Новая молочнокислая бактерия и способ производства с ее помощью силоса или ферментированного корма

Предложены штамм молочнокислой бактерии Lactococcus lactis SBS-0001 (NITE BP-1107) и штамм молочнокислой бактерии Lactococcus lactis SBS-0002 (NITE BP-1108) для производства силоса. Указанные штаммы способны подавлять маслянокислое брожение в сырье для силоса или ферментированного корма, имеющем низкое содержание сахара, и не отличающемся достаточным качеством брожения при использовании обычной молочнокислой бактерии. Предложена также микробная добавка для производства силоса, препарат которой содержит один из указанных штаммов и штамм молочнокислой бактерии Lactobacillus paracasei SBS-0003 (NITE BP-1109), обладающий кислотной устойчивостью. Указанную микробную добавку используют в способе получения силоса, предусматривающем добавление микробной добавки к сырью и брожение сырья, содержащего микробную добавку для производства силоса, при температуре от 5 до 30°C в течение 1 недели и более. Группа изобретений позволяет улучшить качество брожения силоса. 4 н.п. ф-лы, 15 табл., 2 пр.

 

Область техники

Настоящее изобретение относится к молочнокислой бактерии, способной подавлять маслянокислое брожение, к микробной добавке, содержащей бактерию, а также к способу производства силоса или ферментированного корма с использованием микробной добавки.

Уровень техники

Силос, который получают в результате молочнокислого брожения основного корма для скота, такого как трава и кормовые культуры, в анаэробных условиях, в настоящее время является важным кормом, используемым в молочном животноводстве. Таким образом, производство высококачественного силоса очень важно для молочных фермеров. В процессе молочнокислого брожения часто параллельно происходит нежелательное вредное брожение. Это проблематичное брожение вызвано более активным размножением в силосе маслянокислых бактерий по сравнению с молочнокислыми бактериями, что приводит к увеличению содержания в силосе масляной кислоты. При увеличении содержания масляной кислоты в силосе вкусовые качества корма ухудшаются, и потребление корма коровами снижается, а также начинают развиваться такие проблематичные заболевания, как кетоз. Для предотвращения такой порчи, вызванной маслянокислыми бактериями, широко используемым методом является использование молочнокислой бактерии в качестве добавки к силосу. Действительно, были использованы различные молочнокислые бактерии, и большинство из них подавляют маслянокислое брожение за счет ускорения молочнокислого брожения для снижения pH. Однако в условиях, способствующих маслянокислому брожению (в частности, высоком содержании воды, низком содержании сахара и загрязнении большим количеством почвы), эти молочнокислые бактерии могут недостаточно подавлять маслянокислые бактерии. Даже в настоящее время неизбежное производство силоса, испорченного маслянокислым брожением, является проблемой.

Для получения эффекта от молочнокислой бактерии, добавленной к силосу, в сырой траве содержание растворимых сахаридов (сухого вещества) должно быть на уровне 5,0-6,0% (что эквивалентно 1,0-3,0% в сыром веществе) или выше (непатентный документ 1). Кроме того, поскольку многие виды трав и кормовых культур имеют низкое содержание сахара, все молочнокислые бактерии, о которых когда-либо сообщалось, часто не в состоянии оказывать достаточный эффект на качество силоса и подавлять маслянокислое брожение.

Между тем, некоторые молочнокислые бактерии, как известно, производят бактериоцин, антибактериальный белок, в процессе ферментации или культивирования. Одним из таких бактериоцинов является низин, антибактериальный белок, состоящий из 34 аминокислот и продуцируемый некоторыми штаммами Lactococcus lactis, молочнокислых бактерий, который содержит в своей молекуле лантионин, 3-метиллантионин, дегидроаланин, дегидробутирин и 2-аминомасляную кислоту. Низин имеет несколько аналогов, и структуры трех аналогов низина, низина A, низина Z и низина Q, уже определены. Недавно стало известно о низине U, продуцируемом Streptococcus uberis, и низине F, продуцируемом Lactococcus lactis.

Низин имеет широкий спектр антибактериального действия в отношении грамположительных бактерий, включая маслянокислую бактерию. Так, при добавлении к силосу низин может ингибировать маслянокислую бактерию. В настоящее время низин A, являющийся аналогом низина, широко используется в пищевой промышленности в качестве пищевого консерванта для сыра и консервированных овощей, поскольку низин A получил одобрение ВОЗ и ФАО. Однако в случае, когда низин непосредственно добавляют к пище, необходим низин в высокой концентрации, который должен быть получен в результате культивирования молочнокислой бактерии, а также стадий экстракции, очистки и высушивания. Таким образом, процесс в целом требует высоких затрат. Кроме того, низин проявляет немедленный антибактериальный эффект, однако этот эффект трудно сохранить и он может снижаться в некоторых случаях вследствие взаимодействия с ингредиентом, к которому низин был добавлен.

