Способ получения основной аминокислоты (варианты)
Группа изобретений относится к области биохимии. Предложен способ получения основной аминокислоты (варианты). Способ включает культивирование микроорганизма и сбор основной аминокислоты. Причем культивирование осуществляют при управлении концентрацией аммиака в среде культивирования посредством использования способа и аппарата управления аммиаком, где аппарат содержит подающее аммиак устройство, датчик аммиака и управляющую часть. В одном варианте управление концентрацией аммиака осуществляют с помощью управляющей части и включают вычисление концентрации неионизированного аммиака в культуральном резервуаре посредством подстановки сигнала от датчика аммиака в калибровочную кривую и указания устройству подавать аммиак в культуральный резервуар. В другом варианте полную концентрацию аммиака среды регулируют так, чтобы она находилась в определенном диапазоне концентраций во время по меньшей мере части процесса. Так, датчик аммиака реагирует на неионизированный аммиак в среде для культивирования, управляющая часть создает калибровочную кривую, вычисляет концентрацию неионизированного аммиака среды для культивирования посредством подстановки сигнала от датчика аммиака в калибровочную кривую и указывает подающему аммиак устройству подавать аммиак в культуральный резервуар. Изобретения обеспечивают возможность культивирования при непрерывном и произвольном управлении концентрацией аммиака в среде культивирования. 2 н. и 22 з.п. ф-лы, 10 ил., 2 табл.
Область техники
[0001] Настоящее изобретение относится к аппарату для управления аммиаком и способу управления аммиаком, в частности, к аппарату для управления аммиаком и способу управления аммиаком, которые предназначены для управления концентрацией аммиака в среде для культивирования, содержащейся в культуральном резервуаре.
Уровень техники
[0002] Издавна аммиак является очень важным источником получения азота в качестве незаменимого питательного вещества, используемого для ферментации.
[0003] В качестве существующего способа измерения концентрации аммиака существует способ с использованием ионного электрода.
[0004] Например, в способе, описанном в патентном документе 1, концентрацией аммиака в жидкой ферментационной среде управляют так, чтобы она представляла собой определенную концентрацию или ниже, и тем самым ферментационные бактерии культивируют при более высоком значении pH. Тем самым, снижают противоионы, подлежащие добавлению в среду для получения основного вещества посредством ферментации, и в результате значительно упрощают производственный процесс.
Ссылка на известный уровень техники
Патентный документ
[0005] Патентный документ 1: публикация международного патента WO 2006/038695.
Описание изобретения
Цель, достигаемая с помощью изобретения
[0006] Однако указанный выше общепринятый способ имеет такую проблему, что сложно непосредственно управлять концентрацией аммиака в жидкой ферментационной среде, то есть непосредственно измерять концентрацию аммиака или управлять ею в культуральном резервуаре во время культивирования.
[0007] А именно, он имеет такую проблему, что, как показано на фиг. 9 (блок-схема, на которой представлен пример стандартного процесса управления концентрацией аммиака), для того чтобы знать полную концентрацию аммиака (полная концентрация NH3 и NH4+) в среде для культивирования, необходим ряд операций по получению образцов среды для культивирования изнутри культурального резервуара (стадия SA-1), смешиванию образца среды для культивирования с сильнощелочной реакционной жидкостью (например, NaOH) (стадия SA-2) и непрерывному измерению существующего аммиака, который превращен в неионизированный аммиак (NH3) вне культурального резервуара (стадия SA-3). То есть сложно стерильно выполнять ряд операций для измерения с использованием образца среды для культивирования вне культурального резервуара. Кроме того, поскольку среда для культивирования, используемая для измерения, содержит сильнощелочную реакционную жидкость (например, NaOH), ее нельзя рекуперировать в культуральный резервуар и следует удалять. Следовательно, более высокая частота измерений влечет за собой более значительные отходы среды для культивирования, а число раз фактического измерения ограничено (стадия SA-4).
[0008] Кроме того, в культуральном резервуаре аммиак потребляют непрерывно, но скорость потребления аммиака не постоянна. Следовательно, он также имеет такую проблему, что, как показано на фиг. 9, даже если концентрацию аммиака измеряют посредством указанной выше операции получения образца с определенным интервалом (стадия SA-5), нельзя знать ее краткосрочную тенденцию и, следовательно, концентрацией аммиака в среде для культивирования нельзя управлять так, чтобы она была постоянной (стадия SA-6).
[0009] Кроме того, даже если неионизированный аммиак (NH3), частично существующий в среде для культивирования, измеряют с использованием ионного электрода, ввиду указанных выше проблем общепринятого способа, он страдает от такой проблемы, что не просто проверять измеряемые значения для корректировки ошибок, возникающих во время культивирования. Это обусловлено тем, что для того, чтобы знать текущую правильную концентрацию аммиака, необходимо измерять полную концентрацию аммиака для образца среды для культивирования, которая смешана с сильнощелочной реакционной жидкостью с тем, чтобы аммиак в среде для культивирования превращать в неионизированный аммиак (NH3).
[0010] То есть это обусловлено тем, что при обычной ферментации значение pH среды для культивирования в пределах от слабокислого до слабощелочного диапазона (pH приблизительно от 5 до 9), таким образом, часть или по существу весь аммиак, существующий в среде для культивирования, существует в виде ионизированного иона аммония (NH4+) и, следовательно, сложно получать полную концентрацию аммиака (полную концентрацию NH3 и NH4+) в среде для культивирования только посредством измерения концентрации неионизированного аммиака (NH3) с использованием указанного выше ионного электрода. Следовательно, полной концентрацией аммиака нельзя управлять корректно.
[0011] Настоящее изобретение осуществляли ввиду вышеприведенных проблем, и цель настоящего изобретения состоит в том, чтобы предоставлять аппарат для управления аммиаком и способ управления аммиаком, которые делают возможным культивирование при непрерывном и произвольном управлении концентрацией аммиака в среде для культивирования.
Средство достижения цели
[0012] Для того чтобы достигать вышеуказанной цели, настоящее изобретение предусматривает следующие способ и аппарат.
(1) Способ управления аммиаком для управления концентрацией аммиака среды для культивирования, содержащейся в культуральном резервуаре, где концентрацией аммиака в культуральном резервуаре управляют посредством использования аппарата для управления аммиаком, который содержит по меньшей мере подающее аммиак устройство, которое подает аммиак в культуральный резервуар, датчик аммиака, который реагирует на неионизированный аммиак в среде для культивирования, содержащейся в культуральном резервуаре, и управляющую часть, соединенную с подающим аммиак устройством и датчиком аммиака, и этот способ включает следующие стадии, выполняемые с помощью управляющей части:
стадия создания калибровочной кривой для создания калибровочной кривой, представляющей зависимость между концентрацией неионизированного аммиака в культуральном резервуаре и сигналом от датчика аммиака,
стадия вычисления концентрации неионизированного аммиака для вычисления концентрации неионизированного аммиака среды для культивирования, содержащейся в культуральном резервуаре посредством подстановки сигнала от датчика аммиака в калибровочную кривую, и
стадия указания подачи аммиака для указания подающему аммиак устройству подавать аммиак в культуральный резервуар, когда вычисляемая концентрация неионизированного аммиака ниже, чем заданная концентрация.
(2) Способ управления аммиаком, как указано выше, который дополнительно включает стадию создания калибровочной кривой для создания калибровочной кривой, представляющей зависимость между концентрацией неионизированного аммиака в культуральном резервуаре и сигналом от датчика аммиака.
(3) Способ управления аммиаком, как указано выше, где аппарат для управления аммиаком дополнительно соединяют с датчиком pH для измерения значения pH среды для культивирования, содержащейся в культуральном резервуаре,
этот способ дополнительно включает следующую стадию, выполняемую с помощью управляющей части:
стадия вычисления полной концентрации аммиака для вычисления полной концентрации аммиака по концентрации неионизированного аммиака, вычисляемой на стадии вычисления концентрации неионизированного аммиака, и значению pH, измеряемому с использованием датчика pH, на основании кривой диссоциации аммиака, представляющей существующее соотношение концентрации неионизированного аммиака и концентрации диссоциированного аммиака в среде для культивирования, содержащейся в культуральном резервуаре при каждом значении pH, и
где, на стадии указания подачи аммиака, полную концентрацию аммиака используют взамен концентрации неионизированного аммиака.
(4) Способ управления аммиаком, как указано выше, который включает предоставление внешнего датчика аммиака вне культурального резервуара для измерения концентрации неионизированного аммиака, и
получение сигнала от внешнего датчика аммиака посредством измерения концентрации неионизированного аммиака среды для культивирования, которую, после сбора из культурального резервуара, делают достаточно щелочной для превращения иона аммония в неионизированный аммиак, с использованием внешнего датчика аммиака в качестве сигнала для проверки, и
этот способ дополнительно включает следующую стадию, выполняемую с помощью управляющей части:
проверочная стадия для проверки калибровочной кривой с тем, чтобы концентрация неионизированного аммиака, вычисляемая по сигналу для проверки на основании калибровочной кривой, составляла полную концентрацию аммиака, вычисляемую на стадии вычисления полной концентрации аммиака.
(5) Способ управления аммиаком, как указано выше, где аппарат для управления аммиаком соединяют с внешним датчиком аммиака, и
этот способ дополнительно включает следующую стадию, выполняемую с помощью управляющей части:
стадия ввода сигнала для проверки для ввода сигнала от внешнего датчика аммиака в качестве сигнала для проверки.
(6) Способ получения целевого вещества посредством ферментации, который включает культивирование микроорганизма, который обладает способностью продуцировать целевое вещество в культуральном резервуаре, содержащем среду для культивирования, и сбор целевого вещества из культуры, где микроорганизм культивируют при управлении концентрацией аммиака среды для культивирования с помощью способа управления аммиаком, как указано выше.
(7) Способ получения, как указано выше, где целевое вещество представляет собой L-аминокислоту, органическую кислоту, нуклеиновую кислоту, спирт или белок.
(8) Способ получения, как указано выше, где целевое вещество представляет собой основную аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из L-лизина, L-аргинина и L-гистидина.
(9) Способ получения, как указано выше, который включает снижение количества сульфат-ионов и/или хлорид-ионов, используемых в качестве противоионов основной аминокислоты, посредством корректировки полной концентрации аммиака среды для культивирования, чтобы она находилась в пределах определенного диапазона концентраций во время по меньшей мере части полного процесса культивирования.
(10) Способ получения, как указано выше, где определенный диапазон концентраций составляет 300 мМ или ниже.
(11) Способ получения, как указано выше, где определенный диапазон концентраций составляет 200 мМ или ниже.
(12) Способ получения, как указано выше, где определенный диапазон концентраций составляет 100 мМ или ниже.
(13) Аппарат для управления аммиаком, который содержит по меньшей мере подающее аммиак устройство, которое подает аммиак в культуральный резервуар, датчик аммиака и управляющую часть, где:
датчик аммиака реагирует на неионизированный аммиак в среде для культивирования, содержащейся в культуральном резервуаре,
управляющую часть соединяют с подающим аммиак устройством и датчиком аммиака,
управляющая часть создает калибровочную кривую, которая представляет зависимость между концентрацией неионизированного аммиака среды для культивирования и сигналом от датчика аммиака,
вычисляет концентрацию неионизированного аммиака среды для культивирования посредством подстановки сигнала от датчика аммиака в калибровочную кривую, и
указывает подающему аммиак устройству подавать аммиак в культуральный резервуар, когда вычисляемая концентрация неионизированного аммиака ниже, чем заданная концентрация.
(14) Аппарат для управления аммиаком, как указано выше, который дополнительно соединяют с датчиком pH для измерения значения pH среды для культивирования, содержащейся в культуральном резервуаре, и
где управляющая часть дополнительно вычисляет полную концентрацию аммиака по концентрации неионизированного аммиака, вычисляемой с помощью средства вычисления концентрации неионизированного аммиака, и значению pH, измеряемому с использованием датчика pH, на основании кривой диссоциации аммиака, представляющей существующее соотношение концентрации неионизированного аммиака и концентрации диссоциированного аммиака в среде для культивирования при каждом значении pH, и
полную концентрацию аммиака используют взамен концентрации неионизированного аммиака.
(15) Аппарат для управления аммиаком, как указано выше, где управляющая часть дополнительно:
проверяет калибровочную кривую с тем, чтобы концентрация неионизированного аммиака, вычисляемая по сигналу для проверки на основании калибровочной кривой, составляла полную концентрацию аммиака, вычисляемую с помощью средства вычисления полной концентрации аммиака, и
сигнал для проверки представляет собой:
сигнал, получаемый с использованием внешнего датчика аммиака, предусмотренного вне культурального резервуара для измерения концентрации неионизированного аммиака посредством подготовки внешнего датчика аммиака, и
измеряет концентрацию неионизированного аммиака среды для культивирования, которую, после сбора из культурального резервуара, делают достаточно щелочной для превращения иона аммония в неионизированный аммиак с использованием внешнего датчика аммиака.
(16) Аппарат для управления аммиаком, как указано выше, который соединяют с внешним датчиком аммиака, и
где управляющая часть дополнительно вводит сигнал от внешнего датчика аммиака в качестве сигнала для проверки.
(17) Аппарат для управления аммиаком, как указано выше, который выполнен с возможностью поддерживать полную концентрацию аммиака в заданном диапазоне.
(18) Аппарат для управления аммиаком, как указано выше, который дополнительно содержит пользовательский интерфейс.
(19) Аппарат для управления аммиаком, как указано выше, который выполнен с возможностью управления аммиаком в среде для культивирования в реальном времени, предпочтительно с возможностью управления аммиаком в среде для культивирования в реальном времени in situ.
(20) Аппарат для управления аммиаком, как указано выше, который адаптируют для того, чтобы управлять аммиаком в среде для культивирования одного или нескольких культуральных резервуаров, предпочтительно от 1 до 10 культуральных резервуаров.
(21) Аппарат для управления аммиаком, как указано выше, который адаптируют для того, чтобы управлять аммиаком в среде для культивирования с интервалами 5 минут или меньше, предпочтительно 1 секунда или меньше.
(22) Аппарат для управления аммиаком, как указано выше, который адаптируют для проверки калибровочной кривой с интервалами 12 часов или меньше, предпочтительно 8 часов или меньше.
(23) Аппарат для управления аммиаком, как указано выше, который адаптируют для того, чтобы управлять аммиаком в течение по меньшей мере части периода культивирования или всего периода культивирования.
(24) Способ получения целевого вещества посредством ферментации, который включает культивирование микроорганизма, обладающего способностью продуцировать целевое вещество, в культуральном резервуаре, содержащем среду для культивирования, чтобы получать и накапливать целевое вещество в среде для культивирования, где полную концентрацию аммиака среды для культивирования корректируют так, чтобы она находилась в пределах определенного диапазона концентраций во время по меньшей мере части полного процесса культивирования, посредством использования аппарата для управления аммиаком, как указано выше.
(25) Способ получения, как указано выше, где определенный диапазон концентраций составляет 300 мМ или ниже.
(26) Способ получения, как указано выше, где определенный диапазон концентраций составляет 200 мМ или ниже.
(27) Способ получения, как указано выше, где определенный диапазон концентраций составляет 100 мМ или ниже.
Эффект изобретения
[0013] В соответствии с настоящим изобретением создают калибровочную кривую, которая представляет зависимость между концентрацией неионизированного аммиака в культуральном резервуаре и сигналом от датчика аммиака (например, электрическое напряжение), вычисляют концентрацию неионизированного аммиака в культуральном резервуаре с использованием сигнала от датчика аммиака на основании калибровочной кривой и указывают подающему аммиак устройству подавать аммиак в культуральный резервуар, когда вычисляемая концентрация неионизированного аммиака ниже, чем определенная концентрация. Следовательно, настоящее изобретение имеет такой эффект, что возможны стерильные операции для ряда операций для измерений в культуральном резервуаре, и культивирование можно осуществлять при непрерывном и произвольном управлении концентрацией аммиака в среде для культивирования, не расходуя среду для культивирования.
[0014] Кроме того, согласно одному из вариантов осуществления настоящего изобретения, вычисляют концентрацию неионизированного аммиака в культуральном резервуаре, измеряют значение pH в культуральном резервуаре с использованием датчика pH, вычисляют полную концентрацию аммиака по вычисляемой концентрации неионизированного аммиака и измеряемому значению pH на основании кривой диссоциации аммиака, хранимой в накопительной части, и когда вычисляемая полная концентрация аммиака ниже, чем заданная концентрация, подающему аммиак устройству указывают подавать аммиак в культуральный резервуар. Следовательно, настоящее изобретение имеет такой эффект, что полную концентрацию аммиака (полную концентрацию NH3 и NH4+) среды для культивирования можно измерять непосредственно по значению pH и концентрации неионизированного аммиака (NH3) на основании кривой диссоциации аммиака, и тем самым культивирование можно осуществлять при более корректном управлении концентрацией аммиака.
[0015] Кроме того, в соответствии с настоящим изобретением, посредством исследования полной концентрации аммиака среды для культивирования, которую собрали из культурального резервуара и суспендировали в сильнощелочной реакционной жидкости с тем, чтобы превращать ион аммония в неионизированный аммиак, используя внешний аппарат для измерения общего аммиака; и вычисления концентрации неионизированного аммиака в среде для культивирования посредством подстановки вышеуказанного значения полной концентрации аммиака в уравнение диссоциации аммиака и посредством использования значения pH среды для культивирования, сохраненного на указанной выше стадии измерения значения pH, с их использованием можно проверять калибровочную кривую, которая представляет зависимость между концентрацией неионизированного аммиака и выходным сигналом датчика (электрическое напряжение). Следовательно, можно корректировать ошибки, создаваемые во время культивирования.
Краткое описание чертежей
[0016] На фиг. 1A представлена блок-схема, показывающая пример процесса управления концентрацией аммиака в соответствии с настоящим изобретением.
На фиг. 1B представлена блок-схема, показывающая другой пример процесса управления концентрацией аммиака в соответствии с настоящим изобретением.
На фиг. 2 представлена теоретическая конфигурационная диаграмма, показывающая базовую конфигурацию по настоящему изобретению.
На фиг. 3 представлен график, показывающий пример кривой диссоциации аммиака, используемой для настоящего изобретения.
На фиг. 4 представлена логическая блочная диаграмма, показывающая пример конфигурации аппарата 100 для управления аммиаком в соответствии с настоящим изобретением.
На фиг. 5 представлена блок-схема, показывающая пример базовой эксплуатационной обработки, выполняемой с использованием аппарата 100 для управления аммиаком согласно одному из вариантов осуществления настоящего изобретения.
