Способ выявления контаминации вирусами культуры клеток иммунопероксидазным методом


 

C12N1/00 - Микроорганизмы, например простейшие; их композиции (лекарственные препараты, содержащие материал из микроорганизмов A61K 35/66; приготовление лекарственных составов, содержащих бактериальные антигены или антитела, например бактериальных вакцин A61K 39/00); способы размножения, содержания или консервирования микроорганизмов или их композиций; способы приготовления или выделения композиций, содержащих микроорганизмы; питательные среды

Владельцы патента RU 2614256:

Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии имени Я.Р. Коваленко" (ФГБНУ ВИЭВ) (RU)

Изобретение относится к биохимии. Описан способ выявления контаминации вирусами культуры клеток иммунопероксидазным методом, включающий взаимодействие антигена с мечеными антителами в неинфицированной культуре клеток и учет результатов реакции по интенсивности окрашивания образовавшегося комплекса под микроскопом. При этом в реакции используют планшеты с анализируемой культурой клеток, контаминированной вирусом диареи, и после внесения в лунки планшета специфической гомологичной сыворотки по 0,10-0,12 мл в разведении 1:64 - 1:128 инкубируют, отмывают, далее вносят по 0,10-0,12 мл антивидовой иммуноферментный коньюгат, состоящий из меченных пероксидазой хрена антител против глобулинов сыворотки крови крупного рогатого скота, инкубируют, отмывают, вносят субстратную смесь, состоящую из 5-аминосалициловой кислоты и перекиси водорода, и через 30-40 минут проводят учет результатов под световым микроскопом по образованию коричневого окрашивания в вируссодержащих клетках. Изобретение позволяет усовершенствовать систему контроля скрытой контаминации вирусами клеточных линий, используемых в лабораторной практике и биологической промышленности. Изобретение позволяет предотвратить биологическое загрязнение и является чрезвычайно важным этапом в производстве вакцин и диагностикумов. Этот способ может быть использован в целях сертификации на отсутствие вирусов во вновь поступающих культурах клеток. Изобретение является практически легко осуществимым, доступным способом контроля клеточных культур на содержание в них вирусов и может быть рекомендовано для широкого использования как в научно-исследовательских и практических вирусологических лабораториях, так и в производстве при изготовлении диагностикумов и вакцин. 2 пр.

 

Предлагаемое изобретение относится к области ветеринарной вирусологии, в частности к ветеринарной биотехнологии, а именно к обнаружению артефактов (вирусов) в культуре клеток «непрямым» иммунопероксидазным методом.

Контаминация культур клеток вирусами представляет проблему как для научных исследований в вирусологии и биотехнологии, так и при производстве различных биопрепаратов (диагностикумов и вакцин).

Источником заражения культур клеток могут быть среды, реактивы, сыворотки, персонал лаборатории и др. Диагностикумы, изготовленные из контаминированного сырья, могут давать ложные результаты исследования. В лабораторной практике известны случаи контаминации перевиваемых культур клеток вирусом диареи нецитопатогенного биотипа.

Известен способ выявления контаминации культур клеток вирусом диареи крупного рогатого скота в полимеразноцепной реакции (ПЦР) (1).

Известен также способ выявления контаминации культуры клеток вирусом диареи в реакции иммунофлуоресценции, для чего монослой клеток промывают фосфатно-буферным раствором pH 7,2 и фиксируют ацетоном. Клетки инкубируют с иммуноглобулинами мышей против ВД-БС, мечеными ФИТЦ, взятыми в рабочем разведении в течение 45 мин при 37°C. После этого клетки отмывают фосфатно-буферным раствором 3-4 раза, после чего исследуют под люминесцентным микроскопом. О наличии вируса ВД-БС судят по желто-зеленой флуоресценции в клетках (2).

В задачу исследований входило - разработать специфический, чувствительный, не требующий специального оборудования способ обнаружения контаминации культур клеток вирусом диареи крупного рогатого скота.

Сущность предложенного способа состоит в следующем.

Лунки планшета с выросшим монослоем культуры клеток 3-4 раза отмывают фосфатно-буферным раствором (pH 7,2-7,4), фиксируют ацетоном, отмывают буфером, наносят на монослой специфическую сыворотку в рабочем разведении 1:64 - 1:128 в объеме 0,10-0,12 мл, инкубируют 1,5-2 ч при температуре 36-37°C, отмывают, наносят 0,10-0,12 мл антивидового иммуноферментного коньюгата, состоящего из меченных пероксидазой хрена антител к иммуноглобулинам специфической сыворотки крови крупного рогатого скота, инкубируют при тех же условиях, отмывают и после добавления субстратной смеси 0,10-0,12 мл проводят учет результатов реакции через 30-40 минут на наличие вируса под световым микроскопом. Способ можно также проводить на предметных стеклах.

