Способ окраски тромбоцитов после воздействия модулированным ультразвуком


 

G01N1/44 - Исследование или анализ материалов путем определения их химических или физических свойств (разделение материалов вообще B01D,B01J,B03,B07; аппараты, полностью охватываемые каким-либо подклассом, см. в соответствующем подклассе, например B01L; измерение или испытание с помощью ферментов или микроорганизмов C12M,C12Q; исследование грунта основания на стройплощадке E02D 1/00;мониторинговые или диагностические устройства для оборудования для обработки выхлопных газов F01N 11/00; определение изменений влажности при компенсационных измерениях других переменных величин или для коррекции показаний приборов при изменении влажности, см. G01D или соответствующий подкласс, относящийся к измеряемой величине; испытание

Владельцы патента RU 2589679:

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии - МВА имени К. И. Скрябина" (ФГБОУ ВО МГАВМиБ - МВА имени К. И. Скрябина) (RU)

Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике, и может быть использовано для окраски тромбоцитов после воздействия ультразвуком. Для этого проводят предварительную обработку образцов крови in vitro модулированным ультразвуком со скважностью 2, интенсивностью 0,05 Вт/см2 в течение 30-40 с, или интенсивностью 0,2 Вт/см2 в течение 20-35 с, или 0,4 Вт/см2 в течение 15-30 с, или 0,7 Вт/см2 в течение 15-20 с с любой частотой модуляции в диапазоне частот модуляции от 10 до 30 Гц или с частотой модуляции 800 Гц и несущей частотой 880 кГц, а также УЗ с несущей частотой 2,64 МГц, интенсивностью 0,4 Вт/см2 в течение 15-30 с в импульсном режиме с последующим приготовлением мазков крови и их окраской дифференциальными красителями. Изобретение обеспечивает возможность дифференциальной окраски всех форменных элементов крови, включая тромбоциты. 2 ил.

 

Изобретение относится к ветеринарии и медицине и может использоваться при неинвазивном исследовании крови животных, предварительно обработанной ультразвуком.

Тромбоциты - красные кровяные пластинки (бляшки Бицецеро); полиморфные бесцветные клетки, образующиеся из мегакариоцитов, диаметром 2-5 мкм, живут 8-11 дней. В норме (200-400)·109/л. У новорожденных концентрация тромбоцитов такая же, как у взрослых; к 7-9 дню снижается до (164-178)·109/л; к концу второй недели - как у взрослых. Увеличение количества - тромбоцитоз, уменьшение количества -тромбоцитопения.

Несмотря на распространение в последнее время в лабораториях счетчиков форменных элементов крови наиболее часто подсчет тромбоцитов осуществляется в окрашенных мазках крови, приготовленных с использованием трилона Б. Метод основан на подсчете количества тромбоцитов на 1000 эритроцитов, с последующим пересчетом на 1 мкл крови, исходя из количества эритроцитов в этом объеме.

Реактивы:

6%-ный раствор ЭДТА (этилендиаминтетраацетат Na);

раствор эозин-метиленового синего по Май-Грюнвальду;

раствор Романовского-Гимзы.

Окраска. Кровь смешивают с 6%-ным раствором ЭДТА. Для этого реактив, взятый капилляром Панченкова до метки «75», вносят в пробирку, затем добавляют кровь, взятую тем же капилляром, до метки «0». Содержимое пробирки перемешивают и готовят тонкие мазки. Высохший мазок должен быть равномерно тонким, желтоватого цвета, достаточной величины - т.е. располагаться на 1-1,5 см от краев, занимать 2/3 длины стекла и оканчиваться «метелочкой». Толстые, густо-розового цвета мазки не используются, т.к. в них морфология клеток плохо различима.

Мазки фиксируют раствором Май-Грюнвальда 2-3 мин. Окрашивают раствором Романовского-Гимзы 30-45 мин (разведение из расчета примерно 1 капля на 1 мл дистиллированной воды должно устанавливаться опытным путем для каждой новой партии красителя).

Высохшие мазки микроскопируют с иммерсионным объективом, подсчитывая количество тромбоцитов в тонких местах препарата (эритроциты должны быть расположены изолированно). Тромбоциты в мазках выглядят в виде фиолетовых округлых образований размером 2-4 мкм с отчетливо видимой центрально расположенной зернистой частью - грануломером и более светлой периферической незернистой зоной - гиаломером. Подсчет производят следующим образом: в каждом поле зрения микроскопа считают число эритроцитов и тромбоцитов, передвигая мазок до тех пор, пока не будут просчитаны не менее 1000 эритроцитов.