На фиг. 6 представлена блок-схема, показывающая детали примера процесса, выполняемого с использованием аппарата 100 для управления аммиаком согласно одному из вариантов осуществления настоящего изобретения.
На фиг. 7 представлены результаты управления концентрацией аммиака, достигнутые при получении аргинина (Arg), выполняемом с использованием аппарата из примера.
На фиг. 8 представлено накопление Arg при получении Arg, осуществляемом с использованием аппарата из примера.
На фиг. 9 представлена блок-схема, показывающая пример процесса стандартного управления концентрацией аммиака.
Способы осуществления изобретения
[0017] Далее варианты осуществления аппарата для управления аммиаком и способа управления аммиаком по настоящему изобретению объяснены подробно со ссылкой на фигуры. Однако, настоящее изобретение не ограничено этими вариантами осуществления.
[0018] [Основные принципы изобретения] Далее основные принципы настоящего изобретения объяснены со ссылкой на фиг. 1A, 1B, 2 и 3, и затем подробно объяснены конфигурация, процесс и т.д. по настоящему изобретению. На фиг. 1A представлена блок-схема, показывающая пример процесса управления концентрацией аммиака в соответствии с настоящим изобретением, на фиг. 1B представлена блок-схема, показывающая другой пример процесса управления концентрацией аммиака в соответствии с настоящим изобретением, на фиг. 2 представлена теоретическая конфигурационная диаграмма, показывающая базовую конфигурацию аппарата по настоящему изобретению, и на фиг. 3 представлен график, показывающий пример кривой диссоциации аммиака, используемой для настоящего изобретения.
[0019] Способ по настоящему изобретению представляет собой способ управления аммиаком для управления концентрацией аммиака в культуральном резервуаре посредством использования аппарата для управления аммиаком, который содержит по меньшей мере подающее аммиак устройство, которое подает аммиак в культуральный резервуар, датчик аммиака, который реагирует на неионизированный аммиак в среде для культивирования, содержащейся в культуральном резервуаре, и управляющую часть, соединенную с подающим аммиак устройством и датчиком аммиака. Как показано на фиг. 1A, способ по настоящему изобретению включает выполнение процесса с использованием аппарата для управления аммиаком на основании ввода сигнала от датчика аммиака, который реагирует на неионизированный аммиак в среде для культивирования, содержащейся в культуральном резервуаре, и вывод указания на подающее аммиак устройство, которое подает аммиак в культуральный резервуар. Термин «соединен» является достаточным для того, чтобы находиться в функциональной связи, и соединение можно осуществлять с помощью проводной или беспроводной системы.
[0020] Способ по настоящему изобретению включает следующие стадии, выполняемые с помощью управляющей части:
стадия вычисления концентрации неионизированного аммиака для вычисления концентрации неионизированного аммиака среды для культивирования посредством подстановки сигнала от датчика аммиака в калибровочную кривую, представляющую зависимость между концентрацией неионизированного аммиака среды для культивирования и сигналом от датчика аммиака, и
стадия указания подачи аммиака для указания подающему аммиак устройству подавать аммиак в культуральный резервуар, когда вычисляемая концентрация неионизированного аммиака ниже, чем заданная концентрация.
[0021] Способ дополнительно может содержать стадию создания калибровочной кривой для создания калибровочной кривой, представляющей зависимость между концентрацией неионизированного аммиака среды для культивирования и сигналом от датчика аммиака. Что касается калибровочной кривой, ее можно создавать посредством предоставления растворов аммиака с известными концентрациями и погружения электрода в растворы, чтобы строить график напряжений, показываемых с помощью электрода.
[0022] На стадии создания калибровочной кривой создают калибровочную кривую, которая представляет зависимость между концентрацией неионизированного аммиака среды для культивирования и сигналом от датчика аммиака. Это создание может включать считывание калибровочной кривой с накопительной части, предусмотренной в аппарате для управления аммиаком, или ввод калибровочной кривой извне.
[0023] Датчик аммиака реагирует на недиссоциированный аммиак и обычно представляет собой датчик, который содержит избирательную к аммиаку мембрану и внутренний электрод. Сигнал от датчика аммиака конкретно не ограничен при условии, что он представляет собой сигнал, генерируемый посредством реакции на неионизированный аммиак, и обычно используют напряжение внутреннего электрода. Однако его можно преобразовывать в другую электрическую характеристику с использованием электрической схемы. Кроме того, такую электрическую характеристику, как напряжение, можно использовать в качестве исходного аналогового сигнала или в качестве цифрового сигнала, получаемого посредством аналогово-цифрового преобразования.
[0024] Калибровочную кривую можно создавать посредством предварительного изучения зависимости между таким сигналом и концентрацией неионизированного аммиака среды для культивирования. Калибровочную кривую, создаваемую как описано выше, можно хранить в накопительной части. Форма для накопителя конкретно не ограничена, и калибровочную кривую можно хранить в форме таблицы или можно хранить арифметическое уравнение, представляющее калибровочную кривую.
[0025] На стадии вычисления концентрации неионизированного аммиака концентрацию неионизированного аммиака среды для культивирования вычисляют посредством подстановки сигнала от датчика аммиака в калибровочную кривую. Когда калибровочную кривую хранят в форме таблицы, вычисление посредством подстановки в калибровочную кривую можно осуществлять посредством считывания значения, записанного в положении, соответствующем подставленному значению сигнала. Когда калибровочную кривую хранят в виде арифметического уравнения, это можно осуществлять посредством вычисления с помощь подстановки введенного значения сигнала в уравнение.
[0026] На стадии указания подачи аммиака, когда вычисляемая концентрация неионизированного аммиака ниже, чем заданная концентрация, подающему аммиак устройству указывают подавать аммиак в культуральный резервуар.
[0027] Подающее аммиак устройство конкретно не ограничено при условии, что оно может управлять подачей аммиака в культуральный резервуар на основании указания, генерируемого на стадии указания подачи аммиака. Например, подающее аммиак устройство устраивают так, чтобы в ответ на указание, генерируемое на стадии указания подачи аммиака, открывать электромагнитный клапан линии газообразного аммиака, чтобы подавать аммиак.
[0028] Аммиак может представлять собой газообразный аммиак или водный аммиак. Аммиак также можно подавать в форме водного раствора соединения, которое образует ион аммония, когда его растворяют, например, сульфат аммония. Скорость подачи аммиака, подаваемого с помощью подающего аммиак устройства, выбирают с тем, чтобы концентрация аммиака не менялась быстро, принимая во внимание размер культурального резервуара, частоту указаний, генерируемых на стадии указания подачи аммиака, и так далее. Обычно полной концентрацией аммиака управляют так, чтобы она составляла от 1 до 350 мМ, более желательно от 2,5 до 300 мМ, еще более желательно от 2,5 до 200 мМ, еще более желательно от 3 до 100 мМ и еще более желательно 3 до 50 мМ в пересчете на аммиак.
[0029] Вариант осуществления указания может представлять собой вывод электрического сигнала, который непосредственно приводит в действие такое средство, как клапан подающего аммиак устройства, участвующий в управлении подачей аммиака, или, когда подающее аммиак устройство имеет коммуникационную функцию, он может представлять собой вывод коммуникационного сигнала для управления клапаном или тому подобным с помощью коммуникационной функции.
[0030] Аппарат для управления аммиаком по настоящему изобретению дополнительно можно соединять с датчиком pH для измерения значения pH среды для культивирования, содержащейся в культуральном резервуаре. В этом варианте осуществления способ по настоящему изобретению дополнительно содержит следующую стадию, выполняемую с помощью управляющей части:
стадия вычисления полной концентрации аммиака для вычисления полной концентрации аммиака по концентрации неионизированного аммиака, вычисляемой на стадии вычисления концентрации неионизированного аммиака, и значению pH от датчика pH на основании кривой диссоциации аммиака, представляющей существующие соотношения концентрации неионизированного аммиака и концентрации ионов аммония в среде для культивирования при каждом значении pH, и
на стадии указания подачи аммиака полную концентрацию аммиака используют взамен концентрации неионизированного аммиака.
[0031] Зависимость для существующих соотношений концентрации неионизированного аммиака и концентрации ионов аммония в среде для культивирования при каждом значении pH можно вычислять теоретически или измерять фактически. На основании этой зависимости можно создавать кривую диссоциации.
[0032] Кривую диссоциации, создаваемую как описано выше, хранят в накопительной части. Вариант осуществления накопителя конкретно не ограничен, и кривую диссоциации можно хранить в форме двухмерной таблицы или можно хранить арифметическое уравнение, представляющее кривую диссоциации. Кроме того, ее можно хранить вместе с калибровочной кривой, подлежащей сохранению на стадии сохранения калибровочной кривой, в форме таблицы, или можно создавать и сохранять арифметическое уравнение, представляющее кривую диссоциации в сочетании с калибровочной кривой.
[0033] Кривая диссоциации аммиака объяснена со ссылкой на фиг. 3. На фиг. 3 вертикальная ось обозначает существующее соотношение (%) неионизированного аммиака (NH3) и иона аммония (NH4+) в культуральном резервуаре, и горизонтальная ось обозначает значение pH в культуральном резервуаре. Кривые, представленные на графике на фиг. 3, представляют собой кривые диссоциации неионизированного аммиака (NH3) и ионов аммония (NH4+) при различных значениях pH. Как показано на фиг. 3, неионизированный аммиак (NH3) и ионы аммония (NH4+) существуют в по существу эквивалентных количествах около pH 9, и когда значение pH становится выше, возрастает неионизированный аммиак (NH3), тогда как ионы аммония (NH4+) снижаются. Неионизированный аммиак и ионы аммония представляют собой то же, что и недиссоциированный аммиак (NH3) и диссоциированный аммиак (NH4+) соответственно.
[0034] Как описано выше, при обычной ферментации значение pH среды для культивирования находится в пределах от слабокислого до слабощелочного диапазона (pH приблизительно от 5 до 9), и, таким образом, основная часть аммиака, существующего в среде для культивирования, существует в виде ионов аммония (NH4+), и, следовательно, обычно невозможно получать полную концентрацию аммиака (полную концентрацию NH3 и NH4+) в среде для культивирования только посредством измерения концентрации неионизированного аммиака (NH3). Однако, в соответствии с настоящим изобретением, кривую диссоциации аммиака создают предварительно для среды для культивирования, подлежащей использованию, в качестве предварительной обработки, и, следовательно, полную концентрацию аммиака (полную концентрацию NH3 и NH4+) можно вычислять по концентрации неионизированного аммиака (NH3) на основании кривой диссоциации аммиака.
[0035] На стадии вычисления полной концентрации аммиака полную концентрацию аммиака вычисляют по концентрации неионизированного аммиака, вычисляемой на стадии вычисления концентрации неионизированного аммиака, и значению pH, измеряемому с использованием датчика pH, на основании кривой диссоциации аммиака. Когда кривую диссоциации аммиака хранят в форме таблицы, вычисление по концентрации неионизированного аммиака и значению pH на основании кривой диссоциации аммиака можно осуществлять посредством считывания значения, записанного по адресу, соответствующему введенным концентрации неионизированного аммиака и значению pH. Когда хранят арифметическое уравнение, вычисление можно осуществлять посредством вычисления с помощью подстановки введенных значений в уравнение.
[0036] Пример вычисления полной концентрации аммиака представлен далее с (1) до (3).
(1) Сначала посредством подстановки напряжения датчика аммиака в культуральном резервуаре (например, 0,5 В) в арифметическое уравнение, представляющее калибровочную кривую, вычисляют концентрацию неионизированного аммиака (например, 30 мМ).
(2) Затем посредством подстановки значения pH в культуральном резервуаре, измеряемого с использованием датчика pH (например, pH 6), в арифметическое уравнение, представляющее кривую диссоциации, оценивают существующее соотношение неионизированного аммиака (например, 40%).
(3) С использованием оценочного существующего соотношения неионизированного аммиака (например, 40%) и концентрации неионизированного аммиака, вычисляемой в (1) (например, 30 мМ), вычисление осуществляют, например, следующим образом: «30 мМ × (100/40) = 75 мМ», чтобы вычислять полную концентрацию аммиака (в этом случае 75 мМ).
[0037] На стадии указания подачи аммиака, когда концентрация неионизированного аммиака ниже, чем заданная концентрация, подающему аммиак устройству указывают подавать аммиак в культуральный резервуар. Альтернативно, когда полная концентрация аммиака ниже, чем заданная концентрация, подающему аммиак устройству можно указывать подавать аммиак в культуральный резервуар.
[0038] Аппарат для управления аммиаком дополнительно можно соединять с внешним датчиком аммиака, предусмотренным вне культурального резервуара. Посредством измерения напряжения внешнего датчика аммиака для среды для культивирования, которую собрали из культурального резервуара и суспендировали в сильнощелочной реакционной жидкости с тем, чтобы превращать ионы аммония в неионизированный аммиак, можно проверять калибровочную кривую с тем, чтобы концентрация неионизированного аммиака, вычисляемая посредством подстановки измеряемого напряжения в калибровочную кривую, составляла вычисляемую полную концентрацию аммиака.
[0039] Функцию автоматического вычисления полной концентрации аммиака на основании кривой диссоциации аммиака посредством использования фактически измеряемого значения pH среды для культивирования, содержащейся в культуральном резервуаре, можно использовать только для проверки, и фактической концентрацией аммиака в культуральном резервуаре можно управлять на основании концентрации неионизированного аммиака (NH3).
[0040] Кроме того, в соответствии с настоящим изобретением, когда осуществляют проверку, калибровочную кривую можно проверять с тем, чтобы концентрация неионизированного аммиака, вычисляемая посредством подстановки напряжения, измеряемого с помощью внешнего датчика аммиака для образца среды для культивирования, которую суспендировали в сильнощелочной реакционной жидкости (например, NaOH) с тем, чтобы превращать аммиак в среде для культивирования в неионизированный аммиак, в калибровочную кривую, составляла полную концентрацию аммиака, вычисляемую посредством вычисления полной концентрации аммиака.
[0041] Говоря в общем, аппарат по настоящему изобретению имеет следующую базовую конфигурацию. То есть, аппарат для управления аммиаком содержит по меньшей мере подающее аммиак устройство, которое подает аммиак в культуральный резервуар, датчик аммиака, который реагирует на недиссоциированный аммиак в среде для культивирования, содержащейся в культуральном резервуаре, и управляющую часть, соединенную с подающим аммиак устройством и датчиком аммиака. Подающее аммиак устройство можно адаптировать для того, чтобы подавать аммиак в культуральный резервуар. Датчик аммиака адаптируют для того, чтобы реагировать на недиссоциированный аммиак в среде для культивирования, содержащейся в культуральном резервуаре. Как показано на фиг. 2, аппарат для управления аммиаком по настоящему изобретению можно выполнять с возможностью соединения с подающим аммиак устройством, которое подает аммиак в культуральный резервуар, и датчиком аммиака, который реагирует на неионизированный аммиак в культуральной среде, содержащейся в культуральном резервуаре, и содержит накопительную часть и управляющую часть. Термин «соединен» достаточен для функционального соединения, и соединение можно осуществлять с помощью проводной или беспроводной системы.
[0042] Управляющая часть содержит:
средство создания калибровочной кривой для создания калибровочной кривой, которая представляет зависимость между концентрацией неионизированного аммиака среды для культивирования и сигналом от датчика аммиака,
средство вычисления концентрации неионизированного аммиака для вычисления концентрации неионизированного аммиака среды для культивирования по сигналу от датчика аммиака на основании калибровочной кривой, и
средство указания подачи аммиака для того, чтобы указывать подающему аммиак устройству подавать аммиак в культуральный резервуар, когда концентрация неионизированного аммиака ниже, чем заданная концентрация.
[0043] Управляющая часть может содержать:
накопительную часть, выполненную с возможностью хранения предварительно определяемой калибровочной кривой, или средство создания калибровочной кривой, выполненное с возможностью создания калибровочной кривой, которая представляет зависимость между концентрацией неионизированного аммиака среды для культивирования и сигналом от датчика аммиака,
средство вычисления концентрации неионизированного аммиака, выполненное с возможностью вычисления концентрации неионизированного аммиака среды для культивирования по сигналу от датчика аммиака на основании калибровочной кривой, и
средство указания подачи аммиака, выполненное с возможностью указывать подающему аммиак устройству подавать аммиак в культуральный резервуар, когда вычисляемая концентрация неионизированного аммиака ниже, чем заданная концентрация.
[0044] Аппарат по настоящему изобретению дополнительно может содержать средство вычисления полной концентрации аммиака для вычисления полной концентрации аммиака по концентрации неионизированного аммиака, вычисляемой с использованием средства вычисления концентрации неионизированного аммиака и значения pH от датчика pH на основании кривой диссоциации аммиака, представляющей существующие соотношения концентрации неионизированного аммиака и концентрации ионов аммония в среде для культивирования, содержащейся в культуральном резервуаре, при каждом значении pH.
[0045] Средство вычисления полной концентрации аммиака можно выполнять с возможностью вычисления полной концентрации аммиака по концентрации неионизированного аммиака, вычисляемой с помощью средства вычисления концентрации неионизированного аммиака, и значению pH от датчика pH на основании кривой диссоциации аммиака, представляющей существующее соотношение концентрации неионизированного аммиака и концентрации ионов аммония в среде для культивирования при каждом значении pH.
[0046] Компоненты этих средств являются такими же, как те, которые объяснены для стадий способа по настоящему изобретению.
[0047] Управляющая часть дополнительно может содержать:
проверяющее средство, выполненное с возможностью проверки калибровочной кривой с тем, чтобы концентрация неионизированного аммиака, вычисляемая по сигналу для проверки на основании калибровочной кривой, составляла полную концентрацию аммиака, вычисляемую с помощью средства вычисления полной концентрации аммиака, и
где проверяющее средство выполнено с возможностью использовать сигнал для проверки, который может представлять собой:
сигнал, получаемый с использованием внешнего датчика аммиака, предусмотренного вне культурального резервуара для измерения концентрации неионизированного аммиака, и
получаемый посредством измерения концентрации неионизированного аммиака среды для культивирования, которую, после сбора из культурального резервуара, делают достаточно щелочной для превращения иона аммония в неионизированный аммиак, с использованием внешнего датчика аммиака.
[0048] Управляющую часть дополнительно можно адаптировать для ввода сигнала от внешнего датчика аммиака в качестве сигнала для проверки.
[0049] Аппарат для управления аммиаком можно выполнять с возможностью удерживать полную концентрацию аммиака среды для культивирования в заданном диапазоне.
[0050] Аппарат для управления аммиаком дополнительно может содержать пользовательский интерфейс.
[0051] Аппарат для управления аммиаком можно выполнять с возможностью управления в реальном времени аммиаком в среде для культивирования, предпочтительно для управления в реальном времени аммиаком in situ в среде для культивирования.
