Способ трансплантации клеток человека с использованием микротрансплантатов (мкт), состоящих из нитчатого полигликолевого микроносителя и прикрепившихся к нему фибробластоподобных клеток


 


Владельцы патента RU 2567303:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук (ИМБ РАН) (RU)

Изобретение относится к медицине и биотехнологии, в том числе к медицинской и косметической трансплантологии, и представляет собой микротрансплантат (MKT), состоящий из клеток человека, прикрепившихся на поверхности микроносителя, состоящего из полигликолидных волокон, или их группы, диаметром до 20 мкм и длиной от 100 до 1000 мкм. При посеве клеток на тонкие полигликолидные волокна происходит селекция против стареющих и поврежденных клеток. Поэтому в состав MKT входят только сравнительно молодые клетки, что увеличивает их терапевтическую эффективность. Введение прикрепленных клеток позволяет им сохранять это прикрепленное состояние в новом микроокружении, что существенно влияет на профиль генной экспрессии, который соответствует нормально функционирующим клеткам, а не изменяется в сторону воспалительных изменений, что происходит при введении неприкрепленных клеток. 1 з.п. ф-лы, 1 ил.

 

Область техники, к которой относится изобретение

Медицина, биотехнология, медицинская трансплантология, косметическая трансплантология.

Уровень техники

Под микротрансплантатом (MKT) мы понимаем микроноситель вместе с прикрепленными к нему клетками (клеткой). Размер микроносителя определяется с одной стороны тем, чтобы он позволял клетке находиться в естественном прикрепленном состоянии, с другой стороны он должен быть таким, чтобы введение клеток можно было бы производить обычного размера иглой. Применение микротрансплантатов - это удобный способ введения клеток в организм, при котором вместе с клетками частично вводится их микроокружение. Показано, что такой способ введения может принципиально изменить результат трансплантации клеток. Наиболее близким аналогом нашего изобретения является MKT, описанный в [Choi Y.S., Cha S.M., Lee Y.Y., S.W. Kwon, Park C.J., Kim M.J. Adipogenic differentiation of adipose tissue derived adult stem cells in nude mouse. Biochemical and Biophysical Research Communications 345 (2006), 631-637]. В этом случае микроноситель представлял собой микросферы из полилактид-полигликолид сополимера. При его использовании удавалось получать новообразованную жировую ткань, в то время как при применении одних клеток без носителей ткань не образовывалась.

Клетки, суспендированные в растворе, после трансплантации лишены привычных для них контактов и метаболического снабжения, в результате чего существенная их доля погибает. Для прикрепляющихся клеток сам факт отсутствия прикрепления, а также характер субстрата являются сильнейшим сигналом, способным запустить анойкис, т.е. апоптоз от невозможности прикрепления. Возможно более существенным вопросом, чем жизнеспособность клеток после введения является вопрос о функционировании клетки в новом микроокружении. Существенно изменившиеся условия меняют работу генов, что препятствует нормальному функционированию и способствует развитию воспалительных изменений. Мы полагаем, что MKT позволяет клетке (например, фибробласту) сохранять после введения прикрепленное и даже напряженное состояние, что должно положительно сказываться на их функционировании, прежде всего на синтезе коллагена и активности металлопротеиназ [Varani J., Dame М.К., Rittie L., Fligiel S.E.G., Kang S., Fisher G.J., Voorhees J.J. Decreased Collagen Production in Chronologically Aged Skin. Roles of Age-Dependent Alteration in Fibroblast Function and Defective Mechanical Stimulation. American Journal of Pathology, Vol. 168, No. 6, June 2006, 1861-1868].

Существенное значение в дизайне MKT имеет форма микроносителя. Она важна как для адгезии клеток к носителю, так и для взаимодействия MKT между собой и тканью. Соотношение поверхность/объем также сильно меняет свойства микроносителя в процессе его резорбции. Показано, что прикрепление клеток к микроносителю сильно зависит от его локальной кривизны; волокна диаметром менее 3 мкм аккумулируют значительно большее количество клеток, чем более толстые [Tian F., Hosseinkhani Н., Hosseinkhani М., Khademhosseini A., Yokoyama Y., Estrada G. G., Kobayashi H. Quantitative analysis of cell adhesion on aligned micro- and nanofibers. Journal of Biomedical Materials Research 84A: 291-299, 2008].

Материал микроносителя должен резорбироваться с определенной скоростью, но при этом не должен выделять токсических продуктов, как, например, значительных количеств лактата, которые появляются при разложении полилактата. И, наконец, материал должен хорошо сочетаться с клетками, быть в меру гидрофильным, иметь определенную микропористость, способность вступать или не вступать в химические реакции и т.п. [Edwards S.L., Mitchell W., Matthews J.B., Ingham E., Russell S.J. Design of nonwoven scaffold structures for tissue engineering of the anterior cruciate ligament. AUTEX Research Journal, Vol. 4, No2, June 2004].

