррагинана, которые со всех сторон окружены оболочкой, состоящей из частично гидратированного каррагинана, которая становится непроницаемой для воды, из-за чрезвычайно высокой молекулярной массы и гибкой структуры каррагинана).

(8) Закрывают входной люк и продолжают перемешивание на максимальной скорости, т.е. мешалка 1200 об/мин, якорь 20 об/мин. Добавляют 134,0 кг очищенной воды (3-я порция) и отключают линию подачи воды, закрывая кран. Нагревают раствор до температуры 75-80°C, осуществляя подачу тепла на уровне 52%.

(9) Проверяют, чтобы все краны были закрыты, и удаляют из реакционного сосуда воздух до давления 400 мбар. Раствор перемешивают на слегка уменьшенной скорости при оборотах мешалки 1100 об/мин и якоря 20 об/мин в вакууме в течение 1,5 часа при температуре 75-80°C. Постоянное перемешивание раствора, которое необходимо для равномерного распределения и полной интеграции ингредиентов состава, вызывает захват избытка воздуха. Вакуум способствует выделению этого воздуха из раствора.

(10) Выключают нагревание, выключают перемешивание и снимают вакуум. Из реактора отбирают тестовый образец и испытывают его в контрольном тесте №1 на равномерность распределения и полноту интеграции ингредиентов в состав.

Контрольный тест №1: равномерность распределения и полнота интеграции ингредиентов

Отбирают приблизительно 90 мкл получаемой смеси (используя наконечник 200 мкл пипетки с широким отверстием для облегчения отбора раствора каррагинана) и смешивают с 10 мкл 0,1% метилового синего TS (1:1, изопропиловый спирт:H2O) в 500 мкл пробирке Эппендорфа. Смесь в пробирке должна приобрести равномерное синее окрашивание. Это указывает на то, что смесь каррагинанов Κ-II/λ равномерно распределена в растворе. Из 10 мкл полученной смеси готовят препарат для микроскопического исследования, закрывая смесь покровным стеклом, и рассматривают при низком увеличении (10Х). Смесь Κ-II/λ каррагинанов должна иметь вид крупных розовых нитей. Это указывает на полную интеграцию смеси Κ-II/λ каррагинанов в состав и на то, что раствор прошел тест. Если нити имеют синий цвет или имеют вид больших синих сгустков, то смесь Κ-II/λ каррагинанов не полностью интегрирована в состав и раствор считается не прошедшим тест. В этом случае продолжают обработку раствора в условиях стадии №9. Осуществляют дальнейшее тестирование раствора с промежутками 0,5 часа до тех пор, пока раствор не проходит описанный тест.

(11) После прохождения раствором контрольного теста №1 осуществляют контрольный тест №2 для определения pH.

Контрольный тест №2: определение pH

Исследуемый образец следует охладить для тестирования до температуры 25±2°C (т.е. до 23°C-27°C). Значение pH должно находиться в пределах 7,0±0,1 (т.е. в диапазоне от 6,9 до 7,1). Это указывает на то, что pH раствора является стандартным и раствор считается прошедшим тестирование. Если pH раствора не находится в допустимом диапазоне (от 6,9 до 7,1), то раствор считается не прошедшим тестирование. Если раствор не прошел тестирование, необходимо довести его pH до необходимого значения, либо 10% раствором HCl (для уменьшения pH), либо 1 н. NaOH (для увеличения pH), добавляя необходимый реагент порциями по 25 мл, пока раствор не пройдет тест. После добавления каждой порции кислоты или основания, до повторного определения pH, необходимо тщательное перемешивание (перемешивание в вакууме в условиях стадии №9, но без нагревания) для обеспечения равномерного распределения добавленного раствора в объеме продукта. Повторную проверку осуществляют после перемешивания в вакууме в течение 0,5 часа. Продолжают описанные действия, пока раствор не пройдет данный тест.

(12) После прохождения раствором контрольного теста №2 начинают охлаждение смеси до 25±2°C (т.е. до 23°C-27°C). Скорость перемешивания, которое к этому моменту должно было быть выключено, необходимо увеличить, поскольку раствор загустевает при охлаждении. Вначале мешалка не вращается и якорь вращается со скоростью 20 об/мин, увеличивают скорость вращения мешалки 20 об/мин/15 мм и скорость вращения якоря 10 об/мин/30 мм, пока не будет достигнута скорость вращения мешалки 1000 об/мин и скорость вращения якоря 40 об/мин. Предпочтительно не увеличивать скорость вращения слишком быстро, поскольку иначе продукт может захватывать воздух. Если это произошло, необходимо понизить давление до 400 мбар до тех пор, пока раствор не освободится от пузырьков воздуха;

(13) Из реакционного сосуда отбирают образец для завершающего теста, проводя повторный тест №2 для определения pH и контрольный тест №3 для определения вязкости.

Контрольный тест №3: Определение вязкости

Тестируемый образец необходимо нагреть до 35±2°C (до температуры в диапазоне от 33°C до 37°C). Для оптимальной эффективности вязкость должна находиться в пределах от приблизительно 30000 до приблизительно 40000 спуаз. Если измерения вязкости показывают, что вязкость раствора совпадает с эталонным образцом PC и CCS производственной партии, раствор считается прошедшим тест. Если раствор не прошел тест, отбирают тестовые образцы из верхней и нижней частей реакционного сосуда и проводят контрольный тест №2, определяя pH, и контрольный тест №3, определяя вязкость для каждого образца. Если раствор по-прежнему не проходит эти тесты, повторяют стадию №9 и стадию №12 и повторно проводят контрольный тест №3 раствора, определяя вязкость. Если раствор не проходит тест и его параметры не совпадают со спецификацией, необходимо провести исследования для определения причины отклонения свойств продукта от спецификации.

Было обнаружено, что регулирование вязкости добавлением воды приводит к неизвестному процентному содержанию/концентрации действующего вещества в готовом продукте, что делает полученный продукт непригодным для применения.

(14) Если раствор прошел контрольные тесты №1, №2 и №3, он признается годной промышленной партией, которую можно подвергнуть заключительному контрольному тестированию. К крану, находящемуся на дне реактора, присоединяют трубку для отбора продукта, снабженную мешочным фильтром, и переносят состав в емкости для хранения. Сохраняют образец для микробиологического тестирования перед заполнением аппликаторов.

Готовый состав, полученный описанным выше способом, содержит следующие компоненты.

