Олигонуклеотидные праймеры и способ выявления днк mycobacterium avium методом полимеразной цепной реакции


 


Владельцы патента RU 2554842:

Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока" (ФГБНУ ИЭВСиДВ) (RU)

Изобретения относятся к области биотехнологии и касаются олигонуклеотидных праймеров и способа выявления ДНК Mycobacterium avium с их использованием. Охарактеризованные олигонуклеотидные праймеры комплементарны специфичной области mig-гена Mycobacterium avium и имеют следующий нуклеотидный состав:

5'-CGT CAA AAG CGA ACT GCA-3' и 5'-ТАА ТТС GTT GCC CGA СТС-3'.

Способ выявления ДНК Mycobacterium avium выключает выделение ДНК, проведение амплификации ДНК с использованием олигонуклеотидных праймеров, перенос продукта амплификации на гель с последующим детектированием результатов анализа на трансиллюминаторе. В случае положительной реакции синтезируется фрагмент, соответствующий размеру 157 п.н. Представленные изобретения могут использоваться в ветеринарных диагностических и научно-практических лабораториях для выявления генетического материала Mycobacterium avium в пробах. 2 н.п. ф-лы, 1 ил., 4 пр.

 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к идентификации микобактерий с помощью полимеразной цепной реакции, и может использоваться в ветеринарных диагностических и научно-практических лабораториях для выявления генетического материала Mycobacterium avium в пробах.

Быстрое и надежное выявление клинически значимых микобактерий и установление их молекулярно-генетических особенностей является чрезвычайно актуальной задачей для диагностических медицинских и ветеринарных лабораторий.

Известны синтетические олигонуклеотидные праймеры, использующиеся для выявления ДНК Mycobacterium avium (Johansen T.B., В. Djonne, M.R. Jensen, I. Olsen, 2005. Distribution of IS1311 and IS1245 in Mycobacterium avium subspecies revisited. J. Clin. Microbiol. 43: 2500-2502; G.P.S. Jadaun, P. Upadhyay, Z. Ahmed, R. Das, D. Parashar et al. Utility of IS1245 - IS1311 based PCR typing system for Mycobacterium avium isolates obtained from clinical and environmental sources // Journal of Bacteriology Research. - 2010. - V.2(1), pp.005-008).

Однако данные тест-системы, как правило, анализируют образец в режиме реального времени (Real-Time PCR), что делает дороже проведение анализа, и направлены на обнаружение фрагментов генов, свойственных не только для M.avium, но и других представителей семейства MAC.

Прототипом данного изобретения являются праймеры и способ выявления ДНК M.avium, основанный на полимеразной цепной реакции (ПЦР), включающий выделение ДНК M.avium, синтез олигонуклеотидных праймеров на фрагмент mig-гена и инсерционную последовательность IS1245, амплификацию ДНК и идентификацию продуктов ПНР с помощью электрофореза в 1,5% агарозном геле (Beggs M.L., Stevanova R., Eisenach K.D. Species identification of Mycobacterium avium complex isolates by a variety of molecular techniques. - J. Clin. Microbiol. - 2000. - p.508-512. - Vol.38, - №2).

Однако инсерционная последовательность IS 1245 не является высокоспецифичной для изолятов M.avium и обнаруживается не во всех образцах. При этом IS1245 часто идентифицируют в изолятах M.intracellulare, что затрудняет дифференциацию этих двух представителей M.avium complex. Также недостатком данных наборов праймеров является то, что они разработаны на основе структуры ДНК изолятов Mycobacterium avium, циркулирующих за пределами России и отличающихся по строению генома от российских изолятов, что может снижать их эффективность при выявлении генетического материала Mycobacterium avium на указанной территории.

Задача изобретения заключается в расширении способов выявления Mycobacterium avium в исследуемом материале с использованием олигонуклеотидных праймеров, созданных на основе микобактерий, циркулирующих на территории России с учетом строения специфических фрагментов генома российских изолятов.

