Способ получения биологического контейнера

Изобретение относится к области медицины и представляет собой способ получения биоконтейнера для длительного хранения биологических клеток и фракций в жидком азоте при температуре -196°C, отличающийся тем, что емкостью биоконтейнера является внутренняя прозрачная ткань плавательного пузыря рыб, состоящая из однослойного плоского эпителия, взятого от живых рыб. Осуществление изобретения обеспечивает создание благоприятных условий хранения биологических клеток в криогенных условиях. 5 з.п. ф-лы, 1 табл., 2 ил.

 

Биоконтейнер для объектов биологического происхождения, замороженных в форме гранул в жидком азоте (-196°С), относится к ветеринарной медицине, в частности к области акушерства, гинекологии, трансплантации эмбрионов и искусственного осеменения животных.

Известен способ использования биоконтейнера для хранения и адресной доставки антиоксидантов в «Митохондрии», состоящий из синтеза пластохинина и катиона родамина для восстановления дыхательного процесса в мембранах клеточных митохондрий «молекулы-электроды» в больном организме.

Недостатком этого способа является то, что биоконтейнер состоит из химических веществ несовместимых с клетками, с живыми тканями и биологическими лечебными фракциями (сперматозоидами, бластоцистами и фетоплацентарными фракциями), что при длительном хранении губительно влияет на лечебную эффективность, на живые тканевые клетки больного организма животных. Оболочка контейнера такого химического состава не способна выдержать лечебную структуру наполнителей, соединившись с химическими компонентами жидкого азота при его низкой температуре -196°С.

Известен «Контейнер для биологических объектов", состоящий из корпуса, крышки на двух петлях, двух замков. Внутренность выстлана теплоизоляционным материалом, внутри находиться охладитель из резины, наполняемый охлаждающим веществом. В качестве охладителя используется замороженная вода или другие водные растворы солей с температурой от 0 до 5°С. Устройство используют для сохранения биоматериалов на короткое время с места происшествия объекта биологического происхождения.

Недостатком этого устройства является их способность к непригодности в техническом и химикобиологическом отношении, неспособность работать от автономных источников электроэнергии. Теплоизоляционный материал, резина охлаждающий агент, и другие детали контейнера, с которыми биологические объекты будут соприкасаться, состоят из поролона, металла, также возможны нарушения постоянства температуры в контейнере. Устройство не позволяет длительно (30, 90, 100 дней) сохранять биологические объекты в анабиотическом состоянии.

Наиболее близким к настоящему изобретению, что является прототипом предлагаемого нами изобретения, это биоконтейнеры для длительного хранения замороженной спермы и эмбрионов сельскохозяйственных животных. Эти биоконтейнеры для хранения биологических объектов, использующих в повседневной практике в жидком азоте в одноразовых или стеклянных, полиэтиленовых ампулах, пробирках, капиллярах, пайетах, канистрах, мешочках (ситцевая, льняная, лавсановая ткань).

Недостатком этих биоконтейнеров является то, что эти емкости химического происхождения: полиэтилен, полистирол, полипропилен, которые не биологического происхождения. Они не совместимы с бластоцистами, сперматозоидами, эмбрионами, биофракциями, и являются токсичными не только по запаху (феромоны), но и, соединяясь с жидким азотом, образуют вредные вещества, губительно действующие на биологические клетки и лечебные фракции (сперматозоиды, эмбрионы), находящиеся в жидком азоте в анабиотическом состоянии. Поэтому хранящийся биоматериал приходится выбраковывать до 40-50%. Задачей данного изобретения является разработка способа получения биологического контейнера, состоящего из биологической ткани (однослойного, плоского эпителия, околоплодные клетки, эмбриональные ткани), обладающие лечебными фракциями.

Цель изобретения - создание благоприятных анабиотических условий в криогенных жидкостях (жидкий азот -196°С), позволяющих сохранять оплодотворяющую способность и лечебные свойства в половых клетках, жизнеспособность эмбрионов.

Поставленная цель достигается тем, что в качестве биоконтейнера используется плавательный рыбий пузырь.

Плавательный пузырь рыб выполняет гидростатическую функцию, изменяя вес рыбы, создавая нейтральную плавучесть. Плавательный пузырь в эмбриональном развитии возникает из пищеварительной трубки в области пищевода, как трубчатый вырост, сообщаясь с глоткой посредством воздушного хода. У рыб он имеет две камеры. Стенка плавательного пузыря состоит из двух оболочек, легко отделяющихся друг от друга.

Внутренняя прозрачная оболочка плавательного пузыря состоит из однослойных эпителиальных клеток, обладающих прочностью при растяжении и смене температур от +24°С до -196°С при загрузке в жидкий азот биологических объектов в форме замороженных гранул, в объеме от 0,2 до 0,5 мл. Наружная оболочка плавательного пузыря состоит из соединительной ткани и коллагеновых волокон (рис. 1). Плавательный пузырь состоит из: 1 - двух пузырей; 2 - протока; 3 - прозрачного однослойного эпителия; 4 - коллагеновой оболочки.

В качестве изобретения мы предлагаем использование в качестве биоконтейнера (рис. 2) внутреннюю оболочку плавательного пузыря, состоящую из однослойного прозрачного прочного эпителия, с целью хранения половых клеток, эмбрионов, биологических лечебных клеток и фракций вне организма, а также с целью увеличения сроков выживаемости и сохранности имплантационной, оплодотворяющей и лечебной способности в замороженном состоянии, что основано на снижении обменных процессов.