Масса/Процентная доля: 500 литров состава

Компонент Масса Процентная доля
Очищенная вода 484,0 кг 96,8
Метилпарабен 500 г 0,1
PBS:
NaCl 120 ммоль/л
KCl 2,7 ммоль/л
Соли фосфатов 10 ммоль/л
10% HCl 500 г 0,1
смесь каррагинанов Κ-II/λ 15 кг 3,0

Конечный состав имеет значение pH приблизительно 7,0, и его регулируют добавлением раствора HCl и смеси K3PO4 и Na2HPO4 в соотношении 1:1.

Пример 2: Действие каррагинана на ВИЧ инфекцию in vitro

В ряде лабораторий, включая лабораторию PI15-19, было показано, что каррагинан блокирует ВИЧ и другие оболочечные вирусы. В этих исследованиях использовали несколько различных типов клеток-мишеней и штаммов ВИЧ. Как правило, 50% блокирование наблюдается при концентрации несколько микрограммов/мл. Эти результаты сходны с результатами для других сульфатированных полисахаридов, например гепарина и декстран сульфата.

Пример 3: Исследование интравагинальных вирусных инфекций в системе HSV-2/мышь

Система HSV-2/мышь (Balb/C) широко применяется большинством исследовательских групп, принимающих участие в разработке микробицидов. Важное различие между системой, предложенной Philips20-22, и другими системами заключается в применении другого диапазона дозировок вируса для сравнения эффективности препаратов. Стандартная доза вируса, вызывающая заражение, т.е. 100% инфекционная доза или 104 pfu, используемая другими авторами для оценки микробицидов, ограничивает определяемый уровень эффективности. Значительное большинство микробицидов, находящихся на стадии разработки, а также многие OTC спермициды покажут значительную степень защиты против инфекции HSV-2 в указанной 100% инфекционной дозе. Однако в методике Philips применяются концентрации вируса, которые дают возможность оценить защитное действие для дозы, которая в 105, 106 и 1000 раз превышает 100% инфекционную дозу.

Применяя эту систему дозировок заражающего вируса, проводили сравнительное исследование для сравнения эффективности защиты, обеспечиваемой рядом находящихся в разработке микробицидов, OTC спермицидов и лубрикантов, а также составов, подходящих для применения в качестве плацебо в клинических испытаниях по оценке эффективности микробицидов. Помимо композиции по настоящему изобретению, содержащей смесь каррагинанов Κ-II/λ (также именуемой в настоящей заявке «композицией Κ/λ каррагинанов»), сравнительные тестовые композиции содержали: находящиеся в разработке микробициды, такие как BufferGelTM и No Fertil, OTC спермициды: K-Y Plus®, Gynol II® и Advantage STM; OTC вагинальные лубриканты: Replens® и K-Y Jelly®; и подходящие составы плацебо: 2,5% Carbopol® и 2,5% метилцеллюлозу.

Тестируемые составы относили к одной из трех категорий по их эффективности при защите мышей от вагинальной инфекции HSV-2. При дозе заражающего вируса 104 pfu все составы, за исключением K-Y Jelly, Carbopol и метилцеллюлозы, обеспечивали значительный уровень защиты от инфекции HSV-2. Однако при дозе вируса 105 все составы, за исключением композиции Κ-II/λ каррагинанов, обеспечивали лишь минимальный уровень защиты. Композиции Κ-II/λ каррагинанов оказалась единственным составом, который все еще обеспечивал достаточный уровень защиты от вирусной инфекции при дозе заражающего вируса 106 pfu20. При тестировании различных составов в системе сравнения при различных диапазонах дозировки вирусов полученные данные стали первой демонстрацией неожиданно высокого уровня защиты от вирусной инфекции, который обеспечивает композиция Κ-II/λ.

Таким образом, можно прийти к заключению, что систему HSV-2/мышь можно применять в качестве средства, с помощью которого можно проводить оценку потенциальных микробицидов и сравнивать их в одинаковых условиях тестирования для выявления потенциально эффективных микробицидов.

Пример 4: Продолжительность действия в системе HSV-2/мышь

Один из критериев, выдвинутых UNAIDS (World Health Organization, AIDS branch - Всемирная Организация Здравоохранения, отделение СПИДа) для идеального микробицида, гласит: «он должен быть активным при введении в организм и в течение продолжительного периода времени», давая женщине больше гибкости в применении продукта. Кроме того, развитие инфекции, вызванной свободным или ассоциированным с клетками ВИЧ, во времени может происходить не моментально. Для оценки периода времени, в течение которого микробицид мог бы сохранять активность, можно использовать систему HSV-2/мышь. Тестирование проводили, осуществляя интравагинальное введение тестируемого состава, ожидая установленный период времени и затем заражая мышь известной дозой вируса. Определение «продолжительности активности» проводили для Gynol II® (2% N-9 содержащего OTC спермицида), BufferGel® (микробицида с низким pH, находящегося в стадии разработки) и композиции Κ-II/λ каррагинана, через 5 минут, 1,5, 3, 6 и 18 часов после нанесения состава. В момент времени 1,5 часа Gynol II® перестал обеспечивать какую-либо защиту от инфекции, и активность BufferGel® уменьшилась лишь до 30% исходного уровня. Эффективность BufferGel® продолжала уменьшаться с течением времени, и защитное действие полностью прекратилось через 6 часов. Заметно контрастируя с этими результатами, композиция Κ-II/λ каррагинана сохраняла 85-100% эффективности при защите от HSV-2 инфекции вплоть до 6 часов и 72% эффективности в момент времени 18 часов. Композиция Κ-II/λ каррагинана продолжала сохранять определенный уровень активности вплоть до 24 часов после нанесения. Увеличенная продолжительность защиты от вирусной инфекции является уникальной особенностью каррагинана, в частности композиции Κ-II/λ каррагинанов.

Пример 5: Исследование интраректальной вирусной инфекции в системе HSV-2/мышь

С теоретической точки зрения, микробицид, проявивший эффективность, при защите от инфекции, вызванной ВИЧ, мог бы применяться не только ректально, но и вагинально. Используя модификацию системы HSV-2/мышь с интраректальным вирусным заражением, исследовали эффективность и безопасность микробицида.

Предварительная обработка прямой кишки композицией Κ-II/λ каррагинана значительно уменьшала число инфицированных животных, после ректального заражения вирусом HSV-2, по сравнению с предварительной обработкой PBS или метилцеллюлозой (инертными плацебо)23.

