Способ количественной оценки биопленкообразования микроорганизмов

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано для количественной оценки способности микроорганизмов к биопленкообразованию на различных биотических и абиотических поверхностях. Способ заключается в том, что в подготовленные для посева стерильные чашки Петри с питательным бульоном и двумя агаровыми пластинками вносят микробную взвесь. Чашки Петри с посевами инкубируют при 37°C. После инкубации пластинки с выросшей биопленкой вынимают из культуральной жидкости, отмывают стерильной дистиллированной водой от планктонных клеток и высушивают в термостате. Проводят замеры углов смачивания через 3 и 9 ч. По изменению краевого угла смачивания судят об удельной скорости образования биопленки. При этом рассчитывают удельную скорость биопленкообразования по формуле:

μ b = 1 t 2 t 1 l n ( θ 1 θ 2 ) , где µb - удельная скорость биопленкообразования, ч-1; t1 и t2 - продолжительность инкубации, ч (3 и 9 ч); θ1,2 - краевые углы смачивания (°), измеренные после инкубации в течение 3 и 9 ч. Изобретение позволяет ускорить и упростить процесс количественной оценки биопленкообразования микроорганизмов и повысить чувствительность метода. 3 табл.

 

Изобретение относится к области медицинской и промышленной микробиологии и может быть использовано для количественной оценки способности микроорганизмов к биопленкообразованию на различных биотических и абиотических поверхностях и может быть использовано в исследовательских целях и лабораторной диагностике для характеристики штаммов по их биологической активности.

Образование биопленок является одной из основных стратегий выживания бактерий в окружающей среде. Такой способ существования бактерий создает большие проблемы в промышленной деятельности человека и, что особенно важно, в медицинской практике. В настоящее время стало известно, что многие хронические инфекции, возникновение которых связано с использованием медицинского имплантируемого оборудования - линз, катетеров, протезов, искусственных клапанов сердца, - обусловлены способностью бактерий расти в виде биопленок на поверхности этих устройств [Ильина Т.С., Романова Ю.М., Гинцбург А.Л. Биопленки как способ существования бактерий в окружающей среде и организме хозяина: феномен, генетический контроль и системы регуляции их развития // Генетика. - 2004. - Т.40, №11. - С.1445-1456].

Большое значение для диагностики и профилактики биопленкообразования микроорганизмов имеет количественная оценка способности микроорганизма к образованию биопленки. Для количественной оценки биопленкообразования можно использовать различные методы.

Известен способ оценки биопленкообразования, согласно которому биопленку сначала выращивают на определенной поверхности в течение требуемого времени, соскабливают с подложки, суспендируют в физиологическом растворе и определяют количество микроорганизмов в биопленке [Тец В.Г. Роль внеклеточной ДНК и липидов матрикса во взаимодействии бактерий биопленок с антибиотиками // Автореферат диссертации канд. мед. наук. СПб.: С.-Петерб. государственный мед. акад. им. И.И. Мечникова 2007. - 22 с]. Основными недостатками известного способа являются: длительность процесса до 3-4 суток, высокий расход материалов, техническая сложность в получении однородного соскоба с поверхности и в целом высокая трудоемкость.

Известен способ оценки биопленкообразования, предложенный O′Toole G.A. с соавт. [O′Toole G.A., Kaplan H.B., Kolter R. Biofilm formation as microbial development // Ann. Rev. Microbiol. - 2000. - 54. - P.49-79]. Согласно этому способу микроорганизмы выращивают в лунках пластиковых планшетов, окрашивают и по изменению интенсивности окраски красителя судят о способности штамма к биопленкообразованию.

Существенным недостатком данного способа является ограничение по материалу подложки, на которой исследуют биопленкообразование - полистирол. Адсорбция красителя подложкой полистиролового планшета может приводить к получению завышенных результатов.

Наиболее близким к заявляемому способу по назначению и совокупности существенных признаков является способ, предложенный Леоновым В.В. (прототип) [Леонов В.В. Количественная оценка способности условно-патогенных микроорганизмов к образованию биопленки в эксперименте. // Клиническая лабораторная диагностика. - 2012. - №10. - С.57-59]. Согласно прототипу микроорганизмы выращивают в бульоне на стеклянной подложке в течение 24-48 ч и по изменению краевого угла смачивания поверхности биопленки вазелиновым маслом проводят определение удельной скорости биопленкообразования штамма исследуемого микроорганизма графическим способом.

Основной признак заявляемого изобретения, общий с прототипом: использование в качестве критерия оценки процесса образования биопленки удельной скорости, определяемой по изменению краевого угла смачивания ее поверхности вазелиновым маслом.

