Средство, обладающее антиагрегантной и антикоагулянтной активностью
Владельцы патента RU 2573379:
Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Алтайский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ГБОУ ВПО АГМУ Минздрава РФ) (RU)
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Г.Б. Елякова Дальневосточного отделения Российской академии наук (ТИБОХ ДВО РАН) (RU)
Изобретение относится к медицине и может быть использовано как антиагрегантное и антикоагулянтное средство. Для этого применяют 7-О-гентиобиозид формононетина, который выделен из суммарного спиртового экстракта корней Maackia amurensis. Изобретение обеспечивает антиагрегантное и антикоагулянтное действие и угнетает процессы сосудисто-тромбоцитарного и коагуляционного гемостаза. 3 табл., 3 пр.
Изобретение относится к медицине, конкретно к фармакологии, и касается средства растительного происхождения, влияющего на процессы агрегации тромбоцитов и свертывание крови.
Известны средства, обладающие антиагрегантными свойствами, т.к. ацетилсалициловая кислота, тиклопидин, клопидогрел, дипиридамол [1, 2, 3, 4, 5]. Известен также ряд растений, извлечения из которых или содержащиеся в них соединения угнетают агрегацию тромбоцитов [6, 7, 8, 9, 10].
Известны средства, обладающие антикоагулянтными свойствами - гепарин, этилбискумацетат, варфарин, дабигатран [11, 12, 13, 14, 15, 16]. Известен также ряд растительных средств, представляющий собой либо растения, либо извлечения из них, либо содержащиеся в них соединения, которые угнетают процесс свертывания крови [17, 18, 19, 20, 21].
Наиболее близким к заявляемому средству (прототипом) является препарат «Маакии амурской экстракт сухой». В состав этого препарата входят растительные полифенолы, обладающие гепатозащитным действием [22, 23]. Препарат зарегистрирован в качестве субстанции (Р №003309/01 от 12.04.2004 г.) для приготовления лекарственного средства «Максар® таблетки, покрытые оболочкой, 60 мг» (Р №003294/01 от 12.04.2004 г.), использующегося для лечения хронических гепатитов [24, 25, 26].
В ходе дальнейшего углубленного изучения установлено, что препарат обладает выраженной антиоксидантной, гемореологической, антитромбогенной и антитромбоцитарной активностью [27-29]. Однако уровень антитромбогенной и антитромбоцитарной активности известного средства недостаточно высок.
Задачей изобретения явилось расширение арсенала антитромбогенных и антитромбоцитарных средств, обладающих повышенной антиагрегантной и антикоагулянтной активностью.
Поставленная задача достигается использованием в качестве антиагрегантного и антикоагулянтного средства соединения 1, полученного из суммарного сухого экстракта коры и корней маакии амурской (Maackia amurensis) Rupr et. Maxim, сем. Fabaceae, структура которого установлена как 7-O-[β-D-глюкопиранозил-(1→6)]-β-D-глюкопиранозид формононетина. В литературе соединение 1 известно как 7-O-гентиобиозид формононетина [29, 30].
Известно, что 7-О-гентиобиозид формононетина (1) обладает гепатопротекторными [23] и антиоксидантными свойствами [29].
Использование соединения 1 как антиагрегантного и антикоагулянтного средства в литературе не описано.
Принципиально новым является впервые обнаруженная способность 7-O-гентиобиозида формононетина (1) ослаблять процессы агрегации тромбоцитов и свертывания крови, что открывает перспективу в применении этого соединения в лечении широкого круга сердечно-сосудистых заболеваний: для лечения и профилактики тромбофлебитов, в комплексной терапии инфаркта миокарда, ишемического инсульта, для профилактики тромбоэмболии, при нарушениях микроциркуляции. Созданный на основе изученного соединения препарат может выпускаться в лекарственной форме и в виде биологически активных добавок.
7-О-Гентиобиозид формононетина (1) для фармакологических исследований получали из спиртового экстракта коры корней маакии амурской методом колоночной хроматографии на сорбентах с обращенной фазой с выходом более 1,1% от веса воздушно-сухой коры корней этого растения.
Спектральные данные выделенного соединения 1, в том числе спектры ЯМР - 1Н и 13С, соответствовали приведенным в литературе [29, 30].
7-О-Гентиобиозид формононетина (1): белый порошок; (с 1,0; С2Н5ОН); масс-спектр (электроспрейная ионизация): m/z=593.1865 [М+Н]+ для С28Н33О14; ИК (KBr) νmax = 3400, 1622, 1514, 1446, 1383, 1250, 1071, 1030 см-1; УФ (МеОН) λmax = 260, 315 нм.