Пример 6: Влияние композиции Κ-II/λ каррагинанов на влагалищную флору

Важно отметить, что применение микробицида не нарушает баланс естественной влагалищной флоры. Исследования in vitro показали, что каррагинан не ускоряет и не тормозит скорость роста Lactobacillus acidophilus, т.е. бактерии, которая чаще всего присутствует во влагалищной флоре. Исследования, проведенные у 35 женщин, принимавших участие в фазе I клинического испытания безопасности композиции Κ-II/λ каррагинанов при вагинальном применении, не показали значимых изменений влагалищной флоры, что определяли по наличию или отсутствию бактериального вагиноза13.

Пример 7: Система переноса вируса HIV/мышь

Хотя мышей нельзя инфицировать вирусом ВИЧ, было показано, что, если активный или инактивированный вирус ввести во влагалище мыши в небольшой дозе, впоследствии можно обнаружить вирус в лимфатических узлах с помощью полимеразной цепной реакции с обратной транскриптазой (RT-PCR)24. Были представлены данные о том, что в захвате вируса и его последующем переносе в лимфатические узлы принимают участие дендритные клетки. Этот вывод согласуется с исследованиями, подтверждающими участие дендритных клеток в начальной стадии передачи ВИЧ половым путем25.

Результаты проведенных исследований показывают, что композиции Κ-II/λ каррагинанов эффективно препятствуют проникновению ВИЧ в лимфатические узлы, преимущественно за счет блокирования переноса ВИЧ из влагалища через дендритные клетки.

Изучение транспорта ВИЧ проводили с использованием мышиной системы и вируса, инактивированного AldritolTM-2. Это является стандартной методикой инактивации ВИЧ, не меняющей оболочку вируса. Для обнаружения ВИЧ исследовали селезенку и лимфатические узлы, чтобы установить, не является ли селезенка альтернативным местом накопления ВИЧ. Селезенка (в противоположность лимфатическим узлам) позволяет получить относительно большие количества РНК для проведения RT-PCR с целью обнаружения ВИЧ. Кроме того, извлечение селезенки отнимает меньше времени, чем извлечение лимфатических узлов, что уменьшает вероятность разрушения РНК.

Для определения эффективности композиции Κ-II/λ каррагинанов в предотвращении преодоления ВИЧ цервикального/вагинального барьера мышей случайным образом делили на три группы 1) контрольные мыши, получавшие PBS, не обработанные каким-либо препаратом; 2) мыши, предварительно обработанные метилцеллюлозой (инертное плацебо); и 3) мыши, предварительно обработанные композицией Κ-II/λ каррагинанов. Результаты показаны в виде Саузерн-блота на фиг.2 и в приведенной ниже таблице.

Вводимый препарат RT-PCR положительная/общая Процент положительной реакции (инфицированных)
PBS 16/22 72%
Метилцеллюлоза 7/10 70%
Композиция Κ-II/λ каррагинанов 2/22 9%

Данные для мышей, обработанных PBS (контроль), метилцеллюлозой и композицией Κ-II/λ каррагинанов, показывают, что композиция Κ-II/λ каррагинанов значительно снижает количество позитивных (т.е. инфицированных) животных и что метилцеллюлоза не дает никакого эффекта по сравнению с PBS (контролем). Приведенные данные показывают также, что композиция Κ-II/λ каррагинанов проявляет эффективность в профилактике заражения ВИЧ, поступающими из свода влагалища.

Пример 8: Миграция клеток/мышиная система

Ранее предполагалось, что передача ВИЧ половым путем может быть опосредована имеющимися в сперме ВИЧ-инфицированными лимфоцитами или макрофагами, которые проникают через эпителий половых путей26,27. Для проверки гипотезы о том, что мононуклеарные клетки крови мигрируют из свода влагалища через неповрежденный эпителий, во влагалища мышей помещали активированные мононуклеарные клетки крови (мышиные), подвергнутые двойному витальному окрашиванию. Через четыре часа животных умерщвляли, извлекали подвздошный и паховый лимфатические узлы и селезенку, разделяли клетки и производили их подсчет с помощью флуоресцентной микроскопии. В подвздошном и паховом лимфатических узлах и селезенке наблюдали многочисленные окрашенные клетки28,XX. Для оценки влияния, которое композиция Κ-II/λ каррагинанов может оказать на блокирование этого процесса, животных подвергали обработке тестируемым составом перед введением меченых клеток.

Мышь Введенные клетки/препараты Паховый и подвздошный лимфатические узлы Селезенка
1 Макрофаги 36 555
2 Макрофаги 52 366
3 Макрофаги 59 672
4 Макрофаги 87 786
5 Макрофаги 61 357
6 Макрофаги 40 859
7 Макрофаги 54 312
8 Κ-II/λ Каррагинан+макрофаги 4 30
9 Κ-II/λ Каррагинан+макрофаги 4 6
10 Κ-II/λ Каррагинан+макрофаги 6 48
11 Κ-II/λ Каррагинан+макрофаги 3 53
12 Κ-II/λ Каррагинан+макрофаги 3 3
13 Метилцеллюлоза+макрофаги 14 120
14 Метилцеллюлоза+макрофаги 27 245
15 Метилцеллюлоза+макрофаги 38 96

Донорские клетки присутствовали как в подвздошном, так и в паховом лимфатическом узле, а также в селезенке. Если мышам осуществляли только вагинальное введение макрофагов, у животных-реципиентов наблюдалось в среднем 55 меченых донорских клеток в дренирующих лимфатических узлах и 558 клеток в селезенке соответственно. У мышей, которым перед введением клеток осуществляли вагинальное введение композиции Κ-II/λ каррагинанов (показанной в приведенной выше таблице как «Κ-II/λ каррагинан»), в дренирующих лимфатических узлах было обнаружено в среднем только по 4 клетки, и в селезенке наблюдалось в среднем только 28 клеток. Различие между животными, не обработанными и обработанными композицией Κ-II/λ каррагинанов, было статистически значимым. Если животных предварительно обрабатывали метилцеллюлозой, количество донорских клеток, которые достигли лимфатических узлов и селезенки, составляло в среднем 26 в лимфатических узлах и 153 в селезенке. Различие между мышами, обработанными композицией Κ-II/λ каррагинанов и метилцеллюлозой, было статистически значимым, в то время как различие между необработанными животными и животными, обработанными метилцеллюлозой перед введением донорских клеток, не являлось статистически значимым. У контрольных мышей, которым вводили окрашенные макрофаги CMTMR, прошедшие цикл заморозки-оттаивания, не наблюдалось присутствия флуоресцирующих клеток.

