Способ очистки нитчатого бактериофага м13



Способ очистки нитчатого бактериофага м13
Способ очистки нитчатого бактериофага м13
Способ очистки нитчатого бактериофага м13
Способ очистки нитчатого бактериофага м13
Способ очистки нитчатого бактериофага м13
Способ очистки нитчатого бактериофага м13
Способ очистки нитчатого бактериофага м13

 


Владельцы патента RU 2610178:

Федеральное бюджетное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" (ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор") (RU)

Изобретение касается способа очистки нитчатого бактериофага М13. Способ включает удаление бактериальной массы после наработки бактериофага путем первого и второго последовательного центрифугирования с последующей первой очисткой супернатанта бактериофага изоэлектрическим осаждением реагентом при pH 4,2, последующих третьего центрифугирования и ресуспендирования осадка с бактериофагом, а также повторной очисткой суспензии бактериофага изоэлектрическим осаждением реагентом при pH 4,2 и четвертого центрифугирования осадка с бактериофагом с получением готового продукта. Для изоэлектрического осаждения в качестве реагента используют натрий-ацетатный буфер со значением рН=4,2 в соотношении с супернатантом бактериофагов не менее 3:1 при первом изоэлектрическом осаждении, осадок с бактериофагами после третьего центрифугирования ресуспендировали в TBS-буфере, а при повторной очистке ресуспендированного бактериофага изоэлектрическим осаждением используют натрий-ацетатный буфер со значением рН=4,2 в соотношении с ресуспендированным бактериофагом не менее 1:1. Причем первое и второе центрифугирование проводят соответственно при 5000 об/мин и 12000 об/мин в течение 10 минут при 20°С, а третье и четвертое центрифугирование осуществляют при 10000 об/мин в течение 10 минут при 4°С. Изобретение обеспечивает более высокий уровень стерильности и чистоты бактериофага, особенно малых его количеств при более простой методике. 1 з.п. ф-лы, 7 табл., 9 пр.

 

Изобретение относится к методам очистки бактериофагов осаждением для применения их в технологии фагового дисплея, для изготовления медицинских биологических препаратов или в качестве матрицы для наноматериалов [1] и может быть использовано в биотехнологии.

Нитчатые бактериофаги (фаги) - это нелитические вирусы, инфицирующие бактерии и безопасные для человека. Фаги используются в ряде отраслей. Для борьбы с нежелательной бактериальной контаминацией, в том числе как антибактериальные препараты для обработки труднозаживающих ран, как безопасный консервант для пищевых продуктов. Нашли свое использование бактериофаги и в науке: для получения антител и пептидов в технологии фагового дисплея, генной терапии, для генно-инженерных работ и в качестве матрицы для получения наночастиц.

Нитчатый фаг М13 имеет размер около 880 нм в длину и 6,5 нм в ширину [2], кольцевую одноцепочечную ДНК. Капсид бактериофага М13 образован 5 копиями различных минорных оболочечных белков (р3, р6, р7, р9), однако большую часть его капсида составляет мажорный оболочечный белок р8, представленный 2700 копиями. Белок р8 это небольшой, длиной 50 а.о., альфа-спиральный белок. В составе вирусной частицы этот белок уложен в виде трубчатой структуры, при этом N-конец белка направлен в сторону раствора, и С-концевые белки образуют контакт с ДНК бактериофага. Подобная укладка белка приводит к тому, что, фактически, физико-химические свойства целой частицы определяются аминокислотной последовательностью N-конца белка р8 фага М13 - AEGDDPAK. В частности, изоэлектрическую точку (значение рН, при котором суммарный заряд этой молекулы равен нулю) вирусной частицы можно определить, если определить изоэлектрическую точку пептида - AEGDDPAK. Это значение было найдено теоретически, и подтверждено экспериментально, и равно 4,2 [3].

Методы осаждения фага М13 из культуры E. coli, как правило, основаны на использовании полиэтиленгликоля. Осаждение фагов с помощью ПЭГ и NaCl основано на эффекте «высаливания». Добавление больших количеств ПЭГ совместно с высокими концентрациями NaCl экранирует поверхностный заряд вирусной частицы и увеличивает гидрофобность ее поверхности, это приводит к слипанию вирусных частиц и выпадению их в осадок.