Известно, что клетки на полигликолевом матриксе хорошо синтезируют коллагены [Reichardt A., Arshi A., Schuster P., Polchow В., Shakibaei М., Gries Т., Henrich W., Hetzer R., Lueders С.Custom-Made Generation of Three-Dimensional Nonwovens Composed of Polyglycolide or Polylactide for the Cardiovascular Tissue Engineering. Journal of Biomaterials and Tissue Engineering. Vol. 2, 322-329, 2012]. Недавно описано приготовление прозрачного трансплантанта роговицы на полигликолевых нитях с диаметром 15 мкм [Hu X., Lui W., Cui L., Wang M., Cao Y. Tissue engineering of nearly transparent corneal stroma. Tissue engineering 2005, 11, 1710-1717].

Сведения, раскрывающие сущность изобретения

При посеве фибробластоподобных клеток на тонкие ПГА нити происходит селекция против стареющих и поврежденных клеток. Поэтому в состав MKT входят только сравнительно молодые клетки, что увеличивает их терапевтическую эффективность. Введение прикрепленных клеток позволяет им сохранять это прикрепленное состояние в новом микроокружении, что существенно влияет на профиль генной экспрессии, который соответствует нормально функционирующим клеткам, а не изменяется в сторону воспалительных изменений, что происходит при введении неприкрепленных клеток. MKT по сути является промежуточным вариантом между клеточной трансплантацией и тканевой инженерией.

Осуществление изобретения

Исходным материалом для изготовления микроносителя служила хирургическая плетеная полигликолидная нить ПГА USP 5/0. Нить инкубировали в 0,1 М растворе ЭДТА 30 мин при комнатной температуре, после чего трижды промывали дистиллированной водой. Для формирования микроносителей, представляющих из себя отдельные волокна, нить измельчали ножницами до фрагментов, длиной от 100 до 1000 мкм. Для формирования микроносителей, представляющих из себя группы волокон, на хирургической плетеной полигликолидной нити завязывали узлы, удерживающие волокна вместе, и ножницами обрезали нить с двух сторон от узла. Отрезки нити трижды промывали 70% этиловым спиртом. После разрезания нить сама расплеталась до составляющих ее волокон с диаметром до 20 мкм. Перед употреблением микроносители промывали раствором Хенкса.

Суспензию фибробластов кожи человека смешивали с волокнами в 50 мл полипропиленовых пробирках, которые ставили в термостат в наклоненном положении. Клетки росли в среде DMEM с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС), 2 мМ L-глютамина и 40 мкг/мл гентамицина при 37°C и 5% CO2.

Изучали способность клеток образовывать колонии. По 150 клеток (подсчет производили в камере Горяева) высевали в пластиковые 10 см чашки Петри в среде DMEM с 15% ЭТС. Через 7 дней клетки фиксировали этанолом и окрашивали метиленовым синим. В качестве контроля и опыта исследовали по шесть чашек. Производили подсчет колоний и количества клеток в колониях. Количество подсчитанных клеток округляли по разрядам двоичной системы. Например, если группа клеток состояла из трех или четырех клеток, то в зачет шла цифра 4, если в группе было от 5 до 8 клеток - 8 и т.д.

Количество колоний размером от 4 до 64 клеток, образованных клетками, снятыми с микроносителя, было достоверно выше чем образованных контрольными клетками, снятыми с культурального пластика.

С помощью предлагаемого метода была проведена трансплантация фибробластов. Клетки после 24 ч инкубации на нитях были отмыты физиологическим раствором и с помощью шприца с толстой иглой были введены под кожу мышей C57 Black/6. Последующий анализ показал, что клетки частично сохраняются на нитях и частично мигрируют в ткань. Сравнение с инъекцией только клеток показало, что через 15 дней после введения клетки в составе MKT имеют большую численность в месте введения.

Изобретение поясняется графиком:

повышение способности к колониеобразованию фибробластов кожи человека, снятых с микроносителя (фиг. 1).

1. Способ трансплантации клеток человека с использованием микротрансплантатов (MKT), состоящих из микроносителей и прикрепившихся к ним фибробластоподобных клеток, включающий стадию прикрепления клеток к микроносителю и последующую трансплантацию MKT, позволяющий клеткам сохранять прикрепленное состояние после трансплантации и соответствующий этому состоянию профиль экспрессии генов и отличающийся тем, что с целью усиления терапевтического действия в качестве микроносителя используются полигликолевые волокна диаметром до 20 мкм и длиной от 100 до 1000 мкм, которые позволяют за счет селективного прикрепления клеток к указанным нитям освободить популяцию клеток от стареющих и поврежденных.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что MKT включает в себя микроноситель, состоящий их группы удерживаемых вместе волокон.



 

Похожие патенты:
Группа изобретений относится к области биотехнологии и предназначена для получения биологического референтного материала для производства стандартных образцов состава мочи, содержащих ртуть, кадмий, свинец.
Группа изобретений относится к получению стандартных образцов состава крови, содержащих ртуть, кадмий и свинец, и может быть использована в токсикологии, медицине и ветеринарии при определении содержания указанных токсичных металлов в крови.