Пример 9: Микробицидное действие на папилломавирус

Было также показано, что композиция Κ-II/λ каррагинанов эффективна при блокировании образования очагов бычьего папилломавируса (BPV) in vitro (данные не приведены). Композиции Κ-II/λ каррагинанов являются эффективными при предотвращении трансформации вагинальных эксплантатов человека под действием папилломавируса человека (HPV) в системе ксенотрансплантата. В мышиной системе ксенотрансплантата SKID применяются эксплантаты вагинальной ткани человека, свернутые в цилиндрические трубки, которые подкожно вживляют мышам NOD/SKID (иммунодефицитным)29. Трансплантатам дают зажить в течение двух недель, после чего открывают концы трубок и вводят тестовое соединение и затем осуществляют заражение вирусом HPV. В экспериментах по оценке композиций Κ-II/λ каррагинанов, 14 из 14 контрольных эксплантатов, обработанных солевым раствором, подверглись трансформации. В противоположность этому, трансформации подвергся только 1 из 17 эксплантатов, обработанных композицией Κ-II/λ каррагинанов (данные не приведены).

Пример 10: Действие смеси Κ/λ каррагинанов в анализе разбавленных образцов

Смесь Κ/λ каррагинанов эффективна также в значительно разбавленном состоянии, что продемонстрировано в системе HSV-2 мышь. 3% композицию Κ-II/λ каррагинанов разбавляли PBS, получая разбавления 1:1, 1:5, 1:25, 1:50, 1:100 и 1:200. Разбавленные растворы вводили мышам вагинально и затем вводили 104 (100% инфекционную дозу) HSV-2. Результаты этого эксперимента оказались неожиданными. Вместо дозазависимого снижения степени антивирусной защиты, композиция Κ-II/λ каррагинанов с разбавлением 1:50 сохраняла почти полную эффективность антивирусной защиты, как и менее разбавленные растворы. Кроме того, значительная активность сохранялась даже у растворов с разбавлением 1:200. Смотрите фиг.11.

Пример 11: Эффективность составов на основе композиции Κ-II/λ каррагинанов против ВИЧ

Были выявлены соединения, которые при добавлении к каррагинанам по настоящему изобретению или при связывании с ними значительно повышают эффективность блокирования ВИЧ-инфекции PBMCs (мононуклеарных клеток периферической крови) in vitro. Исследования эффективности Zn-каррагинана и LSA-каррагинана при блокировании ВИЧ-инфекции PBMCs показали, что оба состава более эффективны в более низких концентрациях, чем композиции, содержащие только каррагинан. Результаты тестирования показаны на фиг.3.

Пример 12: Действие комбинации LSA-каррагинан против HSV-2

Результаты показывают, что комбинация LSA-каррагинан более эффективна при блокировании ВИЧ-инфекции, чем каррагинаны (смотрите фиг.4). Первоначально LSA не казалась подходящим компонентом микробицида из-за своей коричневой окраски. Однако было обнаружено, что в концентрации 0,25% LSA обладает высокой эффективностью и при включении в состав придает ему пренебрежимо малую окраску. Для гарантии того, что LSA не изменит цвет состава, белую хлопковую ткань замачивают в течение ночи в 3% растворе LSA и затем промывают водопроводной водой; результаты показали отсутствие изменений окраски ткани. Комбинацию LSA-каррагинан сравнивали с каррагинаном в системе HSV-2/мышь для определения эффективности при блокировании вирусной инфекции in vivo. Предварительные результаты показали, что комбинация LSA-каррагинан является более эффективной, чем каррагинан при блокировании вирусной инфекции.

Помимо представленных выше результатов, комбинацию LSA-каррагинан сравнивали с чистой композицией Κ-II/λ каррагинанов при дозе вирусного заражения 106 pfu в трех отдельных экспериментах. Комбинация LSA-каррагинан во всех экспериментах оказалась значительно более эффективной, чем композиция Κ-II/λ каррагинанов сама по себе. Добавление других сульфатированных полимеров к композиции Κ-II/λ каррагинанов не увеличивает эффективность составов. Например, добавление 5% декстрансульфата или 5% гепарина к композиции Κ-II/λ каррагинанов не оказало влияния на эффективность против инфекции HSV-2 у мышей.

Оценка эффективности составов на основе композиции Κ-II/λ каррагинанов (в трех приведенных ниже таблицах, именуемой «каррагинанами»), содержащих и не содержащих LSA.

Доза вируса HSV-2 106 pfu в 100 раз больше дозы вируса, которая могла бы инфицировать всех незащищенных мышей. Необходимость применения таких высоких доз вируса вызвана чрезвычайно высокой эффективностью каррагинана при ингибировании вирусной инфекции.

Каждый состав вначале тестируют в общей сложности на 20 мышах. Соединения или составы, которые демонстрируют блокирующее действие, исследуют на других 20 мышах. Приведено среднее число инфицированных мышей.

Состав Число инфицированных мышей/общее число мышей % инфицированных
3% каррагинан 14/20 70
1% каррагинан 20/20 100
0,5% каррагинан 20/20 100
3% каррагинан+3% LSA 4/20 20
3% каррагинан+1% LSA 2/20 10
3% каррагинан+0,5% LSA 4/20 20
3% каррагинан+0,25% LSA 5/20 25
3% каррагинан+0,1% LSA 7/20 35

Доза вируса в 100 раз превышает 100% инфекционную дозу и другие соединения, за исключением 3% каррагинана, который оказывает минимальное действие, не позволяют добиться какого-либо эффекта при таких высоких дозах вируса.

После этого осуществляли анализ действия LSA без каррагинана для лучшей оценки ее ингибирующих свойств. LSA добавляли к инертному загустителю, а именно метилцеллюлозе, добиваясь такой же вязкости, которую обычно имеют вагинальные продукты (лубриканты, спермициды и микробициды) (данные приведены ниже).

Оценка эффективности LSA без каррагинана

Состав Число инфицированных мышей/общее число мышей % инфицированных
3% каррагинан 14/20 70
3% LSA - метилцеллюлоза 8/20 40
1% LSA - метилцеллюлоза 8/20 40

Доказано, что LSA более эффективна, чем каррагинан, т.к. она демонстрирует лучшее блокирование инфекции HSV-2, чем каррагинан. Однако комбинация двух этих ингредиентов превосходит по своей эффективности любой из них по отдельности.