Эксперименты по изучению сосудисто-тромбоцитарного гемостаза при использовании 7-О-гентиобиозида формононетина (1) проводили на 39 крысах-самцах линии Вистар массой 200-260 г.
Животные были разделены на 3 группы по 13 крыс: первая (контрольная) группа ежедневно на протяжении 10 суток получала внутрижелудочно 1 мл крахмальной слизи; вторая группа - препарат «Маакии амурской экстракт сухой» в дозе 25 мг/кг ежедневно в течение 10 суток; третья группа - соединение 1 в такой же дозе на протяжении такого же периода времени. Выбранные дозы соответствовали таковым, ранее проявившим у обоих веществ фармакологическую активность в виде воздействия на экскреторную функцию почек.
Через 2 ч после последнего введения веществ или крахмальной слизи под легким эфирным наркозом брали кровь из брюшной аорты крыс и с помощью автоматического гематологического анализатора определяли содержание тромбоцитов (кл/мкл). Нормальные пределы колебаний числа тромбоцитов крови у крыс составляют от 430000 до 1 млн в 1 мм3 [31, 32], что соответствовало результатам, полученным в наших экспериментах.
После определения числа тромбоцитов для исследования сосудисто-тромбоцитарного гемостаза использовали метод индуцированной АДФ-агрегации тромбоцитов с помощью оптического агрегометра, регистрирующего их агрегацию в богатой тромбоцитами плазме по изменению ее оптической плотности (степень светопропускания, %).
Эксперименты по изучению коагуляционного гемостаза проводили на 40 крысах-самцах линии Вистар массой 215-280 г. Животные были разделены на 3 группы: первая группа (14 крыс) ежедневно на протяжении 10 дней получала внутрижелудочно по 1 мл крахмальной слизи (контроль); животным второй группы (13 крыс) на протяжении 10 дней энтерально вводили препарат «Маакии амурской экстракт сухой» в дозе 25 мг/кг ежедневно; животным третьей группы - соединение 1 в такой же дозе на протяжении такого же периода времени. Через 2 ч после последнего введения веществ или крахмальной слизи под легким эфирным наркозом брали кровь из брюшной аорты крыс и исследовали показатели коагуляционного гемостаза. С этой целью определяли ряд параметров коагулограммы: активированное парциальное (частичное) тромбопластиновое время (АПТВ, сек), протромбиновое время (сек), тромбиновое время (сек), концентрацию фибриногена (г/л), фибрин-мономерные комплексы плазмы (орто-фенантролиновый тест, РФМК, мг/100 мл); активность физиологического антикоагулянта антитромбина III (%), а также фибринолиз (время лизиса, мин).
Принцип метода определения АПТВ основан на измерении времени свертывания плазмы крови в условиях стандартизованной контактной (каолином) и фосфолипидной (кефалином) активации процесса в присутствии ионов Са2+. В основе измерения протромбинового времени лежит способность тромбопластина (фактор III, тромбиназа) превращать протромбин крови в присутствии Са2+ в активный тромбин, который, в свою очередь, трансформирует фибрин крови в нерастворимый фибрин. Протромбиновое время - это время образования фибрина в присутствии Са2+ и тканевого тромбопластина.
Измерение тромбинового времени заключается в определении времени свертывания плазмы крови под влиянием тромбина стандартной активности.
Принцип определения фибриногена заключается в измерении времени свертывания разбавленной цитратной плазмы избытком тромбина. Время свертывания при этом пропорционально концентрации фибриногена, которую определяют по калибровочному графику. Принцип метода определения фибринмономерных комплексов в плазме крови заключается в фиксировании времени появления в плазме, содержащей эти комплексы, зерен (паракоагулятов) фибрина после добавления к ней раствора фенантролина.
Суть определения антитромбина III заключается в том, что AIII разведенной исследуемой плазмы в присутствии гепарина быстро инактивирует α-тромбин. Это приводит к удлинению времени свертывания, по которому оценивается активность AIII-образца. Активность АIII, выраженную в процентах к норме, находят по специально построенной калибровочной кривой.
Фибринолиз оценивали по времени спонтанного лизиса сгустка (мин), получаемого из эуглобулиновой фракции плазмы, при добавлении к ней раствора хлорида кальция. С целью графической регистрации процессов свертывания крови и фибринолиза использована методика тромбоэластографии. На эластограмме фиксировали следующие показатели: СТ - время начала свертывания, сек; CFT - время формирования сгустка, сек; MCF - максимальную твердость сгустка, мм; ML - максимальный лизис сгустка, %; угол α - кинетику образования сгустка, °.
Результаты исследования представлены в примерах 1-3.