Учитывая данные обстоятельства, были проведены исследования по добавлению продуцирующей низин молочнокислой бактерии к пищевым продуктам, таким как сыр, квашеная капуста, соевое мисо и рисовое мисо (непатентные документы 2-5), однако такую молочнокислую бактерию никогда не использовали на практике применительно к траве и кормовым культурам (сырью силоса), отходам при производстве продуктов питания, и так далее. Одна из возможных причин этого заключается в следующем. Это силосное сырье бедно питательными веществами, включая сахар, который является важным компонентом для роста молочнокислых бактерий, по сравнению с пищевыми продуктами. Кроме того, поскольку это силосное сырье не проходит стадию стерилизации, которую, как правило, проходят пищевые продукты, молочнокислая бактерия растет в конкуренции с другими микроорганизмами. Таким образом, даже при добавлении продуцирующей низин молочнокислой бактерии, которая эффективна в случае пищевых продуктов, эффект может не проявиться в полной степени. В попытке преодолеть данный недостаток, сообщалось о молочнокислой бактерии, которая продуцирует низин в высокой концентрации в синтетической культуральной среде, и о продукции низина в среде ферментированного ячменного экстракта (патентный документ 1 и непатентный документ 6). Однако ни в одном документе предшествующего уровня техники не описано производство низина в высокой концентрации в силосном материале, содержащем другое питательное вещество, хотя раскрыто производство низина в высокой концентрации в синтетической культуральной среде или в среде ферментированного ячменного экстракта.

В случае, когда молочнокислую бактерию добавляют к силосу, известно, что к сырью для силоса добавляют Lactococcus lactis RO50, способную продуцировать бактериоцин (патентный документ 2). Однако в некоторых случаях не был достигнут достаточный эффект улучшения брожения, что свидетельствует о том, что эффект Lactococcus lactis RO50 не достигается систематически. Кроме того, четко не выяснено, действительно ли Lactococcus lactis RO50 продуцирует бактериоцин в силосе (непатентные документы 7 и 8). В патентном документе 3 раскрыт способ внесения добавок в силос, в котором используют продуцирующую низин молочнокислую бактерию и устойчивую к низину молочнокислую бактерию, и в силосе определяют активность низина, составляющую 200 МЕ/г. Тем не менее, по сравнению со случаем, когда добавляют не продуцирующую низин молочнокислую бактерию, качество брожения, включая pH, общее содержание органической кислоты, отношение аммонийного азота к общему азоту и так далее, существенно не менялось. Кроме того, эксперимент проводили при содержании сахара, при котором обычно используемая молочнокислая бактерия может оказывать благоприятный эффект на брожение (5,0% или выше (сухое вещество), 1,0% или выше (сырое вещество)). Таким образом, в патентном документе 3 не описан эффект молочнокислой бактерии в жестких условиях низкого содержания сахара.

Список цитированной литературы

Патентные документы

Патентный документ 1: WO 2005/080550.

Патентный документ 2: JP-A-2004-41064.

Патентный документ 3: EP 1273237 A1.

Непатентные документы

Непатентный документ 1: Takayoshi MASUKO (1999), Progress in Silage Science, Dairy Japan Corporation, 99-101.

Непатентный документ 2: Delves-Broughton, J. et al., Antonie van Leeuwenhoek (1996) 69: 193-202.

Непатентный документ 3: Harris, L. J. et al., Appl. Environ. Microbiol.(1992) 58: 1484-1589.

Непатентный документ 4: Takeo Kato et al., Biosci. Biotechnol. Biochem. (1999) 63: 642-647.

Непатентный документ 5: Takeo Kato et al., Biosci. Biotechnol. Biochem. (2001) 65: 330-337.

Непатентный документ 6: Furuta Y. et al., J. Biosci. Bioeng. (2008) 106: 393-397.

Непатентный документ 7: Cai Yimin et al., Research Results of NARO Institute of Livestock and Grassland Science (2002) No. 2: 53-54.

Непатентный документ 8: Hisami Kobayashi et al., Japanese Journal of Grassland Science (2010) 56: 39-46.

Сущность изобретения

Проблемы, решаемые с помощью изобретения

Задачей настоящего изобретения является получение путем отбора молочнокислой бактерии, способной продуцировать низин в высокой концентрации даже в условиях брожения силоса, когда легко развивается маслянокислое брожение, чтобы тем самым создать способ систематического получения высококачественного силоса и высококачественного ферментированного корма, включающий добавление к силосу микробной добавки, содержащей молочнокислую бактерию, обладающую такой способностью.

Средства для решения проблем

Для того чтобы выбрать молочнокислую бактерию, способную демонстрировать высокую производительность в силосе, авторы изобретения создали травяную бульонную питательную среду без добавления сахара и с существенно более низким содержанием моно- и дисахаридов. Авторы изобретения культивировали молочнокислые бактерии с использованием созданной таким образом среды и выбрали продуцирующие низин молочнокислые бактерии путем скрининга. В результате авторам изобретения удалось получить путем скрининга молочнокислую бактерию, проявляющую более высокую низин-продуцирующую активность в травяной бульонной питательной среде, по сравнению с известными продуцирующими низин штаммами молочнокислых бактерий. Настоящее изобретение было осуществлено на основе этих результатов.

Соответственно, настоящее изобретение относится к следующим пунктам [1]-[11].

[1] Молочнокислая бактерия, продуцирующая низин в травяной бульонной питательной среде, имеющей общее содержание моно- и дисахаридов от 0,1 до 0,4 масс.%, в концентрации 40 МЕ или более на мл супернатанта среды.

[2] Молочнокислая бактерия по п.[1], продуцирующая низин в травяной бульонной питательной среде, имеющей общее содержание моно- и дисахаридов от 0,1 до 0,7 масс.%, в концентрации 100 МЕ или более на мл супернатанта среды.

[3] Молочнокислая бактерия по п.[1] или [2], продуцирующая низин в травяной бульонной питательной среде, имеющей общее содержание моно- и дисахаридов от 0,1 до 0,4 масс.%, в концентрации 100 МЕ или более на мл супернатанта среды.

[4] Молочнокислая бактерия по любому из пунктов [1]-[3], представляющая собой штамм SBS-0001 Lactococcus lactis (NITE BP-1107) или штамм SBS-0002 Lactococcus lactis (NITE BP-1108).