Пример 13: Применение LSA в микробицидах

LSA эффективна в качестве микробицида против HSV-2 инфекции, ВИЧ и других STI's, совместно с каррагинанами или без них. Сульфатированный полимер LSA эффективен для защиты эпителиальных клеток in vitro от ВИЧ-инфекции и мышей от HSV-2 инфекции. Ингибирующее действие можно наблюдать для других оболочечных вирусов, например патогенов людей, а именно вируса T-клеточной лейкемии человека. Кроме того, имеет место защита эпителиальных клеток от папилломавируса человека, который не является оболочечным вирусом. Таким образом, ингибирующая эффективность LSA может распространяться на более широкий круг STI's. Результаты тестирования показаны на фиг.5.

Пример 14: Действие Zn-каррагинана против HSV-2

Исследования эффективности Zn-каррагинана против HSV-2 инфекции проводили in vitro и in vivo. В исследованиях in vitro определяли эффективность солей Zn в предотвращении образования бляшек в рамках анализа, основанного на образовании бляшек HSV-2 41. Было найдено, что значение IC50 для солей Zn при уменьшении образования бляшек соответствует концентрации 50 мМ. Было установлено, что Zn-каррагинан значительно более эффективен, чем каррагинан или соли Zn сами по себе для предотвращения образования бляшек, имея IC50<10 мкг/мл или <25 мМ. Результаты тестирования показаны на фиг.6.

Эффективность Zn-каррагинана оценивалась также в системе HSV-2/мышь (смотрите фиг.7). Для сравнения Zn-каррагинана с OTC спермицидом K-Y Plus и композицией Κ-II/λ каррагинанов также использовались дозы вируса HSV-2 в диапазоне 103 pfu, что равно 50% инфекционной дозе, до 107 pfu или 1000-кратной 100% инфекционной дозе. Авторы заявки определили, что композиция Κ-II/λ каррагинанов была способна защитить некоторое количество животных при дозе инфицирующего вируса, равной 106 pfu или 100-кратной 100% инфекционной дозе. Ни один из других протестированных потенциальных микробицидов не смог обеспечить защиту при этой дозировке вируса. В предварительных исследованиях было установлено, что Zn-каррагинан статистически значимо защищает мышей от HSV-2 инфекции при этой дозе, а также при провоцирующей дозе вируса 107 pfu или 1000-кратной 100% инфекционной дозе. Наиболее неожиданным явился тот факт, что добавление Zn к композиции Κ-II/λ каррагинанов (с образованием комплекса) увеличивает уровень антивирусной защиты.

Пример 15: Продолжительность действия комплекса Zn-каррагинан

Композиция Κ-II/λ каррагинанов остается активной во влагалище мыши в течение продолжительного периода времени. Аналогичные эксперименты проводили для сравнения комплекса Zn-каррагинан с двумя OTC спермицидами, а именно Advantage S и Conceptol для определения продолжительности действия. Было установлено, что уровень активности комплекса Zn-каррагинан нисколько не снижался в течение 6 часов, тогда как Advantage S и Conceptol продемонстрировали 50% уменьшение активности в течение 1,5 часов и 3 часов и после этого не смогли обеспечить дальнейшей защиты (смотрите фиг.8).

Пример 16: Эффективность комплекса Zn-каррагинан после вирусного заражения

Микробицид, который способен проявлять эффективность даже в том случае, когда он введен после попадания вируса в организм, мог бы стать продуктом с более широкой областью применения, включая тех женщин, которые не смогли воспользоваться продуктом заблаговременно и вынуждены применять его после того, как половой акт уже состоялся, например женщин, ставших жертвой изнасилования. Ранее исследователям не удавалось выявить микробицид, который мог бы предоставить такую защиту. Комплекс Zn-каррагинан способен обеспечить защиту против инфекции HSV-2 у мышей после пробного заражения мышей вирусом. Как показывают приведенные ниже данные, комплекс Zn-каррагинан является исключением в том отношении, что он проявляет активность вплоть до 4 часов с момента попадания вируса в организм (смотрите фиг.9). Эти данные особенно интересны в свете наблюдения заявителей, согласно которому композиции Κ-II/λ каррагинанов не способны предотвращать инфекции после пробного заражения вирусом, если только не ввести их сразу же вслед за вирусом.

Пример 17: Микробицид, предупреждающий беременность, для двойной защиты

Композиция Κ-II/λ каррагинанов остается во влагалище до 24 часов, что позволяет наносить ее один раз в день для защиты от ВИЧ и допускает ее применение в качестве системы для вагинальной доставки противозачаточных гормонов. Возможность вагинальной доставки различных стероидов была тщательно изучена в связи с современными разработками противозачаточных вагинальных колец43. Было показано, что стероиды, нанесенные непосредственно на слизистую оболочку влагалища, быстро абсорбируются, и для достижения желаемого противозачаточного эффекта необходимы лишь очень малые их дозы48-52. Кроме того, вагинальная доставка обычно сопровождается снижением нежелательных побочных эффектов, которые часто связаны с пероральными контрацептивами.

Вагинальные составы по настоящему изобретению обеспечивают двойную защиту, являясь комбинацией микробицида/контрацептива, дополнительное преимущество которой заключается в увеличении мотивации пользователя соглашаться на ее применение. Предпочтительным противозачаточным агентом является противозачаточный гормон NES. Было показано, что этот синтетический гормон обладает исключительно сильным действием. При использовании классических биоанализов для измерения прогестагенной активности было установлено, что NES обладает в 100 раз большей активностью, чем прогестерон, и поэтому достаточно очень небольших количеств NES, чтобы подавить активность желтого тела яичников. Кроме того, были выполнены обширные токсикологические исследования NES.

Пример 18: Диффузия NES из смеси Κ/λ каррагинанов

Для того чтобы состав, содержащий композицию Κ-II/λ каррагинанов и NES (далее по тексту именуемый «Carra /NES»), являлся эффективным контрацептивом, важно, чтобы NES высвобождался из каррагинана и абсорбировался через влагалище. Авторы заявки выполнили анализы in vitro для того, чтобы установить, высвобождается ли NES из Carra/NES.

Авторы исследовали диффузию NES через диализную мембрану со значением отсечки молекулярной массы, равным 1000. Молекулярная масса NES равна 370. По данным ВЭЖХ, NES диффундирует из диализного мешка с постоянной скоростью. Результаты показаны на фиг.10. Эти результаты показывают, что NES не связывается с каррагинаном. Однако наблюдаемая скорость диффузии через диализную мембрану не может быть соотнесена со скоростью диффузии, которая могла бы наблюдаться в женском влагалище, поскольку скорость диффузии находится в зависимости от площади поверхности диализного мешка. Условия во влагалище могли бы быть иными.