Этот подход имеет ряд очевидных недостатков: осаждение происходит длительное время, а в результате в осадке фагов присутствует ПЭГ, NaCl и остатки культуральной среды. Очистка фагов от примесей после такого осаждения весьма затруднена. Процедура диализа проводится в течение недели [4].

В источниках информации опубликованы данные об использовании ионнобменной и гель-проникающей хроматографии [5, 6, 7]. Однако это дорогие и трудоемкие методы для очистки фагов, которые не нашли широкого применения.

Наиболее близким аналогом (прототипом) предлагаемого технического решения является способ очистки нитчатого бактериофага М13, описанный в работе [4] и включающий удаление бактериальной массы после наработки бактериофага М13 путем первого и второго последовательного центрифугирования с последующей первой очисткой супернатанта бактериофага изоэлектрическим осаждением реагентом при pH 4,2. Для изоэлектрического осаждения бактериофага М13 из культуральной среды используют сильную кислоту - HCl. Добавление 5М HCl проводят до значения pH 4,2, контролируя его при помощи pH-метра. После доведения значения pH до нужного, суспензию бактериофагов помещают в холодильник на 1-, 5-2 часа для образования осадка. Далее проводят третье центрифугирование и ресуспендирование осадка с бактериофагом, а также повторной очисткой суспензии бактериофага изоэлектрическим осаждением 5М HCl при pH 4,2 и четвертое центрифугирование осадка с бактериофагом с получением готового продукта.

Однако у этого метода есть ряд недостатков. Основная сложность связана с тем, что многие процедуры при работе с бактериофагами требуют работы с небольшими объемами (500-1500 мкл). Измерение pH таких объемов является сложной процедурой. Используют специализированные электроды (нестандартное оборудование), которые снижают уровень стерильности и чистоты бактериофага или наносят аликвоту образца на специальную индикаторную бумагу, что приводит к потерям искомого продукта. Процедура доведения pH до необходимого значения с помощью кислоты или основания требует добавления их в определенном объеме. Рассчитать добавляемый объем сложно, так как необходимо учесть множество параметров (объем суспензии фага, pH среды, вещества, присутствующие в суспензии и т.д.), а добавление кислоты (щелочи) сопряжено с ошибками.

Техническим результатом заявляемого изобретения является упрощение способа очистки бактериофага, особенно малых его количеств, и обеспечение более высокого уровня стерильности и чистоты бактериофага.

Указанный технический результат достигается тем, что в способе очистки нитчатого бактериофага М13, включающем удаление бактериальной массы после наработки бактериофага путем первого и второго последовательного центрифугирования с последующей первой очисткой супернатанта бактериофага изоэлектрическим осаждением реагентом при pH 4,2, последующих третьего центрифугирования и ресуспендирования осадка с бактериофагом, а также повторной очисткой суспензии бактериофага изоэлектрическим осаждением реагентом при pH 4,2 и четвертого центрифугирования осадка с бактериофагом с получением готового продукта, согласно изобретению для изоэлектрического осаждения в качестве реагента используют натрий-ацетатный буфер со значением pH=4,2 в соотношении с супернатантом бактериофагов не менее 3:1 при первом изоэлектрическом осаждении; осадок с бактериофагами после третьего центрифугирования ресуспендировали в TBS-буфере (Tris Buffer Saline), а при повторной очистке ресуспендированного бактериофага изоэлектрическим осаждением используют натрий-ацетатный буфер со значением pH=4,2 в соотношении с ресуспендированным бактериофагом не менее 1:1.

Причем первое и второе центрифугирование проводят соответственно при 5000 об/мин и 12000 об/мин в течение 10 минут при 20°С, а третье и четвертое центрифугирование осуществляют при 10000 об/мин в течение 10 минут при 4°С.

Изоэлектрическое осаждение фаговых частиц с помощью буфера имеет несколько преимуществ. В первую очередь это простота: для осаждения достаточно добавить определенный объем буферного раствора, при этом нет необходимости измерять значение pH, так как буфер сохраняет необходимое для осаждения бактериофагов значение pH. Осадок бактериофагов, полученный в результате очистки, промывается водой, остатки культуральной среды легко удаляются центрифугированием за минимальное время. Значение pH можно довести добавлением кислоты или щелочи, как это делают в прототипе, но при этом существует высокая вероятность ошибки, а данный метод требует точности. Использование буфера исключает такую ошибку, и даже при больших объемах, остается дешевым способом по сравнению с использованием полиэтиленгликоля.