Недостатками способа прототипа являются: высокая трудоемкость, длительность свыше 24 ч и низкая чувствительность, связанная с использованием в качестве подложки, на которой исследуется биопленкообразование микроорганизмов, стекла.

Основными отличиями от прототипа, обеспечивающими получение заявляемого технического результата, являются использование в качестве материала подложки агаровой пластинки, измерение краевого угла смачивания поверхности биопленки через 3 и 9 ч инкубации и расчет удельной скорости биопленкообразования проводят по формуле (2).

Заявляемый способ решает задачи по ускорению и упрощению количественной оценки процесса биопленкообразования, а использование в качестве материала подложки агаровой пластинки позволяет увеличить чувствительность и проводить дифференциальную оценку биопленкообразования между штаммами микроорганизмов, хорошо образующими биопленку, например Pseudomonas aeruginosa.

Сущность предлагаемого изобретения заключается в том, что на агаровую пластинку с выросшей биопленкой наносят каплю вазелинового масла и с помощью горизонтального отсчетного микроскопа определяют краевой угол смачивания ее поверхности. Способность микроорганизма к образованию биопленки оценивают по изменению краевого угла смачивания поверхности биопленки в процессе культивирования, рассчитывая удельную скорость биопленкообразования.

Краевой угол смачивания в зависимости от размера капли рассчитывают по следующей формуле:

где θ - краевой угол смачивания (°);

h, l - высота и длина капли (мм) соответственно.

Удельную скорость биопленкообразования рассчитывают по следующей формуле:

где µb - удельная скорость биопленкообразования, ч-1;

t1 и t2 - продолжительность инкубации, ч (3 и 9 ч);

θ1,2 - краевые углы смачивания (°), измеренные после инкубации в течение 3 и 9 ч.

Примеры 1-5. В стерильные чашки Петри (D=90 мм) с 10 мл питательного бульона МПБ (НПО «Питательные среды», Махачкала) и двумя из агаровыми пластинками (Difco) размером 2,5×2,5 см вносят 0,1 мл микробной взвеси Pseudomonas aeruginosa, стандартизованной до оптической плотности 0,100-0,110 опт. ед. (Specord). Чашки Петри с посевами инкубируют при 37°C. После инкубации пластинки с выросшей биопленкой вынимают из культуральной жидкости и отмывают 10 мл стерильной дистиллированной воды от планктонных клеток и 15 мин высушивают в термостате при 37°C. Образование биопленки оценивают по изменению краевого угла смачивания поверхности биопленки вазелиновым маслом. Замеры проводят через 3 и 9 ч инкубации с помощью горизонтального отсчетного микроскопа марки МПБ-2 в герметичной кювете, которая позволяет рассматривать анализируемый объект в условиях равновесия.

Для одного из исследованных штаммов были получены следующие значения: h(3,0 ч)=2,0 мм; l(3 ч)=7,0 мм; h(9 ч)=1,4 мм; l(9 ч)=7,0 мм.

По изменению краевого угла смачивания судили об удельной скорости образования биопленки.

1. Расчет угла смачивания по формуле (1):

2. Расчет удельной скорости биопленкообразования по формуле (2):

Результаты эксперимента приведены в табл.1.

Как видно из данных таблицы 1, с помощью заявляемого способа получены достоверные отличия по биопленкообразованию между разными штаммами и группами микроорганизмов, а величину удельной скорости биопленкообразования, определенную данным способом, можно использовать для количественной оценки способности штамма к биопленкообразованию.

Примеры 6-8. Для сравнения чувствительности определения биопленкообразования известным способом и заявляемым были отобраны 3 штамма Pseudomonas aeruginosa с одинаковой способностью к биопленкообразованию, определенной способом-прототипом. Величина признака удельной скорости биопленкообразования составляла (5,6±0,4)·102, ч-1. Таким образом, при определении удельной скорости биопленкообразования у данных штаммов, заявляемым способом были получены достоверные отличия по биопленкообразованию (табл.2).

Полученные результаты показывают более высокую чувствительность заявляемого способа по сравнению со способом-прототипом.

Примеры 9-13 проведены в условиях, аналогичных примеру 6, но с использованием в качестве исследуемого микроорганизма Staphylococcus aureus (табл.3).

Как видно при сравнении данных таблиц 1 и 3, заявляемый способ позволяет получить статистически достоверные отличия в значениях удельной скорости биопленкообразования микроорганизмов уже через 9 ч инкубации. Использование в качестве материала подложки агара позволяет выявить различия в биопленкообразовании не только между разными группами, но и штаммами микроорганизмов.

