Модификации аллергенов группы 6 poaceae (мятликовых), имеющих пониженную аллергенность благодаря мутагенезу пролиновых остатков

Настоящее изобретение относится к биотехнологии, конкретно к рекомбинантным модификациям аллергенов группы 6 Poaceae (мятликовых), и может быть использовано в медицине для предупреждения или терапевтического лечения аллергий типа 1, в инициирование которых вовлечены аллергены группы 6 мятликовых. Получают рекомбинантный аллерген Phl p 6, в котором пролины, которые соответствуют в линеаризованном виде пролинам в положениях 29, 30, 57 и 79 аминокислотной последовательности белка Phl p 6 дикого типа в соответствии с SEQ ID №:2, мутированы отдельно или в комбинации за счет точечных мутаций, выбранных из делеций и замен аминокислот. Настоящее изобретение позволяет получить рекомбинантным путем аллерген Phl p 6 с пониженной IgE реактивностью по сравнению с известными немутантными аллергенами и, в то же время, в значительной степени сохраненной реактивностью T-лимфоцитов. 11 н. и 1 з.п. ф-лы, 20 ил., 2 табл., 3 пр.

 

Область изобретения

Представленное изобретение касается получения и использования рекомбинантных модификаций аллергенов труппы 6 Poaceae (мятликовых, истинные травы), которые характеризуются пониженной IgE реактивностью по сравнению с известными аллергенами немутантного типа и, в то же время, в значительной степени сохранили свою реактивность по отношению к T-лимфоцитам.

Данные модификации гипоаллергенных аллергенов могут быть использованы для специфической иммунотерапии (гипосенсибилизация) у пациентов, имеющих аллергию на пыльцу растений, или для профилактического лечения аллергии на пыльцу растений.

Предпочтительный вариант осуществления изобретения касается модификаций аллергена Phl p 6 тимофеевки луговой (Phleum pratense), в которой пролины в положениях 29, 30, 57, 79 мутировали по отдельности или в комбинациях.

Уровень техники изобретения

Аллергии типа 1 имеют всемирное значение. До 20% населения в промышленно развитых странах страдают от недугов, таких как аллергический ринит, конъюнктивит или бронхиальная астма.

Данные аллергии вызывают источники различного происхождения, такие как деревья и травы (пыльца), грибы (споры), клещи (экскременты), коты или собаки. Источники аллергена распространяются напрямую по воздуху (пыльца, споры) или могут распространяться в воздухе, связанные с частицами дизельной сажи (пыльца) или домашней пылью (экскременты клещей, частицы кожи, волосы). В связи с тем, что вещества, запускающие аллергию, находятся в воздухе, также используют термин аэроаллергены.

Вещества, запускающие аллергию типа 1, являются протеинами, гликопротеинами или полипептидами. После проникновения через мембраны слизистой оболочки данные аллергены реагируют с IgE молекулами, связанными с поверхностью тучных клеток у чувствительных лиц. Если данные IgE молекулы являются сшитыми друг с другом посредством аллергена, это в результате приводит к секреции медиаторов (например, гистамина, простагландинов) и цитокинов клеткой-эффектором и, таким образом, к появлению соответствующих аллергических симптомов.

Вплоть до 40% страдающих от аллергии типа 1 демонстрируют специфическую IgE реактивность к экстрактам пыльцы мятликовых (Burney et al., 1997, J. Allergy Clin. Immunol. 99:314-322; D'Amato et al., 1998, Allergy 53:567-578; Freidhoff et al., 1986, J. Allergy Clin. Immunology, 78, 1190-2002). Семейство мятликовых (Poaceae) включает более чем 10000 видов, из которых намного больше чем 20 до настоящего времени известны как инициирующие факторы аллергических симптомов (Andersson & Lidholm, 2003, Int. Arch. Allergy Immunol. 130:87-107; Esch, 2008, Allergens and Allergen Immunotherapy, Clinical Allergy and Immunology Series, 107-126).

Большинство из мятликовых, запускающих аллергию, относятся подсемейству Pooideae (мятликовидные). Кроме того, виды трав, встречающиеся как дикорастущие формы, такие как, например, Holcus lanatus (бухарник шерстистый), Phalaris aquatica (канареечник канарский), Anthoxanthum odoratum (душистый колосок), Dactylis glomerata (ежа сборная), Festuca pratensis (овсяница луговая), Poa pratensis (мятлик луговой) или Lolium perenne (райграс многолетний английский или пастбищный), культурные злаки, такие как Triticum aestivum (пшеница), Secale cereale (рожь) и Hordeum vulgare (ячмень), также являются известными представителями данного подсемейства.

Один из видов Pooideae, который был исследован лучше в отношении своих аллергенов, является тимофеевкой луговой (Phleum pratense), которая широко распространена во всем мире как дикое растение и также играют коммерческую роль как пастбищное растение и большая кормовая трава.

В зависимости от относительного процента встречаемости в популяции, с которой индивидуальные молекулы аллергена реагируют с IgE антителами страдающих от аллергии, различие делают между основными и второстепенными аллергенами.

Шесть аллергенов тимофеевки луговой могут рассматриваться как основные аллергены: Phl p 1 (Petersen et al., 1993, J. Allergy Clin. Immunol. 92:789-796), Phl p 5 (Matthiesen und Löwenstein, 1991, Clin. Exp. Allergy 21:297-307; Petersen et al., 1992, Int. Arch. Allergy Immunol. 98:105-109), Phl p 6 (Petersen et al., 1995, Int. Arch. Allergy Immunol. 108, 49-54), Phl p 2/3 (Dolecek et al., 1993, FEBS 335(3):299-304), Phl p 4 (Haavik et al., 1985, Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 78:260-268; Valenta et al., 1992, Int. Arch. Allergy Immunol. 97:287-294; Nandy et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 2005, 337(2):563-70) и Phl p 13 (Suck et al., 2000, Clin. Exp. Allergy 30:1395-1402).

Первое описание Phl p 6 было сделано еще в 1978. Протеиновая фракция, очищенная от пыльцы тимофеевки луговой, которую назвали "Ag19", содержавшая аллерген с размером около 15 кДа, которую позже классифицировали в официальной номенклатуре аллергенов и продолжают далее как Phl p 6 (Løwenstein, 1978, Allergy 33:30-41; WHO/IUIS Allergen Nomenclature Subcommittee, www.allergen.org). Phl p 6 классифицируют как основной аллерген в связи с тем, что Phl p 6 - реактивные IgE антитела могут быть обнаружены у около 70% страдающих от аллергии на пыльцу трав (Rossi et al., 2001, Allergy, 56:1180-85; Vrtala et al., 1999, J. Immunol. 15; 163:5489-9).

Физико-химические исследования аллергена из экстракта пыльцы травы обнаружили две разновидности протеина, которые отличаются первичной последовательностью (Blume et al., 2004, Proteomics 4:1366-71). Данные изоформы приписывают двум ДНК последовательностям, идентифицированным в библиотеках экспрессии пыльцы тимофеевки луговой и носят WHO/IUIS названия Phl p 6.0101 (GenBank: Z27082.1; UniProt: P43215; смотри Фиг.15 и 16 или SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4, с пропептидом, смотри Фиг.19 или SEQ ID NO: 9; Petersen et al., 1995, Int. Arch. Allergy Immunol. 108:55-59) и Phl p 6.0102 (GenBank: Y16955; UniProt: O65868; смотри Фиг.3 и 4 или SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2, с пропептидом, смотри Фиг.20 или SEQ ID NO: 10; Vrtala et al., 1999, J. Immunol. 15; 163:5489-9). За исключением сигнального пептида каждый из протеинов состоит из 110 аминокислот и отличаются только двумя положениями (Val 14 → Ile и Arg 95 → His, начиная со зрелых Phl p 6.0101), которые вызывают различия в молекулярной массе в 5 Да (11790 Да для Phl p 6.0101 по сравнению с 11785 Да для Phl p 6.0102; Фиг.1).

Пыльца других видов истинной травы семейства Poaceae и, в частности, подсемейства Pooideae может содержать основные аллергены, которые являются гомологичными к аллергенам тимофеевки луговой. Такие аллергены, которые встречаются во всех видах, обобщают как группу аллергенов. Высокая структурная гомология таких родственных аллергенов, которая, прежде всего, основана на подобии аминокислотной последовательности, вызывает соответственно высокую перекрестную реактивность молекул с IgE антителами (Lorenz et al., 2009, Int. Arch. Immunol. 148:1-17). Кроме того, известно, что атопические особы, которые аллергически реагируют на основные аллергены тимофеевки луговой, могут первично быть сенсибилизированными одним из других родственных видов истинных трав. В конечном счете, данная перекрестная реактивность может означать, что сенсибилизация одним видом трав является достаточной для запуска аллергической реакции на другие родственные травы.

Аллерген группы 6, который является перекрестно реактивным с Phl p 6, уже обнаружен на протеиновом уровне в пыльце мятлика лугового (Poa pratensis) (Vrtala et al., 1999, J. Immunol. 15; 163:5489-9; Niederberger et al., 1998, J. Allergy din. Immunol. 101(2):258-264).

Помимо перекрестной реактивности аллергенов группы 6 друг с другом также известна перекрестная реактивность с основными аллергенами из группы 5. Полипептидная цепь Phl p 6 демонстрирует значительную схожесть с N-терминальной областью Phl p 5, которая имеет размер около 26-28 кДа (Фиг.1, Фиг.2). Считается, что аллергены могут быть отнесены к общему исходному гену (Petersen et al., 1995, Int. Arch. Allergy Immunol. 108:55-59). Оба протеина образуют α-спиральные вторичные структуры, а не β-складчатые листовые структуры. Рентгеноструктурный анализ показал, что четыре α-спирали Phl p 6 складываются, чтобы образовать характерный пучок спиралей (RCSB Protein Data Bank (Банк данных протеинов) запись: 1NLX; Fedorov et al., 2003; Фиг.1), структура которого также обнаружена в фрагментах Phl p 5 (Rajashankar et al., 2002, Acta Cryst. D58:1175-1181; Maglio et al., 2002, Protein Engineering 15:635-642; Wald et al., 2007, Clin. Exp. Allergy 37:441-450). Подобность между аллергенами имеет такое действие, что некоторые из Phl p 5 - реактивных IgE антител также связываются с Phl p 6 (Petersen et al., 1995, Int. Arch. Allergy Immunol. 108:49-54; Andersson & Lidholm, 2003, Int. Arch. Allergy Immunol. 130:87-107).

Специфическую иммунотерапию (СИТ) или гипосенсибилизацию рассматривают как эффективный подход к терапевтическому лечению аллергий (Fiebig 1995 Allergo J. 4(6):336-339, Bousquet et al., 1998, J. Allergy Clin. Immunol. 102(4):558-562; Cox et al., 2007, J. Allergy Clin. Immunol. 120:825-85; James & Durham, 2008, Clin. Exp. Allergy 38:1074-1088).