[5] Микробная добавка для производства силоса, содержащая молочнокислую бактерию, продуцирующую низин в травяной бульонной питательной среде, имеющей общее содержание моно- и дисахаридов от 0,1 до 0,4 масс.%, в концентрации 40 МЕ или более на мл супернатанта среды.

[6] Микробная добавка для производства силоса по п.5, отличающаяся тем, что молочнокислая бактерия представляет собой молочнокислую бактерию по любому из пунктов [2]-[4].

[7] Микробная добавка для производства силоса по п.[5] или [6], дополнительно содержащая молочнокислую бактерию, обладающую кислотной устойчивостью.

[8] Микробная добавка для производства силоса по п.[7], отличающаяся тем, что молочнокислая бактерия, обладающая кислотной устойчивостью, представляет собой штамм SBS-0003 Lactobacillus paracasei (NITE BP-1109).

[9] Способ производства силоса или ферментированного корма, включающий использование микробной добавки для производства силоса, содержащей молочнокислую бактерию, продуцирующую низин в травяной бульонной питательной среде, имеющей общее содержание моно- и дисахаридов от 0,1 до 0,4 масс.%, в концентрации 40 МЕ или более на мл супернатанта среды.

[10] Способ производства силоса или ферментированного корма по п.[9], отличающийся тем, что молочнокислая бактерия представляет собой молочнокислую бактерию по любому из пунктов [2]-[4].

[11] Способ производства силоса или ферментированного корма по п.[9] или [10], отличающийся тем, что микробная добавка для производства силоса дополнительно содержит молочнокислую бактерию, обладающую кислотной устойчивостью.

Эффекты изобретения

В настоящее время многие молочные фермеры страдают от проблем, связанных с маслянокислым брожением силоса и ферментированного корма. По настоящему изобретению предложена молочнокислая бактерия, продуцирующая низин даже в материале с низким содержанием сахара, который похож на силос, предназначенный для брожения. По настоящему изобретению также предложена микробная добавка, содержащая вышеуказанную молочнокислую бактерию и дополнительную молочнокислую бактерию, обладающую кислотной устойчивостью, при этом добавка подавляет маслянокислое брожение, тем самым способствуя желательному молочнокислому брожению. В соответствии с настоящим изобретением можно производить силос или ферментированный корм с гарантированной высокой безопасностью и высокой вкусовой привлекательностью для домашнего скота.

Способы осуществления изобретения

Продуцирующую низин молочнокислую бактерию по настоящему изобретению получают путем отбора молочнокислой бактерии, продуцирующей низин в травяной бульонной питательной среде, имеющей общее содержание моно- и дисахаридов 1,0 масс.% или менее, предпочтительно 0,7 масс.% или менее, более предпочтительно 0,4 масс.% или менее.

В настоящем изобретении не существует никаких особых ограничений в отношении травы для получения травяной бульонной питательной среды, в которой проводят отбор продуцирующей низин молочнокислой бактерии, при условии, что траву используют в качестве силоса или ферментированного корма. Примеры травы включают люцерну, клевер, тимофеевку, ежу, двукисточник тростниковидный, пырей, итальянский райграс, пастбищный райграс, овсяницу высокую, овсяницу луговую, фестулолиум, мятлик луговой, полевицу белую, просо гвинейское, хлорис гвианскую и слоновую траву. С учетом условий, в которых существует вероятность маслянокислого брожения, трава предпочтительно является травой с низким содержанием сахара, такой как люцерна, клевер, тимофеевка, ежа, двукисточник тростниковидный, пырей, просо гвинейское, хлорис гвианская или слоновая трава. Трава может быть как свежескошенным зеленым кормом, так и полученным из травы охлажденным или замороженным продуктом. Альтернативно, можно также использовать сухой порошок из травы, полученный путем сушки обдувом или лиофилизации свежей травы с последующим измельчением. Кроме того, можно также использовать обычные доступные кормовые продукты, такие как гранулы люцерны и кубы сена.

Травяная бульонная питательная среда, используемая по настоящему изобретению, представляет собой среду, содержащую в качестве единственного питательного вещества жидкость, полученную при замачивании описанной выше травы в горячей воде. Температура горячей воды составляет предпочтительно 50-100°C, более предпочтительно 70-100°C. Время для замачивания травы в горячей воде составляет предпочтительно от 10 до 180 минут, более предпочтительно от 30 до 120 минут. При необходимости, настоянную на траве жидкость предпочтительно фильтруют для удаления твердого материала перед использованием. Для отбора молочнокислой бактерии, продуцирующей низин в условиях низкого содержания сахара, травяную бульонную питательную среду, используемую по изобретению, предпочтительно разбавляют водой таким образом, чтобы общее содержание в ней моно- и дисахаридов составляло 1,0 масс.% или менее, предпочтительно 0,7 масс.% или менее, более предпочтительно 0,4 масс.% или менее. Нижний предел общего содержания моно- и дисахаридов составляет предпочтительно 0,1 масс.%, более предпочтительно 0,2 масс.%.

При отборе продуцирующей низин молочнокислой бактерии по настоящему изобретению можно использовать условия культивирования, при которых можно выращивать обычные молочнокислые бактерии. В одном примере молочнокислые бактерии инокулируют в травяную бульонную питательную среду при концентрации клеток от 0,1 до 1,0 масс.% и проводят статическое культивирование при 25-35°C в течение 8-24 часов.