Известно приготовление мазков и подсчет количества тромбоцитов в периферической крови человека. Оснащение: смесь Никифорова, предметное и покровное стекла, марлевые салфетки, донорская кровь, капилляр, краска Романовского-Гимза, микроскоп, иммерсионное масло, счетчик 11-клавишный. Мазок готовится на обезжиренном стекле с помощью покровного или предметного стекла. Чистые стекла хранятся до употребления в смеси Никифорова (эфир со спиртом в отношении 1:1) в банке с притертой пробкой. Перед взятием крови стекла вынимают пинцетом и тщательно протирают салфеткой. На палец, обработанный спиртом, наносится капля 14%-ного раствора MgS04, через которую делается прокол скарификатором. Большим и средним пальцами левой руки берут предметное стекло за ребро и наносят каплю крови на край стекла. Правой рукой берут покровное стекло, ставят его узким краем рядом с каплей крови так, чтобы она растеклась в углу, образованном двумя стеклами. Покровным стеклом под углом 45° проводят по предметному стеклу, растягивая каплю тонким слоем. Хорошо сделанный мазок должен быть достаточно тонким, немного уже и короче предметного стекла, иметь желтоватый цвет и просвечивать. Высушивают мазок на воздухе, не подогревая. Затем фиксируют в смеси Никифорова 10 минут, после чего вынимают и сушат в вертикальном положении.

Высушенный мазок окрашивают краской Романовского. Необходимо отметить, что для дифференциального подсчета тромбоцитов используют концентрацию краски вдвое больше, чем для окраски мазка при подсчете лейкоцитарной формулы. Мазок покрывают тонким слоем краски и оставляют на 45 минут. Затем мазок промывают под проточной водой и сушат. Смотрят под микроскопом при увеличении 90 с иммерсионным маслом, используя окошечко по Fonio. Подсчет количества тромбоцитов производится на 1000 эритроцитов.

В известных методах окраски тромбоциты отдельно окрашивают крайне редко, поскольку в таком случае остальные форменные элементы учитывать невозможно или крайне затруднительно. Одномоментной окраски форменных элементов, включая тромбоциты, без дополнительных затрат красителей в известных способах не происходит.

Наиболее близким аналогом заявленного изобретения является метод быстрого дифференциального окрашивания биопрепаратов ДИФФ-КВИК. Мазки фиксируют в абсолютном метаноле 15 с, выдерживают в растворах красителей в течение 10 с, промывают в забуференной воде, высушивают, микроскопируют (микроскоп «Микмед-5», объектив 100x/1,25, окуляр 10х/18) и подсчитывают процентное содержание форменных элементов крови [Н.А. Любин, Л.Б. Конова. Методические рекомендации к определению и выведению гемограммы у сельскохозяйственных и лабораторных животных при патологиях. Ульяновск, ГСХА, 2005, 113 с.].

Однако данный способ не обеспечивает глубокую и равномерную окраску тромбоцитов всех размеров, независимо от их видовой принадлежности какому-либо животному, возможность подсчета и выявления морфологических особенностей кровяных пластинок. Нами была отработана методика одновременной глубокой окраски всех форменных элементов крови, в то время как в известных способах окраски при окраске лейкоцитов невозможно всегда равномерно окрасить тромбоциты животного любого вида для изучения морфологии и диагностики изменений клеточных мембран. Найденный диапазон интенсивности ультразвука (УЗ) и времени озвучивания гарантированно обеспечивает качественную окраску тромбоцитов во всех случаях (независимо от особенностей конкретных клеток, условий взятия и хранения крови, состояния животного, наличия патологического процесса), не влияя отрицательно на окраску других форменных элементов.

Окрашивание ДИФФ-КВИК с УЗ позволяет хорошо визуализировать тромбоциты и может быть использовано в качестве модификации для подсчета именно тромбоцитов любого размера и вида и для одновременного изучения морфологических и цитологических особенностей всех окрашенных клеток, показывает наличие: клеточных деформаций, анизоцитоза, повреждений цитоплазматических мембран тромбоцитов, дает возможность визуализировать границы тромбоцитов.

