Способ определения опасности микробиологической загрязненности воды



Способ определения опасности микробиологической загрязненности воды
Способ определения опасности микробиологической загрязненности воды

 


Владельцы патента RU 2576030:

Иванов Сергей Дмитриевич (RU)

Изобретение относится к гигиенической медицине и экологии и может найти применение при оценке санитарного состояния водоемов. Для этого определяют микробиологическую загрязненность воды. Согласно предложенному способу используют пробы с различной концентрацией колониеобразующих единиц (КОЕ) бактерий. При возбуждении ультрафиолетовым излучением определяют интенсивность флуоресценции Iфл каждой пробы, а также интенсивность флуоресценции Iфлк контрольной пробы, содержащей дистиллированную воду при длине волны λфл=415±10 нм. Затем строят калибровочную кривую зависимости между КОЕ и значением Iфл-Iфлк в каждой пробе, определяют флуоресценцию Iфла анализируемой пробы и значение Iфла-Iфлк, по калибровочной кривой определяют соответствующую Iфла-Iфлк концентрацию КОЕап в анализируемой пробе. В случае превышения КОЕап допустимого значения более чем на заданную величину микробиологическую загрязненность оценивают как опасную. Изобретение обеспечивает точность оценки инфекционной опасности воды, упрощает и сокращает время определения и может быть использовано для мониторинга процесса очистки сточных вод. 2 ил., 2 пр.

 

Изобретение относится к гигиенической медицине и экологии и может найти применение при оценке санитарного состояния водоемов, их пригодности для использования в качестве источника водозабора, а также для мониторинга процесса очистки сточных вод.

Для характеристики санитарно-гигиенического состояния водоемов первостепенное значение имеет степень их микробиологического загрязнения, а также выявление в них патогенных микроорганизмов и возбудителей паразитарных заболеваний. Это обусловлено тем, что инфекционная диарея является ведущей причиной заболеваемости населения и детской смертности. В связи с этим выявление загрязнения водных объектов микроорганизмами играет важную роль в определении степени экологического неблагополучия региона. Причем такая оценка необходима, в первую очередь, для источников водозабора, а также для контроля процесса очистки сточных вод.

Вместе с тем нередко возникает необходимость в экспресс-оценке санитарно-гигиенического состояния водоема, главным образом, в случае чрезвычайных ситуаций и экологических бедствий. Это требует определения микробиологической загрязненности непосредственно на месте происшествия. Однако нам не известен метод, который позволял бы в полевых условиях в течение нескольких минут дать оценку санитарного состояния водоема.

В настоящее время для определения опасности микробиологической загрязненности воды считается достаточным показать, что исследуемый образец воды содержит определенное количество бактерий, известных как специфические обитатели кишечного тракта, даже если они не являются прямыми возбудителями заболеваний, при этом в очаге эпидемии важен контроль как общей микробиологической загрязненности воды, так и наличия жизнеспособных бактерий. Индикаторами таких загрязнений чаще всего являются бактерии Escherichia coli. Большая часть стандартных методов включает посев бактерий, инкубацию при 37° или 44°C и последующий подсчет числа выросших колоний через 24-72 ч. Основным недостатком этих методов является их длительность (1-3 суток) и непригодность для экспресс-оценки санитарно-гигиенического состояния водоема, что особенно важно в чрезвычайных ситуациях.

Известны методы, включающие использование флуоресцентной индикации для определения β-D-галактозидазы фермента E. coli, который гидролизует 4-метилумбеллиферил β-D-галактозид. Это позволяет сократить время обнаружения микроорганизмов до 1,5 ч, Zweifel U.L. et al. Total counts of marine bacteria include a large fraction of non-nucleoid-containing bacteria (Ghosts). - Appl. Environm. Microbiol., 1995, V. 61, p. 2180-2185. Однако этот метод непригоден для объективной экспресс-оценки загрязненности водоемов живыми патогенными бактериями, которые не имеют этого фермента (например, Vibro cholerae).

