Способ очистки вирусных полиэдров


 


Владельцы патента RU 2570553:

Федеральное бюджетное учреждение "Всероссийский научно-исследовательский институт лесоводства и механизации лесного хозяйства (ФБУ ВНИИЛМ) (RU)

Способ относится к области вирусологии и касается способа очистки вирусных полиэдров. Изобретение включает гомогенизацию биомассы из погибших насекомых, центрифугирование и выделение осадка. При этом суспензию полиэдров вируса предварительно взбалтывают и центрифугируют до появления белой фракции полиэдров вируса над осадком тканей насекомого. Удаляют надосадочную жидкость с полиэдрами в новую пробирку и добавляют в нее раствор трехмолярного гуанидина тиоцианата, повторно центрифугируют, удаляют надосадочную жидкость, добавляют в пробирку воду и ресуспендируют на центрифуге. Далее к осадку из полиэдров добавляют ТЕ-буфер, выдерживают 180 сек при температуре +25 градусов Цельсия, и затем центрифугируют, удаляют надосадочную жидкость, и в осадке остаются очищенные вирусы полиэдров. Изобретение может быть использовано в технологии производства инсектицидных препаратов на основе энтомопатогенных вирусов в качестве промежуточного этапа при выделении вирусов из погибших насекомых. 1 пр.

 

Способ очистки вирусных полиэдров.

Изобретение относится к области вирусологии и может быть использовано в технологиях производства инсектицидных препаратов на основе вирусов в качестве промежуточного этапа при выделении вирусов из погибших насекомых.

Большую роль при выделении вирусов играет степень очистки вирусных полиэдров от тканей насекомых. Использование недостаточно очищенных вирусных полиэдров может снизить уровень достоверности в молекулярно-генетических исследованиях, создавать ошибки в конечном результате.

Известен способ очистки вирусных полиэдров [1], в котором инфицированных вирусом трупы личинок растирали в воде и очищали с помощью низкоскоростного центрифугирования. Раствор с полиэдрами разбавляли введением равного объема 0,1% M Na2CO3 с последующей очисткой в водном градиенте сахарозы (от 30 до 65% (вес/вес) при 90000 g (g - ускорение свободного падения) в течение 2 часов. Вирусные фракции собирали и осаждали из сахарозы. Полиэдры ресуспендировали в воде и хранили при +4°C.

Недостатками этого метода являются низкая скорость процесса очистки.

Известен способ очистки вирусных полиэдров, использующийся при получении штамма вируса ядерного полиэдроза хлопковой совки [2], в котором для очистки вируса к биомассе из погибших гусениц добавляют дистиллированную воду и размельчают с помощью гомогенизатора, полученный гомогенат фильтруют через 2 слоя капроновой ткани с ячейками 0,1 мм, затем фильтрат осаждают центрифугированием, осадок высушивают на лиофильной установке. В качестве наполнителя используют цеолит или кремниевую кислоту.

Описанный способ обладает низким уровнем очистки полиэдров, так как через слой капроновой ткани с ячейками 0,1 мм проходит много посторонних веществ, и такой диаметр пор ткани как минимум в 50 раз превышает среднестатистический размер вирусных полиэдров насекомых.

В основу изобретения поставлена задача усовершенствования способа очистки вирусных полиэдров, улучшение качества очистки и ускорение процесса.

Поставленная задача решается таким образом, что в способе очистки вирусных полиэдров, включающем гомогенизацию биомассы из погибших насекомых, в заявляемом способе неоднократно проводят центрифугирование при 12000-13000 об/мин, при этом в надосадочную жидкость с полиэдрами добавляют трехмолярный раствор гуанидина тиоцианата и после удаления надосадочной жидкости в пробирку и добавления воды ресуспендируют на центрифуге типа Vortex, при этом полиэдры остаются приклеенными к стенкам пробирки, а осадок, содержащий ткани насекомого, переходит в надосадочную жидкость, которую удаляют, далее полиэдры промывают водой в объеме 200 мкл и удаляют надосадочную жидкость, а к осадку из полиэдров добавляют ТЕ-буфер в соотношении 1:50 (осадок/буфер) по объему, выдерживают 180 сек при температуре +25°C и центрифугируют при 5000 об/мин в течение 60 сек.