Кроме того, авторы заявки провели эксперимент, который включал центрифугирование Carra/NES через сборку, состоящую из центрифужного фильтра Ultrafree-15 и центрифужной пробирки, при ускорении 2000g в течение 99 минут, с целью определения процентной доли высвободившегося NES. Центрифужный фильтр представляет собой устройство, которое помещают в центрифужную пробирку. На дне устройства имеется фильтр, который пропускает молекулы массой до 500. При использовании этого устройства свыше 98% добавленного NES было обнаружено в фильтрате. Данный эксперимент подтверждает, что NES не связан с каррагинаном.

Пример 19: Carra/NES (доля высвободившегося NES)

Carra/NES

Для определения совместимости двух компонентов, растворы с увеличивающимися концентрациями NES вводят в композицию Κ-II/λ каррагинанов. При концентрации NES в композиции Κ-II/λ каррагинанов 500 мкг/мл реологические свойства состава сохраняются, что определяли по значению pH, вязкости, гомогенности и зрительному впечатлению, и композиция демонстрирует сохранение эффективности по данным анализа в системе HSV-2/мышь. Данная концентрация NES в 40 раз превышает концентрацию, которая согласно прогнозам требуется для состава с высокой дозировкой, а именно 100 пг/мл.

Диффузию NES из Carra/NES исследовали двумя различными способами, а именно мембранным диализом и центрифугированием с применением Ultrafree-15. В эксперименте по мембранному диализу пороговое значение молекулярной массы для мембраны составляло 1000, и диффузию NES измеряли с помощью ВЭЖХ. Результаты измерений показывают, что NES не связывается с отрицательно заряженным каррагинаном, и, хотя скорость диффузии через диализную мембрану отличается от скорости системной абсорбции in vivo, диффузия проходит зависимым от времени образом. В экспериментах по центрифугированию с применением Ultrafree-15 использовали сборку, состоящую из центрифужного фильтра Ultrafree-15 производства Millipore и центрифужной пробирки, которая пропускает молекулы, имеющие массу MW<500; Молекулярная масса NES (NES MW) составляет 370. При использовании этой методики из Carra/NES было выделено 98,6% NES.

Пример 20: Zn/каррагинан/MIV-150

Комбинацию наиболее предпочтительных каррагинанов по настоящему изобретению с ацетатом цинка в качестве водорастворимой соли металла и MIV-150 в качестве NNRTI сравнивали с комбинациями цинк/каррагинан (PC-707), MIV-150/каррагинан (PC-815) и каррагинаном (Carraguard®). В частности, когда животных подвергали пробному заражению SHIV-RT через 8 или 24 часа после введения последней дозы каждого из этих гелей, PC-707 и PC-815 в отдельности блокировали развитие вагинальной инфекции SHIV-RT почти на том же уровне, как и Carraguard ® (при значении p>0,05), в то время как PC-1005 в оба момента времени блокировал вагинальную инфекцию SHIV-RT лучше, чем оба упомянутых состава (при значении p<0,03). Таким образом, хотя PC-707 и PC-815 действительно в определенной степени блокировали вагинальную инфекцию SHIV-RT в период времени до 24 часов, нельзя было предположить, что комбинация ацетата цинка, каррагинанов и MIV-150 могла бы полностью блокировать развитие вагинальной инфекции SHIV-RT на период до 24 часов.

Использовалась следующая методика эксперимента:

В 700-мл стеклянный сосуд для смешивания помещают 1,5 грамма дигидрата ацетата цинка, 15,0 г каррагинанов (в данном случае использовали смесь 95% лямбда каррагинана и 5% каппа каррагинана) и 300,3 грамма очищенной стерильной воды. Содержимое перемешивают с помощью мешалки с верхним расположением при 300 об/мин в течение трех часов при комнатной температуре. Отдельно помещают в 250 мл колбу Эрленмейера 1,0 г метилпарабена и 150,9 г стерильной очищенной воды. Колбу Эрленмейера нагревают до 60°C при перемешивании до получения прозрачного раствора и содержимое колбы немедленно добавляют к смеси цинк-каррагинан-вода, содержащейся в 700-мл сосуде. Полученную смесь перемешивают в течение двух часов при комнатной температуре и после этого к содержимому 700-мл сосуда добавляют 5 мл заранее приготовленного раствора MIV-150/ДМСО, полученного растворением 18,5 мг MIV-150 в 10 мл диметилсульфоксида. Затем образовавшуюся смесь перемешивают при 300 об/мин в течение 35 минут при комнатной температуре и после этого в сосуд добавляют 26 г стерильной очищенной воды и перемешивают содержимое в течение 30 минут при комнатной температуре.

Макакам вводили с помощью инъекции, контрацептив длительного действия Depo-Provera и через 2 недели вводили по 2 мл геля, полученного, как описано выше, в течение 2 недель, после чего проводили пробное заражение 1000 TCID50 SHIV-RT в течение указанных выше сроков после последнего нанесения геля. Число инфицированных животных, приведенное ниже в таблице 1, отображает число животных с типичной виремией (копиями РНК SIV в плазме).

Таблица 1
Многократное нанесение PC-1005 защищает от вагинальной инфекции SHIV-RT в течение периода до 24 ч
Микробицид# Время после последнего прим.геля Число животных инфицир./общее Процент инфицир. Стат.значимость^
(величина p MC отн.тест.)
Стат.значимость^
(величина p носитель отн.тест.)
MC 4ч, 8ч, 24ч 12/14 85,71%
PC-1005 4 ч 0/7 0% <0,0003
Carraguard 8 ч 5/7 71,43 <0,6
PC-815 8 ч 2/7 28,57% <0,02 <0,3
PC-707 8 ч 1/7 14,29% <0,004 <0,2
Pc-1005 8 ч 0/7 0% <0,0003 <0,03
Carraguard 24 ч 4/7 57,1% <0,3
PC-815 24 ч 4/7 57,1% <0,3
PC-707 24 ч 2/7 28,57% <0,02 <0,3
Pc-1005 24 ч 0/7 0% <0,0003 <0,03
#MC=плацебо метилцеллюлоза; PC-707=Carraguard +0,3% ацетата цинка; PC-815=Carraguard+50мкМ MIV-150; PC-1005=Carraguard +0,3% ацетата цинка+50 мкМ MIV-150;
^ Вычислено с применением точных критериев Фишера

Список литературы

Хотя изобретение было описано в настоящей заявке с упоминанием конкретных вариантов осуществления, следует понимать, что эти варианты осуществления являются лишь иллюстрациями принципов и путей применения настоящего изобретения. Поэтому необходимо понимать, что эти иллюстративные варианты осуществления могут быть подвергнуты многочисленным модификациям, или может быть выработан другой порядок их сочетания, без отступления от сути настоящего изобретения и выхода за пределы его объема, которые определены приложенной формулой изобретения.