Пример 1. В условиях 10-дневного энтерального введения крахмальной слизи количество тромбоцитов в контрольной группе крыс составило 477±23.1·103 кл/мкл, амплитуда АДΦ-индуцированной агрегации тромбоцитов в стандартизованной плазме составила 34±3,5% (контроль).
10-дневное энтеральное применение «Маакии амурской экстракта сухого» в дозе 25 мг/кг обусловило существенное увеличение числа тромбоцитов: 564±13,7·103 кл/мкл; рост на 18,2%. При этом значительных изменений амплитуды АДФ-агрегации тромбоцитов при использовании препарата в данной дозе зафиксировано не было (группа 1).
Энтеральное введение соединения 7-О-гентиобиозида формононетина на протяжении 10 дней в дозе 25 мг/кг ежедневно привело к значительному росту числа тромбоцитов на 60,3% (до 765±40,1·103 кл/мкл). При этом показатель амплитуды АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов резко снижался, в 9,8 раз уступая цифрам контрольных животных (группа 2). Результаты представлены в таблице 1.
Из полученных данных следует, что соединение 1 при 10-дневном энтеральном введении крысам в дозе 25 мг/кг обладает выраженным антиагрегантным эффектом, значительно превосходящим действие «Маакии амурской экстракта сухого», взятого в такой же дозе при такой же продолжительности введения.
Пример 2. В условиях 10-дневного энтерального применения крахмальной слизи были получены цифры, характеризующие показатели коагуляционного гемостаза у данной популяции крыс (контроль).
Внутрижелудочное введение препарата «Маакии амурской экстракт сухой» на протяжении 10 дней в дозе 25 мг/кг привело к достоверному увеличению показателей протромбинового и тромбинового времени (на 24% и 15,8% соответственно). Кроме того, был зафиксирован рост антитромбина III на 8,8% (группа 1).
Энтеральное введение соединения 7-О-гентиобиозида формононетина на протяжении 10 дней в дозе 25 мг/кг обусловило значительное удлинение показателей протромбинового и тромбинового времени (на 54,9% и 73,1% соответственно), существенно превосходящее эффект препарата «Маакии амурской экстракт сухой». Кроме того, было выявлено достоверное увеличение показателя АПТВ на 36% (группа 2). Результаты представлены в таблице 2.
Таким образом, установлено, что в условиях 10-дневного введения в дозе 25 мг/кг соединение 7-О-гентиобиозид формононетина обладает выраженным воздействием на свертывание крови, замедляя этот процесс в большей степени, чем препарат «Маакии амурской экстракт сухой». Одновременное удлинение показателей протромбинового времени и АПТВ указывает на то, что соединение 7-О-гентиобиозид формононетина (1) угнетает как внешний, так и внутренний пути свертывания крови.
Фиксация происходящих в крови изменений с помощью тромбоэластографа в основном подтвердила способность ряда изученных веществ вмешиваться в процесс гемокоагуляции, замедляя процесс свертывания крови.
Пример 3. В условиях 10-дневного применения крахмальной слизи были установлены показатели тромбоэластограммы, характерные для данной популяции крыс (контроль).
Энтеральное использование препарата «Маакии амурской экстракт сухой» на протяжении 10 дней в дозе 25 мг/кг не изменило существенно показатели тромбоэластограммы за исключением увеличения на 36,9% максимальной твердости образовавшегося сгустка (группа 1).
10-дневное энтеральное введение соединения 1 привело к значительным изменениям ряда показателей тромбоэластограммы. Так, время начала свертывания увеличилось на 48,3%, а время образования сгустка удлинилось в 3 раза. Одновременно было зарегистрировано достоверное замедление скорости образования фибрина, на что указывает уменьшение на тромбоэластограмме угла α на 15,4% (группа 2). Результаты представлены в таблице 3.
Полученные данные подтверждают, что соединение 7-О-гентиобиозид формононетина (1) в значительной степени угнетает процесс свертывания крови.
Таким образом, проведенные фармакологические исследования показали, что соединение 7-О-гентиобиозид формононетина (1) обладает выраженными антиагрегантными и антикоагулянтными свойствами.
Источники информации
1. Муляр А.Г. др. Рецепторная регуляция активности тромбоцитов. // Экспериментальная и клиническая фармакология. - 2004. - Τ 67, №1. - С. 61-68.
2. Литвинов Р.И. Современные ингибиторы функции тромбоцитов. // Казанский медицинский журнал. - 2004. - Т. 85, №2. - С. 125-134.
3. Зиганшин А.У. Новые антиагреганты - блокаторы тромбоцитарных Р2-рецепторов. // Казанский медицинский журнал. - 2010. - Т. 91, №1. - С. 73-77.
4. Гарькина СВ. и др. Проблемы применения антитромбоцитарной терапии в кардиологии. // Эффективная фармакотерапия. - 2012. - №1. - С. 24-27.