Причинно-следственная связь между отличительными признаками изобретения и достигаемым техническим результатом - улучшением качества очистки и ускорением процесса - заключается в следующем. Трехмолярный раствор гуанидина тиоцианата при комнатной температуре хорошо растворяет осадок из тканей насекомого, который потом легко удалить, а осадок из полиэдров слипается и остается на месте. Процедура очищения полиэдров занимает меньше времени по сравнению с прототипом и улучшает качество очистки.

Проведенный заявителем анализ уровня техники, включающий поиск по патентам и научно-техническим источникам информации, и выявление источников, содержащих сведения об аналогах заявляемого решения, позволил установить, что заявителем не обнаружены аналоги, характеризующиеся признаками, идентичными всем существующим признакам заявляемого изобретения.

Предложенный прототип позволил выявить совокупность существенных по отношению к усматриваемому заявителем техническому результату отличительных признаков, изложенных в формуле изобретения. Следовательно, заявляемое изобретение соответствует критерию «новизна».

Для проверки соответствия заявляемого изобретения требованию изобретательского уровня был проведен дополнительный поиск по выявлению известных способов очистки вирусных полиэдров с целью выявления признаков, совпадающих с отличительными от прототипа признаками заявляемого изобретения. Результаты проверки показывают, что заявляемое изобретение не следует для специалиста явным образом из известного уровня техники по разработке способа, в частности заявляемым изобретением не предусматривается известное преобразование.

Следовательно, заявляемое изобретение соответствует требованию «изобретательский уровень»

Пример конкретного осуществления способа.

В полипропиленовую пробирку объемом 1,5 мл заливают 1 мл препарата, предварительно взбалтывают. Для избавления от тяжелых фракций центрифугируют препарат в пробирке в течение 10-15 секунд при 12000-13000 об/мин до появления белой фракции полиэдров вируса над осадком тканей насекомого, удаляют надосадочную жидкость с полиэдрами в новую пробирку и добавляют в нее 100 мкл раствора трехмолярного гуанидина тиоцианата на 30-40 мкл осадка. Повторно центрифугируют при 12000-13000 об/мин в течение 60 сек. Удаляют надосадочную жидкость, добавляют в пробирку 200 мкл воды и ресуспендируют на центрифуге типа «Vortex». При этом полиэдры остаются прикрепленными к стенкам пробирки, а осадок, содержащий ткани насекомого, переходит в надосадочную жидкость, которую удаляют, далее полиэдры промывают в объеме 200 мкл воды и опять удаляют надосадочную жидкость.

Далее к осадку из полиэдров добавляют обычный ТЕ-буфер, в соотношении 1:50 (осадок /буфер) по объему. Выдерживают 180 сек при температуре +25 градусов Цельсия, затем центрифугируют при 5000 об/мин в течение 60 сек. После этого удаляют надосадочную жидкость и в осадке остаются очищенные вирусные полиэдров.

Источники информации

1 HarrietM. et. all, The DNA Contained by Nuclear Polyhedrosis Viruses Isolated from Four Spodoptera spp., J. Gen. Virol.(1977), 37,135-143

2 Патент РФ №2359031, МПК C12N 7/00 (2006.01) «Штамм вируса ядерного полиэдроза Хлопковой совки Heliothis armigera Hbn„ используемый для получения инсектицидного препарата».