ПРОМЫШЛЕННАЯ ПРИМЕНИМОСТЬ

В настоящем изобретении разработаны антимикробные композиции, которые конкретно могут применяться для продолжительной антимикробной защиты у людей, предпочтительно для защиты женщин путем вагинального введения. Поэтому они особенно подходят для подавления передачи инфекций, передающихся половым путем.

1. Водная антимикробная композиция, содержащая эффективное количество антимикробного агента, содержащего каррагинаны, которые представляют собой лямбда каррагинан в количестве по меньшей мере приблизительно 50% сухой массы указанных каррагинанов, где остальная часть указанных каррагинанов является по меньшей мере одним не лямбда каррагинаном, а также физиологически приемлемую водорастворимую соль металла и антиретровирусный агент, выбранный из группы, состоящей из не нуклеозидных ингибиторов обратной транскриптазы и нуклеозидных ингибиторов обратной транскриптазы.

2. Антимикробная композиция по п.1, содержащая физиологически приемлемый агент, регулирующий pH.

3. Антимикробная композиция по п.1, содержащая физиологически приемлемый консервант.

4. Антимикробная композиция по п.2, где указанный физиологически приемлемый агент, регулирующий pH, выбирают из группы, состоящей из ацетатных, цитратных и лактатных буферов.

5. Антимикробная композиция по п.4, где указанный ацетатный буфер содержит смесь уксусной кислоты и ацетата натрия.

6. Антимикробная композиция по п.4, где указанный цитратный буфер содержит смесь лимонной кислоты и цитрата натрия.

7. Антимикробная композиция по п.4, где указанный лактатный буфер содержит смесь молочной кислоты и лактата натрия.

8. Антимикробная композиция по п.3, где указанный физиологически приемлемый консервант содержит метилпарабен.

9. Антимикробная композиция по п.1, где указанный антиретровирусный агент содержит не нуклеозидный ингибитор обратной транскриптазы.

10. Антимикробная композиция по п.9, где указанный не нуклеозидный ингибитор обратной транскриптазы содержит MIV-150.

11. Антимикробная композиция по п.10, где указанный MIV-150 присутствует в количествах от приблизительно 5 мкМ до 5000 мкМ.

12. Антимикробная композиция по п.11, где указанный MIV-150 присутствует в количествах от приблизительно 20 мкМ до 250 мкМ.

13. Антимикробная композиция по п.1, где указанное эффективное количество указанного антимикробного агента составляет от приблизительно 1% до приблизительно 5% от общей массы указанной композиции.

14. Антимикробная композиция по п.13, где указанное эффективное количество указанного антимикробного агента составляет приблизительно 3% от общей массы указанной композиции.

15. Антимикробная композиция по п.1, имеющая pH от приблизительно 3,5 до приблизительно 8,5.

16. Антимикробная композиция по п.15, где значение pH составляет от приблизительно 6,8 до приблизительно 7,2.

17. Антимикробная композиция по п.1, где указанный металл является цинком, медью или серебром.

18. Антимикробная композиция по п.17, где указанная соль металла представляет собой ацетат цинка.

19. Антимикробная композиция по п.17, где указанная соль металла представляет собой лактат цинка.

20. Антимикробная композиция по п.1, где указанная соль металла присутствует в количестве от приблизительно 0,03% до приблизительно 1,5% от общей массы указанной композиции.

21. Антимикробная композиция по п.20, где указанная соль металла присутствует в количестве от приблизительно 0,3% до приблизительно 1,0% от общей массы указанной композиции.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится преимущественно к ветеринарии и фармации, а именно к средствам для лечения мастита. Фармацевтическая композиция в форме мази для лечения мастита у коров, содержит н-тетрадецилтрибутилфосфоний бромид в качестве активного компонента и вазелин в качестве вспомогательного вещества при соотношении 1:2000. Изобретение обеспечивает новую по механизму действия, эффективную при местном применении при низкой терапевтической концентрации фармацевтическую композицию в форме мази.

Изобретение относится к индустрии фармацевтических средств. Лекарственное средство представляет собой раствор N,N´-диамино-дифенилсульфона в смеси растворителей: этанола и воды и по меньшей мере одного из растворителей, выбранных из группы, включающей пропиленгликоль, бензиловый спирт и гликофурол.

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к композиции для стимуляции иммунитета. Композиция для стимуляции иммунитета и/или усиления иммунной защиты включает комбинацию экстракта бузины и по меньшей мере один штамм Lactobacillus paracasei, Lactobacillus casei, Lactobacillus bulgaricus или Streptococcus thermophilus, взятые в определенном соотношении.

Изобретение относится к соединению формулы (I) в которой, каждый из R1 и R2 независимо выбран из группы, состоящей из атома водорода, нитро и NR6R7; R3 представляет собой C1-C8алкил; каждый из R4 и R5 независимо выбран из группы, состоящей из C1-C8алкокси, фенокси и фенил(C1-C8алкилен)окси; каждый из R6 и R7 независимо выбран из группы, состоящей из атома водорода, C1-C8алкила, C(O)R8 и SO2R8;R8 выбран из группы, состоящей из атома водорода, C1-C8алкила, галогензамещенного C1-C8-алкила, C1-C8-алкила, замещенного (C1-C8-алкилзамещенный амино), C1-C8-алкила, замещенного пиперидином и C1-C8-алкила, замещенного морфолином, которые могут быть использованы для снижения активности фермента PDE4 или для лечения заболеваний или состояний, опосредованных ферментом PDE4.6 н.и 15 з.п.

Настоящее изобретение относится к новым соединениям формулы (I) или их фармацевтически приемлемым солям, используемым для лечения или предупреждения расстройств, опосредуемых рецепторами витамина D, а также к фармацевтической композиции, содержащей данные соединения.

