Способ количественной оценки биопленкообразования микроорганизмов



Способ количественной оценки биопленкообразования микроорганизмов
Способ количественной оценки биопленкообразования микроорганизмов
Способ количественной оценки биопленкообразования микроорганизмов
Способ количественной оценки биопленкообразования микроорганизмов
Способ количественной оценки биопленкообразования микроорганизмов

 


Владельцы патента RU 2547935:

Бюджетное учреждение высшего образования Ханты-Мансийского автономного округа-Югры "Ханты-Мансийская государственная медицинская академия" (RU)
Общество с ограниченной ответственностью "Сибмедика" (RU)

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано для количественной оценки способности микроорганизмов к биопленкообразованию на различных биотических и абиотических поверхностях. Способ заключается в том, что в подготовленные для посева стерильные чашки Петри с питательным бульоном и двумя агаровыми пластинками вносят микробную взвесь. Чашки Петри с посевами инкубируют при 37°C. После инкубации пластинки с выросшей биопленкой вынимают из культуральной жидкости, отмывают стерильной дистиллированной водой от планктонных клеток и высушивают в термостате. Проводят замеры углов смачивания через 3 и 9 ч. По изменению краевого угла смачивания судят об удельной скорости образования биопленки. При этом рассчитывают удельную скорость биопленкообразования по формуле:

μ b = 1 t 2 t 1 l n ( θ 1 θ 2 ) , где µb - удельная скорость биопленкообразования, ч-1; t1 и t2 - продолжительность инкубации, ч (3 и 9 ч); θ1,2 - краевые углы смачивания (°), измеренные после инкубации в течение 3 и 9 ч. Изобретение позволяет ускорить и упростить процесс количественной оценки биопленкообразования микроорганизмов и повысить чувствительность метода. 3 табл.

 

Изобретение относится к области медицинской и промышленной микробиологии и может быть использовано для количественной оценки способности микроорганизмов к биопленкообразованию на различных биотических и абиотических поверхностях и может быть использовано в исследовательских целях и лабораторной диагностике для характеристики штаммов по их биологической активности.

Образование биопленок является одной из основных стратегий выживания бактерий в окружающей среде. Такой способ существования бактерий создает большие проблемы в промышленной деятельности человека и, что особенно важно, в медицинской практике. В настоящее время стало известно, что многие хронические инфекции, возникновение которых связано с использованием медицинского имплантируемого оборудования - линз, катетеров, протезов, искусственных клапанов сердца, - обусловлены способностью бактерий расти в виде биопленок на поверхности этих устройств [Ильина Т.С., Романова Ю.М., Гинцбург А.Л. Биопленки как способ существования бактерий в окружающей среде и организме хозяина: феномен, генетический контроль и системы регуляции их развития // Генетика. - 2004. - Т.40, №11. - С.1445-1456].

Большое значение для диагностики и профилактики биопленкообразования микроорганизмов имеет количественная оценка способности микроорганизма к образованию биопленки. Для количественной оценки биопленкообразования можно использовать различные методы.

Известен способ оценки биопленкообразования, согласно которому биопленку сначала выращивают на определенной поверхности в течение требуемого времени, соскабливают с подложки, суспендируют в физиологическом растворе и определяют количество микроорганизмов в биопленке [Тец В.Г. Роль внеклеточной ДНК и липидов матрикса во взаимодействии бактерий биопленок с антибиотиками // Автореферат диссертации канд. мед. наук. СПб.: С.-Петерб. государственный мед. акад. им. И.И. Мечникова 2007. - 22 с]. Основными недостатками известного способа являются: длительность процесса до 3-4 суток, высокий расход материалов, техническая сложность в получении однородного соскоба с поверхности и в целом высокая трудоемкость.

Известен способ оценки биопленкообразования, предложенный O′Toole G.A. с соавт. [O′Toole G.A., Kaplan H.B., Kolter R. Biofilm formation as microbial development // Ann. Rev. Microbiol. - 2000. - 54. - P.49-79]. Согласно этому способу микроорганизмы выращивают в лунках пластиковых планшетов, окрашивают и по изменению интенсивности окраски красителя судят о способности штамма к биопленкообразованию.

Существенным недостатком данного способа является ограничение по материалу подложки, на которой исследуют биопленкообразование - полистирол. Адсорбция красителя подложкой полистиролового планшета может приводить к получению завышенных результатов.