Технический результат: изобретение позволяет ускорить и упростить процесс количественной оценки биопленкообразования микроорганизмов, повышает чувствительность метода, позволяет проводить дифференциальную оценку биопленкообразования между штаммами микроорганизмов, хорошо образующими биопленку.

Таблицы

Таблица 1
Биопленкообразование Pseudomonas aeruginosa
Пример Штамм µb·102, ч-1
1 27853 АТСС (5,6±0,4)
2 5070 (5,2±0,2)
3 2364 (5,6±0,3)
4 4922 (4,9±0,2)
5 2898 (5,0±0,2)
Таблица 2
Сравнительный анализ чувствительности количественной оценки биопленкообразования Pseudomonas aeruginosa с использованием заявляемого способа и способа-прототипа
Пример Штамм Биопленкообразование
Способ-прототип Заявляемый способ (µb·102, ч-1)
6 27853 АТСС (5,6±0,4) (5,6±0,4)
7 5070 (5,6±0,2) (5,0±0,2)
8 2898 (5,6±0,2) (4,8±0,1)
Таблица 3
Биопленкообразование Staphylococcus aureus
Пример Вид и штамм µb·102, ч-1
9 25923 АТСС (3,9±0,1)
10 2891 (2,7±0,1)
11 391 (5,0±0,2)
12 2888 (3,5±0,3)
13 352 (5,9±0,6)

Способ количественной оценки биопленкообразования микроорганизмов, заключающийся в том, что на подложку с выросшей биопленкой наносят каплю вазелинового масла, с помощью горизонтального отсчетного микроскопа измеряют краевой угол смачивания ее поверхности, отличающийся тем, что в качестве материала подложки используют агаровые пластинки и замеры угла смачивания проводят через 3 и 9 ч культивирования микроорганизмов, а удельную скорость биопленкообразования (µb) рассчитывают по формуле:
,
где µb - удельная скорость биопленкообразования, ч-1;
t1 и t2 - продолжительность инкубации, ч;
θ1,2 - краевые углы смачивания (°), измеренные после инкубации в течение 3 и 9 ч.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к гироскопическим устройствам. Может быть преимущественно использовано для исследования поверхностных явлений смачивания и растекания при нагреве в вакууме и инертной или активной газовых средах. Самогоризонтируемое устройство включает корпус 1, выполненный из керамики, молибдена или стали, в верхней части которого установлен промежуточный элемент 2, выполненный из такого же материала, что и корпус 1 или отличающийся от него, закрепленный двумя стержнями 3 к стенке корпуса 1, самогоризонтируемый столик 4, выполненный из такого же материала, что и корпус 1 или отличающийся от него, в нижней части которого расположен массивный груз 5, который может быть выполнен съемным и соединяться через соединительный стержень 6; самогоризонтируемый столик 4 закреплен двумя стержнями 7 в промежуточном элементе 2, причем стержни 3 и 7 расположены взаимно - перпендикулярно друг другу.

Изобретение относится к области поверхностных явлений и может быть использовано для оценки свойств жидкостей, различных поверхностей и свойств веществ в разных отраслях промышленности и в том числе в нанотехнологиях и порошковой металлургии.

Изобретение относится к измерительной технике и может быть использовано при исследовании процессов массопереноса в капиллярно-пористых материалах для определения коэффициентов диффузии влаги в строительных материалах и конструкциях, а также в пищевой, химической и других отраслях промышленности.

Изобретение относится к способам определения аэрационной способности пенообразователей, используемых в технологии пенобетонов, и может быть использовано для оценки эффективности использования пенообразующих добавок, корректировки рецептуры пенобетонных смесей. Способ определения аэрационного потенциала пенообразователей, используемых в технологии пенобетонов, включает приготовление рабочего раствора пенообразователя, измерение температуры рабочего раствора пенообразователя и приготовление пены.

Изобретение относится к области оценки свойств дисперсных материалов и может быть использовано для разработки энергетических нанотехнологий в разных отраслях промышленности и областях знаний, а также для разработки и управления самоорганизующихся систем, открывает возможности для изучения новых принципов построения технических устройств.

Изобретение относится к области определения физико-химических свойств поверхностей и может быть использовано для оценки степени гидрофильности хвои, предварительно обработанной водяным паром.

Изобретение относится к области исследования свойств взаимодействия поверхности с флюидами и может быть использовано для определения теплоты адсорбции и смачивания поверхности.

Изобретение относится к области исследования характеристик порошковых материалов, в частности их смачиваемости. Целью изобретения является разработка более точного способа определения смачиваемости порошков.