Классическая форма лечения инъекционной терапии (СКИТ), в которой экстракты природных аллергенов вводят пациенту подкожно в возрастающих дозах, успешно использовалась в течение около 100 лет. В данном лечении иммунная система страдающего от аллергии неоднократно сталкиваются с аллергенами, вызывая перепрограммирование иммунной системы для того, чтобы наряду с этим была достигнута толерантность к аллергенам. После поглощения антигенов из препаратов аллергена антиген-представляющими клетками пептиды присутствуют с антигенами на поверхности клетки. Некоторые специфические пептиды, которые содержат так называемые эпитопы T-клеток признаны антиген-специфическими T-клетками. Данное связывание в результате приводит, среди прочего, к развитию различных типов T-клеток, которые имеют регуляторную функцию. В случае СИТ ответ регуляторной T-клетки в результате приводит к толерантности аллергена, понижающей регуляции T_H2 цитокинов, восстановлению T_H1/T_H2 равновесия, подавлению аллерген-специфического IgE, индукции IgG4, IgG1 и IgA антител, подавлению клеток-эффекторов (тучных клеток, базофилов и эозинофилов) и возобновлению воспаленной ткани (Akdis et al., 2007, J. Allergy Clin. Immunol. 119(4):780-789; Larchè et al., 2008, Nature Reviews 6:761-771). Эпитопы T-клеток, таким образом, имеют решающее значение для терапевтического действия препаратов аллергенов в случае гипосенсибилизации.

Благодаря перекрестной реактивности основных аллергенов истинных трав, которые присутствуют на IgE, а также на T-клеточном уровне, успешное лечение экстрактом аллергена из представителя одного вида травы обычно является достаточным (Mailing et al., 1993, EAACI Position Paper: Immunotherapy, Allergy 48:9-35; Cox et al., 2007, J Allergy Clin Immunol 120:25-85).

Кроме подкожной иммунотерапии, сублингвальная форма лечения, в которой аллергены или производные аллергенов доставляются через мембрану слизистой оболочки ротовой полости, подвергается клиническим испытаниям и используется как альтернатива инъекционной терапии (James & Durham, 2008, Clin. Exp. Allergy 38:1074-1088).

Следующая возможность - это лечение подвергающейся экспрессии ДНК, которая кодирует соответствующие аллергены (иммунотерапевтическая вакцинация). Экспериментальное доказательство аллерген-специфического влияния иммунного ответа обеспечивается у грызунов путем инъекции аллерген-кодирующей ДНК (Hsu et al. 1996, Nature Medicine 2(5):540-544, Weiss et al., 2006, Int. Arch. Allergy Immunol. 139:332-345).

Во всех данных формах терапии существует принципиальный риск аллергических реакций или даже анафилактического шока (Kleine-Tebbe, 2006, Allergologie, 4:135-156). С целью минимизировать данные риски, применяют инновационные препараты в форме аллергоидов. Существуют химически модифицированные экстракты аллергенов, которые имеют значительно сниженную реактивность IgE, но идентичную реактивность T-клеток по сравнению с необработанным экстрактом (Fiebig 1995 Allergo J. 4(6):336-339, Kahlert et al., 1999, Int. Arch. Allergy Immunol, 120:146-157).

Оптимизация лечения является возможной за счет аллергенов, полученных рекомбинантными способами. Определенные коктейли высоко очищенных аллергенов, полученных рекомбинантными способами, которые необязательно приводят в соответствие к индивидуальным характерам сенсибилизации пациентов, могли заменять экстракты из природных источников аллергенов, так как, помимо различных аллергенов, последние содержат относительно большое количество иммуногенных, но не вызывающих аллергию, сопутствующих протеинов. Уже с успехом провели начальные клинические исследования с рекомбинантными аллергенами (Jutel et al., 2005, J. Allergy Clin. Immunol., 116:608-613; Valenta & Niederberger, 2007, J. Allergy Clin. Immunol. 119:826-830).

Реальные перспективы, которые могут в результате привести к безопасной гипосенсибилизации с рекомбинантными продуктами экспрессии, представляются определенно посредством мутированных рекомбинантных аллергенов, в которых IgE эпитопы модифицированы без ослабления эпитопов T-клетки, которые являются неотъемлемой частью лечения (Schramm et al. 1999, J. Immunol. 162:2406-2414). Данные гипоаллергенные протеины могли бы быть использованы в относительно высоких дозах в течение СИТ без возрастания вероятности нежелательных IgE-стимулированных побочных действий.

Ранее такие "гипоаллергенные" модификации с пониженным IgE связыванием были опубликованы для многих аэроаллергенов (в том числе пыльцы и аллергенов домашнего пылевого клеща) и пищевых аллергенов. На основе ДНК немодифицированных аллергенов является возможным получить и экспрессировать рекомбинантную ДНК, в том числе путем фрагментации, олигомеризации, делеций, точечных мутаций или рекомбинации индивидуальных сечений аллергена (перестановка в ДНК) (Ferreira et al., 2006, Inflamm. & Allergy - Drug Targets 5:5-14; Bhalla & Singh, 2008, Trends in Biotechnology 26:153-161; Westritschnig et al., 2007, J. Immunol. 179: 7624-7634).

Рассматривая аллергены группы 6 трав, только одна мутационная стратегия является опубликованной на сегодняшний день, в которой первые девяносто нуклеотидов, кодирующих аминокислоты 1-30 зрелых Phl p 6, были удалены. Молекулу экспрессировали, как гистидин слитую молекулу, очищали и исследовали с учетом ее иммунологических свойств. N-терминальная делеция в результате привела к понижению IgE связывания и снижению способности быть стимулированными базофильными гранулоцитами (Vrtala et al., 2007, J. Immunol. 179:1730-1739). В более поздней статье такая же молекула была присоединена к рекомбинантной модификации Phl p 2, для того чтобы получить гибридную молекулу (Linhart et al., 2008, Biol. Chem. 389:925-933). Мутационная стратегия, основанная на точечных мутациях, как описано для других аллергенов, до настоящего времени еще не была опубликована для аллергенов группы 6 пыльцы травы.

Объект, на котором основано представленное изобретение, заключался в получении новых модификаций аллергенов группы 6 Poaceae на уровне протеина и ДНК, которые характеризуются пониженной IgE реактивностью, в то же время при значительном сохранении реактивности T-клетки и, поэтому, приемлемы для лечебной и профилактической специфической иммунотерапии и иммунотерапевтической ДНК вакцинации.

Краткое описание фигур

Фиг.1. Первичная структура зрелой формы Phl p 6 изоформы, использованной в данном документе. Phl p 6.0102 (IUIS последовательность, UniprotKB 065868, длина 110 аминокислот) со второй известной Phl p 6 изоформой, Phl p 6.0101 (IUIS последовательность, UniprotKB P43215, длина 110 аминокислот) и N-терминальные части - области четырех Phl p 5 изоформ: Phl p 5.0101 (IUIS последовательность, UniprotKB Q40960), Phl p 5.0104 (IUIS последовательность, UniprotKB P93467), Phl p 5.0109 (IUIS последовательность, UniprotKB Q84UI2, 284 аминокислоты) и Phl p 5.0201 (IUIS последовательность, UniprotKB Q40963, общая длина 265 аминокислоты и). Информация о положении аминокислоты слева указывает положение аминокислоты в преобразованном протеине. Положение семи пролиновых остатков, представленных в Phl p 6, по отдельности указывает последовательности выше. Блоки показывают положение α-спиралей Phl p 6 на основе данных рентгено-структурного анализа рекомбинантного Phl p 6 (PDB запись 1NLX; Fedorov et al., 2003). Области, имеющие последовательность идентичную выделены серым.

Фиг.2. Упрощенная модель Phl p 6. Четыре α-спирали (H1-H4) образуют 4-спиральный пучок. Пролиновые остатки 29, 30, 57 и 79 расположены в петлях, связывающих спирали. Пролин 101 расположен позади завершающей спирали. а) Поверхностная модель. Пролиновые остатки 29, 30, 57, 79 и 101 выставлены на поверхности. Пролиновые остатки в каждом случае окрашены черным цветом и обеспечивается обозначением положения. Обе модели сделаны на основе данных рентгеноструктурного анализа рекомбинантного Phl p 6 (PDB запись: 1NLX; Fedorov et al., 2003).

Фиг.7. 12% SDS-PAGE после окрашивания Кумасси. Наполнение: ~1 мкг протеина на след, невосстановленный.

Образцы: 1 = rPhl p 6 wt + 6His; 2 = d[P29, 30] + 6His; 3 = d[P57] + 6His; 4 = d[P79] + 6His; 5 = d[P101] + 6His. M: размер маркера.

Фиг.8. Хроматограмма аналитического SEC определения молекулярной массы, происходящего в реальном времени.

На фигуре изображен относительный УФ сигнал на 280 нм (правая часть оси Y) и молекулярная масса (левая часть оси Y; измерение указано линией в области пика), график от времени элюирования (ось X). Происходящее в реальном времени определение концентрации протеина выполняли, используя OptilabrEX (Wyatt, Santa Barbara, USA) рефрактометрический детектор. Рассеяние света частицами определяли, используя MiniDAWN Treos многоугловой детектор (Wyatt). Массу частиц рассчитывали, используя ASTRA 5.3.2.17 программное обеспечение (Wyatt) посредством совокупности формул Дебая с предположительно увеличенным показателем преломления 0,180 мл/г. Колонка: Superdex 200 GL 10/300 (GE Healthcare, Uppsala, Sweden). Размер выделения на 20,45 мин (стрелочка). Элюент: 20 mM Tris, pH 8,0 с 150 mM NaCl.

Образцы: 1 = rPhl p 6 wt + 6His; 2 = d[P29, 30] + 6His; 3 = d[P57] + 6His; 4 = d[P79] + 6His; 5 = d[P101] + 6His.

Фиг.9. Иммуноблот исследуемых веществ после инкубации с сыворотками клинически определенных страдающих от аллергии на пыльцу травы (3-150) rPhl p 6 wt: рекомбинантный Phl p 6 с (+6His) и без гистидинового слитого компонента.

HSA: альбумин сыворотки человека (отрицательный контроль).

Общий: контроль за равномерным наполнением протеина в тест-полосках. Общее протеиновое окрашивание с реагентом "DB71" (Sigma-Aldrich, Taufkirchen).

Фиг.10. В каждом случае данные от одного конкретного эксперимента с сывороткой клинически определенных страдающих от аллергии на пыльцу травы (P). Обозначения представляют собой среднее значение от двух измерений 10 концентраций каждого ингибитора. Горизонтальные линии погрешности показывают соответствующие конкретные значения двух определений. Твердая фаза: rPhl p 6 wt + 6His.

Фиг.11. Доказательство пониженной функциональной аллергенности посредством анализа активирования базофилов с цельной крови клинически определенного страдающего от аллергии на пыльцу травы (P21). Горизонтальная линия: уровень стимулирования путем отрицательного контроля.

Фиг.12. 12% SDS-PAGE после окрашивания Кумасси. Наполнение: ~1 мкг протеина на след, невосстановленный.

Образцы: 1 = d[29, 30, 57] + 6His; 2 = d[P29, 30, 79] + 6His; 3 = d[P29, 30] P57L + 6His; 4 = d[P29, 30] P79L + 6His; 5=d[P29, 30] P57L, P79L] + 6His.

М: размер маркера.

Фиг.13. Хроматограмма аналитического SEC с определением молекулярной массы, происходящим в реальном времени.

На фигуре изображен относительный УФ сигнал на 280 нм (правая часть оси Y) и молекулярная масса (левая часть оси Y; измерение указано линией в области пика), график от времени элюирования (ось X). Происходящее в реальном времени определение концентрации протеина выполняли, используя OptilabrEX (Wyatt, Santa Barbara, USA) рефрактометрический детектор. Рассеяние света частицами определяли, используя MiniDAWN Treos многоугловой детектор (Wyatt). Массу частиц рассчитывали, используя ASTRA 5.3.2.17 программное обеспечение (Wyatt) посредством совокупности формул Дебая с предположительно увеличенным показателем преломления 0,180 мл/г.