Важным преимуществом является чистота получаемых таким способом препаратов бактериофагов. Использование буфера в качестве осадителя позволяет избежать попадания в препарат нежелательных примесей, таких как ПЭГ в случае осаждения способом ПЭГ - NaCl. Буферная система в заявляемом способе готовится заранее, автоклавируется и в него больше не вносится никаких реагентов или технических средств контроля pH, например, электроды, а в прототипе для достижения изоэлектрической точки требуется добавление реагентов и введения электродов pH-метра для контроля концентрации ионов водорода.

Бактериофаги обычно стабильны в диапазоне pH от 5 до 8 [8], изоэлектрическая точка бактериофага М13 лежит ниже этих значений, однако, в данной работе было показано, что низкое значение pH используемого буфера не влияет на жизнеспособность фага М13, результат представлен в таблице 5.

Способ очистки нитчатого бактериофага М13 осуществляют следующим образом. Вначале удаляют бактериальную массу после наработки бактериофага путем первого и второго последовательного центрифугирования соответственно при 5000 об/мин и 12000 об/мин в течение 10 минут при 20°С. Далее проводят первую очистку супернатанта бактериофага М13 изоэлектрическим его осаждением натрий-ацетатным буфером со значением pH=4,2 в соотношении с супернатантом бактериофага не менее 3:1. Третье центрифугирование осуществляют при 10000 об/мин в течение 10 минут при 4°С. Осадок бактериофага М13 ресуспендируют в TBS-буфере (Tris Buffer Sa line) и повторно очищают осаждением. Для этого ресуспендированный бактериофаг смешивают с натрий-ацетатным буфером со значением pH=4,2 в соотношении с ресуспендированным бактериофагом не менее 1:1 с последующим четвертым центрифугированием осадка с бактериофагом при 10000 об/мин в течение 10 минут при 4°С с получением чистого продукта бактериофага М13.

Ниже приведены пример 1 и примеры 4-9 конкретного выполнения заявленного способа очистки нитчатого бактериофага М13, а для сравнения воспроизведены способ-аналог (пример 2) и способ-прототип (пример 3).

Пример 1. Наращивание культуры фага М13.

Культуру наращивали в 200 мл среды LB. Состав среды: 10 г/л триптон, 5 г/л дрожжевой экстракт, 5 г/л NaCl, pH 7.0-7.5. В 500-миллиметровую колбу Эрленмейера приливали 200 мл среды LB, добавляли 200 мкл E.coli ER2738 и 10 мкл фаговой суспензии (примерно 1×1010 БОЕ/мл), полученной из одной отдельной колонии. Наращивание проводили при 37°С, 220 об/мин, 16 часов. Бактериальные клетки удаляли двумя последовательными центрифугированиями 5000 об/мин и 12000 об/мин в течение 10 минут при 20°С.

Пример 2. Осаждение бактериофагов с помощью ПЭГ (аналог)

После удаления бактериального осадка (пример 1) 2.5 М NaCl / 20% PEG-8000 добавляли к супернатанту в соотношении 4:1. Осторожно перемешали, оставили на ночь для преципитации при 4°С. Фаги осаждали центрифугированием в течение 10 минут при 4°С, 13000 об/мин. Супернатант удаляли, осадок ресуспендировали в 10 мл деионизированной воды.

Суммарное время, необходимое для очистки фагов выше описанным способом - сутки. Однако в полученном препарате фагов даже после кратных осаждений присутствуют остатки ПЭГ, что подтверждается качественной реакцией с тиоцианатом железа. В работе [4] фаговую суспензию очищали от остатков ПЭГ с помощью диализа в течение 7 суток, но даже после этого качественная реакция с тиоцианатом железа давала положительный результат.

Титр жизнеспособных бактериофагов определяли методом Грациа. Кратное переосаждение с уменьшением объема ПЭГ привело к снижению титра на порядок, таблица 1.

Пример 3. Изоэлектрическое осаждение бактериофагов с помощью HCl (повторение методики прототипа).