Изобретение относится к новым соединениям формулы I: цис-COOR-XCH-(СН2)a-СН=СН-(СН2)b-СН3, в которой (а) и (b) могут принимать любое значение от 0 до 14, (X) выбирают из: ОН, NH2, СН3, F, F3C, HS, O-СН3, PO4(СН2-СН3)2 и СН3СОО, и (R) представляет собой натрий (Na), применяемым для профилактики и/или терапевтического лечения ожирения, гипертензии и/или рака.
Изобретение относится к медицине и описывает применение 2'-фукозиллактозы для изготовления энтеральной композиции, причем указанная композиция не является женским молоком, для лечения и/или предупреждения вирусных инфекций, вызываемых orthomyxoviridae, в частности вируса гриппа, вируса герпеса, ротавируса, цитомегаловируса, респираторно-синцитиального вируса, вируса иммунодефицита человека и/или риновируса, а также описывает применение 2'-фукозиллактозы для изготовления энтеральной композиции для усиления реакции на вакцинацию, предпочтительно для усиления реакции на вакцинацию при вакцинации вирусным антигеном.

Предложена группа изобретений: фармацевтическая композиция, содержащая иммунологически активный энантиомер компонента катионного липида R-DOTAP или S-DOTAP, способ применения указанного энантиомера для вызова иммуностимулирующего адъювантного эффекта в иммунной системе, способ индукции иммунного ответа у пациента с его использованием и способ лечения или предотвращения заболевания у пациента путем индукции липидом иммуностимулирующего адъювантного эффекта.
Изобретение относится к области ветеринарной медицины, в частности к ветеринарному акушерству, и может быть использовано для лечения послеродового эндометрита у коров.

Изобретение относится к соединению формулы (VA-1), в котором WRW2 и WRW4 независимо выбирают из атома водорода, -CN, -CF3, галогена, линейного или разветвленного (C1-C6)алкила, 3-12-членной циклоалифатической группы или фенила, где WRW2 и WRW4 независимо и необязательно замещены, вплоть до трех, заместителями, выбранными из -OR′, -CF3, -OCF3, -SR′, -S(O)R′, -SO2R′, галогена, -CN, -COOR′, -(CH2)OR′, -CH2CN, фенила, феноксигруппы, -N(R′)(R′), -NR′C(O)OR′, -NR′C(O)R′, -(CH2)N(R′)(R′); WRW5 выбирают из группы, состоящей из атома водорода, -CN, -CHF2, -N(R′)2, -NHC(O)R′, -NHC(O)OR′, -NHSO2R′, -OR′, -CH2OH, -CH2N(R′)2, -C(O)OR′, -SO2NHR′, -SO2N(R′)2 или -CH2NHC(O)OR′; X означает связь; Rx означает атом водорода; R′ независимо выбирают из атома водорода, (C1-C8)алифатической группы, (C3-C8)циклоалкила или фенила.
Изобретение относится к области медицины, а именно к стоматологии. Способ консервативного лечения пародонтита включает наложение на ткани пародонта лечебной повязки, приготовленной на основе оксида цинка и сульфата цинка, при этом до наложения лечебной повязки производят многократную ирригацию тканей пародонта раствором бутола; лечебную повязку изготавливают путем добавления порошка оксида цинка и сульфата цинка в раствор бутола и смешиванием их до пастообразной консистенции; твердые ткани зубов с вестибулярной и оральной поверхностей в пришеечных областях покрывают турундой диаметром 1-4 мм, насыщенной раствором бутола; на ткани пародонта и твердые ткани зубов, покрытых турундой, насыщенной раствором бутола, накладывают лечебную повязку.
Изобретение относится к фармацевтической промышленности и представляет собой средство для профилактики и лечения простатита и аденомы предстательной железы в виде капсулы, которая содержит доксазозин, диизопропиламмоний дихлорацетат, афобазол, глицинат меди, витамин E (d-альфа токоферола ацетат), глицинат цинка; L-Глутамин; L-Аланин; L-Аргинин и наполнители: кукурузный крахмал и тальк.

Изобретение относится к антибактериальной композиции и предназначено для ухода за полостью рта. Антибактериальная композиция содержит антибактериальную систему, включающую 4-изопропил-3-метилфенол (IPMP), источник ионов цинка и С8-18 алкилсульфат щелочного металла, или С8-18алкиларилсульфонат щелочного металла, или их смесь и перорально приемлемый носитель или эксципиент.
Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности и представляет собой заменитель костного трансплантата, содержащий остеогенный агент и цеолит, содержащий частицы, содержащие ионообменные катионы металлов, присутствующие в количестве, эффективном для стимуляции остеогенеза у нуждающегося в этом пациента, в котором вышеуказанные катионы металлов выбраны из группы, состоящей из ионов цинка, ионов серебра, ионов меди и их комбинаций.
Изобретение относится к ветеринарии, в частности к веществам, используемым при лечении гнойно-некротических поражений дистальных отделов конечностей крупного рогатого скота, к которым относится пальцевый дерматит.
(57) Изобретение относится к области ветеринарии и предназначено для лечения пальцевого дерматита крупного рогатого скота. Способ включает применения препарата в виде мази следующего состава, масс.%: ветеринарный медный купорос 35 - 45, оксид цинка 9 - 11, мазевая основа -остальное.

Изобретение относится к гранулам в качестве слабительного средства, содержащим частицы оксида магния формулы (1) со средним диаметром вторичных частиц 0,1-25 мкм и кажущимся удельным объемом 3-20 мл/г.
Изобретение относится к средству наружной терапии для больных атопическим дерматитом. Средство включает цинк пиритона 0,2%, эмульгатор, эмолент - изопропилмиристат и растворитель.
Изобретение относится к медицине, а именно к урологии, и может быть использовано для лечения мужского бесплодия, обусловленного аутоиммунными реакциями против сперматозоидов.

Изобретение относится к применению смешанных соединений металлов для получения лекарственного средства, предназначенного для нейтрализации желудочной кислоты или буферного действия на нее, а также для лечения состояния или заболевания, связанного с высокими уровнями кислоты в желудке.
Изобретение относится к области микрокапсулирования, в частности к способу получения микрокапсул лекарственных препаратов группы цефалоспоринов. Способ характеризуется тем, что в качестве оболочки микрокапсул используется альбумин сывороточный человеческий, при этом к водному раствору альбумина добавляют порошок препарата группы цефалоспоринов в присутствии поверхностно-активного вещества, соотношение количества препарата группы цефалоспоринов к альбумину при пересчете на сухое вещество составляет от 1:1 до 3:1, полученную смесь перемешивают и приливают изопропанол в качестве первого осадителя, а затем ацетон в качестве второго осадителя, полученную суспензию микрокапсул фильтруют, промывают ацетоном, сушат в эксикаторе, процесс получения микрокапсул осуществляется при 25°C.
Наверх