Колонка: Superdex 200 GL 10/300 (GE Healthcare, Uppsala, Sweden). Размер выделения на 20,45 мин (стрелочка). Элюент: 20 мМ Tris, pH 8,0 з 150 мМ NaCl.

Образцы: 1 = d[29, 30, 57] + 6His; 2 = d[P29, 30, 79] + 6His; 3 = d[P29, 30] P57L + 6His; 4 = d[P29, 30] P79L + 6His; 5 = d[P29, 30] P57L, P79L] + 6His.

Фиг.14. Иммуноблот исследуемых веществ после инкубации с сыворотками клинически определенных страдающих от аллергии на пыльцу травы (3-150)

Общий: контроль за равномерным наполнением протеина в тест-полосках. Общее протеиновое окрашивание с реагентом "DB71" (Sigma-Aldrich, Taufkirchen).

Описание изобретения

Неожиданно было обнаружено, что модификации аллергенов группы 6 семейства мятликовых (Poaceae), в которых пролины, которые соответствуют в первичной структуре пролинам в положениях 29, 30, 57, 79 в аминокислотной последовательности немутантного типа Phl p 6, мутировали по отдельности или в комбинации, понизили IgE реактивность по сравнению с аллергенами немутантного типа и, в то же время, существенно сохранили реактивность в отношении T-лимфоцитов и, таким образом, является гипоаллергенным.

Изобретение, соответственно, касается гипоаллергенных модификаций аллергенов группы 6 семейства мятликовых (Poaceae), в которых пролины, которые соответствуют в первичной структуре пролинам в положениях 29, 30, 57, 79 в аминокислотной последовательности немутантного типа Phl p 6, мутировали по отдельности или в комбинации.

Особое предпочтение отдается модификациям аллергенов в соответствии с изобретением, которые отличаются тем, что пролины удалены или замещены.

Предпочтение отдают гипоалергенным модификациям, в соответствии с изобретением, аллергенов группы 6 подсемейства Pooideae, предпочтительно из группы Poodae и Triticodae, предпочтительно представленными Phleum pratense, Holcus lanatus, Phalaris aquatica, Anthoxanthum odoratum, Dactyl is glomerata, Lolium perenne, Poa pratensis, Festuca pratensis, Hordeum vulgare, Secale cereale и Triticum aestivum. Они являются предпочтительно гипоаллергенными модификациями в соответствии с изобретением Tri a 6, Sec c 6 и Hor v 6 с Triticum aestivum, Secale cereale и Hordeum vulgare. Особенное предпочтение отдают гипоаллергенным модификациям в соответствии с изобретением аллергенов группы 6 Poodae. Данные аллергены группы 6 являются, предпочтительно Phl p 6, Poa p 6, Hol p 6, Lol p 6 и Pha a 6 из Phleum pratense, Lolium perenne, Poa pratensis, Holcus lanatus и Phalaris aquatica и, особенно предпочтительно, Poa p 6 и Phl p 6, а именно Phl p 6. Все встречающиеся в природе изомеры, полиморфы и модификации аллергенов, упомянутых выше, и их белки-предшественники также находятся в соответствии с изобретением.

В гипоаллергенных модификациях в соответствии с изобретением мутированные пролины являются предпочтительнее чем те, которые соответствуют в первичной структуре пролинам в положениях 29, 30, 57, 79 в аминокислотной последовательности зрелого Phl p 6.0101 или его модификаций (SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8) или зрелый Phl p 6.0102 (SEQ ID NO: 2), особенно предпочтительно зрелый Phl p 6.0102.

Несмотря на то, что известно, что пролины могут оказывать влияние на структуру протеина, специфические точечные мутации остатков пролинов, как начальная точка для генерации гипоаллергенных мутантов аллергенов, были исследованы всего лишь для основного аллергена группы 2 клеща домашней пыли Dermatophaogides farinae (Der f2, замещение пролиновых остатков на аланин) (Takai et al., 2000, Eur. J. Biochem. 267: 6650-6656). Однако способность IgE связывания и способность стимулировать базофильные клетки была только незначительно снижена в случае трех точковых мутаций, в то время как другие три вели себя как немодифицированный аллерген. Мутации пролина в случае Der f 2, таким образом, показали только очень слабое снижение аллергенности или отсутствовало вовсе. Дальнейшие стратегии для получения гипоаллергенных мутантов путем обменных мутаций пролина еще не опубликованы. Таким образом, квалифицированному специалисту в данной области было бы неожиданным, что мутации пролина являются успешными в качестве исходной точки для создания гипоаллергенных мутаций аллергенов.

Кроме того, до сих пор не исследовано для какого-либо аллергена, как специфическая делеция пролиновых остатков влияет на всеобъемлющую способность IgE связывания продукта экспрессии и какие последствия возникают при активации клеток-эффекторов, относящихся к аллергии.

Аминокислотные последовательности Phl p 6 или двух изоформов (Phl p 6.0101, GenBank: Z27082.1, UniProt: P43215; Phl p 6.0102, GenBank: Y16955, UniProt: 065868) содержат 7 пролиновых остатков (Фиг.1). Пролины в положениях 29, 30, 57, 79 и 101 в аминокислотах расположены непосредственно в начале и в конце α-спиралей или вовлечены в образование протеиновой поверхности (Фиг.2). Пролиновый остаток в положении 61 является частью третей спирали, в то время как пролин 108 расположен вблизи C-терминальной области.

Исходя из аминокислотных последовательностей Phl p 6 изоформ Phl p 6.0101 (SEQ ID NO: 4) и Phl p 6.0102 (SEQ ID NO 2) получены рекомбинантный немодифицированный аллерген немутантного типа (rPhl p 6 wt; Фиг.4) и модификации в соответствии с изобретением, модифицированные путем генной инженерии. Аналогично способу получения, описанному ниже, кроме того, могут быть получены протеины немутантного типа и, в соответствии с изобретением, гипоаллергенные модификации аллергенов группы 6 в соответствии с изобретением мятликовых, например Poa p 6. В связи с этим, пролины, которые соответствуют в первичной структуре пролинам в положениях 29, 30, 57, 79 в аминокислотной последовательности немутантного типа Phl p 6 мутировали по отдельности или в комбинации, преимущественно путем замещения или делеции.

Модификации аллергена в соответствии с изобретением могли бы быть получены исходя из клонированной последовательности ДНК с помощью методов генной инженерии. Процессы получения в соответствии с изобретением известны квалифицированному специалисту в данной области из соответствующих лабораторных методик и публикаций, таких как, например: E.F. Fritsch, J. Sambrook, T. Maniatis, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.

В дополнение к описанным модификациям аллергенов группы 6 дальнейшее модифицирование в других положениях - например, с целью повышения гипоаллергенности - естественно, также является возможным. Данные модифицирования могут быть, например, введениями, удалениями, замещениями аминокислоты и расщеплениями протеина на фрагменты, а также слияниями протеина или его фрагментов с другими протеинами или пептидами, а также мультимерами посредством слияния одинаковых протеинов или фрагментов.

Фрагменты, в соответствии с изобретением, преимущественно содержат 20-109 аминокислот, преимущественно 30-100 аминокислот, особенно преимущественно 40-90 аминокислот. Модификации, в соответствии с изобретением, дополнительно включают протеины-предшественники, такие как, например, ProPhl p 6, с вышестоящей природной или искусственной сигнальной последовательностью, как изображено, например, на фигурах 18, 19 и 20 (SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10). Кроме того, в соответствии с изобретением находятся слитые протеины, содержащие N- или C-терминальные слитые метки (например, His метка, как на Фиг.5 и 6, МВР метка, последовательности, контролирующие экспрессии и др.), гибридные молекулы, такие как, например, слитые с другими аллергенами или их гипоаллергенными модификациями, или слияние фрагментов в какой-либо желаемой последовательности. Кроме того, модификации, в соответствии с изобретением, также включают гомологические последовательности (полиморфы (SNPs), изоморфы), содержащие идентичную аминокислотную последовательность из, по меньшей мере, 80% с соответствующей аллергену немутантного типа группы 6, предпочтительно из, по меньшей мере, 90% с соответствующей аллергену немутантного типа группы 6, особенно предпочтительно из, по меньшей мере, 95% с соответствующей аллергену немутантного типа группы 6. В данных модификациях одна или несколько аминокислот предпочтительно традиционно замещены, например полярная аминокислота замещена другой полярной аминокислотой или нейтральной аминокислотой, однако модификации вследствие нетрадиционного замещения также находятся в соответствии с изобретением. Мультимеры преимущественно включают димеры и тримеры гипоаллергенных модификаций в соответствии с изобретением, связанных линкерной последовательностью или полученных непосредственным слиянием.

Примерами таких модификаций являются модификации Phl p 6.0101, как показано на фигурах 17 и 18 (SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8), в которых индивидуальные аминокислоты, которые не имеют отношения к действию в соответствии с изобретением, были заменены, или не хватает трех аминокислот на N-конце, или их последовательности-предшественники, содержащие сигнальные пептиды на N-конце, и т.п. Следующими примерами модификаций в соответствии с изобретением являются полиморфные модификации, такие как, например, два изомера Phl p 6.0101 и их Phl p 6.0102, и дополнительные модификации с замещением одной или более аминокислот, исключением одной или более аминокислоты на N- и/или C-конце или с соответствующей делецией гэпов с аминокислотной последовательности. Более того, в соответствии с изобретением находятся модификации с введением одной или нескольких аминокислот в отдельности в различные положения аминокислотной последовательности или на N- и/или C-конце.

Таким образом, изобретение также касается гипоаллергенных модификаций аллергенов группы 6 мятликовых (Poaceae), отличающийся тем, что он является фрагментом или модификацией гипоаллергенной модификации в соответствии с изобретением, или мультимером одной или более гипоаллергенных модификаций в соответствии с изобретением, или отличающийся тем, что одна или более гипоаллергенных модификаций в соответствии с изобретением или их фрагменты, модификации или мультимеры являются составной частью рекомбинантного слитого протеина.

К тому же, изобретение касается молекулы ДНК, которая кодирует гипоаллергенную модификацию в соответствии с изобретением.

Более того, изобретение касается рекомбинантного вектора экспрессии, который в соответствии с изобретением содержит молекулу ДНК данного типа, функционально связанную с последовательностью, контролирующей экспрессию. Под последовательностью, контролирующей экспрессию, подразумевают, например, промотор или часть последовательности, с помощью которой оказывают влияние на экспрессию протеина-мишени, и который функционально связанный с геном-мишенью, но необязательно должен быть расположен в непосредственной близости от гена-мишени.

Кроме того, изобретение касается организма-хозяина, который не является человеком, трансформированного с помощью молекулы ДНК в соответствии с изобретением или вектора экспрессии в соответствии с изобретением.

Изобретение касается процесса получения гипоаллергенной модификации в соответствии с изобретением путем культивирования организма-хозяина, который не является человеком, в соответствии с изобретением и выделением соответствующей модификации аллергена из культуры.

Приемлемыми организмами-хозяинами, которые не являются человеком, могут быть про- или эукариотические, одно- или многоклеточные организмы, такие как бактерии или дрожжи. Организм-хозяин, которому отдается предпочтение в соответствии с изобретением, является Е. coli.

Влияние делеции одного или двух близко расположенных пролинов на способность IgE связывания Phl p 6 может быть исследовано путем делеции пролинов 29+30 из пролина 57, из пролина 79 и из пролина 101. В протеине немутантного типа Phl p 6, данные пролины расположены в областях петли в начале или конце α-спиралей (Фиг.1; Фиг.2). Пролин 61 и пролин 108 преимущественно являются не модифицированными, так как соответствующие модификации демонстрируют незначительную эффективность. Влияние мутаций пролина в соответствующих гомологичных положениях других аллергенов группы 6 мятликовых в соответствии с изобретением, например Poa p 6, на способность IgE связывания может быть исследовано аналогичным образом.