Само собой разумеется, что поскольку продуцирующий низин штамм обладает устойчивостью к низину, при первичном скрининге можно отбирать штаммы, способные расти в среде с добавлением низина. В этом случае среда для скрининга может представлять собой среду MRS, содержащую низин в концентрации от 100 до 1000 МЕ/мл. Продуцирующую низин бактерию, способную выполнить задачу по настоящему изобретению, можно выбирать путем измерения концентрации низина или активности низина в культуральном супернатанте. Концентрацию низина можно определять таким методом, как высокоэффективная жидкостная хроматография. Активность низина можно определять как антибактериальную активность в отношении чувствительного к низину штамма молочнокислой бактерии или маслянокислой бактерии; например, Lactobacillus bulgaricus. Активность низина предпочтительно определяют как содержание низина. Содержание низина в культуральном супернатанте можно определять общеизвестным методом. В одном конкретном методе активность низина можно определять с помощью лунок в агаровом геле. Более конкретно, пенициллиновые флаконы (диаметр: 8 мм) помещают на чашку 1,5% агара со средой MRS. На агар со средой наслаивают 0,75% агар со средой MRS, содержащей 0,1% раствор культуры Lactobacillus bulgaricus JCM1002T в качестве индикаторной бактерии. После затвердевания агара пенициллиновые флаконы удаляют, и чашку используют в качестве среды для пластинчатых разводок в антибактериальном тесте. Каждый культуральный супернатант фильтруют для удаления ненужных микроорганизмов и добавляют в лунки, сформированные при помощи пенициллиновых флаконов. Чашку культивируют в анаэробных условиях при 37°C в течение 24 часов, и измеряют диаметр кольца ингибирования для индикаторной бактерии. При использовании препарата низина (производства Sigma, содержание низина: 2,5%) в качестве стандарта, можно получить активность низина на микрограмм низина, соответствующую 40 МЕ (1 МЕ эквивалентна 1 мкг препарата низина).

Молочнокислая бактерия по настоящему изобретению представляет собой молочнокислую бактерию, продуцирующую низин в травяной бульонной питательной среде, имеющей общее содержание моно- и дисахаридов от 0,1 до 0,4 масс.%, в концентрации 40 МЕ или более на мл супернатанта среды.

В одном предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения молочнокислая бактерия продуцирует низин в травяной бульонной питательной среде, имеющей общее содержание моно- и дисахаридов от 0,1 до 0,7 масс.%, в концентрации 100 МЕ или более на мл супернатанта среды. Более предпочтительно, молочнокислая бактерия продуцирует низин в травяной бульонной питательной среде, имеющей общее содержание моно- и дисахаридов от 0,1 до 0,4 масс.%, в концентрации 100 МЕ или более на мл супернатанта среды.

Вышеуказанное общее содержание моно- и дисахаридов в травяной бульонной питательной среде более предпочтительно составляет от 0,2 до 0,4 масс.%. Продукция низина в среде составляет 40 МЕ или более на мл супернатанта, предпочтительно 100 МЕ или более, даже более предпочтительно от 100 до 400 МЕ, даже более предпочтительно от 100 до 300 МЕ.

Кроме того, даже в условиях низкого рН (то есть, pH 5), молочнокислая бактерия по настоящему изобретению продуцирует низин в травяной бульонной питательной среде, имеющей общее содержание моно- и дисахаридов от 0,1 до 0,4 масс.%, в концентрации 40 МЕ или более на мл супернатанта среды. Поскольку молочнокислая бактерия по настоящему изобретению способна продуцировать низин в условиях низкого рН, молочнокислая бактерия по настоящему изобретению сохраняет способность продуцировать низин в течение длительного периода времени.

Вышеуказанная продуцирующая низин молочнокислая бактерия предпочтительно принадлежит к роду Lactococcus, более предпочтительно к Lactococcus lactis. Конкретные примеры включают штамм SBS-0001 Lactococcus lactis (NITE BP-1107), штамм SBS-0002 Lactococcus lactis (NITE BP-1108), штамм SBS-0004 Lactococcus lactis и штамм SBS-0005 Lactococcus lactis. Из них, штамм SBS-0001 Lactococcus lactis (NITE BP-1107) и штамм SBS-0002 Lactococcus lactis (NITE BP-1108) являются предпочтительными.

Вышеуказанные штамм SBS-0001 и штамм SBS-0002 депонированы в депозитарии патентованных микроорганизмов Национального института технологии и оценки (2-5-8, Kazusakamatari, Kisarazu, Chiba, 292-0818, Япония) 15 июня 2011 г.

Молочнокислая бактерия по настоящему изобретению способна расти даже в присутствии травы с низким содержанием сахара и может проявлять способность к брожению, тем самым продуцируя низин в больших количествах. Таким образом, бактерия по настоящему изобретению полезна в качестве ингредиента микробной добавки для производства силоса.

Вышеуказанную молочнокислую бактерию можно культивировать в обычной культуральной среде для молочнокислых бактерий. Никаких конкретных ограничений не существует в отношении среды, при условии, что среду можно использовать для культивирования молочнокислых бактерий. Примеры среды, которую можно использовать по настоящему изобретению, включают среду GYP (Michio KOZAKI et al., Manual for Experiments of lactobacillus, 1992, Asakura Publishing Co., Ltd.) и среду MRS (de Man J.C. et al., Journal of Applied Bacteriology, Vol. 23, 130-135 (1960)). Никаких конкретных ограничений не существует в отношении условий культивирования. Как правило, культивирование можно проводить при рН 5,0-7,0 и температуре 25-40°C в течение 10-24 часов. Продукт культивирования молочнокислой бактерии можно добавлять к силосу или ферментированному корму в виде концентрата культурального раствора или гранул. Концентрат можно замораживать для использования. Альтернативно, продукт культивирования молочнокислой бактерии можно лиофилизировать, высушивать распылением или высушивать в псевдоожиженном слое с соответствующим защитным средством или носителем, и использовать полученный таким образом порошок.