Способ очистки вирусных полиэдров, включающий гомогенизацию биомассы из погибших насекомых, центрифугирование и выделение осадка, отличающийся тем, что в полипропиленовую пробирку объемом 1,5 мл заливают 1 мл суспензии полиэдров вируса, предварительно взбалтывают и центрифугируют при 12000-13000 об/мин в течение 10-15 сек до появления белой фракции полиэдров вируса над осадком тканей насекомого, удаляют надосадочную жидкость с полиэдрами в новую пробирку и добавляют в нее 100 мкл раствора трехмолярного гуанидина тиоцианата на 30-40 мкл осадка, повторно центрифугируют при 12000-13000 об/мин в течение 60 сек, удаляют надосадочную жидкость, добавляют в пробирку 200 мкл воды и ресуспендируют на центрифуге типа "Vortex", при этом полиэдры остаются приклеенными к стенкам пробирки, а осадок, содержащий ткани насекомого, переходит в надосадочную жидкость, которую удаляют, далее полиэдры промывают водой в объеме 200 мкл и удаляют надосадочную жидкость, а к осадку из полиэдров добавляют ТЕ-буфер в соотношении 1:50 (осадок/буфер) по объему, выдерживают 180 сек при температуре +25 градусов Цельсия и затем центрифугируют при 5000 об/мин в течение 60 сек, удаляют надосадочную жидкость, и в осадке остаются очищенные вирусы полиэдров.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к ветеринаринарной микробиологии. Питательная среда для выявления возбудителя некробактериоза содержит среду 199, сыворотку крови крупного рогатого скота и 40%-ный раствор глюкозы в заданных соотношениях компонентов.

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ определения наличия в биологических жидкостях, окружающей среде и продуктах питания бактерий Escherichia coli штамма O157:Н7, включающий дезинтеграцию бактерий ферментативной обработкой и лизис неионным детергентом, адсорбцию на парамагнитных частицах при помощи специфического моноклонального антитела, детекцию антигена бактерий Е.coli O157:Н7 при помощи специфического биотинилированного моноклонального антитела, связывание полученного комплекса с нековалентным коньюгатом ДНК-матрицы с нейтравидином, диссоциацию твердофазного комплекса "антитело-антиген Е.coli O157:Н7 - биотинилированное антитело-коньюгат" добавлением раствора глицин - HCl рН 2.6, ПЦР-амплификацию ДНК-матрицы и выявление наличия бактерий Е.coli O157:Н7 по скорости нарастания флуоресцентного сигнала.

Изобретение относится к биотехнологии, микробиологии. Штамм Trichoderma harzianum Rifai ВКПМ F-180 применяется в качестве продуцента ингибитора Mycoplasma hominis и может быть использован при лечении микоплазменных инфекций.

Изобретение относится к биотехнологии. Способ предусматривает последовательное осуществление стадий культивирования биомассы микроводорослей на питательной среде в течение 8 суток и создания стрессовых условий в течение 3 суток.

Изобретение относится к области биотехнологии. Штамм Komagataeibacter xylinus депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) под регистрационным номером ВКПМ В-12068.

Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии. Предложен штамм клубеньковых бактерий Bradyrhizobium japonicum ВКМ B-2629D для изготовления бактериального удобрения под сою.

Изобретение относится к промышленной микробиологии. Биопрепарат содержит гидролизат, содержащий продукт анаэробной ферментации смеси листьев растений, свекольной или тростниковой мелассы и воды, взятых в заданных соотношениях, и культуральную жидкость, образованную в процессе получения микробной массы аборигенных углеводородокисляющих микроорганизмов при заданном соотношении компонентов.

Изобретение относится к микробиологии. Штамм бактерий Staphylococcus aureus 113, обладающий антилизоцимной активностью, депонирован в Государственной коллекции микроорганизмов нормальной микрофлоры ФБУН «МНИИЭМ им.
Изобретение относится к биотехнологии. Штамм Streptococcus salivarius М-11, обладающий высокой антагонистической активностью, депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов под регистрационным номером ВКПМ В-11174 и может быть использован при производстве кисломолочных продуктов.

Предлагаемое изобретение относится к биотехнологии. Способ предусматривает приготовление питательной среды на основе осветленной творожной сыворотки, стерилизацию и охлаждение.

Настоящее изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ получения вакцины на основе вируса гриппа и применение постоянной клетки-амниоцита человека для получения вакцины на основе вируса гриппа.