Для более быстрой очистки с высоким выходом кодирующая ДНК данных исследований обеспечивается последовательностью, кодирующей N-терминальный слитый компонент гексагистидина (+6His) (Фиг.5, SEQ ID NO: 5; Фиг.6, SEQ ID NO: 6). Модификации, свободные от меток, в соответствии с изобретением и протеины немутантного типа, которые могут быть использованы для фармацевтических целей, также очищают стандартными способами и подтверждает результаты протеинов His-метки.

Соответствующим образом получают последовательности, кодирующие протеины, например rPhl p 6 d[P29, 30] + 6His, rPhl p 6 d[P57] + 6His, rPhl p 6 d[P79] + 6His и rPhl p 6 d[P101] + 6His. Последовательности могут быть экспрессированными во всех известных эукариотических и прокариотических экспрессионных системах, преимущественно в Е. coli. В дальнейшем протеины очищают как растворимые мономеры стандартными способами. Окончательно, чистоту могут контролировать путем анализа в денатурирующем полиакриламидном геле (SDS-PAGE) (Фиг.7).

Аналитическая гель-фильтрация (SEC) в сочетании с рефрактометром (RI детектор) и детектором многоуглового рассеяния света (MALS детектор) позволяет в реальном времени проводить определение молекулярной массы элюированных протеинов (SEC/MALS/RI метод).

Таким образом, анализ rPhl p 6 d[P29, 30] + 6His, rPhl p 6 d[P57] + 6His, rPhl p 6 d[P79] + 6His и rPhl p 6 d[P101] + 6His с помощью SEC/MALS/RI показывает, что эти модификации в соответствии с изобретением находятся в форме чистых мономеров в растворе (Фиг.8, Таблица 1).

Способность IgE связывания рекомбинантных модификаций в соответствии с изобретением может быть определена способом, в котором протеины иммобилизируют на нитроцеллюлозной мембране и контактируют с IgE антителами отдельных сывороток клинически определенных страдающих от аллергии на пыльцу трав (тест-полоски). Модификации аллергена/комплексы антитела впоследствии окрашивают путем ферментативной реакции (Фиг.9).

В данном способе мутантный rPhl p 6 d[P101] + 6His демонстрирует такое же хорошее IgE связывание, как и немодифицированный аллерген со всеми тестированными сыворотками (Фиг.9). Из этого следует, что делеция пролина 101 имеет незначительное влияние на способность IgE связывания Phl p 6. Данное IgE связывание мутантных rPhl p 6 d[P29, 30] + 6His, rPhl p 6 d[P57] + 6His и rPhl p 6 d[P79] + 6His является разным в сыворотках страдающих от аллергии на различную пыльцу травы. Это связано с изменениями в составе IgE популяции конкретных страдающих от аллергии по отношению к аффинности и специфической антигенной детерминации IgE антител. Мутантные rPhl p 6 d[P57] + 6His и rPhl p 6 d[P79] + 6His демонстрируют значительно пониженную IgE реактивность с большинством сывороток по сравнению с немодифицированным rPhl p 6 wt + 6His. Однако наименьшее IgE связывание наблюдается во всех отношениях в случае мутантных rPhl p 6 d[P29, 30] + 6His (Фиг.9).

Рекомбинантные модификации в соответствии с изобретением могут, кроме того, быть исследованы относительно их способности к связыванию с IgE антителами человека путем исследований IgE ингибирования (EAST). В данном способе взаимодействие аллерген/IgE может быть исследовано в растворе, что позволяет маскировать вмешательство эпитопов исследуемой субстанции, например, благодаря иммобилизации на мембране, чтобы ее исключить.

В представленном примере выбирают две сыворотки страдающих от аллергии на пыльцу травы, которые значительно отличались в способе тест-полоски посредством их IgE связывания с мутантными rPhl p 6 d[P29, 30] + 6His. Сыворотка Р32 представляет собой группу сывороток, которые демонстрируют постоянно обнаруживаемое IgE связывание с rPhl p 6 d[P29, 30] + 6His по тест-полоскам (группа "A"), в то время как сыворотку Р82 выбирают как представитель группы сывороток (группа "B"), которая имеет не большую обнаруживаемую реактивность (Фиг.9, Фиг.14).

Используя данный способ исследования, может быть подтверждена пониженная способность IgE связывания мутантных rPhl p 6 d[P29, 30] + 6His, rPhl p 6 d[P57] + 6His и rPhl p 6 d[P79] + 6His по сравнению с немодифицированным rPhl p 6 wt + 6His, в соответствии с результатами по тест-полоскам (Фиг.10).

Результаты способа тест-полоски, таким образом, не являются обусловленными частичным маскированием IgE эпитопов, а, наоборот, точно отражают пониженную способность IgE связывания растворенных протеинов.

Мутантный rPhl p 6 d[P101] + 6His демонстрирует способность IgE связывания, которая соответствует той, что у аллергена немутантного типа при использовании сыворотки P32 во всем диапазоне концентраций (Фиг.10). При использовании сыворотки P82 наблюдается меньшее IgE связывание только при низких концентрациях протеина, в то время как при высоких концентрациях IgE связывание, в свою очередь, соответствует тому, что у аллергена немутантного типа (Фиг.10).

Таким образом, пониженная способность IgE связывания Phl p 6, в принципе, также является возможной за счет делеции пролинового остатка 101, но данный эффект, по всей видимости, настолько мал, что не может быть обнаружен способом тест-полоски при всех концентрациях, а при низких концентрациях - только путем исследования IgE ингибирования (Фиг.9, Фиг.10).

Пониженная способность IgE связывания мутантных rPhl p 6 d[P29, 30] + 6His, rPhl p 6 d[P57] + 6His и rPhl p 6 d[P79] + 6His, напротив, легко обнаруживается способом тест-полоски с большинством сывороток страдающих от аллергии и обеспечивается во всем изучаемом диапазоне концентраций в исследованиях IgE ингибирования (Фиг.9, Фиг.10).

В основном это доказывает, что делеция пролиновых остатков из аллергенов группы 6 может понижать способность IgE связывания. С другой стороны, только делеция определенных пролинов в результате приводит к существенно пониженному IgE связыванию.

С помощью исследования с базофильными гранулоцитами клинически страдающего от аллергии на пыльцу определенных трав влияние пониженной способности IgE связывания модификаций в соответствии с изобретением на активацию клеток-эффекторов человека может быть исследовано in vitro.

Гранулоциты, используемые в исследовании, выделяют из цельной крови страдающего от аллергии, в представленном примере страдающий от аллергии P21. Данный страдающий от аллергии представляет тех страдающих от аллергии, чьи IgE антитела демонстрируют обнаруживаемое связывание с rPhl p 6 d[P29, 30] + 6His в способе тест-полоски (группа "A"; Фиг.9, 14).

При такой же концентрации рекомбинантного аллергена немутантного типа и модификаций rPhl p 6 d[P29, 30] + 6His, rPhl p 6 d[P57] + 6His и Phl p 6 d[P79] + 6His rPhl p 6 d[P29, 30] + 6His в соответствии с изобретением модификации в соответствии с изобретением демонстрируют меньшее связывание мембрана-связь IgE антитела и в результате существенно пониженную активацию базофильных гранулоцитов (Фиг.11).

Таким образом, результаты подтверждают функционально пониженную аллергенность мутантных rPhl p 6 d[P29, 30] + 6His, rPhl p 6 d[P57] + 6His и rPhl p 6 d[P79] + 6His. Таким образом, данное исследование может подтвердить, что мутации пролина в этих двух областях Phl p 6, кроме того, понижают способность IgE связывания, по меньшей мере, у некоторых страдающих от аллергии.

Поэтому представленное изобретение, кроме того, касается гипоаллергенных модификаций аллергенов группы 6 семейства мятликовых (Poaceae), в которых пролины, которые соответствуют в первичной структуре пролинам в положениях 29, 30, 57, 79 в аминокислотной последовательности немутантного типа Phl p 6, мутировали по отдельности.

Представленное изобретение предпочтительно касается гипоаллергенных модификаций Phl p 6 или Poa p 6, в которых пролины, которые соответствуют в первичной структуре пролинам в положениях 29, 30, 57, 79 в аминокислотной последовательности немутантного типа Phl p 6, мутировали по отдельности.

Представленное изобретение особенно предпочтительно касается гипоаллергенных модификаций Phl p 6, в которых пролины, которые соответствуют в первичной структуре пролинам в положениях 29, 30, 57, 79 в аминокислотной последовательности немутантного типа Phl p 6, мутировали по отдельности.

Поэтому особенное предпочтение отдается гипоаллергенным модификациям аллергенов группы 6 семейства мятликовые (Poaceae), в которых пролины, которые соответствуют в первичной структуре пролинам в положениях 29, 30, 57, 79 в аминокислотной последовательности зрелого Phl p 6.0102 (SEQ ID NO: 2), мутировали, то есть удалялись по отдельности.

Представленное изобретение, кроме того, предпочтительно касается гипоаллергенных модификаций, в соответствии с изобретением, аллергенов группы 6 семейства мятликовых (Poaceae), в которых пролины, которые соответствуют в первичной структуре пролинам в положениях 29, 30, 57, 79 в аминокислотной последовательности немутантного типа Phl p 6, удаляли по отдельности.

В дополнение, представленное изобретение, кроме того, касается гипоаллергенных модификаций, в соответствии с изобретением, аллергенов группы 6 семейства мятликовых (Poaceae), в которых пролины, которые соответствуют в первичной структуре пролинам в положениях 29, 30, 57, 79 в аминокислотной последовательности немутантного типа Phl p 6, замещали по отдельности. В данном документе пролин замещают, в виде примера, лейцином (L). В соответствии с изобретением, однако, пролины в соответствии с изобретением могут быть замещены какой-либо аминокислотой.

В частности, гипоаллергенные модификации rPhl p 6 d[P29], rPhl p 6 d[P30], rPhl p 6 d[P29, 30], rPhl p 6 d[P57], rPhl p 6 d[P79], rPhl p 6 P29L, rPhl p 6 P30L, rPhl p 6 P29L, P30L, rPhl p 6 P57L и rPhl p 6 P79L и подобные, включая все гипоаллергенные модификации в соответствии с изобретением, описанные ниже, находятся в соответствии с изобретением, где нумерация соответствует последовательности Phl p 6, в частности зрелой Phl p 6.0102.

Более того, данные примеры не ограничиваются модификациями Phl p 6, но также касаются и, в частности, Poa p 6 и аллергенов группы 6 всех других мятликовых.

В дополнение, по-прежнему обнаруживаемая способность IgE связывания гипоаллергенных модификаций, в соответствии с изобретением, аллергенов группы 6 в дальнейшем может быть понижена путем комбинаций мутаций пролина. Таким образом, вследствие значительно пониженного IgE связывания мутантного rPhl p 6 d[P29, 30] + 6His и обстоятельства, что способность IgE связывания, кроме того, может быть частично понижена путем делеции пролинов 57 и 79, получают нуклеиновые кислоты, которые включают мутации в комбинациях. На основании ДНК мутантного rPhl p 6 d[P29, 30] + 6His пролины в положениях 57 и 79 или удалены, или заменены аминокислотой - лейцином.