Пример 1

На первом этапе реакции лунки планшета отмывали от ростовой среды фосфатным буфером pH 7,2, фиксировали ацетоном. Затем на монослой клеток наносили автоматической пипеткой по 0,1 мл гипериммунную сыворотку к вирусу диареи в титре 1:64, инкубировали в термостате 1,5 ч при 36°C, затем отмывали от несвязавшихся антител и вносили 0,10-0,12 мл антивидовой иммуноферментный коньюгат, состоящий из антивидовых иммуноглобулинов, меченных пероксидазой хрена. Планшет инкубировали в термостате при 36°C - 1,5 ч и вновь отмывали фосфатно-буферным раствором. Затем наносили по 0,1 мл субстратной смеси, состоящей из раствора 5-аминосалилициловой кислоты и перекиси водорода. Планшет просматривали под световым микроскопом. Результат учитывали через 30 мин по появлению в цитоплазме клеток образовавшегося реакционного продукта от коричневого до светло-коричневого цвета.

В качестве контроля вместо гипериммунной сыворотки применяли отрицательную сыворотку.

Для контроля реакции при том же режиме обрабатывали культуру клеток неконтаминированную вирусом диареи.

Проведено 7 опытов по разработке способа выявления контаминации культуры клеток вирусом диареи крупного рогатого скота иммунопероксидазным методом с положительным результатом.

В контрольных препаратах окрашивание отсутствовало.

Пример 2

Реакцию проводили аналогично примеру 1.

На первом этапе реакции лунки планшета отмывали от ростовой среды фосфатным буфером pH 7,2, фиксировали ацетоном. Затем на монослой клеток наносили автоматической пипеткой по 0,1 мл гипериммунную сыворотку к вирусу диареи в титре 1:128, инкубировали в термостате 2 ч при 37°C, затем отмывали от несвязавшихся антител и вносили антивидовой иммуноферментный коньюгат, состоящий из антивидовых иммуноглобулинов, меченных пероксидазой хрена. Планшет инкубировали в термостате при 37°C 2 ч и вновь отмывали фосфатно-буферным раствором. Затем наносили по 0,1 мл субстратной смеси, состоящей из раствора 5-аминосалициловой кислоты и перекиси водорода. Планшет просматривали под световым микроскопом. Результат учитывали через 40 мин по появлению в цитоплазме клеток образовавшегося реакционного продукта от коричневого до светло-коричневого цвета. Контроль аналогичен примеру 1.

Проведено 5 опытов по выявлению контаминации культуры клеток вирусом диареи крупного рогатого скота иммунопероксидазным методом с положительным результатом.

В контрольных препаратах окрашивание отсутствовало.

Предложенный способ чувствителен и специфичен, в лабораторных условиях выявляет нецитопатогенные штаммы вируса диареи. Прост в исполнении, не трудоемок, не требует специального оборудования.

Предложенный способ, используя набор специфических сывороток к различным возбудителям, позволяет значительно сократить время на выявление контаминации культуры клеток.

Совершенствование системы контроля, направленного на предотвращение биологического загрязнения, является чрезвычайно важным этапом в производстве биологических препаратов (вакцин, диагностикумов и др.).

Предложенный способ выявления контаминации культур клеток вирусом диареи крупного рогатого скота иммунопероксидазным методом испытан с положительным результатом в 2014 году в лаборатории вирусологии ФГБНУ ВИЭВ им. Я.Р. Коваленко.

В связи с вышеизложенным проблема совершенствования системы контроля скрытой контаминации вирусами клеточных линий, используемых в лабораторной практике и биологической промышленности, направлена на предотвращение биологического загрязнения и является чрезвычайно важным этапом в производстве вакцин и диагностикумов. Этот способ может быть использован в целях сертификации на отсутствие вирусов во вновь поступающих культурах клеток.

Способ практически легко осуществим для контроля клеточных культур на содержание в них вирусов и рекомендуется для широкого использования как в научно-исследовательских и практических вирусологических лабораториях, так и в производстве при изготовлении диагностикумов и вакцин.

Источники информации

1. Информационный бюллетень, «Клеточные культуры». М.: ВИЭВ, 2011, вып. 27, стр. 80-88.

2. Российский ветеринарный журнал. «Сельскохозяйственные животные», М.: 2013, 1, стр. 15-18.

Способ выявления контаминации вирусами культуры клеток иммунопероксидазным методом, включающий взаимодействие антигена с мечеными антителами в неинфицированной культуре клеток и учет результатов реакции по интенсивности окрашивания образовавшегося комплекса под микроскопом, при этом в реакции используют планшеты с анализируемой культурой клеток, контаминированной вирусом диареи, и после внесения в лунки планшета специфической гомологичной сыворотки по 0,10-0,12 мл в разведении 1:64 - 1:128 инкубируют, отмывают, далее вносят по 0,10-0,12 мл антивидовой иммуноферментный коньюгат, состоящий из меченных пероксидазой хрена антител против глобулинов сыворотки крови крупного рогатого скота, инкубируют, отмывают, вносят субстратную смесь, состоящую из 5-аминосалициловой кислоты и перекиси водорода, и через 30-40 минут проводят учет результатов под световым микроскопом по образованию коричневого окрашивания в вируссодержащих клетках.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области биохимии, генной инженерии и биотехнологии, в частности к трансформированному микроорганизму Escherichia sp., продуцирующему О-ацетилгомосерин.