После удаления бактериального осадка (Пример 1) pH супернатанта с бактериофагами выровняли до значения 4,2 с помощью 5М HCl. После осторожного перемешивания осадок с бактериофагами осаждали центрифугированием в течение 10 минут при 20°С, 13000 об/мин. Супернатант удаляли, для удаления остатков LB среды осадок промывали 40 мл деионизированной воды, осторожно перемешивая, фаги осаждали центрифугированием в течение 10 минут при 20°С, 13000 об/мин.

Суммарное время, необходимое для очистки фагов выше описанным способом - 2 часа. Очистка полученного препарата фагов от ионов хлора не требуется, но полученный вышеописанным способом препарат содержит остатки бактериальной массы и нуждается в дополнительной очистке.

Титр жизнеспособных бактериофагов определяли методом Грациа, он составил 1011 БОЕ/мл.

Пример 4. Приготовление натрий-ацетатного буфера по заявляемому способу

Для приготовления натрий-ацетатного буфера со значением рН=4,2 использовали 0,2М раствор уксусной кислоты и 0,2М раствор ацетата натрия в пропорции 73,5:26,5 соответственно. 0,2М раствор уксусной кислоты готовили из расчета 1,2 мл ледяной уксусной кислоты на 100 мл воды; 0,2М раствор ацетата натрия готовили, используя тригидрат ацетата натрия из расчета 2,72 г на 100 мл воды.

Для измерения pH использовали pH-метр Sartorius РВ-11.

Пример 5. Определение объема натрий-ацетатного буфера со значением рН=4,2, необходимого для осаждения фагов из культуральной среды LB

Исходная среда LB имела значение рН=7,4. После удаления бактериального осадка (Пример 1) среда LB с бактериофагами имела значение рН=7,38. При добавлении трех объемов буфера значение pH достигало 4,29 - верхнего допустимого значения. При этом значении бактериофаги выпадали в осадок. Результаты осаждения представлены в таблице 2, эксперимент проведен в 14 повторностях.

Таким образом, экспериментально было определено, что для осаждения бактериофагов из культуральной среды LB необходимо добавить не менее трех объемов натрий-ацетатного буфера со значением pH=4,2.

После добавления буфера, бактериофаги охлаждали во льду в течение часа, центрифугировали 10000 об/мин в течение 10 минут при 4°С, осадок ресуспендировали в TBS буфере. Суспензию центрифугировали для удаления остатков бактериальной массы, супернатант с фагами переносили в чистую пробирку.

Пример 6. Определение объема натрий-ацетатного буфера со значением pH=4,2, необходимого для осаждения фагов из буфера TBS (Tris-buffered saline)

Исходный буфер TBS для ресуспендирования бактериофагов имел значение pH=7,5. После осаждения фагов из бактериальной массы, описанного в примере 5, суспензия фагов в TBS буфере имела значение pH=6,91. При добавлении одного объема буфера значение pH достигало 4,26 - близкого к верхнему допустимому значению. При этом значении бактериофаги выпадали в осадок. Результаты осаждения представлены в таблице 3, эксперимент проведен в 8 повторностях.

Таким образом, экспериментально было определено, что для осаждения бактериофагов из буфера TBS необходимо добавить не менее 1 объема натрий-ацетатного буфера со значением pH=4,2.

После добавления буфера, бактериофаги центрифугировали при 10000 об/мин в течение 10 минут при 4°С, осадок ресуспендировали в TBS буфере. Суспензию центрифугировали для удаления остатков бактериальной массы, супернатант с фагами переносили в чистую пробирку.

Титр жизнеспособных бактериофагов определяли методом Грациа, он составил 1011 БОЕ/мл.

Пример 7. Изоэлектрическое осаждение бактериофагов с помощью буфера заявляемым способом.

После удаления бактериального осадка (пример 1) к супернатанту с фагами добавляли натрий-ацетатный буфер Бриттона - Вальполя (табл. 4) в количестве не менее трех объемов и осторожно перемешивали. После добавления буфера, бактериофаги центрифугировали при 10000 об/мин в течение 10 минут при 4°С, осадок ресуспендировали в TBS буфере (Tris Buffer Saline). Суспензию центрифугировали для удаления остатков бактериальной массы, супернатант с фагами переносили в чистую пробирку.