Соответственно, получены последовательности, кодирующие протеины rPhl p 6 d[P29, 30, 57] + 6His и rPhl p 6 d[P29, 30, 79] + 6His, а также rPhl p 6 d[P29, 30] P57L + 6His и rPhl p 6 d[P29, 30] P79L + 6His. Данные модификации кодируют протеины, которые несут мутации пролина в двух петлях, которые связывают α-спирали Phl p 6 (Фиг.2).

Кроме того, нуклеиновую кислоту, кодирующую rPhl p 6 d[P29, 30] P57L P79L + 6His, получают с целью получить модификацию аллергена, который содержит в трех областях петли (Фиг.2). Как уже упоминалось выше, последовательности преимущественно экспрессируют в Е. coli, и протеины очищают стандартными способами.

Более того, чистоту анализировали путем SDS-PAGE и путем SEC/MALS/RI (Фиг.12, Фиг.13). Все протеины в соответствии с изобретением, таким образом, могут быть получены с высокой чистотой и растворимостью.

SEC/MALS/RI способ показывает значительные различия в свойствах упомянутых выше мутантов по отношению к образующимся димерам (Фиг.13, Таблица 2). Молекулярные массы, определенные для протеинов rPhl p 6 d[P29, 30, 57] + 6His, rPhl p 6 d[P29, 30] P57L + 6His и rPhl p 6 d[P29, 30] P57L P79L + 6His, демонстрируют четкую тенденцию к образованию димеров. Протеины rPhl p 6 d[P29, 30, 79] + 6His и rPhl p 6 d[P29, 30] P79L + 6His обнаруживают только в мономерной форме (Таблица 2). Из данных результатов может быть сделан вывод, что модифицирование пролина в положении 57, а не пролин 79, изменяют rPhl p 6 d[P29, 30] таким способом, что индуцируют тенденцию к димеризации.

Определение способности IgE связывания способом тест-полоски неожиданно показывает в действительности, что сыворотки страдающих от аллергии из группы "A", которые имеют обнаруживаемое IgE связывание с rPhl p 6 d[P29, 30], имеют значительно пониженное IgE связывание с оптимизированными модификациями (Фиг.14). Любой из пролинов 57 и 79 удаляли или замещали другой аминокислотой, предположительно это имеет точно такое же небольшое влияние на понижение способности IgE связывания, как и на способность образовывать димеры. Таким образом, показано, что одновременно представленное модифицирование большинства аминокислотных остатков из группы пролинов 29, 30, 57 и 79 значительно понижают в дальнейшем IgE связывание.

Поэтому представленное изобретение, кроме того, касается гипоаллергенных модификаций аллергенов группы 6 семейства мятликовые (Poaceae), в которых пролины, которые соответствуют в первичной структуре пролинам в положениях 29, 30, 57, 79 в аминокислотной последовательности немутантного типа Phl p 6, мутировали в комбинациях. Предпочтение отдается мутациям посредством делеции и посредством замещения другими аминокислотами. В данном документе может быть выбрана какая-либо аминокислота для замещения пролина.

Представленное изобретение предпочтительно касается гипоаллергенных модификаций Phl p 6 или Poa p 6, в которых пролины, которые соответствуют в первичной структуре пролинам в положениях 29, 30, 57, 79 в аминокислотной последовательности немутантного типа Phl p 6, мутировали в комбинациях.

Представленное изобретение особенно предпочтительно касается гипоаллергенных модификаций Phl p 6, в которых пролины, которые соответствуют в первичной структуре пролинам в положениях 29, 30, 57, 79 в аминокислотной последовательности немутантного типа Phl p 6, мутировали в комбинациях.

Особенное предпочтение отдается гипоаллергенным модификациям аллергенов группы 6 семейства мятликовые (Poaceae), в которых пролины, которые соответствуют в первичной структуре пролинам в положениях 29, 30, 57, 79 в аминокислотной последовательности зрелого Phl p 6.0102 (SEQ ID NO: 2), мутировали в комбинациях.

Особенное предпочтение отдается гипоаллергенным модификациям в соответствии с изобретением, в которых пролины 29, 30, 57, 79 удалены в комбинациях. Особенное предпочтение, кроме того, отдается гипоаллергенным модификациям в соответствии с изобретением, в которых пролины 29, 30, 57, 79 замещены в комбинациях.

Кроме того, особенное предпочтение отдается гипоаллергенным модификациям в соответствии с изобретением, в которых пролины 29, 30, 57, 79 были удалены и/или замещены в комбинациях. В частности, гипоаллергенные модификации rPhl p 6 d[P29, 30, 57], rPhl p 6 d[29, 30, 79], rPhl p 6 d[29, 30, 57, 79], rPhl p 6 d[P29, 57], rPhl p 6 d[P30, 57], rPhl p 6 d[29, 79], rPhl p 6 d[30, 79], rPhl p 6 d[29, 57, 79], rPhl p 6 d[30, 57, 79], rPhl p 6 d[P29, 30] P57L, rPhl p 6 d[29, 30] P79L, rPhl p 6 d[29, 30] P57L P79L, rPhl p 6 d[P29] P30L, rPhl p 6 d[P30] P29L, rPhl p 6 d[P57] P29L P30L, rPhl p 6 d[P79] P29L P30L, rPhl p 6 d[P57, 79] P29L P30L, rPhl p 6 P29L P30L P57L, rPhl p 6 P29L P30L P79L, rPhl p 6 P29L P30L P57L P79L и подобные, включая все гипоаллергенные модификации в соответствии с изобретением, описанные ниже, находятся, вследствие этого, в соответствии с изобретением, где нумерация соответствует последовательности Phl p 6, а именно зрелой Phl p 6.0102.

В данном документе пролин замещают, в виде примера, лейцином (L). В соответствии с изобретением, однако, пролины, в соответствии с изобретением, могут быть замещены какой-либо аминокислотой. Соответственно, все гипоаллергенные модификации, упомянутые выше, в которых один или более пролинов, в соответствии с изобретением, замещены другой аминокислотой, находятся в соответствии с изобретением. Более того, данными примерами не ограничиваются модификации Phl p 6, но и также касаются, в частности, Poa p 6 и аллергенов группы 6 всех других мятликовых. Однако особенное предпочтение отдается всем упомянутым гипоаллергенным модификациям, в соответствии с изобретением, Phl p 6 Phleum pratense, а именно на основе Phl p 6.0102.

T-хелперы-лимфоциты реагируют с пептидными фрагментами аллергенов, которые образуются посредством процессов деградации в антиген представляющих клетках (АРС) и представлены связанными с молекулами МНС класса II на поверхности АРС. Пептиды, в основном, имеют длину 13-18 аминокислот, но могут также быть длиннее благодаря сайту связывания МНС класса 2, который открыт сбоку. Обнаружено, что принципиальные точки контакта пептида с молекулой класса МНС находятся в ядерной последовательности из около 7-10 аминокислот. Аллерген специфическая активация T-хелпер-лимфоцитов является необходимым предварительным условием для их пролиферации и функциональной дифференциации (например, Treg, T_H1 и T_H2). Способность аллергена или модификации аллергена стимулировать аллерген специфические T-лимфоциты рассматривается как ключ для их терапевтического действия.

Все модификации аллергена, полученные на основе Phl p 6 или Phl p 6.0102 и описанные в данном документе, демонстрируют значительное сохранение критических эпитопов T-клеток в экспериментах.

Таким образом, впервые описываются модификации аллергенов группы 6 Poaceae, которые демонстрируют новые свойства протеинов посредством модифицирования пролиновых остатков. Рассмотренные пролиновые остатки расположены в областях петли. Исключительно модифицирование определенных пролиновых остатков в результате приводит к новым модификациям, которые характеризуются пониженной IgE реактивностью со значительным сохранением реактивности T-клетки и, поэтому, являются пригодными для лечебной и профилактической специфической иммунотерапии. Соответствующие молекулы ДНК также являются приемлемыми для иммунотерапевтической вакцинации.

Поэтому представленное изобретение касается описанных модификаций аллергена, молекул ДНК и рекомбинантных векторов экспрессии в соответствии с изобретением, как лекарственных средств.

Гипоаллергенные модификации, молекулы ДНК и рекомбинантные векторы экспрессии в соответствии с изобретением или лекарственные средства в соответствии с изобретением могут использовать, в частности, для профилактики и/или для лечения заболеваний и состояний. Лекарственные средства в соответствии с изобретением особенно приемлемы для лечения и/или профилактики аллергий типа 1, то есть для специфической иммунотерапии (гипосенсибилизации) пациентов, страдающих от аллергии на пыльцу травы, или для профилактической иммунотерапии аллергий на пыльцу травы, в инициирование которых вовлечены аллергены группы 6 рода Poaceae. Молекулы ДНК и рекомбинантные векторы экспрессии в соответствии с изобретением могут быть использованы для соответствующей иммунотерапевтической и профилактической ДНК вакцинации.

Изобретение, кроме того, касается использования, по меньшей мере, одной гипоаллергенной модификации в соответствии с изобретением для производства лекарственного средства для предупреждения и/или терапевтического лечения аллергий типа 1, причиной инициирования которых являются аллергены группы 6 мятликовых.

Кроме того, в соответствии с изобретением находится использование, по меньшей мере, одной молекулы ДНК, в соответствии с изобретением, и/или рекомбинантного вектора экспрессии, в соответствии с изобретением, включая их смеси во всех соотношениях, для производства лекарственного средства для иммунотерапевтической ДНК вакцинации.

Более того, изобретение касается фармецевтических препаратов, содержащих, по меньшей мере, одну гипоаллергенную модификацию, в соответствии с изобретением, по меньшей мере, одну молекулу ДНК, в соответствии с изобретением, и/или по меньшей мере, один рекомбинантный вектор экспрессии, в соответствии с изобретением, включая их смеси во всех соотношениях, и необязательно дополнительные активные соединения и/или вспомогательные, для профилактического и/или терапевтического лечения аллергий типа 1.

В частности, фармацевтические препараты в соответствии с изобретением являются приемлемыми для профилактического и/или терапевтического лечения аллергий типа 1, причиной инициирования которых являются аллергены группы 6 мятликовых.

Фармацевтические препараты в смысле данного изобретения могут использовать как терапевтические агенты в медицине человека и ветеринарной медицине и соответственно могут быть введены людям или животным, в частности млекопитающим, таким как обезьяны, собаки, коты, крысы или мыши, и могут быть использованы в терапевтическом лечении человека или животного и в противодействие упомянутым выше заболеваниям. Более того, их могут использовать как диагностические агенты или как реагенты.

При использовании препаратов или лекарственных средств, в соответствии с изобретением, гипоаллергенные модификации, молекулы ДНК или рекомбинантные векторы экспрессии, в соответствии с изобретением, в основном используют аналогично известным, коммерчески доступным препаратам, предпочтительно в дозах между 0,001 и 500 мг, в случае гипоаллергенных модификаций около 1-500 мкг, предпочтительно 5-200 мкг, на дозу в фазе стабилизации. Препарат могут вводить однократно или несколько раз в день, например дважды, три раза или четыре раза в день. Дозы, как правило, увеличиваются до поддерживающей дозы в фазе возрастающего дозирования. Различные схемы увеличения и поддержания дозировки являются возможными для этой цели. В случае подкожной иммунотерапии (SCIT), например, они могут включать кратковременные терапии (ограниченные числом инъекций до начала сезонных жалоб, как правило, 4-7 инъекций), предсезонные терапии (начало терапии до сезона пыления, как правило, еженедельные инъекции во время фазы возрастания и ежемесячные инъекции при поддерживающей дозе до начала сезона пыления) или круглогодичные терапии (фаза возрастающего дозирования, как правило, аж до 16 еженедельных инъекций, с последующими ежемесячными инъекциями поддерживающей дозы, если необходимо пониженная доза во время сезона пыления). В случае сублингвальной иммунотерапии водными или твердыми препаратами (таблетки, капсулы, т.п.) терапию могут проводить с или без фазы возрастающего дозирования. Терапию, предпочтительно, проводят ежедневными дозами на всем протяжении года, но также могут проводить предсезонно или по другим схемам применения (например, через день, еженедельно, ежемесячно).