Известен способ определения микробиологической загрязненности воды, описанный в заявке CA 2264272 (A1), опубл. 26.03.1998. Согласно данному способу отбирается жидкая проба, содержащая микроорганизмы, в контейнер, где находится флуоресцентный сенсор, позволяющий определить по снижению интенсивности флуоресценции уровень дыхания исследуемых бактерий в жидкости. Сопоставление этого параметра для анализируемого образца и контрольного образца, не содержащего дышащих бактерий, позволяет рассчитать по специальной программе наличие живых микроорганизмов в среде. Однако этот способ требует применения сложного и достаточно дорогостоящего оборудования, а определение флуоресценции в среде связано с расходом дефицитного флуорохрома, причем весь процесс изменений дыхания бактерий может быть обусловлен вариациями парциального давления кислорода в атмосфере, что в итоге также отражается на показателях аэробного пути обеспечения энергии микроорганизмами и может привести к неадекватной трактовке полученных результатов.

Известен способ определения микробиологического загрязнения водных сред, заключающийся в отборе проб исследуемой среды, ее пропускании через бактерицид формулы R4NIn((n-1)/2)H2O, доведении pH пробы до значений 5-6 и определении числа живых микробных тел среды по концентрации йода, выделившегося после взаимодействия пробы с бактерицидом, RU 2286565 C2, опубл. 27.10.2006. Способ позволяет в пробе воды объемом 50 см3 количественно определить активное микробное загрязнение в течение 30 мин с точностью до 400 бактерий/см3. Однако этот способ, как и вышеупомянутый, может быть реализован только в стационарных условиях и требует наличия специального оборудования.

Известен способ определения микробиологической загрязненности воды путем обработки пробы воды неионным детергентом, инкубации ее с 4′,6-диамидино-2-фенилиндолом (красителем) и последующего определения флуоресценции при ультрафиолетовом возбуждении. Согласно данному способу используют стандартные пробы с различной концентрацией колониеобразующих единиц (КОЕ) бактерий, определяют интенсивность флуоресценции каждой пробы, а также контрольной пробы, содержащей дистиллированную воду, строят калибровочную кривую зависимости между концентрацией КОЕ и разностью интенсивности флуоресценции в каждой стандартной пробе и контрольной пробе, определяют флуоресценцию анализируемой пробы и разность значения этой флуоресценции и флуоресценции контрольной пробы, по калибровочной кривой определяют соответствующую этой разности концентрацию КОЕ в анализируемой пробе и в случае превышения этой концентрацией допустимого значения более чем на 20% микробиологическую загрязненность оценивают как опасную. Детергентную обработку проводят в присутствии комплексона и при ионной силе, соответствующей концентрации NaCl выше 1 М, а определение интенсивности флуоресценции осуществляют при λфл=460±5 нм, для детергентной обработки используют раствор 0,05-ного тритона X-100, содержащего 0,1 моль Na2ЭДТА и 2 моль NaCl при pH 7,8 8,2, RU 2079138 C1, опубл. 10.05.1997.

Недостаток данного способа, принятого за прототип настоящего изобретения, состоит в следующем. В способе-прототипе, осуществляемом при λфл=460±5 нм, происходит определение, главным образом, концентрации ДНК, величина которой пропорциональна общему количеству микроорганизмов. Данная λфл=460±5 нм соответствует максимальному свечению 4′,6-диамидино-2-фенилиндола для анализируемого количества ДНК. Вместе с тем при обработке сточных вод дезинфицирующими средствами жизнеспособность патогенных микроорганизмов и, соответственно, опасность инфицирования потребителей воды резко уменьшаются. Поэтому для более корректной оценки инфекционной опасности воды необходимо определять не общее число микроорганизмов, а количество жизнеспособных (колониеобразующих) бактерий. Однако способ-прототип позволяет определить только общее количество микроорганизмов по ДНК, среди которых только часть является жизнеспособной.

Жизнеспособность клеток обеспечивают окислительно-восстановительные реакции, в которых принимает участие никотинамидадениндинуклеотид (НАД). Являясь коферментом энзимов, обеспечивающих эти реакции, он принимает водород и электроны от окисляемых веществ, а восстановленная форма - (НАД·Н) способна переносить их на другие вещества. Наличие НАД является свидетельством осуществления ферментативных реакций, характерной чертой живых бактерий. Однако известно, что при λфл=460±5 нм НАД удовлетворительно не определяется, поскольку наиболее интенсивное свечение исходит не от НАД, а от окрашенной флуорохромом ДНК. Недостатком способа-прототипа является необходимость использования лизирующей смеси, что усложняет процесс и увеличивает его продолжительность.