Поставленная задача решается тем, что синтезируются олигонуклеотидные праймеры с высокой степенью специфичности, комплементарные характерной для M.avium области mig-гена и использующиеся для выявления ДНК М. avium, имеющие следующий нуклеотидный состав: 5'-CGT CAA AAG CGA ACT GCA-3' и 5'-ТАА ТТС GTT GCC CGA CTC-3'.

Задача решается также тем, что в способе выявления ДНК Mycobacterium avium методом полимеразной цепной реакции (ПЦР), включающем выделение ДНК, амплификацию ДНК на олигонуклеотидных праймерах, перенос продукта амплификации на гель и оценку проведения реакции, согласно изобретению праймеры имеют нуклеотидные последовательности (MAVaF: 5'-CGT CAA AAG CGA ACT GCA-3') и (MAVaR: 5'-TAA ТТС GTT GCC CGA CTC-3'), в случае положительной реакции синтезируется фрагмент, соответствующий размеру 157 п.н.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами:

Пример 1. Получение олигонуклеоидных праймеров. Получение праймеров осуществляют на основе известных последовательностей штаммов Mycobacterium avium, полученных при секвенировании сибирских штаммов и представленных в базе данных GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/GenbankOverview.html), при помощи программного обеспечения «Lasergen». Полученные последовательности нескольких пар праймеров тестируют на специфичность с помощью моделирования ПЦР в программе «Vector NTI Suit».

В результате выбраны олигонуклеотидные праймеры (MAVaF: 5'-CGT САА AAG CGA ACT GCA-3') и (MAVaR: 5'-TAA TTC GTT GCC CGA CTC-3'), специфичные для M.avium.

Химический синтез праймеров осуществляется по нашему заказу в ООО «Лаборатория Медиген», там же определяется концентрация олигонуклеотидов в маточном растворе.

Пример 2. Выделение ДНК и постановка ПЦР. ДНК M.avium выделяют с использованием набора ДНК-сорб-В (ЦНИИЭ) согласно прилагаемой инструкции. Отработку условий амплификации для данной пары праймеров проводят с использованием музейных штаммов М. avium, задепонированных в Коллекции культур бактерий, бактериофагов и грибов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор», выбирая режим, наиболее полно отвечающий требованиям эксперимента. Режим амплификации включает в себя: отработку времени денатурации при 95°C - 30 сек - 1 мин, температуру отжига праймеров 54°C, 58°C, 59°C, 60°C, 61°C, концентрацию ионов Mg2+ - от 0,8 до 2,5 mM, время циклов каждой стадии амплификации от 30 сек до 1 мин и количество циклов от 30 до 40. Критерием правильности выбранного режима для каждого этапа проводимой реакции служит показательность результата - наличие или отсутствие искомого фрагмента ДНК определенного размера на электрофореграмме.

Для ПЦР применяют готовую ПЦР-смесь GenPack PCR Universal, a также готовят инкубационную смесь конечным объемом 50 мкл, которая содержит 10 мМ Mg-буфер, 10 мМ dNTP, 2 мкл праймеров, 5 мкл ДНК-матрицы, 1 ед. ДНК-полимеразы, оставшийся объем воды. Поверх смеси наслаивают 25 мкл минерального масла. В качестве матрицы используют ДИК штаммов M.avium, выделенную из биоматериала зараженных животных и из музейных культур, задепонированных в Коллекции культур бактерий, бактериофагов и грибов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» под регистрационными номерами В-1254, В-1255, В-1256, В-1257, В-1258, В-1259. Для определения специфичности выбранной пары праймеров используют ДНК родственных видов микобактерий и микроорганизмов других родов. Для идентификации ДНК M.avium используют праймеры (MAVaF) и (MAVaR), гомологичные участку mig-гена M.avium. Выбран следующий режим амплификации с использованием отечественного амплификатора «Терцик»: денатурация при 95°C - 30 секунд, затем 40 циклов, каждый из которых состоял из денатурации при 94°C - 30 секунд, отжига при 54°C - 30 секунд, синтеза при 72°C - 30 секунд и 1 цикл досинтеза при 72°C в течение 10 минут. Продукты ПЦР анализируют в 2% агарозном геле, с нанесением в лунки 6 мкл амплификата. Электрофорез проводят в течение 1 часа 15 минут при напряжении 220 В.