[0052] Аппарат для управления аммиаком можно адаптировать для того, чтобы управлять аммиаком в среде для культивирования одного или нескольких культуральных резервуаров, необязательно от 1 до 10 культуральных резервуаров.
[0053] Аппарат для управления аммиаком можно адаптировать для того, чтобы управлять аммиаком в среде для культивирования с интервалами 5 минут или меньше, предпочтительно 1 секунда или меньше.
[0054] Аппарат для управления аммиаком можно адаптировать для проверки калибровочной кривой с интервалами 12 часов или меньше, предпочтительно 8 часов или меньше.
[0055] Аппарат для управления аммиаком можно адаптировать для того, чтобы управлять аммиаком в течение по меньшей мере части периода культивирования или всего периода культивирования.
[0056] Реальное время или реальное время in situ, используемое в настоящем документе, обозначает управление концентрацией аммиака в предварительно определяемое время, то есть, измерение концентрации аммиака в культуральном резервуаре и подачу аммиака в среду в пределах предварительно определяемого времени. Например, что касается времени для измерения аммиака, его можно адаптировать для того, чтобы измерять с интервалами 5 минут или меньше, 3 минуты или меньше, 1 минута или меньше или 30 секунд или меньше. Что касается времени для подачи аммиака, его можно адаптировать для подачи за 1 минуту или меньше, 30 секунд или меньше, 10 секунд или меньше, 5 секунд или меньше, или 1 секунда или меньше.
[0057] Что касается времени полного управления, его можно адаптировать для того, чтобы управлять с интервалами 5 минут или меньше, 3 минуты или меньше, 1 минута или меньше, 30 секунд или меньше или 1 секунда или меньше.
[0058] Время и интервал можно выбирать в зависимости от скорости изменения концентрации неионизированного аммиака или полной концентрации аммиака, которое может происходить в среде для культивирования в культуральном резервуаре во время культивирования. Например, его можно адаптировать для того, чтобы сделать возможным изменение концентрации неионизированного аммиака в среде для культивирования во время культивирования, которое составляет 0,5 мМ или меньше, 0,2 мМ или меньше, 0,1 мМ или меньше за интервал измерения, или адаптировать для того, чтобы сделать возможным изменение полной концентрации аммиака в среде для культивирования во время культивирования, которое составляет 80 мМ или меньше, 20 мМ или меньше, 10 мМ или меньше за интервал измерения.
[0059] Далее объяснен пример конфигурации аппарата для управления аммиаком.
[0060] [Конфигурация аппарата 100 для управления аммиаком] На фиг. 4 представлена логическая блочная диаграмма, показывающая пример конфигурации аппарата 100 для управления аммиаком, в котором применено настоящее изобретение, и на ней принципиально показана только часть конфигурации, относящаяся к настоящему изобретению.
[0061] Как показано на фиг. 4, аппарат 100 для управления аммиаком по настоящему изобретению соединяют с культуральным резервуаром 200, подающим аммиак устройством 300, которое подает аммиак в культуральный резервуар 200, датчиком 10 аммиака, который вставляют в культуральный резервуар 200 и который измеряет выходное напряжение, и датчиком 20 pH, который вставляют в культуральный резервуар 200 и который измеряет значение pH. Кроме того, аппарат 100 для управления аммиаком содержит управляющую часть 102, такую как CPU, которая как единым целым управляет всем аппаратом 100 для управления аммиаком, управляющую выходную часть 104, которую соединяют с подающим аммиак устройством 300, и т.д., сигнальную входную часть 108, которую соединяют с датчиком 10 аммиака, внешним датчиком 12 аммиака, датчиком 20 pH и т.д., и накопительную часть 106, которая хранит базы данных и таблицы различных типов и т.д., и эти части коммуникационно соединяют через произвольные коммуникационные каналы.
[0062] На фиг. 4 подающее аммиак устройство 300 содержит по меньшей мере аммиачный резервуар 30, который внутри содержит аммиак, клапан 32, который корректирует количество аммиака, подаваемого из аммиачного резервуара 30, и переключатель 31, который управляет открыванием и закрыванием клапана 32. Это подающее аммиак устройство 300 имеет функцию подачи аммиака в культуральный резервуар 200 в соответствии с указаниями, отправляемыми с аппарата 100 для управления аммиаком.
[0063] На фиг. 4 культуральный резервуар 200 внутри содержит среду для культивирования и соединен с аппаратом 100 для управления аммиаком через датчик 10 аммиака и датчик 20 pH, которые вставляют в культуральный резервуар 200. Кроме того, культуральный резервуар 200 соединяют с подающим аммиак устройством 300 через трубу для подачи аммиака из аммиачного резервуара 30 или тому подобного. На фиг. 4 представлен культуральный резервуар 200, соединенный, например, со стаканом для получения образцов или тому подобным, в который внутрь вставляют внешний датчик 12 аммиака через трубу для сбора образца среды для культивирования. Однако культуральный резервуар 200 необязательно можно соединять с таким стаканом, и пользователь может брать образец из культурального резервуара 200, а внешний датчик 12 аммиака можно использовать в стакане или тому подобном, в который перемещают образец.
[0064] На фиг. 4 накопительная часть 106 аппарата 100 для управления аммиаком, которая хранит базы данных, таблицы, файлы различных типов (от файла 106a кривой диссоциации аммиака до файла 106e полной концентрации аммиака), содержит накопительное средство, такое как привод фиксированного диска, и хранит программы, таблицы, файлы, базы данных различных типов и так далее, используемые для различной обработки.
[0065] Среди этих компонентов накопительной части 106, файл 106a кривой диссоциации аммиака представляет собой накопительное средство для кривой диссоциации аммиака, которое хранит кривую диссоциации аммиака, показывающую существующие соотношения концентрации неионизированного аммиака и концентрации ионов аммония в культуральном резервуаре 200 при каждом значении pH, которую создают посредством обработки, осуществляемой с помощью управляющей части 102.
[0066] Кроме того, файл 106b калибровочной кривой представляет собой накопительное средство для калибровочной кривой, которое создает и хранит калибровочную кривую, которая представляет зависимость между концентрацией неионизированного аммиака в культуральном резервуаре 200 и напряжением датчика 10 аммиака.
[0067] Кроме того, файл 106c концентрации неионизированного аммиака представляет собой накопительное средство для концентрации неионизированного аммиака, которое хранит концентрацию неионизированного аммиака в культуральном резервуаре 200, измеряемую с использованием датчика 10 аммиака, с помощью части 102b вычисления концентрации неионизированного аммиака посредством измерения напряжения датчика 10 аммиака и подстановки напряжения в калибровочную кривую.
[0068] Кроме того, файл 106d значений pH представляет собой накопительное средство для значений pH, которое хранит значение pH среды для культивирования, содержащейся в культуральном резервуаре 200, измеряемое с помощью части 102c измерения значения pH с использованием датчика 20 pH.
[0069] Кроме того, файл 106e полной концентрации аммиака представляет собой накопительное средство для полной концентрации аммиака, которое хранит полную концентрацию аммиака в культуральном резервуаре 200, вычисляемую с помощью части 102d вычисления полной концентрации аммиака по концентрации неионизированного аммиака, хранимой в файле 106c концентрации неионизированного аммиака, и значению pH, хранимому в файле 106d значений pH, на основании кривой диссоциации аммиака, хранимой в файле 106a кривой диссоциации аммиака.
[0070] Кроме того, на фиг. 4 управляющая выходная часть 104 управляет связью между аппаратом 100 для управления аммиаком и подающим аммиак устройством 300. То есть управляющая выходная часть 104 имеет коммуникационную функцию для передачи сигнала для открывания и закрывания клапана 32 посредством управления переключателем 31 подающего аммиак устройства 200 с тем, чтобы подающее аммиак устройство 300 подавало аммиак в культуральный резервуар 200 в количестве, указываемом аппаратом 100 для управления аммиаком.
[0071] Кроме того, на фиг. 4 сигнальная входная часть 108 управляет датчиком 10 аммиака, внешним датчиком 12 аммиака и датчиком 20 pH. Датчик 10 аммиака представляет собой датчик для измерения концентрации неионизированного аммиака (NH3) в аммиаке, содержащемся в среде для культивирования, содержащейся в культуральном резервуаре 200, и содержит, например, ионный электрод или тому подобное. Кроме того, этот датчик 10 аммиака можно соединять с NH3 усилителем 11, который усиливает сигнал, представляющий концентрацию неионизированного аммиака (NH3), измеряемую в культуральном резервуаре 200, и передает его на сигнальную входную часть 108. Поскольку внешний датчик 12 аммиака и NH3 усилитель 13 похожи, для них объяснения опущены. Кроме того, датчик 20 pH представляет собой датчик для измерения значения pH среды для культивирования, содержащейся в культуральном резервуаре 200, и содержит, например, pH электрод или тому подобное. Кроме того, этот датчик 20 pH может быть устроен с тем, чтобы соединяться с pH усилителем 21, который усиливает сигнал, представляющий значение pH, измеряемое в культуральном резервуаре 200, и передает его на сигнальную входную часть 108.
[0072] Кроме того, на фиг. 4 управляющая часть 102 имеет внутреннюю память для хранения управляющих программ, таких как OS (операционная система), программ, которые определяют процедуры обработки различных типов, и необходимых данных, и выполняет обработку информации для осуществления различных процессов с использованием этих программ, и так далее. Управляющая часть 102, в функциональном и принципиальном смысле, устроена с тем, чтобы содержать часть 102a создания калибровочной кривой, часть 102b вычисления концентрации неионизированного аммиака, часть 102c измерения значения pH, часть 102d вычисления полной концентрации аммиака, часть 102e указания подачи аммиака, часть 102f измерения напряжения для проверки и проверяющую часть 102g.
[0073] Среди них часть 102a создания калибровочной кривой представляет собой средство создания калибровочной кривой, которое создает калибровочную кривую, которая представляет зависимость между концентрацией неионизированного аммиака в культуральном резервуаре 200 и напряжением датчика 10 аммиака.
[0074] Кроме того, часть 102b вычисления концентрации неионизированного аммиака представляет собой средство вычисления концентрации неионизированного аммиака, которое вычисляет концентрацию неионизированного аммиака в культуральном резервуаре 200 посредством подстановки напряжения датчика 10 аммиака в калибровочную кривую.
[0075] Кроме того, часть 102c измерения значения pH представляет собой средство измерения значения pH для измерения значения pH среды для культивирования, содержащейся в культуральном резервуаре 200, с использованием датчика 20 pH.
[0076] Кроме того, часть 102d вычисления полной концентрации аммиака представляет собой средство вычисления полной концентрации аммиака для вычисления полной концентрации аммиака в культуральном резервуаре 200 по концентрации неионизированного аммиака, хранимой в файле 106c концентрации неионизированного аммиака, и значению pH, хранимому в файле 106d значений pH, на основании кривой диссоциации аммиака, хранимой в файле 106a кривой диссоциации аммиака.
[0077] Кроме того, часть 102e указания подачи аммиака представляет собой средство указания подачи аммиака, которое указывает подающему аммиак устройству 300 подавать аммиак в культуральный резервуар 200, когда концентрация неионизированного аммиака, вычисляемая с помощью части 102b вычисления концентрации неионизированного аммиака, ниже, чем заданная концентрация. Кроме того, часть 102e указания подачи аммиака может указывать подающему аммиак устройству 300 подавать аммиак в культуральный резервуар 200, когда полная концентрация аммиака, вычисляемая с помощью части 102d вычисления полной концентрации аммиака, ниже, чем заданная концентрация.
[0078] Кроме того, часть 102f измерения напряжения для проверки представляет собой средство измерения напряжения для проверки для измерения напряжения для среды для культивирования, которая собрана из культурального резервуара 200 и суспендирована в сильнощелочной реакционной жидкости (например, NaOH) с тем, чтобы превращать ионы аммония в неионизированный аммиак, с использованием внешнего датчика 12 аммиака.
[0079] Кроме того, проверяющая часть 102g представляет собой средство проверки для проверки калибровочной кривой, хранимой в файле 106b калибровочной кривой с тем, чтобы концентрация неионизированного аммиака, вычисляемая посредством подстановки напряжения, измеряемого с использованием части 102f измерения напряжения для проверки, в калибровочную кривую, составляла полную концентрацию аммиака, вычисляемую посредством вычисления полной концентрации аммиака.
[0080] [Обработка, выполняемая с помощью аппарата 100 для управления аммиаком] Далее со ссылкой на фиг. 5 и 6 подробно объяснен пример обработки, выполняемой с помощью аппарата 100 для управления аммиаком, устроенного как описано выше. На фиг. 5 представлена блок-схема, показывающая пример базовой эксплуатационной обработки, выполняемой с помощью аппарата 100 для управления аммиаком согласно этому варианту осуществления, и на фиг. 6 представлена блок-схема, показывающая детали примера обработки, выполняемой с помощью аппарата 100 для управления аммиаком согласно этому варианту осуществления.
[0081] [Базовая эксплуатационная обработка] Сначала в этом варианте осуществления со ссылкой на фиг. 5 объяснен пример базовой эксплуатационной обработки, выполняемой с помощью аппарата 100 для управления аммиаком.
[0082] (Предварительная обработка)
Как показано на фиг. 5, в качестве предварительной обработки, управляющая часть 102 может создавать кривую диссоциации аммиака (см. фиг. 3), которая показывает существующее соотношение концентрации неионизированного аммиака и концентрации ионов аммония в культуральном резервуаре 200 при каждом значении pH, и сохранять ее в файле 106a кривой диссоциации аммиака (стадия SB-1). То есть управляющая часть 102 может создавать кривую диссоциации аммиака посредством вычисления существующих соотношений неионизированного аммиака и ионов аммония при различных значениях pH на основании константы диссоциации аммиака и строить график по вычисленным значениям.
[0083] (Основная обработка)
Затем часть 102a создания калибровочной кривой создает калибровочную кривую, которая представляет зависимость между концентрацией неионизированного аммиака в культуральном резервуаре 200 и напряжением датчика 10 аммиака (стадия SB-2).
[0084] Затем часть 102b вычисления концентрации неионизированного аммиака вычисляет концентрацию неионизированного аммиака в культуральном резервуаре 200 посредством подстановки напряжения датчика 10 аммиака в калибровочную кривую (стадия SB-3). Затем процесс переходит к обработке на стадии SB-6.
[0085] На указанной выше стадии SB-3, после вычисления концентрации неионизированного аммиака посредством обработки в части 102b вычисления концентрации неионизированного аммиака, можно осуществлять обработку на стадии SB-4 и стадии SB-5.
[0086] Часть 102c измерения значения pH, которая указана выше, может измерять значение pH среды для культивирования, содержащейся в культуральном резервуаре 200, с использованием датчика 20 pH (стадия SB-4). Кроме того, часть 102d вычисления полной концентрации аммиака может вычислять полную концентрацию аммиака по концентрации неионизированного аммиака, вычисляемой с помощью части 102b вычисления концентрации неионизированного аммиака, и значению pH, измеряемого с использованием части 102c измерения значения pH, на основании кривой диссоциации аммиака, хранимой в файле 106a кривой диссоциации аммиака (стадия SB-5).
[0087] Затем управляющая часть 102 принимает решение о том, ниже ли концентрация неионизированного аммиака, измеряемая с помощью части 102b вычисления концентрации неионизированного аммиака, чем заданная концентрация, или нет (стадия SB-6). Управляющая часть 102 может принимать решение о том, ниже ли полная концентрация аммиака, измеряемая с помощью части 102d измерения полного аммиака, чем заданная концентрация или нет (стадия SB-6).
[0088] Затем, когда управляющая часть 102 принимает решение о том, что концентрация неионизированного аммиака, измеряемая с помощью части 102b вычисления концентрации неионизированного аммиака на стадии SB-3, ниже, чем заданная концентрация (стадия SB-6, да), часть 102e указания подачи аммиака указывает подающему аммиак устройству 300 подавать аммиак в культуральный резервуар 200 (стадия SB-7). Часть 102e указания подачи аммиака может указывать подающему аммиак устройству 300 подавать аммиак в культуральный резервуар 200, когда управляющая часть 102 принимает решение о том, что полная концентрация аммиака, измеряемая с помощью части 102d измерения полного аммиака, ниже, чем заданная концентрация (стадия SB-6, да) (стадия SB-7).
[0089] С другой стороны, когда управляющая часть 102 принимает решение о том, что концентрация неионизированного аммиака, измеряемая с помощью части 102b вычисления концентрации неионизированного аммиака, не ниже, чем заданная концентрация (стадия SB-6, нет), процесс возвращается к обработке на стадии SB-3.
[0090] Кроме того, когда управляющая часть 102 принимает решение о том, что полная концентрация аммиака, измеряемая с помощью части 102d измерения полного аммиака, не ниже, чем заданная концентрация (стадия SB-6, нет), можно осуществлять обработку на стадиях с SB-8 до SB-10.
[0091] Управляющая часть 102 может принимать решение, подлежит ли калибровочная кривая, создаваемая на стадии SB-2, проверке или нет (стадия SB-8). Несмотря на то, что на фиг. 5 представлен пример, в котором решение о том, начинать ли проверочную обработку, принимают после указания подавать аммиак (стадия SB-6), принятие решения можно осуществлять в любое время в соответствии с пользовательским вводом или можно осуществлять автоматически в течение каждого периода, заданного предварительно.
[0092] Кроме того, когда управляющая часть 102 приняла решение о том, что следует выполнять проверку (стадия SB-8, да), часть 102f измерения напряжения для проверки может измерять напряжение внешнего датчика 12 аммиака для среды для культивирования, которую собрали из культурального резервуара 200 и суспендировали в сильнощелочной реакционной жидкости (например, NaOH) с тем, чтобы превращать ионы аммония в неионизированный аммиак (стадия SB-9).
[0093] Кроме того, проверяющая часть 102g может проверять калибровочную кривую с тем, чтобы концентрация неионизированного аммиака, вычисляемая посредством подстановки напряжения, измеряемого с помощью части 102f измерения напряжения для проверки, в калибровочную кривую, хранимую в файле 106b калибровочной кривой, составляла полную концентрацию аммиака, вычисляемую посредством вычисления полной концентрации аммиака (стадия SB-10).
[0094] С другой стороны, когда управляющая часть 102 приняла решение о том, что не следует выполнять проверку (стадия SB-8, нет), процесс возвращается к обработке на стадии SB-3.
[0095] Эту базовую эксплуатационную обработку (стадии с SB-2 до SB-10) повторно осуществляют во время культивирования. Тем самым, концентрацией аммиака в культуральном резервуаре 200 можно управлять, а культивирование можно осуществлять при непрерывном и произвольном управлении концентрацией аммиака в среде для культивирования. Здесь завершено объяснение базовой эксплуатационной обработки для аппарата 100 для управления аммиаком по настоящему изобретению.