Задачей настоящего изобретения является повышение точности оценки инфекционной опасности воды, упрощение и сокращение продолжительности процесса.

Согласно изобретению в способе определения опасности микробиологической загрязненности воды, при котором используют пробы с различной концентрацией колониеобразующих единиц (КОЕ) бактерий, определяют интенсивность флуоресценции Iфл каждой пробы, а также интенсивность флуоресценции Iфлк контрольной пробы, содержащей дистиллированную воду, при возбуждении ультрафиолетовым излучением, строят калибровочную кривую зависимости между КОЕ и значением Iфл-Iфлк в каждой пробе, определяют флуоресценцию Iфла анализируемой пробы и значение Iфла-Iфлк, по калибровочной кривой определяют соответствующую Iфла-Iфлк концентрацию КОЕап в анализируемой пробе и в случае превышения КОЕап допустимого значения более чем на заданную величину микробиологическую загрязненность оценивают как опасную, определение Iфл, Iфлк, Iфла, осуществляют при длине волны флуоресценции λфл=415±10 нм.

Заявителем не выявлены какие-либо технические решения, идентичные заявленному, что позволяет сделать вывод о соответствии изобретения условию патентоспособности «Новизна».

Реализация отличительных признаков заявленного изобретения обусловливает весьма важный технический результат. Если способ-прототип позволяет определить общее количество микроорганизмов, независимо от их жизнеспособности, то заявленный способ обеспечивает возможность преимущественного определения количества жизнеспособных и, следовательно, опасных микроорганизмов с учетом НАД, при этом установлено, что максимальное свечение НАД имеет место при λфл=415±10 нм; при больших отклонениях λфл от 415 нм свечение НАД существенно снижается, что значительно уменьшает точность определения концентрации КОЕ. Какой-либо краситель или иные вспомогательные вещества не требуются.

Заявителем не выявлены источники информации, в которых содержались бы сведения о влиянии отличительных признаков изобретения на достигаемый технический результат.

Указанные обстоятельства позволяют сделать вывод о соответствии заявленного технического решения условию патентоспособности «Изобретательский уровень».

На фиг. 1 приведена зависимость Iфл-Iфлк (в относительных единицах) и концентрация КОЕ бактерий в пробах, используемых при построении калибровочной кривой; на фиг. 2 - фрагмент калибровочной кривой, иллюстрирующий ее использование при определении концентрации КОЕ бактерий в анализируемой пробе.

Заявленный способ реализуют следующим образом. Для построения калибровочной кривой использовали пробы объемом 2,0 мл, содержащие от 0 (контрольная проба) до 15×103 кл/мл. Контрольная проба представляла собой дистиллированную воду, в качестве остальных проб использована суспензия бактерий Escherichia coli. Коли-индекс установлен путем высева бактерий на агар и подсчета титра КОЕ. Пробы воды облучают ультрафиолетовым излучением с длиной волны λвозб=350±10 нм. Интенсивность флуоресценции проб в конкретных примерах определяли при длине волны флуоресценции λфл=415 нм на флуориметре MPF-850 (Hitachi, Япония), после чего строили калибровочную кривую (фиг. 1).

В примере 1 анализируемую пробу в объеме 2,0 мл брали с поверхности воды в районе пляжа яхт-клуба на озере Разлив (г. Сестрорецк) и подвергали ультрафиолетовому облучению аналогично описанным выше пробам, использованным при построении калибровочной кривой. Затем с помощью флуориметра при длине волны λфл=415 нм определили интенсивность флуоресценции Iфл анализируемой пробы и Iфла-Iфлк.

По калибровочной кривой установили, что данному значению Iфла-Iфлк соответствует концентрация КОЕ=1,14×103 кл/мл, что значительно превышает опасный уровень.