Пример 3. Специфичность пары праймеров. Для оценки специфичности предложенных праймеров используют штаммы Staphylocococcus albus, Citrobacter frendii, Escherichia coli, Mycobacterium terrae, Mycobacterium arupense, Mycobacterium avium. Проводят ПЦР с пробами указанных штаммов. При анализе продуктов амплификации с помощью электрофореза в агарозном геле определяют наличие ампликонов размером 157 п.н. или их отсутствие (фиг.1). Устанавливают, что праймеры MAVaF и MAVaR амплифицируют фрагменты генома искомого размера только при работе с Mycobacterium avium и не дают положительной или неспецифической реакции при анализе ДНК бактерий других родов и с родственными видами микроорганизмов. ПНР проводили в условиях, описанных в 2 примере.

Пример 4. Определение размера продуктов ПЦР. Для электрофореза использовали 6 мкл амплификата. Маркер молекулярной массы состоит из продуктов расщепления ДИК плазмиды pBluescript II SK рестриктазой Mspl. Анализ считают положительным, если продукт ПЦР соответствует ожидаемому размеру фрагмента в 157 п.н.

Результаты проведенных экспериментов показывают, что положительные анализы продуктов ПЦР получают только тогда, когда в качестве матрицы используют ДНК M.avium.

1. Олигонуклеотидные праймеры, комплементарные специфичной для Mycobacterium avium области mig-гена, использующиеся для выявления ДНК Mycobacterium avium, имеющие следующий нуклеотидный состав:
5'-CGT САА AAG CGA ACT GCA -3' и 5'-ТАА ТТС GTT GCC CGA СТС -3'.

2. Способ выявления ДНК Mycobacterium avium с помощью олигонуклеотидных праймеров методом полимеразной цепной реакции (ПНР), включающей выделение ДНК, проведение амплификации ДНК на олигонуклеотидных праймерах, перенос продукта амплификации на гель с последующим детектированием результатов анализа на трансиллюминаторе, отличающийся тем, что праймеры имеют нуклеотидные последовательности:
5'-CGT САА AAG CGA ACT GCA -3'и 5'-ТАА ТТС GTT GCC CGA СТС -3'.
в случае положительной реакции синтезируется фрагмент, соответствующий размеру 157 п.н.



 

Похожие патенты:

Настоящее изобретение относится к биотехнологии и представляет собой генетически модифицированный штамм бактерии Streptomyces thermotolarences WSJ-IA, продуцирующий изовалерилспирамицин I.
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано при получении ксантана. Способ получения культуральной жидкости, содержащей ксантан, предусматривает культивирование культуры бактерий Xanthomonas campestris штамма ВКПМ В-2228 на питательной среде, содержащей источник углерода, в качестве которого используют предварительно гидролизованную низкосортную древесину, источники азота, органическую кислоту, а также минеральные соли.

Изобретение относится к биотехнологии и ветеринарии. Штамм бактерий Pseudomonas aeruginosa №6-ДЕП депонирован в коллекции ФГБУ ВГНКИ.

Изобретение относится к биотехнологии и ветеринарии. Штамм Pseudomonas aeruginosa №1 КВЛ-ДЕП депонирован в коллекции ФГБУ ВГНКИ.

Изобретение относится к биотехнологии и ветеринарии. Штамм бактерий Pseudomonas aeruginosa №25-ДЕП депонирован в коллекции ФГБУ ВГНКИ.

Изобретение относится к биотехнологии и ветеринарии. Штамм бактерий Pseudomonas aeruginosa №34-ДЕП депонирован в коллекции ФГБУ ВГНКИ.

Изобретение относится к медицинской микробиологии. Может быть использовано для культивирования и идентификации урогенитальных микоплазм, в частности Mycoplasma hominis.