Полученный препарат TBS с фагами очищали повторно. Добавляли один объем натрий-ацетатного буфера, бактериофаги центрифугировали 10000 об/мин в течение 10 минут при 4°С, осадок ресуспендировали в TBS буфере. Суспензию центрифугировали для удаления остатков бактериальной массы, супернатант с фагами переносили в чистую пробирку.

Суммарное время, необходимое для очистки фагов выше описанным способом - 2 ч. При необходимости сменить TBS буфер на другой раствор, возможны кратные переосаждения с помощью натрий-ацетатного буфера, титр при этом остается стабильным. Полученный препарат готов к дальнейшему использованию в ИФА, иммунизации лабораторных животных и т.д.

Титр жизнеспособных бактериофагов определяли методом Грациа, он составил 1011 БОЕ/мл.

Пример 8. Проверка жизнеспособности фага М13 в кислой среде

Было проведено изоэлектрическое осаждение бактериофага М13 с помощью натрий-ацетатного буфера с pH=4,2 в трех повторностях, полученные фаги инкубировали 1 час, 2 часа, 4 часа и 8 часов.

Титр жизнеспособных бактериофагов определяли методом Грациа, было показано, что pH=4,2 не влияет на его жизнеспособность, результаты представлены в таблице 5.

Пример 9. Определение выхода нитчатого бактериофага М13 гравиметрическим методом после очистки различными способами

Осадки бактериофагов, полученные в примерах 2 и 4, были высушены в сушильном шкафу при температуре 105°С. Результат представлен в таблице 6.

Препараты бактериофагов, полученные осаждением с помощью ПЭГ, содержат примеси полиэтиленгликоля и составляют около половины массы препарата. Такой вывод можно сделать, сравнивая массу препаратов фагов, полученных осаждением ПЭГ и изоэлектрическим осаждением и имеющих одинаковое количество жизнеспособных частиц.

Из вышеприведенных результатов (примеры 1-9) следует, что разработан новый способ очистки бактериофагов, обеспечивающий достижение заявляемого технического результата, который заключается в упрощении способа очистки бактериофага, особенно малых его количеств, и обеспечение более высокого уровня стерильности и чистоты бактериофага.

Источники научно-технической информации

1. Rakonjac J, Bennett NJ, Spagnuolo J, Gagic D, Russel M (2011) Filamentous bacteriophage: biology, phage display and nanotechnology applications. Mol Biol 13: 51-76

2. Chung WJ, Oh JW, Kwak K, Lee BY, Meyer J, Wang E, Hexemer A, Lee SW (2011) Biomimetic self-templating supramolecular structures. Nature 478: 364-368

3. Zimmermann K, Hagedorn H, Heuck CC, Hinrichsen M, Ludwig H (1986) The ionic properties of the filamentous bacteriophages Pf1 and fd. J Biol Chem 261: 1653-1655

4. Dong Dexian et al. A simple and rapid method to isolate purer M13 phage by isoelectric precipitation // Applied microbiology and biotechnology. - 2013. - T. 97. - №. 18. - C. 8023-8029 (прототип).

5. Monjezi R, Теу ВТ, Sieo CC, Tan WS (2010) Purification of bacteriophage M13 by anion exchange chromatography. J Chromatogr В 878: 1855-1859

6. Zakharova MY, Kozyr AV, Ignatova AN, Vinnikov IA, Shemyakin IG, Kolesnikov AV (2005) Purification of filamentous bacteriophage for phage display using size-exclusion chromatography. Biotechniques 38: 194-198

7. Reitinger S, Petriv OI, Mehr K, Hansen CL, Withers SG (2012) Purification and quantitation of bacteriophage M13 using desalting spin columns and digital PCR. J Virol Methods 185: 171-174

8. Каттер Э. Бактериофаги. Биология и практическое применение. / Э. Каттер, А. Сулаквелидзе. - М.: Научный мир, 2012. - С. 63.