Затем для сравнения данную пробу анализировали с использованием способа-прототипа. В результате установили, что в данной пробе концентрация бактерий (общее микробное число - ОМЧ) составляет 2,8×103 кл/мл. Таким образом, заявленный способ позволяет определять, главным образом, количество жизнеспособных клеток (КОЕ), значительно меньшее общего микробного числа, в котором преобладает количество нежизнеспособных бактерий.

В примере 2 анализируемая проба была взята из реки Олонка, респ. Карелия. Аналогичным образом установлено, что концентрация КОЕ в анализируемой пробе составляет 0,25×103 кл/мл, что несколько превышает опасный уровень. В примере 2 при анализе пробы воды с использованием способа-прототипа было установлено, что ОМЧ составляет 7,6×103 кл/мл. Долю жизнеспособных бактерий в ОМЧ с помощью способа-прототипа оценить невозможно, поэтому его результаты более чем в 30 раз завышают оценку опасности микробиологической загрязненности воды р. Олонка, осуществленную с помощью заявленного способа.

Таким образом, заявленный способ позволяет быстро, просто и надежно с достаточной точностью оценить опасность микробиологической загрязненности воды с учетом жизнеспособных бактерий, представляющих биологическую опасность. Калибровочная кривая строится для определенного флуориметра и используется при работе с ним многократно, время анализа пробы занимает не более 3 минут.

Способ определения опасности микробиологической загрязненности воды, при котором используют пробы с различной концентрацией колониеобразующих единиц (КОЕ) бактерий, определяют интенсивность флуоресценции Iфл каждой пробы, а также интенсивность флуоресценции Iфлк контрольной пробы, содержащей дистиллированную воду, при возбуждении ультрафиолетовым излучением, строят калибровочную кривую зависимости между КОЕ и значением Iфл-Iфлк в каждой пробе, определяют флуоресценцию Iфла анализируемой пробы и значение Iфла-Iфлк, по калибровочной кривой определяют соответствующую Iфла-Iфлк концентрацию КОЕап в анализируемой пробе и в случае превышения КОЕап допустимого значения более чем на заданную величину микробиологическую загрязненность оценивают как опасную, отличающийся тем, что определение Iфл, Iфлк, Iфла осуществляют при длине волны флуоресценции λфл=415±10 нм.



 

Похожие патенты:

Использование: для автоматического контроля водного теплоносителя на ТЭС и АЭС. Сущность изобретения заключается в том, что способ включает последовательные операции подготовки проточной пробы путем охлаждения пробы до 10-50°C и понижения давления до атмосферного, кондуктометрического измерения электропроводности (χt) и температуры (t) прямой пробы, пропуск пробы через H-катионитовую колонку, кондуктометрического измерения электропроводности (χt H) и температуры (tH) H-катионированной пробы, приведения измеренных величин электропроводности к температуре 25°C (χ, χH), проверки на достоверность, определения разности значений электропроводностей прямой и H-катионированной пробы (χ- χH) и расчет значения pH решением системы уравнений ионных равновесий водного раствора.

Изобретение относится к газонефтедобыче и может быть использовано на стадии эксплуатации скважин газовых и газоконденсатных месторождений для определения природы воды, поступающей в продукцию скважин.

Группа изобретений относится к области охраны окружающей среды, в частности к методам и средствам биомониторинга водной среды. Способ включает проведение мониторинга качества воды путем автоматической дистанционной непрерывной регистрации в реальном масштабе времени поведенческих и/или физиологических реакций водных тест-объектов, находящихся в аквариумах, через которые пропускают тестируемую воду стабилизированной температуры, а контроль качества воды проводят по изменениям состояния тест-объектов, при этом осуществляют автоматическое перенаправление тестируемой воды через три и более аквариумов, с находящимися в них водными тест-объектами, при этом подаваемый поток тестируемой воды в каждый момент времени проходит только через один аквариум, а в других - циркуляцию воды осуществляют внутри аквариумов без подачи внешней воды, причем период перенаправления потока тестируемой воды из одного аквариума в другой равен времени, достаточному для оценки поведенческих и/или физиологических реакций водных тест-объектов, смены большей части циркулируемой в аквариуме воды при скорости потока воды, обеспечивающей поддержание в ней стабильной среды для жизнеобеспечения водных тест-объектов, а контроль качества тестируемой воды проводят путем сравнения между собой результатов состояния поведенческих и физиологических реакций водных тест-объектов в моменты времени прохождения протоков тестовой воды в аквариумах.
Изобретение относится к области биологии и предназначено для биомониторинга водоема с использованием генетического состава популяций хирономид. В водоеме осуществляют отбор личинок хирономид IV стадии развития с последующей их фиксацией и приготовлением временных цитологических препаратов политенных хромосом слюнных желез личинок по ацето-орсеиновой методике.