Выражение "эффективное количество" означает количество лекарственного средства или фармацевтически активного соединения, которое обуславливает биологический или медицинский ответ в ткани, системе, животном или человеке, которые подысканы или направлены исследователем или терапевтом.

К тому же, выражение "терапевтически эффективное количество" означает количество, которое по сравнению с соответствующим субъектом, который не получал этого количества, имеет следующие последствия: улучшение лечения, оздоровление, предупреждение или избавление от заболевания, синдрома, состояния, недуга, расстройства, или предупреждения побочных эффектов, или, кроме того, снижение прогрессирования заболевания, недуга или расстройства. Термин "терапевтически эффективное количество", кроме того, охватывает количества, которые являются эффективными с возрастающей нормальной физиологической функцией.

Лекарственные средства могут быть адаптированы для введения посредством какого-либо по желанию приемлемого пути, например оральным (включая буккальный или сублингвальный), ректальным, пульмональным, назальным, местным (включая буккальный, сублингвальный или трансдермальный), вагинальным или парентеральным (включая подкожный, внутримышечный, внутривенный или интрадермальный) путями. Такие лекарственные средства могут быть приготовлены, используя все процессы, известные в фармацевтической отрасли, например комбинацией активного соединения с наполнителем(ями) или вспомогательным(ыми).

Приемлемыми для парентерального использования являются, в частности, растворы, преимущественно масляные или водные растворы, кроме того, суспензии, эмульсии или имплантанты. Модификации аллергена, в соответствии с изобретением, также могут быть лиофилизированными и полученные в результате лиофилизаты используют, например, для приготовления инъекционных препаратов. Указанные препараты могут быть стерилизованными и/или включать адъюванты, такие как лубриканты, консерванты, стабилизаторы и/или увлажняющие агенты, эмульгаторы, соли для модифицирования осмотического давления, буферные вещества и/или множество дополнительных активных соединений. Более того, базовые препараты могут быть получены путем соответствующей формуляции модификаций аллергена, в соответствии с изобретением, например путем адсорбции на гидроксиде алюминия, фосфате кальция или тирозине.

Приемлемыми наполнителями являются органические или неорганические вещества, которые являются приемлемыми для парентерального введения и не взаимодействуют с модификациями аллергена группы 6, в соответствии с изобретением. Их примерами являются наполнители, такие как вода, растительные масла, бензиловые спирты, полиэтиленгликоли, глицеринтриацетаты, желатин, углеводы, такие как лактоза или крахмал, стеарат магния, тальк, ланолин или вазелин.

Парентеральное введение является предпочтительно приемлемым для введения лекарственных средств, в соответствии с изобретением. В случае парентерального введения внутривенное, подкожное, интрадермальное или внутрилимфатическое введение являются особенно предпочтительными. В случае внутривенного введения инъекцию выполняют непосредственно или как дополнение к инфузионным растворам.

Лекарственные средства, которые адаптированы к парентеральному введению, включают водные и неводные стерильные инъекционные растворы, которые содержат антиоксиданты, буферы, бактериостатики и солюбилизаторы, посредством которых состав оказывается изотоническим с кровью реципиента для лечения, водные и неводные стерильные суспензии, которые могут включать суспензирующие агенты и загустители. Составы могут быть введены в однодозовые или многодозовые контейнеры, например запаянные ампулы и флаконы, и хранимые в сухо-замороженном (лиофилизированном) состоянии, означающем, что предполагается, что является необходимым только добавление жидкого носителя, например воды для инъекции, непосредственно перед использованием. Инъекционные растворы и суспензии, которые готовят в соответствии с составом, могут быть получены из стерильных порошков, гранул и таблеток.

При желании, препараты или лекарственные средства, в соответствии с изобретением, могут включать одно или более дополнительных активных соединений и/или один или более агентов, усиливающих действие (адъювантов).

Таким образом, представленное изобретение, кроме того, касается фармацевтических препаратов, которые включают дополнительные активные соединения и/или вспомогательные вещества. Изобретение предпочтительно касается фармацевтических препаратов, в соответствии с изобретением, которые отличаются тем, что дополнительные активные соединения являются аллергенами или их модификациями. Примерами приемлемых дополнительных активных соединений являются другие аллергены, в частности аллергены мятликовых, особенно предпочтительно аллергены подсемейства Pooideae, предпочтительно из групп Poodae и Triticodae, предпочтительно представленные Phleum pratense, Holcus lanatus, Phalaris aquatica, Dactylis glomerata, Lolium perenne, Poa pratensis, Hordeum vulgare, Secede cereale и Triticum aestivum, например аллергены группы 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 12 или 13 и их модификации, например гипоаллергенные модификации, фрагменты, мультимеры, гибридные молекулы или рекомбинантные слитые протеины. Представленное изобретение, кроме того, касается фармацевтических препаратов, которые включают, по меньшей мере, одно дополнительное вспомогательное вещество, особенно предпочтительно так называемые адъюванты. Примерами адъювантов являются гидроксид алюминия, монофосфорильный липид A, активаторы Toll-подобных рецепторов, такие как, например, липополисахариды и CpG олигонуклеотиды, витамин D3, микробактериальные антигены и молекулы с паразитов (например, шитосомы или филярии), такие как, например, цистатин или ES-62.

Изобретение, кроме того, касается наборов (комплектов), которые включают отдельные упаковки из:

a) фармацевтического препарата, в соответствии с изобретением, который содержит эффективное количество гипоаллергенной модификации, молекулы ДНК или рекомбинантный вектор экспрессии, в соответствии с изобретением;

b) фармацевтического препарата, который содержит эффективное количество дополнительного фармацевтически активного соединения и/или адъюванта.

Набор включает приемлемые контейнеры, такие как коробки или картонки, индивидуальные флаконы, пакеты или ампулы. Набор может включать, например, отдельные ампулы, каждая из которых содержит состав, в соответствии с изобретением, включающий эффективное количество гипоаллергенной модификации, молекулы ДНК или рекомбинантный вектор экспрессии в соответствии с изобретением и состав с дополнительным активным соединением в виде лекарственного средства в растворенной или лиофилизированной форме.

Даже без дополнительных вариантов осуществления, предполагается, что квалифицированный специалист в данной области будет способен использовать приведенное выше описание в самом широком объеме. Поэтому предпочтительные варианты осуществления следует рассматривать только как описательное раскрытие информации, которые, однако, никоим образом в любом случае не являются ограничивающими.

Таким образом, следующие примеры предназначены для объяснения изобретения, не ограничивая его. Если не указано другое, то данные в процентах означают процент по массе. Все температуры указаны в градусах Цельсия. "Общепринятая разработка": если необходимо, добавляют воду, если необходимо, регулируют pH в диапазоне значений между 2 и 10, в зависимости от структуры конечного продукта.

Следующие гипоаллергенные модификации в соответствии с изобретением получают биотехнологическими способами и охарактеризовуются. Однако получение и характеристика веществ, кроме того, могут осуществлять другими способами, известными квалифицированному специалисту с уровня техники. Например, гипоаллергенные модификации, в соответствии с изобретением, кроме того, могут быть синтезированы химически. Изобретение, более того, касается гипоаллергенных модификаций, в соответствии с изобретением, описанных ниже.

Пример 1: Модификации Phl p 6 с делециями пролинов в одной области петли

Получение модификаций rPhl p 6 d[P29, 30]+6His, rPhl p 6 d[P57] + 6His и rPhl p 6 d[P79] + 6His и их иммунологическая характеристика описана ниже. Рекомбинантный немодифицированный аллерген (rPhl p 6 wt + 6His) получают и исследуют по аналогии, и гипоаллергенные модификации других аллергенов группы 6, в соответствии с изобретением, мятликовых и их протеины немутантного типа, в частности Poa p 6, также могут быть получены и исследованы по аналогии.

Конструирование путем генной инженерии

ДНК, кодирующие модификации, синтезируют путем связывания длинных перекрывающихся нуклеотидов ДНК и амплификации ДНК стандартным способом PCR (ПЦР). Кодоны выбирают таким образом, чтобы определить концентрацию частиц с помощью RI детектора, а рассеяние света регистрируют, используя MALS детектор (Wen et al., 1996, Anal. Biochem. 240:155-166). Средняя масса элюированных частиц может быть рассчитана исходя из этих данных с погрешностью около 5%. Мономеры, димеры, другие мультимеры и агрегаты могут быть обнаружены с помощью SEC/MALS/RI.

В процессе SEC/MALS/RI анализа становится ясно, что протеины, каждый из которых элюируют отдельным пиком, находятся в форме чистых мономеров при естественных условиях (Фиг.8, Таблица 1).

Таблица 1
Молекулярная масса Phl p 6 немутантного типа и модификаций Phl p 6 с делециями пролина в петлях 1, 2, 3 или 4
Образцы	Протеин	ММрассч.1 [кДа]	SEC2 мм [кДа]	Оценка
1	Phl p 6 wt + 6His	12,92	12,89	Мономер
2	d[P29, 30] + 6His	12,73	12,88	Мономер
3	d[P57] + 6His	12,83	12,91	Мономер
4	d[P79] + 6His	12,83	12,92	Мономер
5	d[P101] + 6His	12,83	12,89	Мономер
1 Рассчитывали молекулярную массу на основании аминокислотной последовательности, начиная с метионина (программное обеспечение: EditSeq 6.0; DNA-Star Inc., Madison, USA).
2 Определение массы частиц способом гель-фильтрации (SEC). Среднюю массу элюированных протеиновых частиц в пике указывают в окне системы.

Происходящее в реальном времени определение концентрации протеина выполняют, используя OptilabrEX рефрактометрический детектор (RI) (Wyatt, Santa Barbara, USA). Рассеяние света частицами определяли, используя MiniDAWN Treos (Wyatt) многоугловой детектор. Массу частиц рассчитывали, используя ASTRA 5.3.2.17 программное обеспечение (Wyatt) через совокупность формул Дебая с предположительно увеличенным показателем преломления 0,180 мл/г. SEC колонка: Superdex 200 GL 10/300 (GE Healthcare, Uppsala, Sweden). Элюент: 20 мМ буферный раствор фосфата натрия pH 7,2 с 150 мМ NaCl.

Выведенная аминокислотная последовательность основана на той, что и зрелая Phl p 6.0102 (Фиг.3, Фиг.4). Мутации делецией пролина вводят, используя специфические олигонуклеотиды, в которых отсутствуют соответствующие кодоны, для пролина в реакциях PCR. Данные олигонуклеотиды выбирают таким образом, что выведенный протеин несет гексагистидиновый слитый компонент на 5' конце (Фиг.5, Фиг.6).

Данные ДНК лигировались в вектор экспрессии pTrcHis2 Topo (Invitrogen, Carlsbad, USA) посредством реакции топоизомеразы. Корректность ДНК подтверждают путем секвенирования.