Настоящее изобретение относится к способу получения и очистки ортопоксвируса. Предложенный способ включает следующие этапы: приготовление культуры пакующих клеток; инфицирование культуры пакующих клеток ортопоксвирусом; культивирование инфицированных пакующих клеток до получения потомства ортопоксвируса; инкубация в присутствии одной или более нуклеаз до разрушения нуклеиновых кислот; выделение ортопоксвирусов из супернатанта культуры и/или пакующих клеток; добавление моновалентных солей в концентрации от 200 до 300 мМ в условиях, подходящих для ингибирования активности нуклеазы и для предотвращения адсорбции указанных ортопоксвирусов к анионообменному адсорбенту; осуществление контакта полученной смеси с анионообменным адсорбентом в условиях, подходящих для захвата нуклеиновых кислот.

Изобретение относится к медицинской биотехнологии. Способ очистки вируса осповакцины, в том числе его рекомбинантных вариантов, включает обработку исходной вируссодержащей жидкости ультразвуком.

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано для производства различных инактивированных вакцин против гриппа. Для этого проводят заражение куриных эмбрионов, сбор вируссодержащей аллантоисной жидкости (ВАЖ), очистку ВАЖ методом микрофильтрации.

Группа изобретений относится к области биотехнологии. Предложены способы очистки инактивированного вируса или фрагментированного вируса (варианты).

Изобретение относится к области биохимии. Проводят гомогенизацию тканей зараженного растения в нейтральном буферном растворе на основе 2-[4-(2-гидроксиэтил)пиперазин-1-ил]этансульфоновой кислоты (HEPES) в концентрации 0,02-0,03 М с добавлением ингибиторов растительных ферментов иодайетата натрия и фенилметилсульфонилфторида.

Изобретение относится к области молекулярной биологии, генной инженерии и вирусологии. Предложен способ получения препарата, содержащего вирусные антигены, включающий а) инокуляцию клеток инфекционным вирусом в жидкости, b) репродукцию указанного вируса в указанных клетках, с) сбор указанного репродуцированного вируса, d) инактивацию указанного собранного вируса, и е) обработку указанного инактивированного вируса детергентом, приводящий к получению препарата, содержащего вирусные антигены.

Изобретение относится к биотехнологии и описывает способ получения очищенного концентрата вируса гриппа, способ включает микрофильтрацию вирусосодержащей аллантоисной жидкости на фильтрующих элементах 0,1-0,2 мкм с дальнейшей диафильтрацией фосфатным буферным раствором, содержащим 0,25-0,5 М натрия хлорида, ЭДТА или цитрат натрия, концентрирование вируса гриппа на мембранах с порогом отсечения 300-500 кДа с последующей диафильтрацией фосфатным буферным раствором, содержащим 0,25-0,5 М натрия хлорида, ЭДТА или цитрат натрия, 0,02-0,002% анионного детергента и ультрацентрифугирование в градиенте плотности сахарозы, приготовленной на фосфатном буферном растворе, содержащем 0,25-0,5 М натрия хлорида, ЭДТА или цитрат натрия и 0,02-0,002% анионного детергента.
Изобретение относится к области биотехнологии. .

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способу очистки вируса везикулярного стоматита (ВВС) из жидкости клеточной культуры. .

Изобретение относится к области биотехнологии и вирусологии. Описан способ очистки векторов на основе рекомбинантного аденоассоциированного вируса (rAAV). Способ предусматривает приведение потока исходных материалов в контакт со средой для хроматографии на апатите в присутствии полиэтиленгликоля (PEG) и элюирование частиц rAAV с помощью буфера для элюирования, содержащего менее 3% (масс./об.) PEG. Векторы на основе рекомбинантного AAV по изобретению лишены технологических примесей, включающих компоненты продукции, такие как клеточные нуклеиновые кислоты, клеточные белки, хелперный вирус и компоненты среды. 33 з.п. ф-лы, 7 ил., 6 табл., 13 пр.
Наверх