Целью заявленного изобретения является разработка способа дифференциальной окраски всех клеток крови одним стандартным набором красителей в одной и той же концентрации.

Техническим результатом заявленного изобретения является дифференциальная окраска всех форменных элементов крови, включая тромбоциты, после УЗ воздействия на образцы крови непосредственно до приготовления мазков, с одинаково равномерной, глубокой и быстрой окраской всех клеток крови одним стандартным набором красителей, без дополнительных средств (красителей, спиртов) и минимальной затратой времени (15-40 с). Для реализации заявляемого изобретения используются любые из отечественных ультразвуковых терапевтических генераторов с излучателями, работающих на несущих частотах 0.88 и 2.64 МГц.

Указанный технический результат достигается тем, что окраску тромбоцитов проводили после ультразвукового воздействия на образцы крови in vitro бегущей УЗ волной. В зависимости от интенсивности УЗ применяли разную экспозицию. Интенсивностью 0,05 Вт/см2 обрабатывали в течение 30-40 с, интенсивностью 0,2 Вт/см2 - 20-35 с, интенсивностью 0,4 Вт/см2 - 15-30 с, интенсивностью 0,7 Вт/см2 в течение 15-20 с. Одновременно накладывали на указанные режимы любое значение из нижеперечисленных диапазонов частот модуляции: 10-30 Гц или 800 Гц, скважность 2. Несущая частота 880 кГц. Того же результата можно достичь, используя несущую частоту 2,64 МГц, интенсивность 0,4 Вт/см2, время воздействия 15-30 с, стандартные импульсные режимы, заложенные в аппаратуру. Применение модулированных воздействий снижает среднюю по пространству и времени интенсивность в 2 раза, уменьшая риск повреждения клеток. После УЗ обработки готовили мазки крови и окрашивали их дифференциальными красителями.

Заявленный способ осуществляется следующим образом.

Воздействие ультразвуком in vitro на образцы крови осуществлялось следующим образом. Кровь брали в ветеринарной клинике из подкожной вены предплечья у кошек, собак, кроликов, яремной вены лошадей натощак в утренние часы. Образцы крови от 0,5-1,5 мл озвучивали в абсолютно одинаковых условиях. УЗ воздействие на клетки крови осуществлялось с помощью терапевтических излучателей аппаратов отечественного производства: УЗТ-1-01Ф; УЗТ-5 и УЗТ-1.02С с внешним входом для модуляции. В качестве генератора модулирующих сигналов использовали низкочастотный генератор Г3-113 или аналогичные генераторы другого типа. Озвучивание образцов крови осуществлялось бегущей импульсно модулированной УЗ волной с экспозицией, зависящей от интенсивности УЗ: при интенсивности 0,05 Вт/см2 обрабатывали в течение 30-40 с (фиг.1), при интенсивности 0,2 Вт/см2 - в течение 20-35 с, при интенсивности 0,4 Вт/см2 - в течение 15-30 с, при интенсивности 0,7 Вт/см2 в течение 15-20 с (фиг.2). Диапазон частот модуляции: 10-30 Гц или 800 Гц. Несущая частота 880 кГц. Того же результата можно достичь без модуляции, используя несущую частоту 2,64 МГц, интенсивность 0,4 Вт/см2, время воздействия 15-30 с в импульсном режиме. После УЗ обработки делали мазки крови и окрашивали по методу быстрого дифференциального окрашивания биопрепаратов ДИФФ-КВИК: мазки фиксировали в абсолютном метаноле 15 с, выдерживали в растворах красителей в течение 10 с, промывали в забуференной воде, высушивали и результат наблюдали и фиксировали под микроскопом (микроскоп «Микмед-5», объектив 100x/1,25, окуляр 10x/18) (см. фиг.1, 2).

С применением УЗ была отработана методика окраски всех форменных элементов крови, в то время как в известных способах при окраске лейкоцитов невозможно одновременно глубоко и эффективно прокрасить тромбоциты всех размеров. Найденный диапазон интенсивности, частот модуляции и времени обеспечивают окраску тромбоцитов, не влияя отрицательно на окраску других форменных элементов. У всех окрашенных клеток отчетливо видны: форма, размер, морфологические и цитологические особенности, целостность или разрушение цитоплазматической мембраны (при наличии), ядра, зернистость цитоплазмы (у гранулоцитов), анизоцитоз или клеточные деформации. Используемые параметры ультразвукового воздействия являются терапевтическими и безопасными для экспериментатора.