Микробная добавка по настоящему изобретению может содержать продуцирующие низин штаммы молочнокислой бактерии, входящие в объем настоящего изобретения, сами по себе или в сочетании с различными видами. Кроме того, микробная добавка может содержать дополнительную молочнокислую бактерию. В частности, если добавка содержит кислотоустойчивую молочнокислую бактерию, маслянокислое брожение подавляется, и может происходить полезное молочнокислое брожение. В этом случае, разумеется, дополнительная молочнокислая бактерия представляет собой предпочтительно штамм с высокой устойчивостью к низину. Никаких конкретных ограничений не существует в отношении кислотоустойчивой молочнокислой бактерии, и примеры включают Lactobacillus plantarum, Lactobacillus casei, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus salivarius, Enterococcus faecium, Pediococcus acidilactici и Pediococcus pentosaceus. Примеры предпочтительных кислотоустойчивых молочнокислых бактерий включают штамм SBS-0003 Lactobacillus paracasei (NITE BP-1109), штамм SBT-2300 Lactobacillus rhamnosus и штамм Chikuso-1 Lactobacillus plantarum. Из них, штамм SBS-0003 Lactobacillus paracasei (NITE BP-1109) является более предпочтительным.

Вышеуказанный штамм SBS-0003 был депонирован в депозитарии патентованных микроорганизмов Национального института технологии и оценки (2-5-8, Kazusakamatari, Kisarazu, Chiba, 292-0818, Япония) 15 июня 2011 г.

В микробной добавке никаких конкретных ограничений не существует для соотношения молочнокислой бактерии по настоящему изобретению и кислотоустойчивой молочнокислой бактерии. Соотношение по массе составляет предпочтительно от 1:100 до 100:1, более предпочтительно от 1:9 до 9:1, даже более предпочтительно от 3:7 до 7:3.

Микробная добавка по настоящему изобретению может дополнительно содержать фермент в соответствии с потребностями. Примеры ферментов включают целлюлазу и гемицеллюлазу.

Микробную добавку по настоящему изобретению можно использовать для получения разнообразного силоса и ферментированных кормовых продуктов. Никаких конкретных ограничений не существует в отношении сырья для силоса и сырья для ферментированного корма, которое используют для производства разнообразного силоса и ферментированных кормовых продуктов, при условии, что их, как правило, используют в качестве корма. Примеры травы и кормовых культур включают люцерну, клевер, тимофеевку, ежу, двукисточник тростниковидный, пырей, итальянский райграс, пастбищный райграс, овсяницу высокую, овсяницу луговую, фестулолиум, мятлик луговой, полевицу белую, просо гвинейское, хлорис гвианскую, слоновую траву, овес, ячмень, рожь, сорго, суданскую траву, японское просо, кукурузу и кормовой рис. Примеры отходов при производстве пищевых продуктов включают пивные зерна, отходы тофу (соевого творога), отходы чая, отходы при производстве шочу (японского алкогольного напитка), отходы при производстве виски, свекловичный жом, жмых, отходы кофе, отходы при производстве сока, отходы капусты и отходы крахмала. Примеры сельскохозяйственных отходов включают рисовую солому, солому и некондиционные овощи. Микробную добавку по настоящему изобретению можно добавлять к ферментированным полнорационным смесям (TMR), которые готовят путем смешивания отходов производства пищевых продуктов, силоса, сельскохозяйственных отходов, сена, концентрированных кормов, витаминов и минералов, и так далее. Такое сырье для силоса и сырье для ферментированных кормов предпочтительно используют после доведения содержания воды в них до 40-90 масс.%.

Примеры способа внесения микробной добавки включают растворение или суспендирование добавки в воде и опрыскивание жидкостью сырья, а также распределение или смешивание микробной добавки в порошковой форме с сырьем.

Количество клеток, добавленных в сырье, составляет предпочтительно 10³-10⁷ всех клеток на грамм сырья, более предпочтительно 10⁴-10⁶ клеток.

При производстве силоса или ферментированного корма, как правило, происходит брожение сырья в анаэробных условиях. Никаких конкретных ограничений не существует в отношении силосохранилища для брожения, при условии, что там до некоторой степени могут поддерживаться анаэробные условия. Примеры силосохранилища включают бункерное силосохранилище, стеллажное силосохранилище, траншейное силосохранилище, башенное силосохранилище, подземное силосохранилище, блочное силосохранилище, цилиндрическое силосохранилище, сенные рулоны и гибкий контейнерный мешок. Как правило, брожение происходит при температуре наружной среды (от примерно 5 до примерно 30°C) в течение одной недели или дольше.

В силосе и ферментированном корме, полученном с использованием микробной добавки по настоящему изобретению, маслянокислое брожение эффективно подавляется. Таким образом, силос и ферментированный корм сохраняют высокую вкусовую привлекательность, хорошо поедаются коровами и не вызывают кетоз.

Примеры

Далее настоящее изобретение будет описано подробно с помощью примеров, которые не должны быть истолкованы как ограничивающие изобретение.

<Пример 1> Активность низина в травяной бульонной питательной среде

Каждую молочнокислую бактерию культивировали в травяной бульонной питательной среде и измеряли активность низина в супернатанте культурального раствора.