[0096] [Детали обработки по управлению аммиаком] Далее со ссылкой на фиг. 6 объяснены детали примера обработки, выполняемой с помощью аппарата 100 для управления аммиаком согласно этому варианту осуществления настоящего изобретения.
[0097] Как показано на фиг. 6, управляющая часть 102 принимает решение, следует ли проверять созданную кривую диссоциации аммиака и/или вычисляемую полную концентрацию аммиака или нет (стадия SC-1). Содержание обработки на этой стадии SC-1 является таким же, как такое у обработки на стадии SB-7, представленной на фиг. 5. Кроме того, как описано выше, решение о начале этой проверочной обработки принимают в любое время в соответствии с пользовательским вводом, или решение принимают автоматически в течение каждого периода, заданного предварительно.
[0098] Затем, когда управляющая часть 102 приняла решение о том, что следует выполнять проверку (стадия SC-1, да), создают калибровочную кривую для среды для культивирования, содержащейся в культуральном резервуаре 200 (стадия SC-2).
[0099] Указанная выше «калибровочная кривая» представляет собой уравнение зависимости, представляющее зависимость между концентрацией неионизированного аммиака в культуральном резервуаре 200 и напряжением, измеряемым с использованием датчика 10 аммиака, и в этом варианте осуществления его используют для измерения концентрации неионизированного аммиака (C) посредством подстановки напряжения, измеряемого с использованием датчика 10 аммиака, на стадии SC-7 и SC-10, описанных далее, в калибровочную кривую.
[0100] С другой стороны, когда управляющая часть 102 приняла решение о том, что не следует выполнять проверку (стадия SC-1, нет), процесс переходит к обработке на стадии SC-3.
[0101] Затем управляющая часть 102 принимает решение, подлежит ли изменению параметр управления для культурального резервуара 200 или нет (стадия SC-3).
[0102] Указанный выше параметр управления представляет собой, например, значение SV (заданное значение), значение TC (временной цикл), значение ON (время включения) или тому подобное. Значение SV представляет собой предварительно заданное значение полной концентрации аммиака или концентрации неионизированного аммиака (мМ), подлежащей управлению. Кроме того, значение TC представляет цикл для принятия решения о подаче аммиака (секунды). Кроме того, значение ON представляет время (секунды) для осуществления подачи аммиака в пределах одного цикла. В частности, когда задают параметры управления, например, следующим образом: значение SV=50 мМ, значение TC=10 секунд и значение ON=1 секунда, решение о том, следует ли подавать аммиак или нет, принимают раз в 10 секунд, и если фактически измеряемая концентрация аммиака выше, чем 50 мМ, аммиак не подают. То есть электромагнитный клапан впуска для газообразного аммиака оставляют закрытым. Кроме того, когда фактически измеряемая концентрация аммиака ниже, чем 50 мМ, аммиак подают в течение 1 секунды. То есть электромагнитный клапан открывают.
[0103] Когда управляющая часть 102 приняла решение о том, что параметр управления подлежит изменению (стадия SC-3, да), вводят значение параметра управления (стадия SC-4).
[0104] С другой стороны, когда управляющая часть 102 приняла решение о том, что параметр управления не подлежит изменению (стадия SC-3, нет), процесс переходит к обработке на стадии SC-5.
[0105] Затем часть 102b вычисления концентрации неионизированного аммиака внедряет напряжение (A) датчика 10 аммиака (например, ионного электрода), вставленного в культуральный резервуар 200 (стадия SC-5). То есть часть 102b вычисления концентрации неионизированного аммиака измеряет напряжение датчика 10 аммиака.
[0106] Затем часть 102c измерения значения pH внедряет значение pH (B) от pH электрода датчика 20 pH, вставленного в культуральный резервуар 200 (стадия SC-6). То есть часть 102c измерения значения pH измеряет значение pH (B) среды для культивирования, содержащейся в культуральном резервуаре 200, с использованием датчика 20 pH.
[0107] Затем часть 102b вычисления концентрации неионизированного аммиака вычисляет концентрацию неионизированного аммиака (C) посредством подстановки напряжения (A), внедренного на стадии SC-5, в калибровочную кривую, созданную на стадии SC-2 (стадия SC-7). То есть часть 102b вычисления концентрации неионизированного аммиака вычисляет концентрацию неионизированного аммиака (C) в культуральном резервуаре 200 посредством подстановки напряжения датчика 10 аммиака в калибровочную кривую.
[0108] Затем часть 102d вычисления полной концентрации аммиака вычисляет полную концентрацию аммиака (D) на основании значения pH (B), внедренного на стадии SC-6, концентрации аммиака (C), вычисленной на стадии SC-7, и кривой диссоциации аммиака (см. фиг. 3), созданной с помощью управляющей части 102, в качестве предварительной обработки (стадия SC-8). То есть часть 102d вычисления полной концентрации аммиака вычисляет полную концентрацию аммиака (D) в культуральном резервуаре 200 по концентрации неионизированного аммиака (C), хранимой в файле 106c неионизированного аммиака, и значению pH (B), хранимому в файле 106d значений pH, на основании кривой диссоциации аммиака, хранимой в файле 106a кривой диссоциации аммиака.
[0109] Затем управляющая часть 102 принимает решение, следует ли выполнять одноточечную коррекцию или нет (стадия SC-9).
[0110] Указанная выше «одноточечная коррекция» представляет собой один из способов стандартизации, и она стандартизирует объект посредством использования образца стандартизации в одной точке. В этом варианте осуществления образец стандартизации в одной точке представляет собой данные измерения, получаемые с использованием внешнего аппарата для измерения (напряжение (A’)), и термин стандартизация используют в том же значении, что и при проверке.
[0111] Когда управляющая часть 102 приняла решение о том, что следует выполнять одноточечную коррекцию (стадия SC-9, да), часть 102f измерения концентрации аммиака для проверки и проверяющая часть 102g внедряют данные измерения (напряжение (A’)), получаемые с использованием внешнего аппарата для измерения (внешний датчик 12 аммиака и т.д.), и выполняет одноточечную коррекцию для калибровочной кривой с тем, чтобы концентрация неионизированного аммиака (C’), получаемая посредством подстановки данных измерения (напряжение (A’)) в калибровочную кривую, составляла полную концентрацию аммиака (D), вычисляемую на стадии SC-8 (стадия SC-10). То есть часть 102f измерения напряжения для проверки измеряет напряжение (A’) внешнего датчика 12 аммиака для среды для культивирования, которую собрали из культурального резервуара 200 и суспендировали в сильнощелочной реакционной жидкости (например, NaOH) с тем, чтобы превращать ионы аммония в неионизированный аммиак, и проверяющая часть 102g проверяет калибровочную кривую с тем, чтобы концентрация неионизированного аммиака (C’), вычисляемая посредством подстановки напряжения (A’), измеряемого с использованием части 102f измерения напряжения для проверки, в калибровочную кривую, хранимую в файле 106b калибровочной кривой, составляла полную концентрацию аммиака (D), вычисляемую посредством вычисления полной концентрации аммиака.
[0112] С другой стороны, когда управляющая часть 102 приняла решение о том, что одноточечную коррекцию не следует выполнять (стадия SC-9, нет), процесс переходит к обработке на стадии SC-11.
[0113] Затем управляющая часть 102 определяет, какой выбрать режим управления аммиаком (стадия SC-11).
[0114] Указанный выше режим управления аммиаком представляет собой, например, режим осуществления управления с использованием полной концентрации аммиака, режим осуществления управления с использованием концентрации неионизированного аммиака или тому подобное, и на стадии SC-11 управляющая часть 102 может выбирать режим управления полной концентрацией аммиака или режим управления концентрацией неионизированного аммиака в качестве режима управления аммиаком.
[0115] Затем, когда управляющая часть 102 выбрала режим управления полной концентрацией аммиака в качестве режима управления аммиаком (стадия SC-11, режим управления полной концентрацией аммиака), она задает режим, в котором концентрацией аммиака управляют на основании полной концентрации аммиака в культуральном резервуаре 200. Затем управляющая часть 102 генерирует указания для управления, подлежащие отправке на культуральный аппарат, содержащий подающее аммиак устройство 300, соединенное с культуральным резервуаром 200, и т.д. с использованием полной концентрации аммиака (D), вычисляемой на стадии SC-8, или полной концентрации аммиака (D’), проверяемой на стадии SC-10, и предварительно заданных значений и параметров управления (например, значение SV, служащее в качестве показателя для управления концентрацией аммиака), заданных в аппарате 100 для управления аммиаком (стадия SC-12).
[0116] Затем управляющая часть 102 принимает решение, необходимо ли управление, вычисляемое на стадии SC-12, или нет (стадия SC-13). Например, управляющая часть 102 принимает решение, ниже ли полная концентрация аммиака, чем заданная концентрация, или нет.
[0117] Затем, когда управляющая часть 102 приняла решение о том, что управляющее указание необходимо (например, полная концентрация аммиака ниже, чем заданная концентрация) (стадия SC-13, да), часть 102e указания подачи аммиака выводит управляющее указание, такое как указание для добавления аммиака в культуральный резервуар 200 из аммиачного резервуара 30 в указанном количестве для подающего аммиак устройства 300. То есть часть 102e указания подачи аммиака приводит в действие переключатель 31 для изменения открывания и закрывания клапана 32 через управляющую выходную часть 104 для того, чтобы управлять открыванием и закрыванием клапана 32 с тем, чтобы аммиак подавать в культуральный резервуар 200 из аммиачного резервуара 30 в количестве, соответствующем управляющему указанию.
[0118] С другой стороны, когда управляющая часть 102 приняла решение о том, что управляющее указание не необходимо (например, полная концентрация аммиака не ниже, чем заданная концентрация) (стадия SC-13, нет), процесс возвращается к обработке на стадии SC-5.
[0119] Когда процесс возвращается к стадии SC-11 и управляющая часть 102 выбрала режим управления концентрацией неионизированного аммиака в качестве режима управления аммиаком, задают режим, в котором управление осуществляют на основании концентрации неионизированного аммиака в культуральном резервуаре 200 (стадия SC-11, режим управления концентрацией неионизированного аммиака). Затем управляющая часть 102 генерирует управляющие указания для культурального аппарата, содержащего подающее аммиак устройство 300, соединенное с культуральным резервуаром 200, и т.п. посредством использования концентрации неионизированного аммиака (C), которую вычисляют на стадии SC-7, предварительно заданных значений и параметров управления (например, значение SV, служащее в качестве показателя для управления концентрацией аммиака), заданных в аппарате 100 для управления аммиаком (стадия SC-15).
[0120] Затем управляющая часть 102 принимает решение, необходимо ли управление, вычисляемое на стадии SC-15, или нет (стадия SC-16). Например, управляющая часть 102 принимает решение, ниже ли концентрация неионизированного аммиака, чем заданная концентрация.
[0121] Затем, когда управляющая часть 102 приняла решение о том, что управляющее указание необходимо (например, концентрация неионизированного аммиака ниже, чем заданная концентрация) (стадия SC-16, да), часть 102e указания подачи аммиака выводит управляющее указание, такое как указание для добавления аммиака в культуральный резервуар 200 из аммиачного резервуара 30 в указанном количестве, для подающего аммиак устройства 300. То есть часть 102e указания подачи аммиака приводит в действие переключатель 31 для переключения открывания и закрывания клапана 32 через управляющую выходную часть 104 для того, чтобы управлять открыванием и закрыванием клапана 32 с тем, чтобы подавать аммиак в культуральный резервуар 200 из аммиачного резервуара 30 в количестве, соответствующем управляющему указанию.
[0122] С другой стороны, когда управляющая часть 102 приняла решение о том, что управляющее указание не необходимо (например, концентрация неионизированного аммиака не ниже, чем заданная концентрация) (стадия SC-16, нет), процесс возвращается к обработке на стадии SC-5.
[0123] Сейчас закончено подробное объяснение примера обработки аппарата 100 для управления аммиаком.
[0124] Объяснение этого варианта осуществления также закончено.
[0125] [Другие варианты осуществления] Несмотря на то, что вариант осуществления изобретения объяснен выше, настоящее изобретение можно реализовать в виде различных вариантов осуществления в пределах технического объема настоящего изобретения, который определен в приложенной формуле изобретения, помимо варианта осуществления, который объяснен выше.
[0126] Например, несмотря на то, что настоящее изобретение объяснено выше для случая, когда аппарат 100 для управления аммиаком выполняет управление аммиаком для ферментации, осуществляемой в культуральном резервуаре 200, его можно использовать не только для ферментации, но также для другого использования, такого как использование реакционном резервуаре для химической промышленности, и т.д.
[0127] Кроме того, в обработке, которая объяснена для варианта осуществления, всю объясненную обработку или ее часть, подлежащую автоматическому осуществлению, также можно осуществлять вручную и всю объясненную обработку или ее часть, подлежащую осуществлению вручную, также можно осуществлять автоматически с помощью известных способов.
[0128] Кроме того, процедуры обработки, процедуры управления, конкретные названия, приведенные в указанных выше упоминаниях и фигурах, информацию, содержащую параметры, такие как регистрируемые данные, условия поиска и т.д. для обработки, а также конфигурацию базы данных можно менять произвольно, пока не указано конкретно.
[0129] Кроме того, компоненты, представленные на рисунках для аппарата 100 для управления аммиаком, схематически представлены для того, чтобы указывать их функции, и физически они могут не быть устроены так, как показано на чертежах.
[0130] Например, все или часть функций обработки компонентов аппарата 100 для управления аммиаком, в частности, функции обработки управляющей части 102, можно реализовать с использованием CPU (центральный блок обработки) и программ, подлежащих интерпретации и исполнению посредством CPU, или с использованием аппаратного обеспечения, основанного на монтажной логике. Программы записывают в среде записи, которая описана далее, и, при необходимости, механически считывают посредством аппарата 100 для управления аммиаком. То есть компьютерные программы для того, чтобы давать команды CPU для осуществления различной обработки посредством взаимодействия с OS (операционной системой), хранят в накопительной части 106, такой как ROM и HD. Эти компьютерные программы исполняют загрузки в RAM и взаимодействия с CPU, чтобы образовать управляющую часть 102.
[0131] Кроме того, компьютерные программы можно хранить на сервере прикладных программ, соединенном с аппаратом 100 для управления аммиаком через произвольную сеть, и все их или их часть можно загружать при необходимости.
[0132] Кроме того, программы в соответствии с настоящим изобретением также можно хранить в машиночитаемой среде записи. Указанная выше «среда записи» включает произвольные «портативные физические среды», такие как гибкий диск, магнитооптический диск, ROM, EPROM, EEPROM, CD-ROM, MO и DVD, а также «коммуникационные среды» для временного хранения программ, такие как коммуникационные линии и несущие волны, используемые для передачи программ через сети, типичными примерами которых являются LAN, WAN и интернет.
[0133] Кроме того, термин «программа» обозначает способ обработки данных, описанный произвольным языком или способом описания, и ее формат, такой как исходный код и бинарный код, не ограничен. Кроме того, «программа» не обязательно ограничена тем, что составляет независимое программное обеспечение, и включает то, что распространяют в виде множества модулей или библиотек, и то, что реализует их функции через взаимодействие с другими отдельными программами, ее типичным примером является OS (операционная система). Кроме того, в качестве конкретных конфигураций для считывания сред записи в аппарате, представленном в варианте осуществления, процедур для считывания программ, процедур для установки их после считывания и так далее можно использовать общеизвестные конфигурации и процедуры.
[0134] Накопительная часть 106, которая хранит базы данных различных типов (от файла 106a кривой диссоциации аммиака до файла 106e полной концентрации аммиака) и так далее, представляет собой накопительное средство, которое содержит устройство памяти, такое как RAM и ROM, привод фиксированного диска, такого как жесткий диск, гибкий диск, оптический диск или тому подобное, и хранит программы, таблицы, базы данных, файлы веб-страниц и т.д. различных типов, используемые для различной обработки или представления на веб-сайтах.
[0135] Кроме того, аппарат 100 для управления аммиаком также можно реализовать посредством соединения информационного процессора, такого как существующие персональные компьютеры и рабочие станции, с объектом управления, и установки программного обеспечения (включая программы, данные и т.д.) для реализации способа по настоящему изобретению на информационном процессоре.
[0136] Кроме того, конкретные варианты распределения и интеграции аппарата не ограничены теми, что показаны на рисунках, и аппарат может быть устроен посредством функционального или физического распределения или интеграции всего или части аппарата в произвольных блоках в соответствии с различными добавлениями компонентов и т.д.
[0137] Указанный выше способ управления аммиаком и аппарат для управления аммиаком можно использовать для следующих способов. Например, их можно использовать для способа получения целевого вещества посредством ферментации с использованием микроорганизма, в частности способа культивирования микроорганизма, который обладает способностью продуцировать целевое вещество в жидкой среде, содержащейся в ферментационном резервуаре, чтобы получать и накапливать целевое вещество в среде.
[0138] Примеры целевого вещества, упомянутого в настоящем изобретении, включают L-аминокислоты, нуклеиновые кислоты, спирты, белки и так далее. В настоящем изобретении, «L-аминокислота» конкретно не ограничена при условии, что она представляет собой L-аминокислоту, которую можно накапливать в среде при ферментации с использованием микроорганизма. Несмотря на то, что тип L-аминокислоты конкретно не ограничен, примеры включают основные аминокислоты, такие как L-лизин, L-орнитин, L-аргинин, L-гистидин и L-цитруллин, алифатические аминокислоты, такие как L-изолейцин, L-аланин, L-валин, L-лейцин и глицин, аминокислоты, которые представляют собой гидрокси-моноаминокарбоновые кислоты, такие как L-треонин и L-серин, циклические аминокислоты, такие как L-пролин, ароматические аминокислоты, такие как L-фенилаланин, L-тирозин и L-триптофан, серусодержащие аминокислоты, такие как L-цистеин, L-цистеин и L-метионин, кислые аминокислоты, такие как L-глутаминовая кислота, L-аспарагиновая кислота, L-глутамин и L-аспарагин и амиды этих кислот.
[0139] Микроорганизм, используемый в настоящем изобретении может иметь способность продуцировать аминокислоты двух или более типов. L-аминокислота, упомянутая в настоящем изобретении, может представлять собой свободную L-аминокислота, или может представлять собой соль, такую как сульфат, гидрохлорид и карбонат L-аминокислоты.