Экспрессия и очистка:

Экспрессию рекомбинантных гистидиновых слитых протеинов осуществляют в Escherichia coli (Top 10 штамм; Invitrogen). rPhl p 6 wt + 6 His и модификации первично очищают путем специфического связывания N-терминальных гистидиновых остатков с Ni + хелатной матрицей (аффинная хроматография с иммобилизированным ионом металла, IMAC; материал: HiTrap, GE Healthcare, Uppsala, Sweden). Рекомбинантные протеины из IMAC элюата впоследствии концентрировали и проводили гель-фильтрацию (материал: Superdex 75; GE Healthcare).

Биохимический анализ:

Чистоту полученных протеинов сначала проверяют путем SDS-PAGE с последующим окрашиванием Кумасси. Анализ показывает очень высокую степень чистоты всех протеинов (Фиг.7).

Аналитическая гель-фильтрация (SEC) позволяет разделение видов протеинов на основе их специфических гидродинамических радиусов. Происходящее в реальном времени определение молекулярной массы может достигаться путем сочетания рефрактометра (RI детектор) и детектора многоуглового рассеяния света (MALS детектор) с хроматографической системой (SEC/MALS/RI способ). В данном способе предоставленное при измерении времени

Отсутствие нерастворимых агрегатов протеинов также проверяют, используя электронную спектроскопию поглощения (фотометр: Ultrospec 5300pro UV/VIS; GE Healthcare).

В электронную спектроскопию поглощения волновой спектр раствора протеина регистрируют в диапазоне длин волн от 240 до 800 нм. Нерастворимые агрегаты в растворах протеинов поглощают в диапазоне длин волн >300 нм, в то время как высоко растворимые протеины не поглощают в данном диапазоне. Волновые спектры типичны для протеинов, имеющих высокую растворимость. Таким образом, протеины, в соответствии с изобретением, являются растворимыми, высокочистыми и мономерными при естественных условиях.

Доказательство пониженного IgE связывания:

Простым способом анализа для определения реактивности специфического IgE из сывороток страдающих от аллергии является тест-полоска. Используя данный способ, относительно большое число сывороток страдающих от аллергии может быть исследовано параллельно.

Для этой цели, исследуемые вещества с одинаковой концентрацией и количеством связывают в одном ряду один за другим с полоской нитроцеллюлозной мембраны при условиях, не вызывающих денатурацию. Серии таких полосок мембран могут инкубировать параллельно с разными сыворотками страдающих от аллергии. После стадии промывания специфически связанные IgE антитела становятся видимыми на мембране посредством цветной реакции, стимулированной IgE/щелочным конъюгатом фосфатазы не человека.

Результаты от модификаций Phl p 6, используя 18 конкретных сывороток страдающих от аллергии на пыльцу травы, изображены на Фиг.9. Как важный контроль, сначала исследуют IgE связывание рекомбинантного аллергена с и без гистидиновой слитой компоненты. Оба протеина демонстрируют одинаковую способность IgE связывания. N-терминальный гистидиновый слитый компонент, использованный для изучения, соответственно, не препятствует связыванию IgE с Phl p 6.

Мутантный rPhl p 6 d[P101] + 6His демонстрирует подобное хорошее IgE связывание, как и немодифицированный аллерген со всех исследованных сывороток (Фиг.9). Из этого следует, что делеция пролина 101 не оказывает значительное влияние на способность IgE связывания Phl p 6. IgE связывание мутантных rPhl p 6 d[P29, 30] + 6His, rPhl p 6 d[P57] + 6His и rPhl p 6 d[P79] + 6His различается в сыворотках страдающих от аллергии на пыльцу разных трав. Это происходит благодаря разновидности в композиции IgE популяции конкретных страдающих от аллергии по отношению к аффинности и специфичности антигенной детерминации IgE антител. Мутантные rPhl p 6 d[P57] + 6His и rPhl p 6 d[P79] + 6His демонстрируют значительно пониженную IgE реактивность с большинством сывороток, по сравнению с немодифицированным rPhl p 6 wt + 6His. Однако во всех отношениях наименьшее IgE связывание наблюдается в случае мутантного rPhl p 6 d[P29, 30] + 6His (Фиг.9).

Исследование способности IgE связывания растворенных анализируемых веществ проводят, используя анализ EAST ингибирования (ферментное исследование аллергосорбента). В данном способе взаимодействие аллерген/IgE может быть исследовано в растворе, что позволяет маскировать вмешательство эпитопов исследуемой субстанции, чтобы его исключить, например, путем иммобилизации на мембране.

Анализ EAST ингибирования проводят, как указано далее. Микротитрационные планшеты покрывают аллергенами, в данном документе rPhl p 6 wt + 6His. После удаления несвязанных молекул аллергена промыванием планшет блокируют альбумином бычьей сыворотки с целью предупреждения более позднего неспецифического связывания. IgE антитела страдающих от аллергии, в виде конкретных сывороток, в приемлемых разбавлениях инкубировали в покрытых аллергеном микротитрационных планшетах. Количество аллерген-связанных IgE антител количественно определяют фотометрически через Anti-hIgG/щелочной конъюгат фосфатазы посредством реакции субстрата, что дает окрашенный конечный продукт.

Связывание IgE антител ингибируют субстанция-специфически растворимым аллергеном или субстанцией для исследования (рекомбинантный модифицированный аллерген) как функцией концентрации.

Результаты анализа IgE ингибирования, приведенные на Фиг.10 с модификациями рекомбинантного аллергена Phl p 6, показывают, что делеция пролиновых остатков Р[29, 30], Р57 и Р79 служит причиной пониженной способности IgE связывания Phl p 6. Способность IgE связывания мутантного d[P29, 30] является значительно более низкой, чем та, что d[P57] или d[P79]. Более низкое ингибирующее действие показывает потерю IgE эпитопов. Мутантный d[P101] не демонстрирует модифицированного IgE связывания с сывороткой страдающего от аллергии на пыльцу травы P32 и только слабое понижение связывания с сывороткой P82, которое, с другой стороны, почти соответствует той, что и у немутантного типа при высокой концентрации ингибитора.

Доказательство понижения функциональной аллергенности:

Функциональное действие мутантов в поперечном связывании мембрана-связанного IgE клеток-эффекторов и их активацию впоследствии исследовали in vitro.

Для теста активации базофилов гепаринизированную цельную кровь страдающих от аллергии на пыльцу травы инкубируют с различными концентрациями исследуемых веществ. Аллергические вещества способны связывать специфические IgE антитела, которые связываются с высоко аффинными IgE рецепторами базофильных гранулоцитов. Сшивание комплексов IgE/рецептор, вызванное молекулами аллергенов, в результате приводит к сигнальной трансдукции, которая в результате приводит к дегрануляции клеток-эффекторов и, таким образом, запускает аллергические реакции in vivo.

Аллерген-индуцированная активация базофильных иммуноцитов может быть определена in vitro количественной оценкой экспрессии поверхностного протеина (CD203c), связанного с сигнальной трансдукцией IgE-рецептора поперечными связями (Kahlert et al., Clinical Immunology and Allergy in Medicine Proceedings of the EAACI 2002 (2003) Naples, Italy 739-744). Число поверхностных протеинов, экспрессированных в клетке, и процентное значение активированных клеток петли клетки измеряют с высокой чувствительностью посредством связывания меченного флюоресцентной меткой моноклонального антитела с поверхностным протеином и последующим анализом с помощью флюоресцентно активированной проточной цитометрии.

Гранулоциты, использованные в анализе, в представленном примере выделяют из цельной крови страдающего от аллергии P21. Данный страдающий от аллергии представляет таких страдающих от аллергии, чьи IgE антитела демонстрируют обнаруживаемое связывание с rPhl p 6 d[P29, 30] + 6His в способе тест-полоски (группа "A").

При тех же концентрациях немодифицированного, рекомбинантного аллергена и rPhl p 6 d[P29, 30] + 6His последний демонстрирует меньшее связывание с мембрана-связанными IgE антителами в случае обоих доноров и вследствие этого существенно снизилась активация базофильных гранулоцитов (Фиг.11.).

Таким образом, результаты подтверждают функциональное понижение аллергенности мутантного rPhl p 6 d[P29, 30] + 6His. Мутантные rPhl p 6 d[P57] + 6His и rPhl p 6 d[P79] + 6His демонстрируют явное понижение активации базофильных клеток в случае донора P21. Таким образом, данные анализа подтверждают, что пролиновые мутации в этих двух областях Phl p 6 также понижают способность IgE связывания, по меньшей мере, у некоторых страдающих от аллергии.

T-клеточная реактивность модификаций:

С целью исследования T-клеточной реактивности олигоклональные линии T-клеток страдающих от аллергии на пыльцу травы создают стандартными способами со стимуляцией немодифицированным аллергеном. В пролиферативном анализе различные линии T-клеток стимулируют упомянутым аллергеном rPhl p 6 wt и модифицированными вариантами рекомбинантного аллергена. Скорость пролиферации определяют стандартными способами включением [3H]-тимидина.

Модификации rPhl p 6 d[P29, 30] + 6His, rPhl p 6 d[57] + 6His и rPhl p 6 d[79] + 6His стимулируют пролиферацию в исследованных линиях T-клеток в сопоставимой степени с немодифицированным аллергеном. Из этого можно сделать вывод о сохранении важных T-клеточных эпитопов.

Пример 2: Модификации Phl p 6 с комбинациями пролиновых делеций в ряде областей петли

Получение и иммунологическая характеристика модификаций rPhl p 6 d[P29, 30, 57] + 6His и rPhl p 6 d[29, 30, 79] + 6His описана ниже в виде примера гипоаллергенных модификаций аллергенов группы 6 Poaceae с комбинациями пролиновых делеций, соответствующих аминокислотным положениям 29, 30; 57 и 79 в Phl p 6 немутантного типа (IUIS запись Phl p 6.0102). В данном документе удаленные пролиновые остатки могут находиться в двух или трех областях петли, гомологичной к Phl p 6. Соответствующие гипоаллергенные модификации Phl p 6 немутантного типа Phl p 6.0101 изомера (GenBank: Z27082.1, UniProt: P43215) получают и исследуют по аналогии, и гипоаллергенные модификации других аллергенов группы 6, в соответствии с изобретением, мятликовых и их протеины немутантного типа, в частности Poa p 6, также могут быть получены и исследованы по аналогии.

Кодоны выбирают таким образом, что установленная аминокислотная последовательность основывается на таком, как зрелый Phl p 6.0102 (Фиг.3, Фиг.4). Мутации для пролиновых делеций вводят, используя специфические олигонуклеотиды, в которых отсутствуют соответствующие кодоны пролина в реакциях PCR. Олигонуклеотиды предпочтительно выбирают таким образом, что выведенный протеин несет гексагистидиновый слитый компонент на 5' конце (Фиг.5, Фиг.6). Данные ДНК лигировались в вектор экспрессии pTrcHis2 Topo (Invitrogen, Carlsbad, USA) посредством реакции топоизомеразы. Корректность ДНК подтверждают путем секвенирования. Однако другие стандартные векторы экспрессии также могут быть использованы.

Экспрессию рекомбинантных гистидиновых слитых протеинов осуществляют во всех стандартных эукариотических и прокариотических экспрессионных системах, экспрессию предпочтительно осуществляют в Escherichia coli (Top 10 штамм; Invitrogen). Модификации первично очищают путем специфического связывания N-терминальных гистидиновых остатков с Ni²⁺ хелатной матрицей (аффинная хроматография с иммобилизированным ионом металла, IMAC; материал: HiTrap, GE Healthcare, Uppsala, Sweden). Рекомбинантные протеины из IMAC элюата впоследствии концентрировали и проводили гель-фильтрацию (материал: Superdex 75; GE Healthcare).