Способ окраски тромбоцитов после воздействия ультразвуком, включающий предварительную обработку образцов крови in vitro модулированным ультразвуком со скважностью 2, интенсивностью 0,05 Вт/см2 в течение 30-40 с, или интенсивностью 0,2 Вт/см2 в течение 20-35 с, или 0,4 Вт/см2 в течение 15-30 с, или 0,7 Вт/см2 в течение 15-20 с с любой частотой модуляции в диапазоне частот модуляции от 10 до 30 Гц или с частотой модуляции 800 Гц и несущей частотой 880 кГц, а также УЗ с несущей частотой 2,64 МГц, интенсивностью 0,4 Вт/см2 в течение 15-30 с в импульсном режиме с последующим приготовлением мазков крови и их окраской дифференциальными красителями.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к нефтяной промышленности и предназначено для отбора проб из манифольда арматуры устья нефтедобывающей скважины, а также при отборе проб жидкости из трубопровода.

Группа изобретений относится к области экологии и воздухотехнического оборудования и предназначена для измерения качества воздуха. Для измерения качества воздуха осуществляют отбор проб воздуха с первой частотой выборки, чтобы получить множество проб качества воздуха при использовании первого датчика.

Изобретение относится к определению моющей способности синтетических моющих средств (CMC) и может быть использовано при товароведной оценке непродовольственных товаров.

Группа изобретений относится к авиационной технике, а именно к устройствам для обнаружения условий обледенения летательных аппаратов. Устройство содержит систему с датчиками и детектор условия обледенения.

Изобретение относится к животноводству. Предложенное устройство для отбора пробы молока из емкости 7 с уровнем молока Н содержит молокозаборную трубку 1 с фиксированным диаметром сквозного канала 9±1 мм и длиной L1.

Группа изобретений предназначена для избирательного переноса проб биологического материала или материала биологического происхождения. Контейнер содержит корпус (2), имеющий по меньшей мере отсек (3), подходящий для содержания по меньшей мере текучей среды или жидкости и/или для содержания по меньшей мере участка (16a) устройства (16) отбора для биологических проб.

Изобретение относится к области биохимии. Предложен микрофлюидный чип для создания клеточных моделей органов млекопитающих.

Группа изобретений относится к промораживанию и отбору проб донных осадков при поисково-разведочных работах на твердые полезные ископаемые в океане на глубинах до 6000 м и более, и подъема значительных масс как донного грунта, так и металлов, например затонувших судов.

Изобретение относится к конструктивным элементам микробиореакторов. Предложен порт введения тестируемого химического соединения и отбора жидкости из ячейки для культивирования клеточных моделей.

Изобретение относится к технике исследования свойств и состава рабочего газа в высокоэнтальпийных установках кратковременного действия. Устройство для отбора пробы газа в высокоэнтальпийных установках кратковременного действия содержит герметично соединенные собственно пробоотборник с заостренной передней кромкой и расширяющимся внутренним каналом.

Изобретение относится к ветеринарии и медицине и может использоваться при неинвазивном исследовании крови животных с помощью ультразвуковых волн. Способ окраски тромбоцитов после ультразвукового воздействия включает обработку образцов крови ультразвуком от 30 с до 45 с, интенсивностью 0,4 Вт/см2, частотой 880 кГц, бегущей ультразвуковой волной, режим непрерывный, с последующим приготовлением мазков крови и их окраской дифференциальными красителями. Изобретение обеспечивает возможность равномерной глубокой дифференциальной окраски всех форменных элементов крови, включая тромбоциты. 2 ил.