Наиболее близким к заявляемому способу по назначению и совокупности существенных признаков является способ, предложенный Леоновым В.В. (прототип) [Леонов В.В. Количественная оценка способности условно-патогенных микроорганизмов к образованию биопленки в эксперименте. // Клиническая лабораторная диагностика. - 2012. - №10. - С.57-59]. Согласно прототипу микроорганизмы выращивают в бульоне на стеклянной подложке в течение 24-48 ч и по изменению краевого угла смачивания поверхности биопленки вазелиновым маслом проводят определение удельной скорости биопленкообразования штамма исследуемого микроорганизма графическим способом.

Основной признак заявляемого изобретения, общий с прототипом: использование в качестве критерия оценки процесса образования биопленки удельной скорости, определяемой по изменению краевого угла смачивания ее поверхности вазелиновым маслом.

Недостатками способа прототипа являются: высокая трудоемкость, длительность свыше 24 ч и низкая чувствительность, связанная с использованием в качестве подложки, на которой исследуется биопленкообразование микроорганизмов, стекла.

Основными отличиями от прототипа, обеспечивающими получение заявляемого технического результата, являются использование в качестве материала подложки агаровой пластинки, измерение краевого угла смачивания поверхности биопленки через 3 и 9 ч инкубации и расчет удельной скорости биопленкообразования проводят по формуле (2).

Заявляемый способ решает задачи по ускорению и упрощению количественной оценки процесса биопленкообразования, а использование в качестве материала подложки агаровой пластинки позволяет увеличить чувствительность и проводить дифференциальную оценку биопленкообразования между штаммами микроорганизмов, хорошо образующими биопленку, например Pseudomonas aeruginosa.

Сущность предлагаемого изобретения заключается в том, что на агаровую пластинку с выросшей биопленкой наносят каплю вазелинового масла и с помощью горизонтального отсчетного микроскопа определяют краевой угол смачивания ее поверхности. Способность микроорганизма к образованию биопленки оценивают по изменению краевого угла смачивания поверхности биопленки в процессе культивирования, рассчитывая удельную скорость биопленкообразования.

Краевой угол смачивания в зависимости от размера капли рассчитывают по следующей формуле:

где θ - краевой угол смачивания (°);

h, l - высота и длина капли (мм) соответственно.

Удельную скорость биопленкообразования рассчитывают по следующей формуле:

где µb - удельная скорость биопленкообразования, ч-1;

t1 и t2 - продолжительность инкубации, ч (3 и 9 ч);

θ1,2 - краевые углы смачивания (°), измеренные после инкубации в течение 3 и 9 ч.

Примеры 1-5. В стерильные чашки Петри (D=90 мм) с 10 мл питательного бульона МПБ (НПО «Питательные среды», Махачкала) и двумя из агаровыми пластинками (Difco) размером 2,5×2,5 см вносят 0,1 мл микробной взвеси Pseudomonas aeruginosa, стандартизованной до оптической плотности 0,100-0,110 опт. ед. (Specord). Чашки Петри с посевами инкубируют при 37°C. После инкубации пластинки с выросшей биопленкой вынимают из культуральной жидкости и отмывают 10 мл стерильной дистиллированной воды от планктонных клеток и 15 мин высушивают в термостате при 37°C. Образование биопленки оценивают по изменению краевого угла смачивания поверхности биопленки вазелиновым маслом. Замеры проводят через 3 и 9 ч инкубации с помощью горизонтального отсчетного микроскопа марки МПБ-2 в герметичной кювете, которая позволяет рассматривать анализируемый объект в условиях равновесия.

Для одного из исследованных штаммов были получены следующие значения: h(3,0 ч)=2,0 мм; l(3 ч)=7,0 мм; h(9 ч)=1,4 мм; l(9 ч)=7,0 мм.

По изменению краевого угла смачивания судили об удельной скорости образования биопленки.

1. Расчет угла смачивания по формуле (1):

2. Расчет удельной скорости биопленкообразования по формуле (2):

Результаты эксперимента приведены в табл.1.

Как видно из данных таблицы 1, с помощью заявляемого способа получены достоверные отличия по биопленкообразованию между разными штаммами и группами микроорганизмов, а величину удельной скорости биопленкообразования, определенную данным способом, можно использовать для количественной оценки способности штамма к биопленкообразованию.