Биохимический анализ:

Чистоту полученных протеинов сначала проверяют путем SDS-PAGE с последующим окрашиванием Кумасси. Анализ показывает очень высокую степень чистоты всех протеинов (Фиг.12).

Аналитическая SEC, в которой протеины исследовали при естественных условиях, показывает, что протеины элюируют одним пиком. Высокомолекулярные агрегаты не обнаружены (Фиг.13). Происходящее в реальном времени определение молекулярной массы способом MALS/RI приводит к результату, что rPhl p 6 d[29, 30, 79] + 6His находится в чисто мономерной форме, в то время как элюированный rPhl p 6 d[P29, 30, 57] + 6His представляет собой смесь мономеров и димеров (Фиг.13, Таблица 2). Несмотря на это волновые спектры обоих протеинов, записанные с помощью электронной спектроскопии поглощения, являются типичными для протеинов, имеющих высокую растворимость.

Таким образом, оба протеина являются растворимыми, чистыми и свободными от осадков при естественных условиях и, таким образом, достигаются необходимые предпосылки для точного анализа их способности специфического IgE связывания.

Таблица 2
Молекулярная масса Phl p 6 мутантов с мутациями в ряде петель
Образцы	Протеин	ММрассч.1 [кДа]	SEC/MALS/RI2 ММ [кДа]	Оценка
1	d[P29, 30, 57] + 6His	12,63	17,24	Смесь мономер/димер
2	d[P29, 30, 79] + 6His	12,63	12,82	Мономер
3	d[P29, 30] P57L + 6His	12,75	20,95	Смесь мономер/димер
4	d[P29, 30] P79L + 6His	12,75	12,99	Мономер
5	d[P29, 30] P57L P79L + 6His	12,76	25,56	Преимущественно димеры
1 Рассчитывали молекулярную массу на основании аминокислотной последовательности, начиная с метионина (программное обеспечение: EditSeq 6.0; DNA-Star Inc., Madison, USA).
2 Определение массы частиц способом гель-фильтрации (SEC). Среднюю массу элюированных протеиновых частиц в пике указывают в окне системы.

Происходящее в реальном времени определение концентрации протеина выполняют, используя OptilabrEX рефрактометрический детектор (RI) (Wyatt, Santa Barbara, USA). Рассеяние света частицами определяли, используя MiniDAWN Treos (Wyatt) многоугловой детектор. Массу частиц рассчитывали, используя ASTRA 5.3.2.17 программное обеспечение (Wyatt) через совокупность формул Дебая с предположительно увеличенным показателем преломления 0,180 мл/г. SEC колонка: Superdex 200 GL 10/300 (GE Healthcare, Uppsala, Sweden). Элюент: 20 мМ буферный раствор фосфата натрия pH 7,2 с 150 мМ NaCl.

Доказательство пониженного IgE связывания:

Результаты анализа тест-полосками с rPhl p 6 d[P29, 30, 57] + 6His и rPhl p 6 d[29, 30, P79] + 6His, используя 18 индивидуальных сывороток страдающих от аллергии на пыльцу травы, показаны на Фиг.14. Неожиданно выявлено, что сыворотки страдающих от аллергии, которые имеют обнаруживаемое IgE связывание с rPhl p 6 d[P29, 30], в тест-полоске имеют преимущественно чрезвычайно пониженную IgE реактивность с модификациями rPhl p 6 d[P29, 30, 57] + 6His и rPhl p 6 d[29, 30, 79] + 6His (группа "A": сыворотки 21, 32, 83, 137 и т.д.).

Таким образом, четко показано, что способность IgE связывания Phl p 6 в дальнейшем может быть снижена множеством комбинированных делеций пролинов из разных областей петли, что является возможным посредством делеций пролиновых остатков только в одной-единственной области петли.

T-клеточная реактивность модификаций:

Модификации стимулируют пролиферацию исследованных линий T-клеток в сопоставимой степени, как и немодифицированный аллерген. Из этого можно сделать вывод о сохранении важных T-клеточных эпитопов.

Пример 3: Модификации Phl p 6 с комбинациями пролиновых точечных мутаций в ряде областей петли

Получение и иммунологическая характеристика модификаций rPhl p 6 d[P29, 30] P57L + 6His, rPhl p 6 d[29, 30] P79L + 6His и rPhl p 6 d[29, 30] P57L P79L + 6His описаны ниже в виде примера гипоаллергенных модификаций аллергенов группы 6 Poaceae с комбинациями пролиновых точечных мутаций, соответствующих аминокислотным положениям 29, 30 57 и 79 в Phl p 6 немутантного типа (IUIS запись Phl p 6.0102). Пролиновые остатки могут быть превращены в какую-либо аминокислоту. Соответствующие гипоаллергенные модификации Phl p 6 немутантного типа изомера Phl p 6.0101 (GenBank: Z27082.1, UniProt: P43215) получают и исследуют по аналогии, и гипоаллергенные модификации других аллергенов группы 6, в соответствии с изобретением, семейства мятликовых и их протеины немутантного типа, в частности Poa p 6, также могут быть получены и исследованы по аналогии.

Кодоны выбирают таким образом, что установленная аминокислотная последовательность основывается на таком, как зрелый Phl p 6.0102 (Фиг.3, Фиг.4). Мутации для пролиновых делеций вводят, используя специфические олигонуклеотиды, в которых отсутствуют соответствующие кодоны пролина в реакциях PCR. Олигонуклеотиды предпочтительно выбирают таким образом, что выведенный протеин несет гексагистидиновый слитый компонент на 5' конце (Фиг.5, Фиг.6).

Данные ДНК лигировались в вектор экспрессии pTrcHis2 Topo (Invitrogen, Carlsbad, USA) посредством реакции топоизомеразы. Корректность ДНК подтверждали путем секвенирования. Однако другие стандартные векторы экспрессии также могут быть использованы.

Экспрессию рекомбинантных гистидиновых слитых протеинов могут осуществлять во всех стандартных эукариотических и прокариотических экспрессионных системах, экспрессию предпочтительно осуществляют в Escherichia coli (Top 10 штамм; Invitrogen). Модификации первично очищают путем специфического связывания N-терминальных гистидиновых остатков с Ni²⁺ хелатной матрицей (аффинная хроматография с иммобилизированным ионом металла, IMAC; материал: HiTrap, GE Healthcare, Uppsala, Sweden). Рекомбинантные протеины впоследствии концентрировали из IMAC элюата и проводили гель-фильтрацию (материал: Superdex 75; GE Healthcare).

Биохимический анализ:

Чистоту полученных протеинов сначала проверяют путем SDS-PAGE с последующим окрашиванием Кумасси. Анализ показывает очень высокую степень чистоты всех протеинов (Фиг.12).

Аналитическая SEC, в которой протеины исследовали при естественных условиях, показывает, что протеины элюируются одним пиком. Высокомолекулярные агрегаты не обнаружены (Фиг.13.). Происходящее в реальном времени определение молекулярной массы способом MALS/RI приводит к результату, что rPhl p 6 d[29, 30] P79L + 6His находится в чисто мономерной форме, в то время как элюированный rPhl p 6 d[P29, 30] P57L + 6His представляет собой смесь мономеров и димеров. rPhl p 6 d[29, 30] P57L P79L + 6His находится преимущественно в форме димера (Фиг.13; Таблица 2).

Волновые спектры всех протеинов, записанные с помощью электронной спектроскопии поглощения, являются типичными для протеинов, имеющих высокую растворимость. Три протеина являются, таким образом, растворимыми, чистыми и свободными от осадков при естественных условиях и, таким образом, достигаются необходимые предпосылки для точного анализа их способности специфического IgE связывания.

Доказательство пониженного IgE связывания:

Результаты исследования тест-полоской с rPhl p 6 d[P29, 30] P57L + 6His, rPhl p 6 d[29, 30] P79L + 6His и rPhl p 6 d[29, 30] P57L P79L + 6His, используя 18 индивидуальных сывороток страдающих от аллергии на пыльцу травы, показаны на Фиг.12.

Неожиданно, выявлено, что сыворотки страдающих от аллергии, которые имеют обнаруживаемое IgE связывание с rPhl p 6 d[P29, 30], в тест-полоске имеют преимущественно чрезвычайно пониженную IgE реактивность с модификациями rPhl p 6 d[P29, 30] P57L + 6His, rPhl p 6 d[29, 30] P79L + 6His и rPhl p 6 d[29, 30] P57L P79L + 6His (группа "A": сыворотка 21, 32, 83, 137 и т.д.).

Таким образом, четко показано, что способность IgE связывания Phl p 6 в дальнейшем может быть снижена множеством комбинированных точечных мутаций пролинов из разных областей петли, что является возможным посредством точечной мутации пролиновых остатков только в одной-единственной области петли.

T-клеточная реактивность модификаций:

Модификации стимулируют пролиферацию исследованных линий T-клеток в сопоставимой степени, как и немодифицированный аллерген. Из этого можно сделать вывод о сохранении важных T-клеточных эпитопов.

1. Гипоаллергенный полипептид аллергенов группы 6 мятликовых (Роасеае) Phl p 6, в котором пролины, которые соответствуют в линеаризованном виде пролинам в положениях 29, 30, 57 и 79 аминокислотной последовательности белка Phl p 6 дикого типа в соответствии с SEQ ID №:2, мутированы отдельно или в комбинации за счет точечных мутаций, выбранных из делеций и замен аминокислот.

2. Гипоаллергенный вариант Phl p 6 полипептида, имеющий аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 95% идентичную полипептиду Phl p 6 дикого типа в соответствии с SEQ ID №:2, и включающий одну или несколько точечных мутаций, выбранных из замен и делеций пролина в положениях 29, 30, 57, 79, соответствующих указанной SEQ ID №:2.

3. Молекула ДНК, которая кодирует полипептид по п. 1.

4. Рекомбинантный вектор экспрессии, содержащий молекулу ДНК по п. 3, функционально связанную с последовательностью, контролирующей экспрессию.

5. Бактериальный организм-хозяин для продуцирования полипептида по п. 1, трансформированный с помощью рекомбинантного вектора экспрессии по п. 4.

6. Способ получения полипептида по п. 1, включающий культивирование организма-хозяина по п. 5 и выделение полипептида по п. 1.

7. Применение полипептида по п. 1, в качестве лекарственного средства для предупреждения или терапевтического лечения аллергий типа 1, в инициирование которых вовлечены аллергены группы 6 мятликовых.

8. Применение молекулы ДНК по п. 3 в качестве лекарственного средства для предупреждения или терапевтического лечения аллергий типа 1, в инициирование которых вовлечены аллергены группы 6 мятликовых.

9. Применение рекомбинантного вектора экспрессии по п. 4 в качестве лекарственного средства для предупреждения или терапевтического лечения аллергий типа 1, в инициирование которых вовлечены аллергены группы 6 мятликовых.

10. Применение молекулы ДНК по п. 3 в качестве лекарственного средства для иммунотерапевтической ДНК вакцинации против аллергенов группы 6 мятликовых.

11. Фармацевтическая композиция для профилактического или терапевтического лечения аллергий типа 1, в инициирование которых вовлечены аллергены группы 6 мятликовых, содержащая по меньшей мере один полипептид по п. 1 в эффективном количестве и вспомогательные вещества.

12. Фармацевтическая композиция по п. 11, дополнительно включающая активные компоненты, которыми являются аллергены мятликовых или их варианты.