[0140] В настоящем изобретении «нуклеиновая кислота» конкретно не ограничена при условии, что она представляет собой нуклеиновую кислоту, которую можно накапливать в среде при ферментации с использованием микроорганизма. Примеры нуклеиновой кислоты включают пуриновые нуклеозиды, пуриновые нуклеотиды и так далее. Пуриновые нуклеозиды включают инозин, ксантозин, гуанозин, аденозин и так далее, а пуриновые нуклеотиды включают сложные 5’-фосфатные эфиры пуриновых нуклеозидов, например, инозиновой кислоты, (инозин-5’-фосфат, в дальнейшем также обозначаемый как «ИМФ»), ксантиловой кислоты (ксантозин-5’-фосфат, в дальнейшем также обозначаемый как «КМФ»), гуаниловой кислоты (гуанозин-5’-монофосфат, в дальнейшем также обозначаемый как «ГМФ»), адениловой кислоты (аденозин-5’-монофосфат, в дальнейшем также обозначаемый как «АМФ») и так далее.
[0141] В настоящем изобретении «органическая кислота» конкретно не ограничена при условии, что она представляет собой органическую кислоту, которую можно накапливать в среде при ферментации с использованием микроорганизма. Примеры органической кислоты включают молочную кислоту, уксусную кислоту, лимонную кислоту, глюконовую кислоту, янтарную кислоту, фумаровую кислоту, яблочную кислоту и так далее.
[0142] В настоящем изобретении «спирт» конкретно не ограничен при условии, что он представляет собой спирт, который можно накапливать в среде при ферментации с использованием микроорганизма. Примеры спирта включают, например, этанол, изобутанол, 1,2-бутандиол, 1,3-бутандиол, 1,3-пропандиол, 1,4-бутандиол, глицерин, 2,3-бутандиол и так далее.
[0143] Примеры микроорганизма, который можно использовать в настоящем изобретении, включают, в частности, бактерии Enterobacteriaceae, относящиеся к роду Escherichia, Enterobacter, Klebsiella, Pantoea, Serratia, Erwinia, Salmonella, Morganella, или тому подобное, дифтериеподобные бактерии, бактерии Bacillus, бактерии Streptococcus, дрожжи Saccharomyces и так далее. Предпочтительно они представляет собой микроорганизм, для которого возможна замена генов.
[0144] Примеры бактерий Escherichia включают Escherichia coli и так далее. Когда выводят Escherichia coli с использованием способов генетической инженерии, можно использовать штамм K12 E. coli и его производные, штамм 1655 Escherichia coli (ATCC 47076) и штамм W3110 Escherichia coli (ATCC 27325). Для получения штамма K-12 Escherichia coli и производных штаммов, их можно предоставлять, например, из American Type Culture Collection (ATCC, адрес: P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, United States of America).
[0145] В качестве бактерий Escherichia можно использовать те, которые описаны в работе Neidhardt et al. (Neidhardt, F.C. et al., Escherichia coli and Salmonella Typhimurium, American Society for Microbiology, Washington D.C., 1208, таблица 1), такие как Escherichia coli. Примеры штаммов Escherichia coli дикого типа включают, например, штамм K12 и его производные, штамм MG1655 Escherichia coli (ATCC № 47076), штамм W3110 (ATCC № 27325) и так далее. Они доступны в American Type Culture Collection (ATCC, адрес: P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, United States of America).
[0146] Примеры бактерий Enterobacter включают Enterobacter agglomerans, Enterobacter aerogenes и так далее, и примеры бактерий Pantoea включают Pantoea ananatis. Некоторые виды Enterobacter agglomerans в последнее время переклассифицированы в Pantoea agglomerans, Pantoea ananatis, Pantoea stewartii или тому подобное, на основании анализа нуклеотидной последовательности 16S rRNA и т.д. Как бактерий Enterobacter, так и бактерий Pantoea можно использовать при условии, что выбранная бактерия по классификации относится к семейству Enterobacteriaceae. Когда выводят штамм Pantoea ananatis способом генетической инженерии, можно использовать штамм AJ13355 (FERM BP-6614), штамм AJ13356 (FERM BP-6615), штамм AJ13601 (FERM BP-7207) Pantoea ananatis и их производные. Эти штаммы идентифицировали как Enterobacter agglomerans, когда их выделяли, и депонировали как Enterobacter agglomerans. Однако в последнее время их переклассифицировали как Pantoea ananatis на основании нуклеотидного секвенирования 16S rRNA и так далее, как описано выше.
[0147] Дифтериеподобные бактерии представляют собой группу микроорганизмов, которая определена в Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology, 8th Ed., стр. 599 (1974), и можно использовать микроорганизмы, относимые по классификации к таким аэробным, грамположительным и не кислотоустойчивым бациллам, которые не способны к споруляции. Дифтериеподобные бактерии включают бактерии, которые ранее отнесены по классификации к роду Brevibacterium, но в настоящее время объединены в род Corynebacterium (Int. J. Syst. Bacteriol. 41:255-260 (1991)), и бактерии, относящиеся к роду Brevibacterium или Microbacterium, который близко относится к роду Corynebacterium.
[0148] Конкретные примеры таких дифтериеподобных бактерий включают следующие виды:
Corynebacterium acetoacidophilum
Corynebacterium acetoglutamicum
Corynebacterium alkanolyticum
Corynebacterium callunae
Corynebacterium glutamicum
Corynebacterium lilium
Corynebacterium melassecola
Corynebacterium thermoaminogenes (Corynebacterium efficiens)
Corynebacterium herculis
Brevibacterium divaricatum
Brevibacterium flavum
Brevibacterium immariophilum
Brevibacterium lactofermentum
Brevibacterium roseum
Brevibacterium saccharolyticum
Brevibacterium thiogenitalis
Corynebacterium ammoniagenes
Brevibacterium album
Brevibacterium cerinum
Microbacterium ammoniaphilum
[0149] Конкретные примеры этих бактерий включают следующие штаммы:
Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870
Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 15806
Corynebacterium alkanolyticum ATCC 21511
Corynebacterium callunae ATCC 15991
Corynebacterium glutamicum ATCC 13020, ATCC 13032, ATCC 13060
Corynebacterium lilium ATCC 15990
Corynebacterium melassecola ATCC 17965
Corynebacterium efficiens AJ12340 (FERM BP-1539)
Corynebacterium herculis ATCC 13868
Brevibacterium divaricatum ATCC 14020
Brevibacterium flavum ATCC 13826, ATCC 14067, AJ12418 (FERM BP-2205)
Brevibacterium immariophilum ATCC 14068
Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 (Corynebacterium glutamicum ATCC 13869)
Brevibacterium roseum ATCC 13825
Brevibacterium saccharolyticum ATCC 14066
Brevibacterium thiogenitalis ATCC 19240
Brevibacterium ammoniagenes ATCC 6871, ATCC 6872
Brevibacterium album ATCC 15111
Brevibacterium cerinum ATCC 15112
Microbacterium ammoniaphilum ATCC 15354
[0150] Эти штаммы доступны, например, в American Type Culture Collection (ATCC) (адрес: P.O. Box 1549, Manassas, VA 2010812301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, United States of America). То есть каждому из штаммов даны регистрационные номера, и штаммы можно заказывать с использованием этих регистрационных номеров. Регистрационные номера штаммов перечислены в каталоге American Type Culture Collection (см. http://www.atcc.org/). Штамм AJ12340 депонирован 27 октября 1987 года в National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of Economy, Trade and Industry (в настоящее время независимый административный орган, National Institute of Technology and Evaluation, International Patent Organism Depositary, помещение № 120, 2-5-8 Kazusakamatari, Kisarazu-shi, Chiba-ken, 292-0818, Japan) с номером доступа FERM BP-1539 в соответствии с положениями Budapest Treaty. Штамм AJ12418 депонирован 5 января 1989 года в National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of Economy, Trade and Industry (в настоящее время независимый административный орган, National Institute of Technology and Evaluation, International Patent Organism Depositary) с номером доступа FERM BP-2205 в соответствии с положениями Budapest Treaty.
[0151] Когда используют бактерии Bacillus, их примеры включают Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus pumilus и так далее.
[0152] Примеры Bacillus subtilis включают штамм 168 Marburg Bacillus subtilis (ATCC 6051), штамм PY79 Bacillus subtilis (Plasmid, 1984, 12, 1-9) и так далее. Примеры Bacillus amyloliquefaciens включают штамм T Bacillus amyloliquefaciens (ATCC 23842), штамм N Bacillus amyloliquefaciens (ATCC 23845) и так далее. Примеры Bacillus pumilus включают Bacillus pumilus Gottheil № 3218 (ATCC 21005) (патент США № 3616206) и так далее.
[0153] Далее в настоящем документе описан способы придавать способность продуцировать L-аминокислоты или нуклеиновые кислоты таким исходным штаммам, как указано выше.
[0154] Для того чтобы придавать способность продуцировать L-аминокислоту или нуклеиновую кислоту, можно использовать способы, стандартно применяемые при выведении дифтериеподобных бактерий или бактерий рода Escherichia (см. «Amino Acid Fermentation», Gakkai Shuppan Center (Ltd.), 1st Edition, опубликовано 30 мая 1986 года, стр. 77-100). Такие способы включают способы получения ауксотрофного мутанта, устойчивого к аналогам штамма или мутанта с регуляцией метаболизма или конструирования рекомбинантного штамма с тем, чтобы он осуществлял повышенную экспрессию ферментов биосинтеза L-аминокислоты или нуклеиновой кислоты. При выведении бактерий, продуцирующих L-аминокислоты, можно придавать одно или два или три или более из описанных выше свойств, таких как ауксотрофия, устойчивость к аналогам или мутация с регуляцией метаболизма. Можно усиливать экспрессию одного или двух или трех или более ферментов биосинтеза L-аминокислоты. Кроме того, способы придавать свойства, такие как ауксотрофная мутация, устойчивость к аналогам или мутация с регуляцией метаболизма, можно комбинировать со способом усиления ферментов биосинтеза.
[0155] Ауксотрофный мутантный штамм, Штамм, устойчивый к аналогам L-аминокислот или нуклеиновых кислот, или мутантный штамм с регуляцией метаболизма, обладающий способностью продуцировать L-аминокислоту или нуклеиновую кислоту, можно получать, подвергая исходный штамм или штамм дикого типа стандартному мутагенезу, такому как воздействие рентгеновских лучей или УФ-облучение, или обработке мутагеном, таким как N-метил-N’-нитро-N-нитрозогуанидин, и т.д., и последующему отбору тех, которые проявляют автотрофию, устойчивость к аналогам или мутацию с регуляцией метаболизма и которые также обладают способностью продуцировать L-аминокислоту, среди полученных мутантных штаммов.
[0156] Ауксотрофный мутантный штамм, штамм, устойчивый к аналогам L-аминокислот, или мутантный штамм с регуляцией метаболизма, обладающий способностью продуцировать L-аминокислоту, можно получать, подвергая исходный штамм или штамм дикого типа стандартному мутагенезу, такому как воздействие рентгеновских лучей или УФ-облучение, или обработке мутагеном, таким как N-метил-N’-нитро-N-нитрозогуанидин (NTG) или этилметансульфонат (EMS) и т.д., и последующему отбору тех, которые проявляют автотрофию, устойчивость к аналогам или мутацию с регуляцией метаболизма, и которые также обладают способностью продуцировать L-аминокислоту, среди полученных мутантных штаммов.
[0157] Конкретные примеры способов придавать способность продуцировать аминокислоты и продуцирующих аминокислоты бактерий приведены далее.
[0158] (L-лизин-продуцирующие бактерии)
L-лизин-продуцирующие бактерии и способы их конструирования в качестве примера приведены далее.
Примеры штаммов, обладающих L-лизин-продуцирующей способностью, включают, например, штаммы, устойчивые к аналогам L-лизина, и мутантные штаммы с регуляцией метаболизма. Примеры аналога L-лизина включают, но не ограничиваясь этим, оксализин, лизингидроксамат, S-(2-аминоэтил)-L-цистеин (AEC), γ-метиллизин, α-хлоркапролактам и так далее. Мутантные штаммы, обладающие устойчивостью к этим аналогам лизина, можно получать, подвергая бактерию, относящуюся к семейству Enterobacteriaceae, или дифтериеподобную бактерию обработке при стандартном искусственном мутагенезе. Конкретные примеры L-лизин-продуцирующих бактерий включают Escherichia coli AJ11442 (FERM BP-1543, NRRL B-12185, см. выложенную японскую патентную заявку № 56-18596 и патент США № 4346170), штамм VL611 Escherichia coli (выложенная японская патентная заявка № 2000-189180) и так далее. В качестве L-лизин-продуцирующей Escherichia coli также можно использовать штамм WC196 (см. международную публикацию WO 96/17930).
[0159] Кроме того, L-лизин-продуцирующую бактерию также можно сконструировать посредством увеличения активности фермента системы биосинтеза L-лизина. Увеличения активности такого фермента можно достигать посредством увеличения числа копий гена, который кодирует фермент в клетках, или посредством модификации последовательности, управляющей его экспрессией. Увеличения числа копий гена, кодирующего фермент системы биосинтеза L-лизина в клетках, и модификации управляющей экспрессией последовательности можно достигать аналогично, как и таковые для генов gltP и gltS, описанных далее.
[0160] Примеры генов, кодирующих ферменты биосинтеза L-лизина, включают гены, которые кодируют ферменты диаминопимелатного пути, такие как ген дигидродипиколинатсинтазы (dapA), ген аспартокиназы (lysC), ген дигидродипиколинатредуктазы (dapB), ген диаминопимелатдекарбоксилазы (lysA), ген диаминопимелатдегидрогеназы (ddh) (WO 96/40934 для всех приведенных выше генов), ген фосфоенолпируваткарбоксилазы (ppc) (выложенная японская патентная заявка № 60-87788), ген аспартатаминотрансферазы (aspC) (публикация японского патента (Kokoku) № 6-102028), ген диаминопимелатэпимеразы (dapF) (выложенная японская патентная заявка № 2003-135066) и ген аспартатполуальдегиддегидрогеназы (asd) (WO 00/61723), и гены, кодирующие ферменты пути аминоадипиновой кислоты, такие как ген гомоаконитатгидратазы (выложенная японская патентная заявка № 2000-157276). Кроме того, исходный штамм может показывать повышенный уровень экспрессии гена, вовлеченного в энергоэффективность (cyo) (EP 1170376 A), гена, кодирующего никотинамиднуклеотидтрансгидрогеназу (pntAB) (патент США № 5830716), ген ybjE, кодирующий белок, который обладает активностью экскреции L-лизина (WO 2005/073390), гена, кодирующего глутаматдегидрогеназу (gdhA) (Gene 23:199-209 (1983)), или произвольной их комбинации. Сокращения для генов приведены в круглых скобках. Среди указанных выше генов предпочтительным является ген ybjE.
[0161] Известно, что дигидродипиколинатсинтаза дикого типа, полученная из Escherichia coli, страдает ингибированием L-лизином по принципу обратной связи, и известно, что аспартокиназа дикого типа, полученная из Escherichia coli, страдает от супрессии и ингибирования L-лизином по принципу обратной связи. Следовательно, когда используют гены dapA и lysC, эти гены предпочтительно представляют собой гены, кодирующие мутантные ферменты, не чувствительные к ингибированию L-лизином по принципу обратной связи.
[0162] Примеры ДНК, кодирующей мутантную дигидродипиколинатсинтетазу, не чувствительную к ингибированию L-лизином по принципу обратной связи, включают ДНК, которая кодирует такой белок, обладающий аминокислотной последовательностью, в которой остаток гистидина в положении 118 заменяют на остаток тирозина. Примеры ДНК, кодирующей мутантную аспартокиназу, не чувствительную к ингибированию L-лизином по принципу обратной связи, включают ДНК, кодирующую AKIII, имеющий аминокислотную последовательность, в которой остаток треонина в положении 352, остаток глицина в положении 323 и остаток метионина в положении 318 заменяют на остатки изолейцина, аспарагина и изолейцина, соответственно (об этих мутантах см. патенты США №№ 5661012 и 6040160). Такую мутантную ДНК можно получать с помощью сайт-специфического мутагенеза с использованием ПЦР или тому подобного.
[0163] Плазмиды с широким спектром организмов-хозяев RSFD80, pCAB1 и pCABD2 известны как плазмиды, содержащие мутантный ген dapA, который кодирует мутантную дигидродипиколинатсинтазу, и мутантный ген lysC, который кодирует мутантную аспартокиназу (патент США № 6040160). Штамм JM109 Escherichia coli, трансформированный с использованием RSFD80, назван AJ12396 (патент США № 6040160), и штамм депонирован в National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry (в настоящее время независимый административный орган, National Institute of Technology and Evaluation, International Patent Organism Depositary) 28 октября 1993 года и ему присвоен номер доступа FERM P-13936, и затем депозит преобразован в международный депозит в соответствии с положениями Budapest Treaty 1 ноября 1994 года и ему присвоен номер доступа FERM BP-4859. RSFD80 можно получать из штамма AJ12396 стандартным способом.
[0164] Кроме того, бактерии, продуцирующие L-аминокислоты, могут иметь пониженную активность фермента, который катализирует реакцию, ответвляющуюся от пути биосинтеза L-аминокислоты и продуцирующую другое соединение, или могут иметь дефицит такой активности, или они могут иметь пониженную активность фермента, который отрицательно действует на синтез или накопление L-аминокислоты, или могут иметь дефицит такой активности. Примеры таких ферментов, вовлеченных в образование L-лизине, включают гомосериндегидрогеназу, лизиндекарбоксилазу (cadA, ldcC), яблочный фермент и так далее, и штаммы, у которых активности этих ферментов снижены или удалены, раскрыты в WO 95/23864, WO 96/17930, WO 2005/010175 и т.д.
[0165] Предпочтительно, чтобы экспрессия обоих генов cadA и ldcC, кодирующих лизиндекарбоксилазу, была снижена для того, чтобы снижать или удалять активность лизиндекарбоксилазы. Экспрессию обоих генов можно понижать, например, с помощью способа, описанного в WO2006/078039.
[0166] Для того чтобы снижать или устранять активности этих ферментов, мутацию можно вводить в гены ферментов в геноме с помощью обычного способа мутагенеза или способа рекомбинации генов с тем, чтобы понижать или устранять внутриклеточные активности ферментов. Такого введения мутации можно достичь посредством, например, использования генетической рекомбинации для того, чтобы устранять гены, кодирующие ферменты в геноме, или чтобы модифицировать такую управляющую экспрессией последовательность, как промотор или последовательность Шайна-Дальгарно (SD). Этого также можно достичь посредством введения мутации для замены аминокислоты (миссенс-мутация), терминирующего кодона (нонсенс-мутация) или мутации со сдвигом рамки для добавления или удаления одного или двух нуклеотидов в области, кодирующие ферменты в геноме, или частичного или полного удаления генов (J. Biol. Chem., 272:8611-8617 (1997)). Ферментативные активности также можно понижать или устранять посредством конструирования гена, который кодирует мутантный фермент, кодирующая область которого полностью или частично удалена, и замены им нормального гена в геноме посредством гомологичной рекомбинации или тому подобного, или посредством введения транспозона или IS-фактора в ген.