Травяную бульонную питательную среду готовили следующим образом. Дистиллированную воду (1 л) добавляли к гранулам люцерны (100 г) и смесь нагревали в кипящей водяной бане до температуры жидкости 90°C. Затем ингредиенты травы экстрагировали при 90°C в течение 30 минут. Смесь фильтровали через марлю, и полученный таким образом остаток отжимали. Фильтрат центрифугировали, и жидкость фильтровали через фильтровальную бумагу. Полученный таким образом фильтрат разбавляли до 1 л, и разбавленный раствор разливали по пробиркам. Эти образцы стерилизовали в автоклаве (115°C, 20 минут).

Содержание сахара в травяной бульонной питательной среде определяли следующим образом. Ацетонитрил (840 мкл) добавляли к среде (360 мкл), с последующим перемешиванием, и смесь оставляли стоять при комнатной температуре в течение 15 минут. Смесь центрифугировали (15000 об/мин, 15 минут) для удаления осадка, и супернатант фильтровали через 0,2-мкм фильтр. Фильтрат анализировали методом ВЭЖХ. Количество моносахаридов и дисахаридов (ксилозы, глюкозы, фруктозы и сахарозы) суммировали, получая содержание сахара.

Каждую из молочнокислых бактерий, представленных в таблице 1, предварительно культивировали в жидкой среде MRS. Полученный таким образом раствор предварительной культуры центрифугировали для удаления среды. К клеточным осадкам добавляли эквивалентное количество физиологического раствора. Клеточную суспензию инокулировали в количестве 1% в травяную бульонную питательную среду, и проводили статическое культивирование при 32°С в течение 8 часов. Измеряли оптическую плотность (при 660 нм) культурального раствора. Затем культуральный раствор центрифугировали и фильтровали через 0,2-мкм фильтр для удаления клеток. Активность низина в культуральном супернатанте определяли с помощью метода лунок в агаровом геле.

Таблица 1
Штамм бактерий
SBS-0001	Тестируемый штамм
SBS-0002	Тестируемый штамм
RO50	Контрольный штамм: продуцирующий бактериоцин
ATCC 11454	Контрольный штамм: продуцирующий низин A
JCM 7638	Контрольный штамм: продуцирующий низин Z

Метод лунок в агаровом геле применяли следующим образом. Более конкретно, пенициллиновые флаконы (диаметр: 8 мм) помещали на чашку 1,5% агара со средой MRS. На агар со средой наслаивали 0,75% агар со средой MRS, содержащей 0,1% раствор культуры Lactobacillus bulgaricus JCM1002T в качестве индикаторной бактерии. После затвердевания агара пенициллиновые флаконы удаляли, и чашку использовали в качестве среды для пластинчатых разводок в антибактериальном тесте. Каждый культуральный супернатант фильтровали для удаления ненужных микроорганизмов и добавляли в лунки, сформированные при помощи пенициллиновых флаконов. Чашку культивировали в анаэробных условиях при 37°C в течение 24 часов, и измеряли диаметр кольца ингибирования для индикаторной бактерии. Добавку низина (производства Sigma, содержание низина: 2,5%) использовали в качестве стандарта, и активность низина на микрограмм низина принимали за 40 МЕ (1 МЕ эквивалентна 1 мкг добавки низина).

Таблица 2
Штамм Lactobacillus	O.D. 660	Активность низина (МЕ/мл)
SBS-0001 (экс.)	0,88	165,56
SBS-0002 (экс.)	0,85	165,56
RO50 (контроль)	0,82	30,36
ATCC 11454 (контроль)	0,75	0

Содержание сахара в травяной бульонной питательной среде: 0,33%

Таблица 3
Штамм Lactobacillus	O.D. 660	Активность низина (МЕ/мл)
SBS-0001 (экс.)	0,75	145,03
SBS-0002 (экс.)	0,84	169,94
JCM 7638 (контроль)	0,77	0

Содержание сахара в травяной бульонной питательной среде: 0,31%

Таблица 4
Штамм Lactobacillus	O.D. 660	Активность низина (МЕ/мл)
SBS-0001 (экс.)	1,15	192,91
SBS-0002 (экс.)	1,21	229,66
JCM 7638 (контроль)	1,14	96,05

Содержание сахара в травяной бульонной питательной среде: 0,68%

Таблица 5
Штамм Lactobacillus	O.D. 660	Активность низина (МЕ/мл)
SBS-0001 (экс.)	0,53	44,59
SBS-0002 (экс.)	0,54	40,25
RO50 (контроль)	0,62	0

Содержание сахара в травяной бульонной питательной среде: 0,33%

Исходное значение pH: 5,0

Как видно из таблиц 2 и 3, в травяной бульонной питательной среде с содержанием сахара примерно 0,3%, продуцирующий низин A штамм ATCC 11454, продуцирующий низин Z штамм JCM 7638 и продуцирующий бактериоцин штамм RO50 демонстрировали такие же показатели роста (O.D. 660), что и показатели у штамма SBS-0001 и штамма SBS-0002, однако отличались очень низкой активностью низина. Напротив, штамм SBS-0001 и штамм SBS-0002 проявляли очень высокую активность низина в травяной бульонной питательной среде с содержанием сахара примерно 0,3%.

Кроме того, как видно из таблицы 4, штамм SBS-0001 и штамм SBS-0002 демонстрировали более высокие показатели роста и активность низина в травяной бульонной питательной среде с содержанием сахара примерно 0,7%, чем в травяной бульонной питательной среде с содержанием сахара примерно 0,3%. Напротив, штамм JCM 7638 демонстрировал активность, составляющую половину или менее от активности штамма SBS-0001 или штамма SBS-0002.