Примеры 6-8. Для сравнения чувствительности определения биопленкообразования известным способом и заявляемым были отобраны 3 штамма Pseudomonas aeruginosa с одинаковой способностью к биопленкообразованию, определенной способом-прототипом. Величина признака удельной скорости биопленкообразования составляла (5,6±0,4)·102, ч-1. Таким образом, при определении удельной скорости биопленкообразования у данных штаммов, заявляемым способом были получены достоверные отличия по биопленкообразованию (табл.2).

Полученные результаты показывают более высокую чувствительность заявляемого способа по сравнению со способом-прототипом.

Примеры 9-13 проведены в условиях, аналогичных примеру 6, но с использованием в качестве исследуемого микроорганизма Staphylococcus aureus (табл.3).

Как видно при сравнении данных таблиц 1 и 3, заявляемый способ позволяет получить статистически достоверные отличия в значениях удельной скорости биопленкообразования микроорганизмов уже через 9 ч инкубации. Использование в качестве материала подложки агара позволяет выявить различия в биопленкообразовании не только между разными группами, но и штаммами микроорганизмов.

Технический результат: изобретение позволяет ускорить и упростить процесс количественной оценки биопленкообразования микроорганизмов, повышает чувствительность метода, позволяет проводить дифференциальную оценку биопленкообразования между штаммами микроорганизмов, хорошо образующими биопленку.

Таблицы

Таблица 1
Биопленкообразование Pseudomonas aeruginosa
Пример Штамм µb·102, ч-1
1 27853 АТСС (5,6±0,4)
2 5070 (5,2±0,2)
3 2364 (5,6±0,3)
4 4922 (4,9±0,2)
5 2898 (5,0±0,2)
Таблица 2
Сравнительный анализ чувствительности количественной оценки биопленкообразования Pseudomonas aeruginosa с использованием заявляемого способа и способа-прототипа
Пример Штамм Биопленкообразование
Способ-прототип Заявляемый способ (µb·102, ч-1)
6 27853 АТСС (5,6±0,4) (5,6±0,4)
7 5070 (5,6±0,2) (5,0±0,2)
8 2898 (5,6±0,2) (4,8±0,1)
Таблица 3
Биопленкообразование Staphylococcus aureus
Пример Вид и штамм µb·102, ч-1
9 25923 АТСС (3,9±0,1)
10 2891 (2,7±0,1)
11 391 (5,0±0,2)
12 2888 (3,5±0,3)
13 352 (5,9±0,6)

Способ количественной оценки биопленкообразования микроорганизмов, заключающийся в том, что на подложку с выросшей биопленкой наносят каплю вазелинового масла, с помощью горизонтального отсчетного микроскопа измеряют краевой угол смачивания ее поверхности, отличающийся тем, что в качестве материала подложки используют агаровые пластинки и замеры угла смачивания проводят через 3 и 9 ч культивирования микроорганизмов, а удельную скорость биопленкообразования (µb) рассчитывают по формуле:
,
где µb - удельная скорость биопленкообразования, ч-1;
t1 и t2 - продолжительность инкубации, ч;
θ1,2 - краевые углы смачивания (°), измеренные после инкубации в течение 3 и 9 ч.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к гироскопическим устройствам. Может быть преимущественно использовано для исследования поверхностных явлений смачивания и растекания при нагреве в вакууме и инертной или активной газовых средах. Самогоризонтируемое устройство включает корпус 1, выполненный из керамики, молибдена или стали, в верхней части которого установлен промежуточный элемент 2, выполненный из такого же материала, что и корпус 1 или отличающийся от него, закрепленный двумя стержнями 3 к стенке корпуса 1, самогоризонтируемый столик 4, выполненный из такого же материала, что и корпус 1 или отличающийся от него, в нижней части которого расположен массивный груз 5, который может быть выполнен съемным и соединяться через соединительный стержень 6; самогоризонтируемый столик 4 закреплен двумя стержнями 7 в промежуточном элементе 2, причем стержни 3 и 7 расположены взаимно - перпендикулярно друг другу.

Изобретение относится к области поверхностных явлений и может быть использовано для оценки свойств жидкостей, различных поверхностей и свойств веществ в разных отраслях промышленности и в том числе в нанотехнологиях и порошковой металлургии.

Изобретение относится к измерительной технике и может быть использовано при исследовании процессов массопереноса в капиллярно-пористых материалах для определения коэффициентов диффузии влаги в строительных материалах и конструкциях, а также в пищевой, химической и других отраслях промышленности.