[0167] Например, для того, чтобы вводить мутацию, которая снижает или устраняет активности указанных выше ферментов, посредством генетической рекомбинации, используют следующие способы. Мутантный ген получают посредством модификации частичной последовательности целевого гена с тем, чтобы он не кодировал фермент, который может функционировать обычным образом, и затем бактерию, относящуюся к семейству Enterobacteriaceae, можно трансформировать ДНК, содержащей мутантный ген, чтобы вызывать рекомбинацию соответствующего гена в геноме с мутантным геном, чтобы заменить мутантным геном целевой ген в геноме. Примеры такой замены генов с использованием гомологичной рекомбинации включают способы использования линейной ДНК, такие как способ, называемый Red-зависимой интеграцией (Datsenko, K.A, и Wanner, B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97:6640-6645 (2000)), и способ с использованием Red-зависимой интеграции в комбинации с вырезающей системой, зависимой от фага λ (Cho, E.H., Gumport, R.I., Gardner, J.F., J. Bacteriol., 184:5200-5203 (2002)) (см. WO 2005/010175), способ использования плазмиды, содержащей температурочувствительный сайт начала репликации (патент США № 6303383, выложенная японская патентная заявка № 05-007491), и так далее. Кроме того, такой сайт-специфический мутагенез на основании замены генов с использованием гомологичной рекомбинации также можно осуществлять с использованием плазмиды, которая не способна к репликации у организма-хозяина.
[0168] Предпочтительные примеры L-лизин-продуцирующих бактерий включают Escherichia coli WC196ΔcadAΔldcC/pCABD2 (WO2006/078039). Штамм конструировали посредством введения плазмиды pCABD2, содержащей гены биосинтеза лизина (патент США № 6040160) в штамм WC196, содержащий нарушенные гены cadA и ldcC, которые кодируют лизиндекарбоксилазу. Штамм WC196 выводили из штамма W3110, который получали из Escherichia coli K-12, посредством замены гена lysC дикого типа в хромосоме штамма W3110 на мутантный ген lysC, кодирующий мутантную аспартокиназу III, в которой треонин в положении 352 заменяли на изолейцин, что ведет к потере ее чувствительности к ингибированию L-лизином по принципу обратной связи (патент США № 5661012), и дает AEC устойчивость получаемому штамму (патент США № 5827698). штамм WC196 обозначен как Escherichia coli AJ13069, который депонирован в National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology (в настоящее время независимый административный орган, National Institute of Technology and Evaluation, International Patent Organism Depositary, помещение № 120, 2-5-8 Kazusakamatari, Kisarazu-shi, Chiba-ken, 292-0818, Japan) 6 декабря 1994 года, и которому присвоен номер доступа FERM P-14690. Затем его преобразовали в международный депозит в соответствии с положениями Budapest Treaty 29 сентября 1995 года и присвоили номер доступа FERM BP-5252 (патент США № 5827698). Сам штамм WC196ΔcadAΔldcC также представляет собой предпочтительную L-лизин-продуцирующую бактерию. WC196ΔcadAΔldcC обозначен как AJ110692 и депонирован в National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology (в настоящее время независимый административный орган, National Institute of Technology and Evaluation, International Patent Organism Depositary, помещение № 120, 2-5-8 Kazusakamatari, Kisarazu-shi, Chiba-ken, 292-0818, Japan) 7 октября 2008 года в качестве международного депозита, и ему присвоен номер доступа FERM BP-11027.
[0169] Плазмида pCABD2 содержит мутантный ген dapA, полученный из Escherichia coli и кодирующий дигидродипиколинатсинтазу (DDPS), которая имеет мутацию для потери чувствительности к ингибированию L-лизином по принципу обратной связи, мутантный ген lysC, полученный из Escherichia coli и кодирующий аспартокиназу III, которая имеет мутацию для потери чувствительности к ингибированию L-лизином по принципу обратной связи, ген dapB, полученный из Escherichia coli и кодирующий дигидродипиколинатредуктазу, и ген ddh, полученный из Brevibacterium lactofermentum и кодирующий диаминопимелатдегидрогеназу.
[0170] Процедуры, описанные выше для усиления экспрессии гена для ферментов, участвующих в биосинтезе L-лизина, и способы понижения ферментативных активностей можно аналогичным образом применять к генам, кодирующим другие ферменты биосинтеза L-аминокислоты.
[0171] (L-триптофан-продуцирующие бактерии)
Примеры L-триптофан-продуцирующих бактерий и исходных штаммов, которые можно использовать для их получения, включают, но не ограничиваясь этим, штаммы, относящиеся к роду Escherichia, такие как E. coli JP4735/pMU3028 (DSM10122) и JP6015/pMU91 (DSM10123), которые дефицитны по триптофанил-тРНК-синтетазе, кодируемой мутантным геном trpS (патент США № 5756345), E. coli SV164 (pGH5), который имеет аллель serA, кодирующий фосфоглицератдегидрогеназу, не чувствительную к ингибированию серином по принципу обратной связи, и аллель trpE, который кодирует антранилатсинтазу, не чувствительную к ингибированию триптофаном по принципу обратной связи (патент США № 6180373), E. coli AGX17 (pGX44) (NRRL B-12263) и AGX6(pGX50)aroP (NRRL B-12264), дефицитные по триптофаназе (патент США № 4371614), E. coli AGX17/pGX50,pACKG4-pps, в котором усилена способность продуцировать фосфоенолпируват (WO 97/08333, патент США № 6319696), и так далее. L-триптофан-продуцирующие бактерии, относящиеся к роду Escherichia, которые обладают усиленной активностью белка, кодируемого геном yedA или yddG, также можно использовать (опубликованные заявки на патенты США 2003/0148473 A1 и 2003/0157667 A1).
[0172] Примеры L-триптофан-продуцирующих бактерий и исходных штаммов, которые можно использовать для их получения, также включают штаммы, в которых усилена одна или несколько активностей следующих ферментов: антранилатсинтаза (trpE), фосфоглицератдегидрогеназа (serA) и триптофансинтаза (trpAB). Антранилатсинтаза и фосфоглицератдегидрогеназа подвержены ингибированию L-триптофаном и L-серином по принципу обратной связи и, следовательно, мутации, снижающие чувствительность ферментов к ингибированию по принципу обратной связи, можно вводить в эти ферменты. Конкретные примеры штаммов, имеющих такую мутацию, включают E. coli SV164, который несет не чувствительную антранилатсинтазу, и штамм-трансформант SV164, полученный посредством введения в E. coli SV164 плазмиды pGH5, которая содержит мутантный ген serA, который кодирует не чувствительную к ингибированию по принципу обратной связи фосфоглицератдегидрогеназу (WO 94/08031).
[0173] Примеры L-триптофан-продуцирующих бактерий и исходных штаммов, которые можно использовать для их получения, также включают штамм, который обладает усиленной активностью 3-фосфосеринфосфатазы (serB) (патент США № 4371614), штамм, который обладает усиленной активностью фосфоенолпируваткарбоксикиназы (pckA) (WO 2004/090125), и штамм, у которого имеет место конститутивная экспрессия ферментов пути глиоксиловой кислоты (WO 2005/103275).
[0174] L-триптофан, L-фенилаланин и L-тирозин – все представляют собой ароматические аминокислоты и имеют общий путь биосинтеза. Примеры генов, кодирующих ферменты биосинтеза для этих ароматических аминокислот, включают дезоксиарабиногептулозонатфосфатсинтазу (aroG), 3-дегидрохинатсинтазу (aroB), дегидратазу шикимовой кислоты (aroE), шикиматкиназу (aroL), 5-енолпирувилшикимат-3-фосфатсинтазу (aroA), и хоризматсинтазу (aroC) (публикация европейского патента № 763127 A). Известно, что этими генами управляет тирозиновый репрессор (tyrR), и, следовательно активность фермента биосинтеза ароматической аминокислоты также можно увеличивать посредством удаления гена tyrR (см. публикацию европейского патента № 763127 A). Сокращения в круглых скобках после названий ферментов представляют названия генов (аналогичное применимо к аналогичным случаям далее).
[0175] Для того чтобы увеличивать производительность для каждой из целевых ароматических аминокислот, можно ослаблять систему биосинтеза аминокислоты, отличной от целевой аминокислоты. Например, когда целевой аминокислотой является L-триптофан, можно ослаблять пути биосинтеза L-фенилаланина и/или L-тирозина (патент США № 4371614).
[0176] В настоящем изобретении, термин «увеличение активности фермента» соответствует, например, увеличенному числу молекул фермента не клетку, увеличенной специфичной активности на молекулу фермента и так далее. Например, активность можно увеличивать посредством увеличения количества экспрессии гена фермента. Внутриклеточную активность фермента предпочтительно увеличивают, чтобы она была выше, чем таковая у немодифицированного штамма, например, штамма микроорганизма дикого типа.
[0177] Кроме того, 3-дезокси-D-арабиногептулозонат-7-фосфатсинтетаза (aroF, aroG) подвержена ингибированию ароматическими аминокислотами по принципу обратной связи. Следовательно, фермент можно модифицировать с тем, чтобы он не был чувствителен к ингибированию по принципу обратной связи. Продуцирующую ароматическую L-аминокислоту бактерию можно получать посредством, например, введения мутантного aroF, в котором остаток L-аспарагиновой кислоты в положении 147 или остаток L-серина в положении 181 с N-конца заменяют на другую аминокислоту, или посредством введения мутантного гена aroG, в котором один из остатка L-аспарагиновой кислоты в положении 146, остатка L-метионина в положении 147, L-пролина в положении 150 и остатка L-аланина в положении 202 или как остаток L-метионина в положении 157, так и остаток L-аланина в положении 219 с N-конца заменяют на другую аминокислоту(аминокислоты) (EP0488424).
[0178] Примеры L-триптофан-продуцирующих бактерий и исходных штаммов, которые можно использовать для их получения, также включают штаммы, в которые введен триптофановый оперон, содержащий ген, который кодирует не чувствительную к ингибированию антранилатсинтазу (выложенные японские патентные заявки №№ 57-71397, 62-244382, патент США № 4371614). Кроме того, L-триптофан-продуцирующую способность можно придавать посредством усиления экспрессии гена, который кодирует триптофансинтазу в триптофановом опероне (trpBA). Триптофансинтаза состоит из α и β субъединиц, которые кодируют гены trpA и trpB, соответственно. Кроме того, L-триптофан-продуцирующую способность можно повышать посредством усиления экспрессии оперона изоцитратлиазы-малатсинтазы (WO 2005/103275).
[0179] В качестве дифтериеподобных бактерий можно использовать Corynebacterium glutamicum AJ12118 (FERM BP-478, японский патент № 01681002), которая устойчива к сульфагуанидину, дифтериеподобную бактерию, которой введен триптофановый оперон (выложенная японская патентная заявка № 63-240794), и дифтериеподобную бактерию, которой введен ген, кодирующий шикиматкиназу, получаемый из дифтериеподобной бактерии (выложенная японская патентная заявка № 01-994749).
[0180] (L-фенилаланин-продуцирующие бактерии)
Примеры L-фенилаланин-продуцирующих бактерий и исходных штаммов, которые можно использовать для их получения, включают, но не ограничиваясь этим, штаммы, относящиеся к роду Escherichia, такие как E. coli AJ12739 (tyrA::Tn10, tyrR) (VKPM B-8197), E. coli HW1089 (ATCC 55371), несущий мутантный ген pheA34 (патент США № 5354672), E. coli MWEC101-b (корейский патент № 8903681), E. coli NRRL B-12141, NRRL B-12145, NRRL B-12146 и NRRL B-12147 (патент США № 4407952). Также в качестве исходного штамма можно использовать E. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pPHAB (FERM BP-3566), E. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pPHAD] (FERM BP-12659), E. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pPHATerm] (FERM BP-12662) и E. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pBR-aroG4, pACMAB], называемый AJ12604 (FERM BP-3579) (EP 488424 B1). Кроме того, также можно использовать L-фенилаланин-продуцирующие бактерии, относящиеся к роду Escherichia, с усиленной активностью белка, кодируемого геном yedA или геном yddG (опубликованные заявки на патенты США № 2003/0148473 A1 и 2003/0157667 A1).
[0181] В качестве фенилаланин-продуцирующих дифтериеподобных бактерий можно использовать Corynebacterium glutamicum BPS-13 (FERM BP-1777), K77 (FERM BP-2062) и K78 (FERM BP-2063) (публикация европейского патента № 331145 A, выложенная японская патентная заявка № 02-303495), у которых снижена активность фосфоенолпируваткарбоксилазы или пируваткиназы, тирозин-ауксотрофный штамм (выложенная японская патентная заявка № 05-049489) и так далее.
[0182] Бактерию, которая эффективно продуцирует фенилаланин, также можно получать посредством модификации бактерии с тем, чтобы она задействовала побочные продукты, например, посредством увеличения количества экспрессии гена накопления L-триптофана, tnaB или mtr, или гена накопления L-тирозина, tyrP (EP 1484410).
[0183] (L-тирозин-продуцирующие бактерии)
Примеры тирозин-продуцирующих бактерий включают бактерии Escherichia с геном не чувствительной префенатдегидратазы (tyrA) (публикация европейского патента № 1616940 A).
[0184] (L-валин-продуцирующие бактерии)
Примеры L-валин-продуцирующих бактерий и исходных штаммов, которые можно использовать для получения L-валин-продуцирующих бактерий, включают, но не ограничиваясь этим, штаммы, которые модифицированы для повышенной экспрессии оперона ilvGMEDA (патент США № 5998178). Предпочтительно в опероне ilvGMEDA удаляют область, которая необходима для ослабления, чтобы не ослаблять экспрессию оперона L-валинов, который продуцируют. Кроме того, предпочтительно в опероне нарушают ген ilvA с тем, чтобы снижать активность треониндезаминазы.
[0185] Примеры исходных штаммов, которые можно использовать для получения L-валин-продуцирующих бактерий, также включают мутантные штаммы с аминоацил-тРНК-синтетазой, содержащей мутацию (патент США № 5658766). Например, можно использовать E. coli VL1970, которая имеет мутацию в гене ileS, который кодирует изолейцин-тРНК-синтетазу. E. coli VL1970 депонирована в Всероссийская коллекция промышленных микроорганизмов (ВКПМ) (Россия, 117545, Москва, 1-й Дорожный проезд, 1) 24 июня 1988 года под номером доступа VKPM B-4411.
[0186] Кроме того, в качестве исходных штаммов также можно использовать мутанты, которым необходима липоевая кислота для роста и/или у которых отсутствует H+-АТФаза (WO 96/06926).
[0187] Примеры L-валин-продуцирующих бактерий из дифтериеподобных бактерий включают, например, штаммы, модифицированные с тем, чтобы усиливать экспрессию гена, который кодирует фермент биосинтеза L-валина. Примеры фермента биосинтеза L-валина включают ферменты, кодируемые генами, присутствующими в опероне ilvBNC, то есть, синтетаза ацетооксикислот, кодируемая ilvBN, и изомероредуктаза, кодируемая ilvC (WO 00/50624). Поскольку оперон ilvBNC подвержен регуляции экспрессии L-валином и/или L-изолейцином и/или L-лейцином, желательно устранять ослабление, чтобы избегать подавления экспрессии продуцируемым L-валином.
[0188] L-валин-продуцирующую способность можно придавать дифтериеподобным бактериям, и L-валин-продуцирующую способность дифтериеподобных бактерий можно усовершенствовать посредством снижения или устранения активности фермента по меньшей мере одного типа, участвующего в метаболическом пути, который снижает образование L-валина. Например, предусмотрено снижение активности треониндегидратазы, участвующей в синтезе L-лейцина, или активности фермента, участвующего в D-пантотенатсинтезы (WO 00/50624).
[0189] Примеры способов придавать L-валин-продуцирующую способность также включают придание устойчивости к аналогу аминокислоты или тому подобному.
[0190] Примеры включают, например, мутантные штаммы, которые являются ауксотрофными по L-изолейцину и L-метионину и устойчивы к D-рибозе, пуриновому рибонуклеозиду или пиримидиновому рибонуклеозиду, и обладают способностью продуцировать L-валин (FERM P-1841, FERM P-29, публикация японского патента № 53-025034), мутантные штаммы, устойчивые к поликетидам (FERM P-1763, FERM P-1764, публикация японского патента № 06-065314), и мутантные штаммы, устойчивые к L-валину в среде, содержащей уксусную кислоту в качестве единственного источника углерода, и чувствительные к аналогам пировиноградной кислоты (β-фторпировиноградная кислота и т.д.) в среде, содержащей глюкозу в качестве единственного источника углерода (FERM BP-3006, BP-3007, японский патент № 3006929).
[0191] Примером гена, участвующего в синтезе аминокислот с разветвленной цепью, является оперон ilvGMEDA, и этот оперон подвержен контролю (ослаблению) экспрессии L-валином и/или L-изолейцином и/или L-лейцином. Следовательно, производительность микроорганизма для этих L-аминокислот можно усовершенствовать посредством введения в микроорганизм оперона ilvGMEDA, в котором удаляют область, необходимую для ослабления, или вводят в нее мутации.
[0192] (L-изолейцин-продуцирующие бактерии)
Примеры L-изолейцин-продуцирующих бактерий и исходных штаммов, которые можно использовать для получения L-изолейцин-продуцирующих бактерий, включают, но не ограничиваясь этим, мутанты, которые обладают устойчивостью к 6-диметиламинопурину (выложенная японская патентная заявка № 5-304969), мутанты, которые обладают устойчивостью к аналогам изолейцина, таким как тиаизолейцин и изолейцингидроксамат, и мутанты, которые обладают устойчивостью к DL-этионину и/или аргинингидроксамату (выложенная японская патентная заявка № 5-130882). Кроме того, рекомбинантные штаммы, трансформированные генами, которые кодируют белки, участвующие в биосинтезе L-изолейцина, такие как треониндезаминаза и синтаза ацетооксикислот, также можно использовать в качестве исходных штаммов (выложенная японская патентная заявка № 2-458, французский патент № 0356739 и патент США № 5998178).