Значение рН силоса, как известно, снижается в процессе брожения. Таким образом, с тем чтобы обеспечить долговременный стойкий эффект, низин предпочтительно должен продуцироваться также при низком значении pH. Однако, как известно, способность к продукции низина снижается при снижении pH в культуре. Как видно из таблицы 5, если исходное значение pH травяной бульонной питательной среды доводили до 5,0, у всех тестируемых штаммов наблюдали пониженную активность низина в каждом культуральном супернатанте. Хотя у штамма RO50 наблюдали активность низина, равную 0, штамм SBS-0001 и штамм SBS-0002 демонстрировали активность низина, составляющую 40 МЕ/мл или выше.

<Пример 2> Производство силоса и качество брожения

Образцы силоса получали путем добавления молочнокислой бактерии к траве, и исследовали качество брожения в каждом образце.

Молочнокислые бактерии, приведенные в таблице 6, получали следующим образом. Каждый клеточный штамм инокулировали в жидкую среду GYP и культивировали при 37°С в течение 24 часов. Культуральный раствор центрифугировали (6500 об/мин, 15 минут), и супернатант отбрасывали. К отделенным таким образом клеточным осадкам добавляли 10% раствор трегалозы и 1% раствор глутамата натрия, получая суспензию. Суспензию высушивали, используя лиофильную сушилку.

Таблица 6
Штамм бактерий
SBS-0001	Тестируемый штамм: Lactococcus lactis
SBS-0002	Тестируемый штамм: Lactococcus lactis
SBS-0003	Тестируемый штамм: Lactobacillus paracasei
SBT-2300	Контрольный штамм: Lactobacillus rhamnosus Штамм, используемый в коммерческом продукте Snow Lact L (Snow Brand Seed Co., Ltd.)
RO50	Контрольный штамм: Lactococcus lactis

Образцы силоса получали следующим образом. Тимофеевку, ежу, двукисточник тростниковидный, пырей, итальянский райграс и рожь скашивали на стадии колошения, а люцерну скашивали на стадии цветения. В каждом случае скошенное растение измельчали на куски длиной примерно 2 см. Лиофилизированный порошок каждой молочнокислой бактерии растворяли в воде. Если добавляли один единственный штамм, то бактерию добавляли в количестве 1,0×10⁵ КОЕ на 1 г травяного сырья, с последующим перемешиванием, а если добавляли два штамма, то каждую бактерию добавляли в количестве 5,0×10⁴ КОЕ на 1 г травяного сырья, с последующим перемешиванием. Каждое травяное сырье помещали в пластиковую бутылку из полиэтилена емкостью 1 л или в пластиковый пакет (из многослойной нейлоново-полиэтиленовой пленки). В случае пластиковой бутылки, травяное сырье (600 г) утрамбовывали в бутылку, и бутылку закрывали крышкой. В случае пластикового пакета, травяное сырье (100 г) вносили, и из пакета откачивали воздух с помощью коммерческого всасывающего насоса для герметизации. Эти образцы подвергали брожению при 25°C в течение 2 месяцев. Полученные таким образом образцы силоса анализировали с точки зрения pH (с помощью pH-метра) и содержания органических кислот (методом ВЭЖХ).

Таблица 7
Качество брожения силоса из тимофеевки (пластиковая бутылка)
Обработка	pH	Содержание органических кислот (% от свежего материала)
Молочная кислота	Уксусная кислота	Масляная кислота
Без добавок (контроль)	4,82	0	0,87	0,74
SBT-2300 (контроль)	4,81	0	0,79	0,78
SBT-2300 + RO50 (контроль)	4,86	0	0,38	0,86
SBT-2300 + SBS-0001 (экс.)	4,56	0,62	0,18	0,46

Таблица 8
Качество брожения силоса из двукисточника тростниковидного (пластиковая бутылка)
Обработка	pH	Содержание органических кислот (% от свежего материала)
Молочная кислота	Уксусная кислота	Масляная кислота
Без добавок (контроль)	5,35	0	0,80	0,92
SBT-2300 (контроль)	4,92	0,05	0,25	1,08
SBT-2300 + RO50 (контроль)	4,45	0,72	0,05	0,55
SBT-2300 + SBS-0001 (экс.)	4,30	0,96	0,06	0,38

Таблица 9
Качество брожения силоса из тимофеевки (пакет)
Обработка	pH	Содержание органических кислот (% от свежего материала)
Молочная кислота	Уксусная кислота	Масляная кислота
Без добавок (контроль)	5,10	0	0,22	0,77
SBT-2300 (контроль)	4,25	0,87	0,15	0,51
SBS-0003 (контроль)	3,97	1,43	0,30	0,11
SBS-0003 + SBS-0001 (экс.)	3,80	1,71	0,28	0,01
SBS-0003 + SBS-0002 (экс.)	3,81	1,79	0,30	0

Таблица 10
Качество брожения силоса из ежи (пакет)
Обработка	pH	Содержание органических кислот (% от свежего материала)
Молочная кислота	Уксусная кислота	Масляная кислота
Без добавок (контроль)	5,11	0	0,57	0,94
SBT-2300 (контроль)	5,02	0,02	0,49	0,89
SBS-0003 (контроль)	4,73	0,25	0,30	0,81
SBS-0003 + SBS-0001 (экс.)	3,82	2,61	0,18	0
SBS-0003 + SBS-0002 (экс.)	3,80	2,22	0,15	0