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть применено для регенерации тканей мезодермального происхождения с использованием фибробластов взрослого организма.
Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен способ получения плюрипотентных стволовых клеток, включающий процесс дедифференцировки соматических клеток, культивирование индуцированных плюрипотентных стволовых клеток в присутствии агента, изменяющего эпигенетический статус клетки, и культивирование стволовых клеток в отсутствие указанного агента.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению стимулированных дендритных клеток (ДК), и может быть использовано в медицине для иммунотерапии рака.
Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ получения дезинфицированного препарата клеток из ткани млекопитающего.

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для получения композиций, содержащих стволовые плацентарные клетки. Способ включает: (a) получение адгезивных плацентарных клеток в растворе, включающем от 2% до 10% декстрана, от 2,5% до 10% ДМСО и от 4% до 10% HSA, (b) фильтрацию полученного раствора через 70 мкм - 100 мкм фильтр; (c) разбавление указанных клеток до содержания не более 10±3·106 клеток на миллилитр раствором, включающим от 2% до 5% декстрана, от 2,5% до 10% ДМСО и от 4% до 10% HSA, и (d) криоконсервацию раствора, содержащего клетки.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению популяции Tr1-клеток, направленных против коллагена типа II, и может быть использовано в медицине.

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к культивированию клеток и их применению для получения полипептидов. Способ получения рекомбинантного посттрансляционно модифицированного полипептида предусматривает стадию продукции.

Изобретения относятся к области клеточной биологии, фармакологии и медицины. Описан способ культивирования стволовых клеток, исключающий их спонтанную дифференцировку.

Изобретение относится к медицине, а именно к хирургии, и может быть использовано при лечении дефектов покровных тканей. Проводят подготовку раны.

Группа изобретений относится к медицине. Описан биоматериал, имеющий многомерную структуру и содержащий дифференцированную MSCs ткань и деминерализованный костный матрикс, который диспергирован в дифференцированной MSCs ткани, способ его приготовления и применение.
Изобретение относится к области медицины, офтальмологии и биотехнологии. Предложен способ подготовки клеточных культур в виде сфероидов для формирования передних слоев искусственной роговицы, включающий использование кусочков лимба.

Изобретение относится к медицине. Описаны новые усиленные биоразлагаемые каркасы для регенерации мягких тканей, а также описаны способы поддержки, наращивания и регенерации живой ткани, где усиленный биоразлагаемый каркас применяют для лечения симптомов, где требуется повышенная прочность и устойчивость помимо необходимости регенерации живой ткани пациента.

Изобретение относится к способам, техническим устройствам и композициям для изготовления в краткие сроки графта или трансплантата в форме каркаса, которые могут найти применение для лечения или заживления повреждений и травм разнообразных тканей и органов центральной или периферической локализации организма человека или животного.

Изобретения касаются мембраны, используемой в качестве подложки для выращивания клеток ретинального пигментного эпителия, ее применения для поддержания клеток и способа засевания клеток на такую мембрану.
Группа изобретений относится к медицине. Описан биологический материал, включающий: a) жидкий носитель, включающий вязкий раствор, содержащий, по меньшей мере, один натуральный и/или полусинтетический полисахарид и имеющий динамическую вязкость, измеренную при 20ºС и при скорости сдвига D=350 с-1, в диапазоне от 100 до 250 сантипуаз и/или кинематическую вязкость в диапазоне от 99 до 248 сантистокс (измеренную в тех же условиях); b) культуру мезенхимальных стволовых клеток аутологичного или гетерологичного типа и/или c) обогащенный тромбоцитами продукт крови.

Группа изобретений относится к области медицины и касается способов создания зуба, обладающего требуемым размером, и восстановления утраченной части зубов ротовой полости путем трансплантации созданного зуба в область утраты зубов.

Группа изобретений относится к медицине, в частности к регенеративной медицине и тканевой инженерии. Предложены сконструированные многослойные сосудистые трубочки, содержащие, по меньшей мере, один слой дифференцированных взрослых фибробластов, по меньшей мере, один слой дифференцированных взрослых гладкомышечных клеток.

Изобретение относится к медицинскому протезу для имплантации в человеческий организм и, в частности, к биологическому имплантату переносицы, используемому в пластической хирургии переносицы.

Предлагаемое изобретение относится к пищевой промышленности, в частности к получению систем доставки вкусоароматических соединений. Система доставки имеет структуру, содержащую агрегаты поверхностно-активного вещества, при этом система доставки содержит систему поверхностно-активных веществ, выбранную из группы, состоящей из неионных и цвиттер-ионных поверхностно-активных веществ, при этом такое поверхностно-активное вещество присутствует в количестве, равном или превышающем его критическую концентрацию мицеллообразования, гидрофильную фазу, образованную водой и/или водным растворителем, в количестве 10 масс.% или более по отношению к общей массе системы доставки и от 0,0001 до 5 масс.% по отношению к общей массе системы доставки соединения со структурой или его соли и/или сольваты («соединение 1»), в которой по меньшей мере часть соединения 1 инкапсулирована в агрегатах поверхностно-активного вещества.
Наверх