Группа изобретений относится к биотехнологии. Предложен штамм Bacillus subtilis Maseca-1, вырабатывающий пептид, имеющий противомикробную активность против Micrococcus luteus, Bacillus cereus и Aspergillus flavus.
Изобретение относится к микробиологической промышленности и может быть использовано при биологической очистке воды и почвы от нефти и нефтепродуктов. Предложен консорциум штаммов микроорганизмов Acinetobacter sp.

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен штамм бактерий Bacillus subtilis, депонированный в Ведомственной коллекции полезных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения Россельхозакадемии под номером RCAM01729 для получения биопрепарата против фитопатогенных грибов.

Изобретение относится к области кардиологии и касается набора синтетических олигонуклотидов. Представленный набор используется для выявления мутаций кодирующей части генов NKX2.5, CFC1, GATA4, ассоциированных с орфанной моногенной патологией, лежащей в основе семейных форм врожденных пороков сердца.

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к паре синтетических олигонуклеотидных праймеров, применяемых для выделения ДНК провируса и РНК вируса иммунодефицита кошек, и к способу диагностики вирусного иммунодефицита кошек с использованием данных праймеров.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к набору олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда для идентификации вируса лихорадки долины Рифт методом обратно транскриптазной полимеразной цепной реакции в реальном времени.
Изобретение относится к области биохимии, в частности к способу подвидовой дифференциации штаммов возбудителя чумы. Способ предусматривает выделение ДНК, проведение ПЦР с применением синтезированных праймеров для амплификации фрагментов межгенных участков wzyE-dapF и YPDF_0064-YPDSF_0065 исследуемого штамма.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к лентивирусной доставке апоптина в опухолевые ткани, и может быть использовано в медицине. Способ включает получение лентивирусного конструкта, экспрессирующего модифицированный апоптин, слитый с секреторным сигналом лактотрансферрина и трансдукторным сигналом (ST-CTP-апоптин), с последующим получением рекомбинантных лентивирусных частиц, дефектных по репликации и несущих модифицированный апоптин, которые затем вводятся в Т-лимфоциты (TILs), полученные при хирургическом удалении опухоли или в процессе получения биопсии, которые обладают способностью проникать в опухолевые ткани.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способу анализа соматических мутаций в генах EGFR, KRAS и BRAF. Способ включает амплификацию фрагментов генов EGFR, KRAS и BRAF с помощью LNA-блокирующей мультиплексной «гнездовой» ПЦР, в которой в качестве матрицы для амплификации используется образец опухолевой ДНК.
Изобретение относится к области медицины и предназначено для диагностики вагинита у женщин репродуктивного возраста. Во влагалищных соскобах измеряют уровни экспрессии мРНК генов TNF, IL18, GATA3 и TLR4.

Группа изобретений относится к области биотехнологии, в частности к микроматричной геномной селекции (MGS). Устройство содержит:(a) по меньшей мере одну реакционную зону, содержащую микроматрицу, одну или более единиц контроля и регуляции температуры для контроля и регуляции температуры внутри реакционной зоны; (b) по меньшей мере одну нереакционную зону, содержащую одну или более единиц контроля и регуляции температуры для контроля и регуляции температуры внутри нереакционной зоны, которая соединена с возможностью переноса жидкости с реакционной зоной; и (c) по меньшей мере одно средство переноса, способное генерировать и/или регулировать поток жидкости между указанной реакционной зоной (а) и указанной нереакционной зоной (b).

Изобретение относится к области биохимии, в частности к способу выявления устойчивых к пиразииамиду изолятов Mycobacterium tuberculosis, путем определения наличия мутаций в гене pncA, ассоциированных с формированием устойчивости к пиразинамиду, посредством проведения ПЦР в режиме «реального времени» с использованием HRM-анализа.
Изобретение относится к области биохимии, в частности к набору олигонуклеотидных зондов для диагностики популяции людей, проживающих на территории РФ, на наследственные моногенные заболевания, путем выявления мутаций и/или полиморфизмов.

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для идентификации гетеромультимерных убиквитинов со способностью связываться с лигандом-антигеном.
Наверх