5. Шилов A.M. Двухкомпонентная (АСК + клопидогрел) антитромботическая терапия острого коронарного синдрома в практике врача первого звена. // РМЖ. - 2012. - №20. - С. 1070-1075.
6. Захаров В.В., Яхно Н.Н. Применение танакана при нарушении мозгового и периферического кровообращения. // Русский медицинский журнал. - 1999. -Неврология. - С. 3-9.
7. Olas В. et al. Effects of polyphenol-rich extract from berries of Aronia melanocarpa on the markers of oxidative stress and blood platelet activation. // Platelets. - 2010. - V. 21, №4. - P. 274-281.
8. Jantan I., et al. Inhibitory effects of the extracts of Garcinia species on human low-density lipoprotein peroxidation and platelet aggregation in relation to their total phenolic contents. // Journal of medical plants research, - 2011. - V. 5, №13. - P. 2699-2709.
9. Policegoudra R.S., et al. Cytotoxicity, platelet aggregation inhibitory and antioxidant activity of Curcuma amada Roxb. extracts. // Food technology and biotechnology. - 2011. - V. 49, №2. - P. 162-168.
10. Saputri F.S., et al. Effects of selected medicinal plants on human low-density lipoprotein oxidation, 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) radicals and human platelet aggregation. // Journal of medicinal plants research. - 2011. - V. 5, №26. - P. 6182-6191.
11. Кондашевская M.B. Современные представления о роли гепарина в гомеостазе и регуляции ферментативной и гормональной активности. // Вестник РАМН. - 2010. - №7. - С. 35-43.
12. Затейщиков Д.Α., Исаева М.Ю. Вопросы организации лечения антикоагулянтами. // Клиническая практика. - 2012. - №3. - С. 51-62.
13. Баркаган З.С. Пути совершенствования и пролонгации антитромботической профилактики и терапии. // Гематология и трансфузиология. - 2005. - №4. - С. 3-7.
14. Замятин М.Н., и др. Профилактика венозных тромбозов у стационарных больных. // Consilium Medicum. - 2006. - Т. 8, №11. - С. 95-100.
15. Затейщиков Д.А. и др. Дабигатран: перспективы клинического применения. // Фарматека. - 2011. - №15. - С. 30-34.
16. Панченко Ε. и др. О назначении варфарина. // Врач. - 2006. - №10. - С. 36-38.
17. RU 2504391 С2, 20.01.2014.
18. RU 2085205 С1, 27.07.1997.
19. Сычев И.А. и др. Действие полисахаридов донника желтого на систему кроветворения в норме и при патологии. // Российский медико-биологический вестник им. акад. И.П. Павлова. - 2007. - №1. - 50-58.
20. Pawlaczyk I., et al. Effects of extraction condition on structural features and anticoagulant activity of F. vesca L. conjugates. // Carbohydrate polymers. - 2013. - V. 92, №1. - P. 741-750.
21. Zargar B.A., et al. Paeonia emodi Royle: Ethnomedicinal uses, phytochemistry and pharmacology. // Phytochemistry letters. - 2013. - V. 6, №2. - P. 261-266.
22. RU 2104027 C1, 10.02.1998.
23. RU 2454243 C1, 27.06.2012.
24. RU 21752337 C2, 27.10.2001.
25. Белобородова Э.И. и др. Новое гепатозащитное средство - максар. // Сибирский журнал гастроэнтерологии и гепатологии. - 1999. - №8. - С. 443-445.
26. Путилова Е.А. и др. Роль препарата максар в лечении хронических вирусных гепатитов. // Дальневосточный журнал инфекционной патологии. - 2011. - №18. - С. 34-40.
27. RU 2342944 С1, 10.01.2009.
28. Плотникова A.M. и др. Антитромбогенная и антитромбоцитарная активность экстракта из древесины маакии амурской. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2009. - Т. 147, №2. - С. 164-167.
29. Kulesh N.I., et al. Antioxidant activity of the isoflavonoids from the roots of Maackia amurensis. // Natural product communications. - 2013. - V. 8, №5. - P. 589-592.
30. Li X, Li J, et al. Isoflavone glycosides from the bark of Maackia amurensis. // Acta Pharm. Sin. - 2009. V. 44. - P. 63-68.
31. Закревская А.Л. Тромбоциты крыс как модель исследования ингибиторов агрегации. // Патологические функциональные системы гемостаза. - Л., 1990. - С. 46-54.
32. Западнюк И.П. и др. Лабораторные животные. - Киев, 1974. - 303 с.
Применение 7-O-гентиобиозида формононетина в качестве антиагрегантного и антикоагулянтного средства.