Изобретение относится к экологии, в частности к экспресс-определению фальсификации бутилированных питьевых вод из подземных источников (скважин) и загрязнения питьевой, бутилированной и природной воды.

Изобретение относится к аналитической химии и может быть использовано для определения концентрации азотсодержащих противомикробных препаратов (изиниазида, этамбутола и др.) и антибиотиков (цефалоспоринового ряда - цефазолина, цефатоксима, цефуроксима, цефалексина и др.) в исследуемых жидких средах.

Изобретение относится к определению биологической активности воды. Способ осуществляют путем разделения воды на контрольную и исследуемую части, приготовления сахарного раствора с концентрацией сахара 20%, внесения наиболее распространенных и доступных быстродействующих хлебопекарных дрожжей рода Saccharomyces, определения количества выделившегося углекислого газа и вычисления относительного показателя биологической активности водного раствора из соотношения где Vисслед.

Изобретение может быть использовано в аналитической химии железа, а именно для концентрирования железа (III) из воды и водных растворов и количественного определения железа (III) в концентрате.

Изобретение относится к водной экологии и токсикологии и может быть использовано для оценки токсичности вод Азово-Черноморского бассейна. В способе тест-объекты выдерживают в тестируемых растворах; регистрируют физиологический ответ и о степени токсичности загрязнителя судят по токсикологическим параметрам.

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для определения биологической активности питьевой воды. Для этого проводят определение содержания связанной воды и дополнительно определяют общую минерализацию воды по массе сухого остатка и рассчитывают показатель структурированности ПС как отношение содержания связанной воды к общей минерализации в условных единицах.

Изобретение относится к аналитической химии, а именно к методам определения нитрит-ионов, и может быть использовано при их определении в питьевых и минеральных водах. Для этого приготавливают раствор нитрита и помещают в него полиметакрилатную мембрану с иммобилизованным сафранином, в результате чего происходит обесцвечивание окрашенной матрицы за счет реакции диазотирования сафранина. Затем мембрану отделяют от раствора и оценивают содержание нитрит-ионов по интенсивности окраски оптической мембраны методом спектрофотометрии при 530 нм по градуировочному графику или визуально-тестовым методом с использованием цветовой шкалы. Для снижения предела обнаружения нитритов применяют метод добавок. Изобретение обеспечивает простой и быстрый способ определения содержания нитрит-ионов в воде. 1 табл., 2 ил., 4 пр.

Изобретение относится к экологии, а именно охране окружающей среды и способам мониторинга состояния пресных водоемов методом биоиндикации для оценки антропогенного загрязнения природных водоемов ртутью. Для этого проводят комплексное определение загрязнения рек по оценке содержания ртути в тканях пресноводных двустворчатых моллюсков, воде и донных отложениях. Забор тестируемых объектов, а именно пресноводных двустворчатых моллюсков Unio pictorum (перловица обыкновенная), воды и донных отложений, производят в вегетационный период и рассчитывают коэффициент биологического поглощения токсиканта (Кб) как отношение содержания ртути в тканях моллюсков к суммарному содержанию данного металла в воде и донных отложениях. При Кб > 0,00002±0,000001 фиксируют загрязнение водоема ртутью. Изобретение позволяет дать прогноз неблагоприятного токсического состояния водной экосистемы по наличию опасного токсиканта в природном водоеме и может быть внедрен в экологический мониторинг загрязнения речной экосистемы и контроля качества речной воды. 2 табл., 2 пр.
Наверх