Изобретение относится к системам аналитического контроля пульповых продуктов, растворов или суспензий в потоке, применяемых в горно-обогатительной и других отраслях промышленности. Автоматическая система включает автоматический пробоотборный комплекс 1, автоматический комплекс 10 циркуляционной пробоподачи и транспортные магистрали 30. Система дополнительно снабжена автоматическим комплексом 5 пробоподготовки, автоматическим комплексом 14 подготовки и подачи порошковых проб, аналитическим комплексом 20, комплексом 24 сетевого оборудования, центральной станцией 27 управления системой, серверами 28 системы, информационными магистралями 31. Выход пробоотборного комплекса 1 соединен с входом комплекса 5 пробоподготовки, который имеет два выхода, соединенные с комплексом 10 циркуляционной пробоподачи и комплексом 14 подготовки и подачи порошковых проб. Выходы комплекса 10 циркуляционной пробоподачи и комплекса 14 подготовки и подачи порошковых проб соединены с входами комплекса 20. Система управления каждого комплекса объединена в единую информационную сеть с центральной станцией 27 управления автоматической системой аналитического контроля и серверами 28 данной системы через комплекс сетевого оборудования. Комплекс 14 подготовки и подачи порошковых проб состоит из оборудования 15 подготовки порошковых проб, оборудования 16 шифровки/дешифровки порошковых проб, оборудования 17 перемещения порошковых проб, оборудования 18 хранения порошковых проб и устройства 19 управления комплексом. Комплекс 20 состоит из многокюветных поточных пульповых и порошковых анализаторов 22 и 21 физико-химических свойств проб и устройства 23 управления комплексом. Обеспечивается повышение эффективности системы путем повышения достоверности получаемой аналитической информации и расширения функциональных возможностей системы аналитического контроля пульповых продуктов. 2 з.п. ф-лы, 1 ил.

Изобретение относится к устройствам для взятия проб в жидком или текучем состоянии и может быть использовано в ядерных реакторах с жидкометаллическим теплоносителем для отбора проб расплавленного теплоносителя. Устройство содержит емкость 1 для фиксации отобранной пробы теплоносителя, трубку 2 и трубопровод 3 для подключения емкости к линии вакуум-насоса. Емкость 1 установлена снаружи боковой стенки реактора. Нижний торец емкости 1 герметично закрыт днищем, в котором выполнено отверстие 4 для выхода отобранной пробы с возможностью его перекрытия на период отбора пробы. Для подачи пробы теплоносителя в емкость 1 к ней одним концом присоединена трубка 2. Второй конец трубки 2 свободный и расположен за пределами емкости 1 ниже места сообщения трубки 2 с емкостью 1 и предназначен для погружения в теплоноситель. Канал 7 в боковой стенке реактора выполнен наклонным для прохода трубки устройства во внутриреакторное пространство. Обеспечивается упрощение конструкции устройства и улучшение радиационной обстановки при отборе пробы. 1 з.п. ф-лы, 1 ил.

Изобретение относится к области гидрологии, а именно к устройствам для забора проб воды при измерении локального и общего расхода воды малых струящихся водопадов, где площадь стекания воды может составлять несколько десятков квадратных метров. Устройство для забора воды содержит прикрепленную к держателю емкость с водозаборной частью и водоотводящей частью, подключенной к измерителю расхода воды. Для повышения точности измерения расхода воды малых струящихся водопадов емкость со стороны водозаборной части содержит на входе прижимное кольцо с размещенным по контуру лицевой ее части уплотнительным кольцом, изготовленным из мягкого водонепроницаемого материала, например поролона. При этом водоотводящая часть емкости выполнена переходящей в трубу, к которой прикреплен гибкий шланг, подключенный к измерителю расхода воды. В качестве измерителя расхода воды используется мерная емкость либо стандартный механический расходомер. При этом емкость для забора воды выполнена в виде жесткого цилиндра с отводящим для воды патрубком либо в виде гибкой конусной воронки с гладкой или гофрированной поверхностью. Для удобства в работе держатель выполнен в виде ручки, прикрепленной с торцевой стороны к прижимному кольцу. Обеспечивается повышение функциональных возможностей устройства и точности измерения расхода воды. 3 з.п. ф-лы, 4 ил.

Изобретение относится к медицине и биологии и может быть использовано для фиксации головки бедренной кости в процессе ее распила при подготовке биологического материала к гистологическому исследованию. Устройство содержит корпус и удерживающие элементы. Корпус имеет четыре вертикальные стенки, отходящие от основания. В середине каждой стенки корпуса имеется сквозное отверстие, проходящее от верхней кромки до основания. По обе стороны от сквозного отверстия вдоль него рядами расположены отверстия с резьбой, предназначенные для установки в них удерживающих элементов в виде винтов с ручками и заостренными концами. Устройство изготовлено из сплава железа с хромированным покрытием. Обеспечивается получение высококачественных образцов костной ткани, пригодных для дальнейшего гистологического исследования, за счет сохранности гистологических структур кости, а также обеспечивается сокращение сроков получения образца и снижение трудоемкости. 1 з.п. ф-лы, 4 ил.
Наверх