[0193] Примеры L-изолейцин-продуцирующих штаммов дифтериеподобных бактерий включают дифтериеподобную бактерию, в которой амплифицируют ген brnE, кодирующий белок экскреции аминокислот с разветвленной цепью (выложенная японская патентная заявка № 2001-169788), дифтериеподобную бактерию, которой придана L-изолейцин-продуцирующая способность посредством слияния протопластов с L-лизин-продуцирующей бактерией (выложенная японская патентная заявка № 62-74293), дифтериеподобную бактерию, у которой усилена гомосериндегидрогеназа (выложенная японская патентная заявка № 62-91193), устойчивый к треонингидроксамату штамм (выложенная японская патентная заявка № 62-195293), устойчивый к α-кетомалоновой кислоте штамм (выложенная японская патентная заявка № 61-15695), и устойчивый к метиллизину штамм (выложенная японская патентная заявка № 61-15696).
[0194] (L-лейцин-продуцирующие бактерии)
Примеры L-лейцин-продуцирующих бактерий и исходных штаммов, которые можно использовать для получения L-лейцин-продуцирующих бактерий, включают, но не ограничиваясь этим, бактерии Escherichia, такие как штаммы E. coli, устойчивые к лейцину (например, штамм 57 (VKPM B-7386, патент США № 6124121)) или аналогам лейцина, в том числе β-2-тиенилаланин, 3-гидроксилейцин, 4-азалейцин и 5,5,5-трифторлейцин (публикация японского патента № 62-34397 и выложенная японская патентная заявка № 8-70879); штаммы E. coli, полученные способом генетической инженерии, описанным в WO 96/06926; и E. coli H-9068 (выложенная японская патентная заявка № 8-70879).
[0195] L-лейцин-продуцирующие бактерии также можно усовершенствовать посредством усиления экспрессии одного или нескольких генов, участвующих в биосинтезе L-лейцина. Примеры таких генов включают гены оперона leuABCD, которые предпочтительно представлены мутантным геном leuA, кодирующим изопропилмалатсинтазу, не чувствительную к ингибированию L-лейцином по принципу обратной связи (патент США № 6403342). Кроме того, L-лейцин-продуцирующие бактерии также можно усовершенствовать посредством усиления экспрессии одного или нескольких генов, кодирующих белки, которые экскретируют L-аминокислоту из бактериальной клетки. Примеры таких генов включают гены b2682 и b2683 (гены ygaZH) (EP 1239041 A2).
[0196] Примеры L-лейцин-продуцирующих штаммов дифтериеподобных бактерий включают штаммы, устойчивые к 2-тиазолаланину и β-гидроксилейцину (выложенная японская патентная заявка № 8-266295), штамм, устойчивый к аналогам валина (выложенная японская патентная заявка № 63-248392), валиновый ауксотрофный штамм (публикация японского патента № 38-4395), штамм, устойчивый к S-(2-аминоэтил)-L-цистеин (AEC) (публикация японского патента № 51-37347), и фенилаланиновый, валиновый и изолейциновый ауксотрофный штамм (публикация японского патента № 54-36233).
[0197] (Продуцирующие L-глутаминовую кислоту бактерии)
Предпочтительные примеры продуцирующих L-глутаминовую кислоту бактерий включают, например, штаммы, у которых усилена экспрессия гена, который кодирует фермент биосинтеза L-глутаминовой кислоты. Примеры таких генов включают, но не ограничиваясь этим, гены, которые кодируют глутаматдегидрогеназу (gdhA), глутаминсинтетазу (glnA), глутаматсинтетазу (gltAB), изоцитратдегидрогеназу (icdA), аконитатгидратазу (acnA, acnB), цитратсинтазу (gltA), фосфоенолпируваткарбоксилазу (ppc), пируватдегидрогеназу (aceEF, lpdA), пируваткиназу (pykA, pykF), фосфоенолпируватсинтазу (ppsA), енолазу (eno), фосфоглицеромутазу (pgmA, pgmI), фосфоглицераткиназу (pgk), глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу (gapA), триозофосфатизомеразу (tpiA), фруктозобисфосфатальдолазу (fbp), фосфофруктокиназу (pfkA, pfkB), глюкозофосфатизомеразу (pgi) и так далее.
[0198] Примеры штаммов, которые модифицированы с тем, чтобы усиливать экспрессию гена цитратсинтетазы, гена фосфоенолпируваткарбоксилазы, гена изоцитратдегидрогеназы, гена пируватдегидрогеназы и/или гена глутаматдегидрогеназы, включают те, которые раскрыты в EP 1078989 A, EP 955368 A, EP 952221 A и EP 1033407 A.
[0199] Модификации для того, чтобы придавать способность продуцировать L-глутаминовую кислоту, также можно достигать посредством снижения или устранения активности фермента, который катализирует реакцию, ответвляющуюся от пути биосинтеза L-глутаминовой кислоту и продуцирующую соединение, отличное от L-глутаминовой кислоты. Примеры такого фермента, который катализирует реакцию, ответвляющуюся от пути биосинтеза L-глутаминовой кислоты и продуцирующую соединение, отличное от L-глутаминовой кислоты, включают изоцитратлиазу, α-кетоглутаратдегидрогеназу, синтазу ацетооксикислоты, ацетолактатсинтазу, формиатацетилтрансферазу, лактатдегидрогеназу, глутаматдекарбоксилазу, 1-пирролин-5-карбоксилатдегидрогеназу и так далее.
[0200] Например, чтобы снижать активность α-кетоглутаратдегидрогеназы, можно осуществлять модификацию с использованием гена sucA (odhA), кодирующего субъединицу E1o фермента. Примеры штаммов с пониженной активностью α-кетоглутаратдегидрогеназы, включают, например, следующие штаммы:
[0201] Штамм ΔS Brevibacterium lactofermentum (WO 95/34672).
Brevibacterium lactofermentum AJ12821 (FERM BP-4172; французский патент № 9401748).
Brevibacterium flavum AJ12822 (FERM BP-4173; французский патент № 9401748).
Corynebacterium glutamicum AJ12823 (FERM BP-4174; французский патент № 9401748).
Pantoea ananatis AJ13601 (FERM BP-7207).
Klebsiella planticola AJ13410 (FERM BP-6617).
Pantoea ananatis AJ13355 (FERM BP-6614).
[0202] Pantoea ananatis AJ13356 имеет дефицит активности α-кетоглутаратдегидрогеназы в результате разрушения гена субъединицы αKGDH-E1 (sucA). Этот штамм идентифицировали как Enterobacter agglomerans, когда его выделили и депонировали как Enterobacter agglomerans AJ13356. Однако в последнее время его переклассифицировали как Pantoea ananatis на основании нуклеотидного секвенирования 16S rRNA и так далее. Несмотря на то, что AJ13356 депонирован в указанном выше депозитарии как Enterobacter agglomerans, в этом описании он описан как Pantoea ananatis.
[0203] Кроме того, способность продуцировать L-глутаминовую кислоту также можно придавать дифтериеподобным бактериям с помощью способа амплификации гена yggB (NCgl 1221;NP_600492. Сообщалось о низкой проводимости. [gi:19552490], WO 2006/070944), или способа введения мутантного гена yggB, в котором мутацию вводят в кодирующую область.
[0204] Примеры других способов придавать или усиливать способность продуцировать L-глутаминовую кислоту включают способ придания устойчивости к аналогу органической кислоты, ингибитору дыхательной цепи и т.д., и способ придания чувствительности к ингибитору синтеза клеточной стенки. Примеры таких способов включают способ придания устойчивости к монофторуксусной кислоте (выложенная японская патентная заявка № 50-113209), способ придания устойчивости к аденину или тимину (выложенная японская патентная заявка № 57-065198), способ ослабления уреазы (выложенная японская патентная заявка № 52-038088), способ придания устойчивости к малоновой кислоте (выложенная японская патентная заявка № 52-038088), способ придания устойчивости к бензопиронам или нафтохинонам (выложенная японская патентная заявка № 56-1889), способ придания устойчивости к HOQNO (выложенная японская патентная заявка № 56-140895), способ придания устойчивости к α-кетомалоновой кислоте (выложенная японская патентная заявка № 57-2689), способ придания устойчивости к гуанидину (выложенная японская патентная заявка № 56-35981), способ придания чувствительности к пенициллину (выложенная японская патентная заявка № 4-88994) и так далее.
[0205] Конкретные примеры таких устойчивых штаммов включают следующие штаммы:
Brevibacterium flavum AJ3949 (FERM BP-2632; выложенная японская патентная заявка № 50-113209);
Corynebacterium glutamicum AJ11628 (FERM P-5736; выложенная японская патентная заявка № 57-065198);
Brevibacterium flavum AJ11355 (FERM P-5007; выложенная японская патентная заявка № 56-1889);
Corynebacterium glutamicum AJ11368 (FERM P-5020; выложенная японская патентная заявка № 56-1889);
Brevibacterium flavum AJ11217 (FERM P-4318; выложенная японская патентная заявка № 57-2689);
Corynebacterium glutamicum AJ11218 (FERM P-4319; выложенная японская патентная заявка № 57-2689);
Brevibacterium flavum AJ11564 (FERM BP-5472; выложенная японская патентная заявка № 56-140895);
Brevibacterium flavum AJ11439 (FERM BP-5136; выложенная японская патентная заявка № 56-35981);
Corynebacterium glutamicum H7684 (FERM BP-3004; выложенная японская патентная заявка № 04-88994);
Brevibacterium lactofermentum AJ11426 (FERM P-5123; выложенная японская патентная заявка № 56-048890);
Corynebacterium glutamicum AJ11440 (FERM P-5137; выложенная японская патентная заявка № 56-048890);
Brevibacterium lactofermentum AJ11796 (FERM P-6402; выложенная японская патентная заявка № 58-158192).
[0206] (L-треонин-продуцирующие бактерии)
Предпочтительные примеры L-треонин-продуцирующих бактерий включают бактерии, относящиеся к семейству Enterobacteriaceae, у которых повышена активность фермента системы биосинтеза L-треонина. Примеры генов, кодирующих ферменты биосинтеза L-треонина, включают ген аспартокиназы III (lysC), ген аспартатполуальдегиддегидрогеназы (asd), ген аспартокиназы I (thrA), ген гомосеринкиназы (thrB) и ген треонинсинтазы (thrC), кодируемый опероном thr. Можно вводить эти гены двух или более типов. Гены, которые кодируют ферменты биосинтеза L-треонина, можно вводить в бактерию Enterobacteriaceae с сниженным расщеплением треонина. Примеры бактерии Escherichia со сниженным расщеплением треонина включают, например, штамм TDH6, который имеет дефицит активности треониндегидрогеназы (выложенная японская патентная заявка № 2001-346578), и т.д.
[0207] Активности ферментов биосинтеза L-треонина ингибирует конечный продукт L-треонин и, следовательно, при конструировании продуцирующих L-треонин штаммов ферменты биосинтеза L-треонина предпочтительно модифицируют с тем, чтобы они были не чувствительны к ингибированию L-треонином по принципу обратной связи. Описанные выше гены thrA, thrB и thrC составляют треониновый оперон, который имеет структуру аттенюатора. Экспрессию треонинового оперона ингибирует изолейцин и треонин в среде для культивирования и также имеет место репрессия посредством аттенюации. Эту аттенюацию можно устранять или снижать посредством удаления лидерной последовательности или аттенюатора в аттенюирующей области (Lynn, S.P., Burton, W.S., Donohue, T.J., Gould, R.M., Gumport, R.I., and Gardner, J.F.J., Mol. Biol. 194:59-69 (1987); WO 02/26993; WO 2005/049808).
[0208] Нативный промотор, присутствующий в области треонинового оперона, которая расположена выше по направлению считывания, можно заменить на ненативный промотор (WO 98/04715), или треониновый оперон можно конструировать с тем, чтобы управлять экспрессией генов биосинтеза треонина с помощью репрессора и промотора фага λ (европейский патент № 0593792). Кроме того, мутантные бактерии Escherichia, которые не чувствительны к ингибированию L-треонином по принципу обратной связи, можно получать посредством отбора штаммов, устойчивых α-амино-β-гидроксиизовалериановой кислоте (AHV).
[0209] Предпочтительно увеличивают число копий модифицированного треонинового оперона, устойчивого к ингибированию по принципу обратной связи, или экспрессию модифицированного оперона увеличивают посредством его соединения с промотором, активном у организма-хозяина. Число копий можно увеличивать посредством использования, в дополнение к амплификации с использованием плазмиды, транспозона, фага μ или тому подобного с тем, чтобы переносить оперон на хромосому.
[0210] Ген, который кодирует аспартокиназу III (lysC), предпочтительно модифицируют с тем, чтобы фермент был не чувствителен к ингибированию L-лизином по принципу обратной связи. Такой модифицированный устойчивый к ингибированию по принципу обратной связи ген lysC можно получать с помощью способа, описанного в патенте США № 5932453.
[0211] L-треонин-продуцирующие бактерии также предпочтительно можно получать посредством усиления экспрессии генов, участвующих в гликолитическом пути, цикле трикарбоновых кислот или дыхательной цепи, или генов, которые регулируют экспрессию этих генов или генов, участвующих в накоплении сахаров, помимо генов ферментов биосинтеза L-треонина. Примеры этих генов, которые эффективны для получения L-треонина, включают ген трансгидрогеназы (pntAB, европейский патент № 733712), ген фосфоенолпируваткарбоксилазы (pepC, WO 95/06114), ген фосфоенолпируватсинтазы (pps, европейский патент № 877090), и ген пируваткарбоксилазы, полученный из дифтериеподобной бактерии или бактерии Bacillus (WO 99/18228, публикация европейского патента № 1092776 A).
[0212] L-треонин-продуцирующие бактерии также предпочтительно можно получать посредством усиления экспрессии гена, который придает устойчивость к L-треонину, и/или гена, который придает устойчивость к L-гомосерину, или посредством придания устойчивости к L-треонину и/или устойчивости к L-гомосерину бактерии-хозяину. Примеры генов, которые придают указанную выше устойчивость, включают ген rhtA (Res. Microbiol. 154:123-135 (2003)), ген rhtB (публикация европейского патента № 0994190 A), ген rhtC (публикация европейского патента № 1013765 A), ген yfiK и ген yeaS (публикация европейского патента № 1016710 A). Образцовые способы придавать устойчивость к L-треонину бактерии-хозяину включают те, что описаны в публикации европейского патента № 0994190 A и WO 90/04636.
[0213] E. coli VKPM B-3996 (патент США № 5175107) можно привести в качестве примера L-треонин-продуцирующей бактерии. Штамм VKPM B-3996 депонирован 19 ноября 1987 года во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ), ГНИИ Генетика (Россия, 117545, Москва, 1-й Дорожный проезд, 1) по регистрационным номером VKPM B-3996. Штамм VKPM B-3996 содержит плазмиду pVIC40 (WO 90/04636), которую получали посредством вставки генов биосинтеза треонина (треониновый оперон, thrABC) в плазмидный вектор pAYC32 с широким спектром организмов-хозяев, содержащий маркер устойчивости к стрептомицину (Chistorerdov, A.Y., and Tsygankov, Y.D., Plasmid, 16, 161-167 (1986)). В pVIC40 аспартокиназа I-гомосериндегидрогеназа I, кодируемые геном thrA в треониновом опероне, не чувствительны к ингибированию L-треонином по принципу обратной связи.
[0214] E. coli VKPM B-5318 (см. европейский патент № 0593792) также можно привести в качестве примера предпочтительной L-треонин-продуцирующей бактерии. Штамм VKPM B-5318 депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) ГНИИ Генетика 3 мая 1990 года под регистрационным номером VKPM B-5318. Штамм VKPM B-5318 является прототрофным в отношении L-изолейцина и несет рекомбинантную плазмидную ДНК, сконструированную с тем, чтобы треониновый оперон, т.е. гены биосинтеза треонина, лишенный области аттенюатора, который исходно содержал область регуляции транскрипции, располагался ниже по направлению считывания от полученного из фага λ температурочувствительного репрессора C1, PR-промотора и гена, кодирующего N-концевой белок Cro, и экспрессию генов биосинтеза треонина регулируют посредством репрессора и промотора, полученного из фага λ.
[0215] (L-аргинин-продуцирующие бактерии)
Примеры L-аргинин-продуцирующих бактерий и исходных штаммов, которые можно использовать для получения L-аргинин-продуцирующих бактерий, включают, но не ограничиваясь этим, штаммы бактерий Escherichia, такие как штамм 237 E. coli (VKPM B-7925) (опубликованная заявка на патент США № 2002/058315 Al) и его производные штаммы, несущие мутантную N-ацетилглутаматсинтазу (российская патентная заявка № 2001112869), штамм 382 E. coli (VKPM B-7926) (EP 1170358 A1) и аргинин-продуцирующий штамм, трансформированный геном argA, который кодирует N-ацетилглутаматсинтетазу (EP 1170361 A1).
[0216] Примеры L-аргинин-продуцирующих бактерий и исходных штаммов, которые можно использовать для получения L-аргинин-продуцирующих бактерий, также включают штаммы, в которых усиливают экспрессию одного или нескольких генов, которые кодируют ферменты биосинтеза L-аргинина. Примеры таких генов включают ген N-ацетилглутамилфосфатредуктазы (argC), ген орнитинацетилтрансферазы (argJ), ген N-ацетилглутаматкиназы (argB), ген ацетилорнитинтрансаминазы (argD), ген орнитинкарбамоилтрансферазы (argF), ген синтетазы аргининоянтарной кислоты (argG), ген лиазы аргининоянтарной кислоты (argH) и ген карбамоилфосфатсинтетазы (carAB).
[0217] Примеры дифтериеподобных бактерий, которые обладают L-аргинин-продуцирующей способностью, включают, но не ограничиваясь этим, штаммы дифтериеподобных бактерий дикого типа; дифтериеподобные бактерии, устойчивые к определенным средствам, включая сульфамидные лекарственные средства, 2-тиазолаланин, α-амино-β-гидроксивалериановую кислоту и так далее; дифтериеподобные бактерии, проявляющие ауксотрофию по L-гистидину, L-пролину, L-треонину, L-изолейцину, L-метионину или L-триптофану в дополнение к устойчивости к 2-тиазолаланину (выложенная японская патентная заявка № 54-44096); дифтериеподобные бактерии, устойчивые к кетомалоновой кислоте, фтормалоновой кислоте или монофторуксусной кислоте (выложенная японская патентная заявка № 57-18989); дифтериеподобные бактерии, устойчивые к аргининолу (выложенная японская патентная заявка № 62-24075); дифтериеподобные бактерии, устойчивые к X-гуанидину (X представляет производное жирной кислоты или алифатическую цепь, выложенная японская патентная заявка № 2-186995) и так далее. Дифтериеподобная бактерия с дефицитом L-аргининового репрессора (опубликованная заявка на патент США № 20020045233) и дифтериеподобная бактерия, у которой повышена активность глутаматдегидрогеназы (публикация европейского патента № 1057893 A), также представляют собой штаммы, подходящие для получения L-аргинина.