Изобретения относятся к области определения значений параметров, характеризующих физико-химические свойства материалов, например коэффициентов диффузии, по величине электропроводности, и могут найти применение в порошковой металлургии, в изучении процессов самораспространяющегося высокотемпературного синтеза, в материаловедении и физике твердого тела.

Изобретение относится к методам металлографического анализа образцов стали и определения трехмерной топографии поверхности и ее структуры при помощи сканирующей зондовой микроскопии (СЗМ).

Изобретение относится к области медицины, фтизиатрии и медицинской микробиологии и касается способа генотипирования штаммов Mycobacterium tuberculosis. Охарактеризованный способ основан на однонуклеотидном полиморфизме генов систем токсин-антитоксин II типа суперсемейств VapBC, HigAB и MazEF и характеризуется тем, что для идентификации проводят амплификацию с геномной ДНК с использованием набора олигонуклеотидных праймеров для 10 генов систем токсин-анатоксин.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способам определения активности веществ, обладающих способностью встраиваться в биологические мембраны клеточных стенок с нарушением функционирования клеток.

Группа изобретений относится к биотехнологии и сельскому хозяйству. Предложены соединения A-87774, представленные соединениями A-87774-1, A-87774-2, A-87774-3 или их солью, способ получения соединений A-87774, штамм Streptomyces sp.

Изобретение относится к области сельскохозяйственной микробиологии и может быть использовано для получения биопрепаратов. Штамм Serratia ficaria TP депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ) под регистрационным номером ВКПМ В-11403 и обладает выраженными антагонистическими, фитостимулирующими и фунгицидными свойствами по отношению к фитопатогенным грибам.
Изобретение относится к биотехнологии и медицине, в частности, может быть использовано для сорбции аэробных микроорганизмов при изготовлении стерильных растворов, очистке воды или нефтезагрязненных почв, а также при лечении различных ран.
Изобретение относится к области полезных для здоровья композиций и способу их получения. Способ получения композиции неживой лактобациллы, обладающей способностью специфического связывания со Streptococcus mutans, включает следующие стадии: нагревание суспензии клеток лактобациллы или смеси лактобацилл, обладающих способностью специфического связывания со Streptococcus mutans, с исходной температуры ниже 40°C до температуры пастеризации от 75 до 85°C с изменением температуры от 0,5 до 2°C/мин, удерживание нагретой суспензии при температуре пастеризации в течение от 20 до 40 минут и охлаждение суспензии до конечной температуры ниже 40°C с изменением температуры от 0,5 до 2°C/мин.

Группа изобретений касается способа улучшения показателей роста животного и композиции, используемой в таком способе. Охарактеризованный способ включает введение животному, не являющемуся насекомым или человеком, эффективного количества композиции, включающей Bacillus subtilis QST713, с кормом или питьевой водой.
Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен способ очистки сточных вод.

Изобретение относится к биотехнологии и к сельскохозяйственной микробиологии. Способ предусматривает предпосевную обработку семян, пролив почвы и обработку вегетативных частей растений культуральной жидкостью штамма Lactobacillus plantarum 60-ДЕП, депонированного во Всероссийской государственной коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве, с титром 106 KOE/мл при расходе 5-30 мл на 100 мл воды.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для очистки промышленных сточных вод машиностроительных, приборостроительных, электротехнических предприятий от повышенных концентраций ионов меди и других тяжелых металлов.
Изобретение относится к области микробиологического анализа воздуха. Предложен способ микробиологического анализа воздуха.

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано для количественной оценки способности микроорганизмов к биопленкообразованию на различных биотических и абиотических поверхностях. Способ заключается в том, что в подготовленные для посева стерильные чашки Петри с питательным бульоном и двумя агаровыми пластинками вносят микробную взвесь. Чашки Петри с посевами инкубируют при 37°C. После инкубации пластинки с выросшей биопленкой вынимают из культуральной жидкости, отмывают стерильной дистиллированной водой от планктонных клеток и высушивают в термостате. Проводят замеры углов смачивания через 3 и 9 ч. По изменению краевого угла смачивания судят об удельной скорости образования биопленки. При этом рассчитывают удельную скорость биопленкообразования по формуле:μb1t2−t1ln, где µb - удельная скорость биопленкообразования, ч-1; t1 и t2 - продолжительность инкубации, ч ; θ1,2 - краевые углы смачивания, измеренные после инкубации в течение 3 и 9 ч. Изобретение позволяет ускорить и упростить процесс количественной оценки биопленкообразования микроорганизмов и повысить чувствительность метода. 3 табл.

Наверх