Группа изобретений относится к микробиологии и биотехнологии и касается получения трансформантов дрожжей Schizosaccharomyces pombe, продуцирующих молочную кислоту. Предложен трансформант, несущий ген ldh, кодирующий лактатдегидрогеназу из Lactobacillus acidophilus или фермент, аминокислотная последовательность которого гомологична ей не менее чем на 93%.

Изобретение относится к биотехнологии. Штамм аскомицетного гриба из класса Sordariomycetes ИНА 01108 обладает способностью продуцировать антибиотик эремоксиларин А.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к рекомбинантному получению интерферонов, и может быть использовано для получения рекомбинантного белка интерферона лямбда.

Группа изобретений относится к биотехнологии и касается штаммов бактерий B.adolescentis 150 и B.angulatum GT 102. Штаммы бактерий B.adolescentis и B.angulatum депонированы во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов под регистрационными номерами ВКПМ Ас-1974 и ВКПМ Ас-1973 и обладают способностью синтезировать гамма- аминомасляную кислоту (ГАМК).

Изобретение относится к биотехнологии. Планктонный штамм одноклеточной зеленой водоросли Chlorella kessleri NF обладает высокой продуктивностью.
Изобретение относится к биотехнологии. Способ предусматривает следующее.

Группа изобретений относится к биотехнологии. Предложен штамм непатогенной грамотрицательной бактерии, депонированный в CNCM 8 апреля 2010 г.

Настоящее изобретение относится к области биохимии, биотехнологии и микробиологической промышленности, в частности к рекомбинантному штамму мицелиального гриба Penicillium canescens CS15 ВКМ F-4679D, секретирующего термостабильную целлюлазу Cel48S из Clostridium thermocellum.

Изобретение относится к области медицинской микробиологии и биотехнологии. Штамм микромицета Penicillium vulpinum, обладающий антибактериальной активностью в отношении возбудителя сибирской язвы Bacillus anthracis, депонирован в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур (ГКПМ-Оболенск) под регистрационным номером F-1523.

Изобретение относится к области биотехнологии и вирусологии. Описан бактериофаг F510/08, имеющий геном, который содержит последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO:4.

Изобретение относится к способу получения бактериофага. Способ включает культивирование бактериальных клеток штамма-хозяина при отсутствии посторонней микрофлоры, получение фаголизата, а также очистку фаголизата осаждением и/или фильтрацией.

Изобретение относится к области биотехнологии и вирусологии. Описано получение оптимизированных полипептидов HA вируса гриппа H1N1, вызывающих иммунный ответ с широким спектром активности в отношении изолятов вируса гриппа H1N1.

Изобретение относится к медицине и касается способа прогнозирования возникновения рецидива вульвы I и II стадии. Предложенный способ заключается в определении в ткани опухоли ДНК вируса папилломы человека методом полимеразной цепной реакции.

Изобретение относится к вирусологии. Предложен аттенуированный штамм «СКА-2015 ВНИИВВиМ» вируса африканской чумы свиней VIII-го серотипа.

Настоящее изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ получения вируса гриппа с моногликозилированным гемагглютинин-антигеном (НА-антиген).

Изобретение относится к области медицинской биотехнологии. Предложены способы определения биологической активности монокомпонентов в ассоциированных комбинированных ди- и тривакцинах, содержащих вакцинные штаммы вируса кори (Л-16), эпидемического паротита (Л-3) и/или краснухи (Орлов).
Настоящее изобретение относится к способу захвата представляющих интерес вирусоподобных частиц из смеси, включающей разрушенные клетки растений. Способ включает использование расширяющегося слоя адсорбента, содержащего материал смолы, уравновешивание материала смолы при рН 6,0-8,0 и внесение смеси на расширяющийся слой адсорбента для связывания вирусоподобных частиц.

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии и касается штамма вируса нодулярного дерматита крупного рогатого скота (ВНД КРС). Описанный штамм выделен от коров, больных нодулярным дерматитом, и депонирован в Коллекции штаммов микроорганизмов ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационным номером - ВНД КРС/Дагестан/2015 (диагностический).

Изобретение относится к области биотехнологии и касается штамма вируса гриппа. Представленный штамм вируса гриппа птиц A/Common Muskrat/Chany Lake/226/05 H2N2-субтипа, депонированный в Коллекции микроорганизмов Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» под регистрационным номером V-623.

Изобретение относится к биохимии. Описан способ диагностики рака толстой кишки путем определения уровня метилирования промоторной области гена COL1A2, посредством проведения пиросеквенирования, отличающийся тем, что исследуют уровень метилирования CpG динуклеотидов в промоторной области гена COL1A2, и при обнаружении снижения метилирования в опухолевой ткани на 10% и более по сравнению с нормальной тканью, делают вывод о высокой вероятности рака толстой кишки.
Наверх