1. Способ очистки нитчатого бактериофага М13, включающий удаление бактериальной массы после наработки бактериофага путем первого и второго последовательного центрифугирования с последующей первой очисткой супернатанта бактериофага изоэлектрическим осаждением реагентом при рН 4,2, последующим третьим центрифугированием и ресуспендированием осадка с бактериофагом, а также повторной очисткой ресуспендированного бактериофага изоэлектрическим осаждением реагентом при рН 4,2 и четвертого центрифугирования осадка с бактериофагом с получением готового продукта, отличающийся тем, что для изоэлектрического осаждения в качестве реагента используют натрий-ацетатный буфер со значением рН=4,2 в соотношении с супернатантом бактериофагов не менее 3:1 при первом изоэлектрическом осаждении, осадок с бактериофагами после третьего центрифугирования ресуспендировали в TBS-буфере (Tris Buffer Saline), а при повторной очистке ресуспендированного бактериофага изоэлектрическим осаждением используют натрий-ацетатный буфер со значением рН=4,2 в соотношении с ресуспендированным бактериофагом не менее 1:1.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что первое и второе центрифугирование проводят соответственно при 5000 об/мин и 12000 об/мин в течение 10 минут при 20°С, а третье и четвертое центрифугирование осуществляют при 10000 об/мин в течение 10 минут при 4°С.



 

Похожие патенты:

Настоящее изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ очистки вирусного вектора.

Предложенное изобретение касается способа очистки бактериофагов. Охарактеризованный способ включает: а) культивирование штамма бактериального хозяина в подходящей среде, засев культуры бактериофагом и получение бактериофагового лизата, b) очищение лизата с помощью аффинной хроматографии, c) использование полученного фильтрата для приготовления очищенного бактериофага, при этом на стадии a) используемый штамм бактериального хозяина состоит из бактериальных клеток, содержащих последовательность, кодирующую белок слияния, включающий чужеродный полипептид, обладающий аффинностью к хроматографической смоле, применяемой на стадии b), и полипептид, относящийся к структурным фаговым белкам бактериофага, присутствующий в конечном лизате, и указанный полипептид, обладающий аффинностью по отношению к хроматографической смоле, выбирают из группы, включающей His-тэг и GST.

Изобретение относится к области биотехнологии и вирусологии. Описан способ очистки векторов на основе рекомбинантного аденоассоциированного вируса (rAAV).
Способ относится к области вирусологии и касается способа очистки вирусных полиэдров. Изобретение включает гомогенизацию биомассы из погибших насекомых, центрифугирование и выделение осадка.

Настоящее изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ получения вакцины на основе вируса гриппа и применение постоянной клетки-амниоцита человека для получения вакцины на основе вируса гриппа.

Настоящее изобретение относится к способу получения и очистки ортопоксвируса. Предложенный способ включает следующие этапы: приготовление культуры пакующих клеток; инфицирование культуры пакующих клеток ортопоксвирусом; культивирование инфицированных пакующих клеток до получения потомства ортопоксвируса; инкубация в присутствии одной или более нуклеаз до разрушения нуклеиновых кислот; выделение ортопоксвирусов из супернатанта культуры и/или пакующих клеток; добавление моновалентных солей в концентрации от 200 до 300 мМ в условиях, подходящих для ингибирования активности нуклеазы и для предотвращения адсорбции указанных ортопоксвирусов к анионообменному адсорбенту; осуществление контакта полученной смеси с анионообменным адсорбентом в условиях, подходящих для захвата нуклеиновых кислот.

Изобретение относится к медицинской биотехнологии. Способ очистки вируса осповакцины, в том числе его рекомбинантных вариантов, включает обработку исходной вируссодержащей жидкости ультразвуком.

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано для производства различных инактивированных вакцин против гриппа. Для этого проводят заражение куриных эмбрионов, сбор вируссодержащей аллантоисной жидкости (ВАЖ), очистку ВАЖ методом микрофильтрации.

Группа изобретений относится к области биотехнологии. Предложены способы очистки инактивированного вируса или фрагментированного вируса (варианты).

Изобретение относится к области биохимии. Проводят гомогенизацию тканей зараженного растения в нейтральном буферном растворе на основе 2-[4-(2-гидроксиэтил)пиперазин-1-ил]этансульфоновой кислоты (HEPES) в концентрации 0,02-0,03 М с добавлением ингибиторов растительных ферментов иодайетата натрия и фенилметилсульфонилфторида.
Наверх