Таблица 11
Качество брожения силоса из люцерны (пакет)
Обработка	pH	Содержание органических кислот (% от свежего материала)
Молочная кислота	Уксусная кислота	Масляная кислота
Без добавок (контроль)	5,63	0	0,74	1,08
SBT-2300 (контроль)	5,64	0	0,82	1,18
SBS-0003 (контроль)	5,69	0	0,84	1,09
SBS-0003 + SBS-0001 (экс.)	4,85	1,31	0,88	0,15
SBS-0003 + SBS-0002 (экс.)	4,74	1,43	0,89	0

Таблица 12
Качество брожения силоса из двукисточника тростниковидного (пластиковая бутылка)
Обработка	pH	Содержание органических кислот (% от свежего материала)
Молочная кислота	Уксусная кислота	Масляная кислота
Без добавок (контроль)	4,98	0	1,10	0,78
SBT-2300 (контроль)	5,11	0	0,77	0,94
SBS-0003 + SBS-0001 (экс.)	3,89	1,57	0,10	0

Таблица 13
Качество брожения силоса из пырея (пластиковая бутылка)
Обработка	pH	Содержание органических кислот (% от свежего материала)
Молочная кислота	Уксусная кислота	Масляная кислота
Без добавок (контроль)	5,47	0	0,64	1,02
SBT-2300 (контроль)	4,22	1,49	0,10	0,44
SBS-0003 + SBS-0001 (экс.)	3,80	2,59	0,18	0

Таблица 14
Качество брожения силоса из итальянского райграса (пакет)
Обработка	pH	Содержание органических кислот (% от свежего материала)
Молочная кислота	Уксусная кислота	Масляная кислота
Без добавок (контроль)	5,17	0	0,74	1,40
SBT-2300 (контроль)	4,18	2,03	0,21	0,31
SBS-0003 + SBS-0001 (экс.)	3,73	3,06	0,10	0
SBS-0003 + SBS-0002 (экс.)	3,76	3,05	0,12	0

Таблица 15
Качество брожения силоса из ржи (пакет)
Обработка	pH	Содержание органических кислот (% от свежего материала)
Молочная кислота	Уксусная кислота	Масляная кислота
Без добавок (контроль)	5,58	0,24	0,33	0,98
SBT-2300 (контроль)	5,17	0,71	0,29	0,63
SBS-0003 + SBS-0001 (экс.)	4,16	2,03	0,10	0
SBS-0003 + SBS-0002 (экс.)	4,15	2,01	0,10	0

Как видно из таблиц 7 и 8, при добавлении штамма RO50, который способен продуцировать низин в травяной бульонной питательной среде в количестве 40 МЕ/мл или менее, к сырью, качество брожения которого практически не может быть улучшено с помощью штамма SBT-2300 (используемого в качестве коммерческой молочнокислой бактерии для производства силоса), качество брожения силоса существенно не улучшалось, или наблюдался только слабый эффект снижения содержания масляной кислоты. Напротив, при добавлении штамма SBS-0001, обладающего повышенной способностью продуцировать низин в травяной бульонной питательной среде, к травяному сырью уровень масляной кислоты был отчетливо снижен, следствием чего было улучшение качества брожения силоса.

Как видно из таблицы 9, штамм SBS-0003 демонстрировал более высокие показатели молочнокислого брожения, чем показатели штамма SBT-2300. При добавлении штамма SBT-0001 или штамма SBT-0002 уровень масляной кислоты был снижен еще больше.

Как видно из таблиц 10 и 11, при добавлении штамма SBS-0001 или штамма SBS-0002 дополнительно к штамму SBS-0003, содержание масляной кислоты в силосе, качество брожения которого не может быть улучшено за счет штамма SBT-2300 или штамма SBS-0003, было значительно снижено, и было достигнуто заметное улучшение качества брожения.

Как видно из таблиц 9, 10, 11, 12, 13, 14 и 15, при добавлении штамма SBS-0001 или штамма SBS-0002 дополнительно к штамму SBS-0003, уровни масляной кислоты различного сырья, демонстрирующего плохое качество брожения в отсутствие обычных бактерий, и качество брожения которого невозможно было полностью улучшить при помощи штамма SBT-2300, были значительно снижены, и было достигнуто заметное улучшение качества брожения.

1. Молочнокислая бактерия, принадлежащая к роду Lactococcus, представляющая собой штамм SBS-0001 Lactococcus lactis (NITE BP-1107) для производства силоса.

2. Молочнокислая бактерия, принадлежащая к роду Lactococcus, представляющая собой штамм SBS-0002 Lactococcus lactis (NITE BP-1108) для производства силоса.

3. Микробная добавка для производства силоса, препарат которой содержит молочнокислую бактерию, принадлежащую к роду Lactococcus, и молочнокислую бактерию, обладающую кислотной устойчивостью,
где молочнокислой бактерией, принадлежащей к роду Lactococcus, является молочнокислая бактерия по п. 1 или 2,
и где молочнокислой бактерией, обладающей кислотной устойчивостью, является штамм Lactobacillus paracasei SBS-0003 (NITE BP-1109).

4. Способ производства силоса, включающий
- добавление микробной добавки для производства силоса, содержащей молочнокислую бактерию, принадлежащую к роду Lactococcus, и молочнокислой бактерии, обладающей кислотной устойчивостью, к сырью,
где молочнокислой бактерией, принадлежащей к роду Lactococcus, является молочнокислая бактерия по п. 1 или 2,
и где молочнокислой бактерией, обладающей кислотной устойчивостью, является штамм Lactobacillus paracasei SBS-0003 (NITE BP-1109); и
- брожение сырья, содержащего микробную добавку для производства силоса при температуре от 5 до 30°C в течение 1 недели и более.