Изобретение относится к способам определения аэрационной способности пенообразователей, используемых в технологии пенобетонов, и может быть использовано для оценки эффективности использования пенообразующих добавок, корректировки рецептуры пенобетонных смесей. Способ определения аэрационного потенциала пенообразователей, используемых в технологии пенобетонов, включает приготовление рабочего раствора пенообразователя, измерение температуры рабочего раствора пенообразователя и приготовление пены.

Изобретение относится к области оценки свойств дисперсных материалов и может быть использовано для разработки энергетических нанотехнологий в разных отраслях промышленности и областях знаний, а также для разработки и управления самоорганизующихся систем, открывает возможности для изучения новых принципов построения технических устройств.

Изобретение относится к области определения физико-химических свойств поверхностей и может быть использовано для оценки степени гидрофильности хвои, предварительно обработанной водяным паром.

Изобретение относится к области исследования свойств взаимодействия поверхности с флюидами и может быть использовано для определения теплоты адсорбции и смачивания поверхности.

Изобретение относится к области исследования характеристик порошковых материалов, в частности их смачиваемости. Целью изобретения является разработка более точного способа определения смачиваемости порошков.

Изобретения относятся к области определения значений параметров, характеризующих физико-химические свойства материалов, например коэффициентов диффузии, по величине электропроводности, и могут найти применение в порошковой металлургии, в изучении процессов самораспространяющегося высокотемпературного синтеза, в материаловедении и физике твердого тела.

Изобретение относится к методам металлографического анализа образцов стали и определения трехмерной топографии поверхности и ее структуры при помощи сканирующей зондовой микроскопии (СЗМ).

Изобретение относится к области медицины, фтизиатрии и медицинской микробиологии и касается способа генотипирования штаммов Mycobacterium tuberculosis. Охарактеризованный способ основан на однонуклеотидном полиморфизме генов систем токсин-антитоксин II типа суперсемейств VapBC, HigAB и MazEF и характеризуется тем, что для идентификации проводят амплификацию с геномной ДНК с использованием набора олигонуклеотидных праймеров для 10 генов систем токсин-анатоксин.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способам определения активности веществ, обладающих способностью встраиваться в биологические мембраны клеточных стенок с нарушением функционирования клеток.

Группа изобретений относится к биотехнологии и сельскому хозяйству. Предложены соединения A-87774, представленные соединениями A-87774-1, A-87774-2, A-87774-3 или их солью, способ получения соединений A-87774, штамм Streptomyces sp.

Изобретение относится к области сельскохозяйственной микробиологии и может быть использовано для получения биопрепаратов. Штамм Serratia ficaria TP депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ) под регистрационным номером ВКПМ В-11403 и обладает выраженными антагонистическими, фитостимулирующими и фунгицидными свойствами по отношению к фитопатогенным грибам.
Изобретение относится к биотехнологии и медицине, в частности, может быть использовано для сорбции аэробных микроорганизмов при изготовлении стерильных растворов, очистке воды или нефтезагрязненных почв, а также при лечении различных ран.
Изобретение относится к области полезных для здоровья композиций и способу их получения. Способ получения композиции неживой лактобациллы, обладающей способностью специфического связывания со Streptococcus mutans, включает следующие стадии: нагревание суспензии клеток лактобациллы или смеси лактобацилл, обладающих способностью специфического связывания со Streptococcus mutans, с исходной температуры ниже 40°C до температуры пастеризации от 75 до 85°C с изменением температуры от 0,5 до 2°C/мин, удерживание нагретой суспензии при температуре пастеризации в течение от 20 до 40 минут и охлаждение суспензии до конечной температуры ниже 40°C с изменением температуры от 0,5 до 2°C/мин.

Группа изобретений касается способа улучшения показателей роста животного и композиции, используемой в таком способе. Охарактеризованный способ включает введение животному, не являющемуся насекомым или человеком, эффективного количества композиции, включающей Bacillus subtilis QST713, с кормом или питьевой водой.
Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен способ очистки сточных вод.

Изобретение относится к биотехнологии и к сельскохозяйственной микробиологии. Способ предусматривает предпосевную обработку семян, пролив почвы и обработку вегетативных частей растений культуральной жидкостью штамма Lactobacillus plantarum 60-ДЕП, депонированного во Всероссийской государственной коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве, с титром 106 KOE/мл при расходе 5-30 мл на 100 мл воды.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для очистки промышленных сточных вод машиностроительных, приборостроительных, электротехнических предприятий от повышенных концентраций ионов меди и других тяжелых металлов.
Изобретение относится к области микробиологического анализа воздуха. Предложен способ микробиологического анализа воздуха.
Наверх