Предлагаемый нами биоконтейнер (рис. 2) состоит из: 1 - корпуса биоконтейнера; 2 - прозрачная оболочка из однослойного эпителия; 3 - воздушный проток; 4 - загрузка гранулоцитов или жидкой биологической фракции; 5 - шелковая хирургическая нить.

Анабиоз при низкой температуре в биоконтейнере, стенка которого состоит их природой созданных эпителиальных клеток, способствующих сохранности анабиотического состояния. Но этого не могут создать биоконтейнеры химического происхождения из пластмассы, полипропилена, макролона, поликарбоната, дакрила, лавсана, полистирола, из шелковой и ситцевой ткани, капилляры (пайеты).

Последовательность выполнения предлагаемого способа получения биоконтейнера состоит в следующем:

1. Извлекают из брюшной полости рыб плавательные пузыри;

2. Промывают плавательный пузырь раствором марганцево-кислого калия 1:5000 и орошают физиологическим раствором (0,85%) многократным погружением в емкость;

3. Обеззараживают плавательный пузырь в микробиологическом боксе кварцеванием в течение одной минуты;

4. Снимают с помощью стерильного пинцета с плавательного пузыря коллагеновую поверхностную оболочку;

5. Освобождают внутреннюю прозрачную, состоящую из однослойного эпителия оболочку, имеющую форму мешочка, промывают ее физиологическим раствором (0,85%);

6. Поверхность эпителиального мешка помещают, путем погружения, в раствор ланолина в течение одной минуты для придания ткани эластичности. После этого промывают, орошая физиологическим раствором;

7. Обеззараживают полученный биоконтейнер в микробиологическом боксе кварцеванием в течение одной минуты в подвешенном виде;

8. Через расширенный воздухоносный проток, соединяющий оба пузыря, после его разъединения на две емкости резекцией, загружают замороженными в форме гранул биологическими клетками, тканями, лечебными фракциями;

9. Перевязывают воздухоносный проток шелковой стерильной хирургической нитью;

10. Помещают биоконтейнер в сосуд Дьюара с жидким азотом при температуре -196°С для длительного хранения;

11. Перед использованием замороженные биологические гранулы с эмбриональными клетками извлекают из биоконтейнера, сохранившего эластичность;

12 Гранулы оттаивают в водяной бане при температуре 38-40°С, согласно Ветеринарному Законодательству России.

Практическое применение

Извлеченные из биоконтейнера, оттаянные биологические фракции в форме гранул, мы вводили в матку коровам с серозно-катаральным послеродовым эндометритом. Результаты лечения отображены в таблице 1.

Из таблицы 1 видно, что после лечения коров с болезнями половых органов, после патологических родов, когда коровам в полость матки вводили биологические лечебные фракции, ранее замороженные в биологическом контейнере, успешно выздоровели из 12 больных коров 9, что составляет 75%, а в контрольной группе, когда коров лечили общепринятыми способами, сохраняя фракции в мешочках из лавсановой ткани, выздоровело меньше на 3,6%. В опытной группе коровы после лечения пришли в половую охоту в среднем через 28-32 дня, а коровы контрольной группы пришли в охоту после отела на 40-45 день.

Библиографический список

1. Лямзаев К.Г., Антоненко А.В. и др. Произведение пластохинина, адресованное в митохондрии, как средство, прерывающее программу старения. Катионные производные пластохинина: синтез и исследование in vitro. Международный форум по нанотехнологиям, 6-8 октября. Сборник тезисов докладов участников Второго Международного форума по нанотехнологиям. Москва, 2009 г., стр. 519-520.

2. Патент на полезную модель РФ №42634 «Контейнер для биологических объектов». 10.12.2004. Авторы: Филипов А.И., Коршунов В.М., Филипова С.И.

3. Небогатиков Г.В. «Практикум по акушерству, гинекологии и биотехнике размножения животных». Издательство Москва, Мир, 2005 г., стр. 225-228.

1. Способ получения биоконтейнера для длительного хранения биологических клеток и фракций в жидком азоте при температуре -196°C, отличающийся тем, что емкостью биоконтейнера является внутренняя прозрачная ткань плавательного пузыря рыб, состоящая из однослойного плоского эпителия, взятого от живых рыб.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что корпус биоконтейнера перед использованием освобождают стерильным пинцетом, снимая коллагеновую поверхностную оболочку с плавательного пузыря рыб.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что прозрачный корпус биоконтейнера, состоящий из однослойного плоского эпителия, обеззараживают в микробиологическом боксе кварцеванием в течение одной мин.

4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что через расширенный воздухоносный проток, соединяющий оба пузыря после его разделения на две емкости резекцией, загружают замороженные в форме гранул биологические клетки, ткани, лечебные фракции, бластоцисты, сперматозоиды.

5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что помещают перевязанный стерильной нитью биоконтейнер, заполненный гранулированными фракциями, в сосуд Дьюара (Т-196°C).

6. Способ по п. 1, отличающийся тем, что перед практическим использованием биологических фракций биоконтейнеры извлекают из сосуда Дьюара, а гранулы извлекают и оттаивают в водяной бане при температуре 38-40°C.