[0218] В частности, в качестве примера можно привести следующие штаммы: Brevibacterium flavum AJ11169 (BP-6892), Corynebacterium glutamicum AJ12092 (FERM BP-6906), Brevibacterium flavum AJ11336 (FERM BP-6893), Brevibacterium flavum AJ11345 (FERM BP-6894) и Brevibacterium lactofermentum AJ12430 (FERM BP-2228). Штаммы AJ11169 и AJ12092 представляют собой устойчивые к 2-тиазолаланину штаммы, описанные в выложенной японской патентной заявке № 54-44096, штамм AJ11336 представляет собой устойчивый к аргининолу и сульфадиазину штамм, описанный в публикации японского патента № 62-24075, штамм AJ11345 представляет собой штамм, устойчивый к аргининолу, 2-тиазолаланину, и сульфагуанидину и проявляет гистидиновую ауксотрофию, который описан в публикации японского патента № 62-24075, и штамм AJ12430 представляет собой устойчивый к октилгуанидину и 2-тиазолаланину штамм, описанный в выложенной японской патентной заявке № 2-186995.
[0219] Corynebacterium glutamicum AJ12092 (FERM BP-6906) депонирован 29 сентября 1983 года в National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology (в настоящее время независимый административный орган, National Institute of Technology and Evaluation, International Patent Organism Depositary, помещение № 120, 2-5-8 Kazusakamatari, Kisarazu-shi, Chiba-ken, 292-0818, Japan) с номером доступа FERM P-7273, и исходный депозит преобразован в международный депозит на основании Budapest Treaty 1 октября 1999 года, и ему присвоен номер доступа FERM BP-6906.
[0220] Примеры бактерий Escherichia, обладающих L-аргинин-продуцирующей способностью, включают Escherichia coli, которой введен ген argA (см. выложенную японскую патентную заявку № 57-5693), и штамм 237 Escherichia coli, который представляет собой L-аргинин-продуцирующее производное мутантного штамма, утилизирующего уксусную кислоту (российская патентная заявка № 2000117677). Штамм 237 депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) ГНИИ Генетика под номером доступа VKPM B-7925 с 10 апреля 2000 года, и исходный депозит преобразован в международный депозит на основании Budapest Treaty, 18 мая 2001 года. Также можно использовать штамм 382 Escherichia coli, обладающий мутацией для устойчивости к ингибированию L-аргинином по принципу обратной связи, который представляет собой производное штамма 237 (выложенная японская патентная заявка № 2002-017342). Штамм 382 Escherichia coli депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под номером VKPM B-7926 10 апреля 2000 года, и депозит преобразован в международный депозит на основании Budapest Treaty 18 мая 2001 года.
[0221] Примеры бактерий Serratia, обладающих L-аргинин-продуцирующей способностью, включают Serratia marcescens, дефицитную по способности разлагать L-аргинин и демонстрирующую устойчивость к антагонистам аргинина и канаванину и автотрофию по лизину (см. выложенную японскую патентную заявку № 52-8729).
[0222] (L-гистидин-продуцирующие бактерии)
Примеры исходных штаммов, которые можно использовать для получения L-гистидин-продуцирующих бактерий, включают, но не ограничиваясь этим, бактериальные штаммы Escherichia, такие как штамм 24 E. coli (VKPM B-5945, RU2003677), 80 штамм E. coli (VKPM B-7270, RU2119536), E. coli NRRL с B-12116 до B-12121 (патент США № 4388405), E. coli H-9342 (FERM BP-6675), E. coli H-9343 (FERM BP-6676) (патент США № 6344347), E. coli H-9341 (FERM BP-6674) (EP 1085087) и E. coli AI80/pFM201 (патент США № 6258554).
[0223] Примеры исходных штаммов, которые можно использовать для получения L-гистидин-продуцирующих бактерий, также включают штаммы, в которых усиливают экспрессию одного или нескольких генов, которые кодируют ферменты биосинтеза L-гистидина. Примеры таких генов включают ген АТФ фосфорибозилтрансферазы (hisG), ген фосфорибозил-АМФ-циклогидролазы (hisI), ген фосфорибозил-АТФ пирофосфогидролазы (hisIE), ген фосфорибозилформимино-5-аминоимидазо карбоксамидриботидизомеразы (hisA), ген амидотрансферазы (hisH), ген гистидинолфосфатаминотрансферазы (hisC), ген гистидинолфосфатазы (hisB), ген гистидинолдегидрогеназы (hisD) и так далее.
[0224] Известно, что ферменты биосинтеза L-гистидина, кодируемые hisG и hisBHAFI, подвержены ингибированию L-гистидином, и, следовательно, способность продуцировать L-гистидин, также можно эффективно усиливать посредством введения мутации, которая придает устойчивость к ингибированию по принципу обратной связи, в ген, кодирующий АТФ-фосфорибозилтрансферазу (hisG) (российские патенты №№ 2003677 и 2119536).
[0225] Конкретные примеры штаммов, обладающих L-гистидин-продуцирующей способностью, включают E. coli FERM-P 5038 и 5048, которые трансформированы вектором, несущим ДНК, кодирующую фермент биосинтеза L-гистидина (выложенная японская патентная заявка № 56-005099), штаммы E. coli, трансформированные геном, который кодирует белок, вовлеченный в экспорт аминокислот (EP 1016710 A), штамм 80 E. coli, который устойчив к сульфагуанидину, DL-1,2,4-триазол-3-аланину и стрептомицину (VKPM B-7270, российский патент № 2119536), и так далее.
[0226] (L-цистеин-продуцирующие бактерии)
Примеры исходных штаммов, которые можно использовать для получения L-цистеин-продуцирующих бактерий, включают, но не ограничиваясь этим, штаммы, относящиеся к роду Escherichia, такие как E. coli JM15, который трансформируют различными аллелями cysE, кодирующим устойчивые к обратной связи серинацетилтрансферазы (патент США № 6218168, российская патентная заявка № 2003121601), E. coli W3110 со сверхэкспрессируемыми генами, которые кодируют белки, которые способствуют экскреции веществ, токсичных для клеток (патент США № 5972663), штаммы E. coli со сниженной активностью цистеиндесульфогидразы (выложенная японская патентная заявка № 11-155571), E. coli W3110 с повышенной активностью положительного транскрипционного регулятора для регуляции цистеина, кодируемого геном cysB (WO 01/27307A1), и так далее.
[0227] (L-серин-продуцирующие бактерии)
Примеры исходных штаммов, которые можно использовать для получения L-серин-продуцирующих бактерий, включают дифтериеподобные бактерии, в которых амплифицирован ген фосфосеринфосфатазы (выложенные японские патентные заявки №№ 2001-275689 и 11-253187), дифтериеподобные бактерии, обладающие D-3-фосфоглицератдегидрогеназой, не чувствительной к ингибированию, которую извлекают из дифтериеподобных бактерий, которые обладают L-серин-продуцирующей способностью и устойчивы к азасерину или β-(2-тиенил)-DL-аланину (выложенная японская патентная заявка № 11-266881), и серин-продуцирующие дифтериеподобные бактерии, устойчивые к азасерину или тиенилаланину и с недостаточной способностью к расщеплению серина (выложенная японская патентная заявка № 10-248588).
[0228] Примеры способов придавать способность продуцировать нуклеиновые кислоты микроорганизму и продуцирующих нуклеиновые кислоты бактерий приведены далее.
Микроорганизм, обладающий способностью продуцировать нуклеиновую кислоту, можно получать посредством придания, например, ауксотрофии по пуриновым нуклеозидам или устойчивости к лекарственному средству, такому как аналог пурина, таким бактериям, как описано выше (см. публикации японских патентов №№ 38-23099, 54-17033, 55-45199, 57-14160, 57-41915 и 59-42895). Например, бактерии Bacillus, обладающие ауксотрофией или лекарственной устойчивостью, можно получать посредством обработки мутагеном, который используют для обычной мутагенной обработки, таким как N-метил-N’-нитро-N-нитрозогуанидин (NTG) или этилметансульфонат (EMS).
[0229] Примеры бактерий Bacillus, которые продуцируют пуриновый нуклеозид, включают следующее.
В качестве конкретного примера инозин-продуцирующего штамма, относящегося к роду Bacillus, можно использовать штамм KMBS16 Bacillus subtilis. Штамм получают из известного штамма trpC2 Bacillus subtilis (168 Marburg), где нарушены ген purR, который кодирует репрессор пуринового оперона (purR::spc), ген purA, который кодирует сукцинил-АМФ-синтазу (purA::erm), и ген deoD, который кодирует фосфорилазу пуриновых нуклеозидов (deoD::kan) (выложенная японская патентная заявка № 2004-242610, опубликованная заявка на патент США № 2004166575 A1). Также можно использовать штамм AJ3772 Bacillus subtilis (FERM P-2555, выложенная японская патентная заявка № 62-014794) и так далее.
[0230] Примеры бактерий Bacillus, обладающих способностью продуцировать гуанозин, включают бактерию Bacillus, которая имеет увеличенную активность ИМФ-дегидрогеназы (выложенная японская патентная заявка № 3-58787), бактерию Bacillus, полученную посредством введения вектора, содержащего ген, который придает устойчивость к аналогам пурина или декоинину, в адениновый ауксотрофный мутант (публикация японского патента № 4-28357), и так далее.
[0231] Примеры бактерий Bacillus, которые продуцируют пуриновый нуклеотид, включают следующее.
[0232] В качестве продуцирующих инозиновую кислоту бактерий Bacillus сообщалось об инозин-продуцирующих штаммах Bacillus subtilis, которые обладают ослабленной активностью фосфатазы (Uchida, K. et al., Agr. Biol. Chem., 1961, 25, 804-805; Fujimoto, M., Uchida, K., Agr. Biol. Chem., 1965, 29, 249-259). Примеры продуцирующих гуаниловую кислоту бактерий включают мутанты бактерий Bacillus, которые обладают адениновой ауксотрофией, устойчивостью к декоинину или метионинсульфоксиду и способностью продуцировать 5’-гуаниловую кислоту (гуанозин-5’-монофосфат, в дальнейшем также обозначаемый как «ГМФ») (публикация японского патента № 56-12438).
[0233] Кроме того, продуцирующую ксантиловую кислоту бактерию можно сконструировать с помощью способа, используемого для выведения дифтериеподобных бактерий, типичным примером которых является Corynebacterium ammoniagenes. Например, посредством получения штамма с ФРПФ амидотрансферазой с повышенной активностью (выложенная японская патентная заявка № 8-168383), устойчивого к алифатическим аминокислотам штамма (выложенная японская патентная заявка № 4-262790) или устойчивого к дегидропролину штамма (публикация непроверенного южнокорейского патента № 2003-56490), можно сконструировать бактерии, продуцирующие ксантиловую кислоту.
[0234] Кроме того, образцовые способы выведения бактерий Bacillus, которые обладают способностью продуцировать получаемое из пурина вещество, также включают усиление активности фермента, участвующего в биосинтезе пурина, который является общим для биосинтеза пуриновых нуклеозидов и пуриновых нуклеотидов, т.е., фермент биосинтеза пурина, в бактериальных клетках.
Примеры фермента, участвующего в биосинтезе пурина, включают, например, фосфорибозилпирофосфатамидотрансферазу, фосфорибозилпирофосфатсинтетазу (ФРПФ синтетаза [EC: 2.7.6.1]) и так далее.
[0235] Некоторые из катаболитов, полученные с помощью метаболизма источников сахара, таких как глюкоза, которые участвуют в пентозофосфатном пути, превращают в рибозо-5-фосфат через рибулозо-5-фосфат. Из биосинтезированного рибозо-5-фосфата получают фосфорибозилпирофосфат (ФРПФ), который является незаменимым предшественником биосинтеза пуриновых нуклеозидов, гистидина и триптофана. В частности, превращение рибозо-5-фосфата в ФРПФ происходит с помощью фосфорибозилпирофосфатсинтетазы. Следовательно, бактерии Bacillus можно придавать способность продуцировать полученное из пурина вещество или можно усиливать способность бактерии посредством модификации бактерии с тем, чтобы увеличивать активность ее фосфорибозилпирофосфатсинтетазы.
[0236] Активность фосфорибозилпирофосфатсинтетазы можно измерять, например, способом по Switzer et al. (Methods Enzymol., 1978, 51, 3-11) или способом по Roth et al. (Methods Enzymol., 1978, 51, 12-17). Бактерию Bacillus, у которой увеличена активность фосфорибозилпирофосфатсинтетазы, можно получать посредством, например, увеличения экспрессии гена, который кодирует фосфорибозилпирофосфатсинтетазу, у бактерии Bacillus в соответствии со способом использования плазмиды или встраивания гена в хромосому, который можно осуществлять аналогичным образом, как и способ, описанный в выложенной японской патентной заявке № 2004-242610.
[0237] С другой стороны, при образовании ФРПФ, который является незаменимым предшественником для биосинтеза пуриновых нуклеозидов, гистидина и триптофана, происходит превращение некоторой его части в пуриновые нуклеотиды и пуриновые нуклеозиды с помощью ферментов, участвующих в биосинтезе пурина. Примеры генов, которые кодируют такие ферменты, включают гены пуринового оперона из Bacillus subtilis, в частности, гены оперона purEKB-purC(orf)QLF-purMNH(J)-purD (Ebbole D.J. и Zalkin H., J. Biol. Chem., 1987, 262, 17, 8274-87) (в настоящее время также называемого purEKBCSQLFMNHD, Bacillus subtilis and Its Closest Relatives, главный редактор: A.L. Sonenshein, ASM Press, Washington D.C., 2002, номер доступа GenBank NC_000964), и гены регуляции пурина из Escherichia coli (Escherichia and Salmonella, Second Edition, главный редактор: F.C. Neidhardt, ASM Press, Washington D.C., 1996).
[0238] Соответственно посредством усиления экспрессии этих генов также можно придавать или усиливать способность продуцировать получаемое из пурина вещество. Кроме того, гены пуринового оперона, которые можно использовать для настоящего изобретения, не ограничены этим, и также можно использовать гены, полученные из других микроорганизмов, животных и растений.
[0239] Примеры способа увеличения экспрессии пуринового оперона включают увеличение экспрессии генов пуринового оперона у бактерий Bacillus с помощью способа использования плазмиды, встраивания генов в хромосому или тому подобного.
[0240] Второй способ увеличения экспрессии пуринового оперона включает замену нативного промотора пуринового оперона на более сильный промотор, и замены участка -35 или -10 нативного промотора на консенсусную последовательность.
[0241] Например, у Bacillus subtilis (штамм 168 Marburg B. subtilis, ATCC 6051), -35 последовательность пуринового оперона представляет собой консенсусную последовательность (TTGACA), а -10 последовательность представляет собой TAAGAT, которая отличается от консенсусной последовательности TATAAT (Ebbole, D.J. and H. Zalikn, J. Biol. Chem., 1987, 262, 8274-8287). Следовательно, посредством замены -10 последовательности (TAAGAT) на консенсусную последовательность или посредством приближения -10 последовательности (TAAGAT) ближе к консенсусной последовательности, ее можно заменять на TATAAT, TATGAT или TAAAAT, и тем самым можно увеличивать транскрипционную активность пуринового оперона. Промоторную последовательность можно заменять с помощью того же способа, что и для замены генов, который описан далее.
[0242] Третий способ увеличения экспрессии пуринового оперона включает снижение количества экспрессии репрессора пуринового оперона (патент США № 6284495).
[0243] Количество экспрессии репрессора пуринового оперона (пуринового репрессора) можно понижать, например, с помощью способа обработки бактерии Bacillus облучением ультрафиолетовыми лучами или мутагена, используемого при обычной мутагенной обработке, например, NTG или EMS, и отбора мутанта, демонстрирующего пониженную экспрессию пуринового репрессора.
[0244] Кроме того, бактерию Bacillus с пониженной экспрессией пуринового репрессора также можно получать, помимо мутагенной обработки, например, посредством замены гена, который кодирует пуриновый репрессор на хромосоме (purR, номер доступа GenBank NC_000964), на соответствующий ген, который не функционирует обычным образом (далее, также обозначают как «ген нарушенного типа»), посредством гомологичной рекомбинации с использованием способа рекомбинации генов (Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1972); Matsuyama, S. and Mizushima, S., J. Bacteriol., 1985, 162, 1196-1202).
[0245] Кроме того, способность продуцировать получаемое из пурина вещество также можно усиливать посредством ослабления накопления получаемых из пурина веществ в клетках. Например, накопление пуриновых нуклеозидов клетками можно ослаблять посредством блокирования реакции, участвующей в накоплении пуриновых нуклеозидов клетками. Примеры реакции, участвующей в накоплении пуриновых нуклеозидов клетками включает реакции, катализируемые нуклеозидными пермеазами.
[0246] Кроме того, при образовании пуринового нуклеозида активность фермента, которых разлагает получаемые из пурина вещества, можно понижать для того, чтобы усиливать способность продуцировать пуриновый нуклеозид. Примеры такого фермента включают фосфорилазу пуриновых нуклеозидов.
[0247] Пуриновые нуклеотиды, биосинтезируемые из ФРПФ ферментами, участвующими в биосинтезе пуринов, подвергаются дефосфорилированию и, тем самым, преобразуются в пуриновый нуклеозид. Для того чтобы эффективно инициировать накопление пуринового нуклеозида, предпочтительно снижать активности фосфорилаз пуриновых нуклеозидов, которые в дальнейшем разлагают пуриновые нуклеозиды на гипоксантин или тому подобное. То есть предпочтительно ослаблять или устранять активность фосфорилазы пуринового нуклеозида, которая использует пуриновые нуклеозиды, такие как инозин, в качестве субстрата.
[0248] В частности, активность фосфорилазы пуриновых нуклеозидов можно понижать посредством нарушения генов deoD и pupG, которые кодируют фосфорилазу пуриновых нуклеозидов у бактерий Bacillus. Бактерию Bacillus, используемую в настоящем изобретении, можно модифицировать посредством нарушения одного или обоих из генов deoD и pupG. В качестве генов deoD и pupG, например, можно использовать те гены, которые получают из бактерий Bacillus (deoD; номер доступа GenBank NC_000964, pupG; номер доступа GenBank NC_000964).
[0249] Способность продуцировать получаемое из пурина вещество также можно усиливать посредством снижения активности сукцинил-АМФ-синтазы. Примеры гена, который кодирует сукцинил-АМФ синтазу, включают ген purA. Примеры гена purA включают, например, те, которые имеют нуклеотидную последовательность, зарегистрированную под номером доступа GenBank NC_000964 (кодирующая область соответствует номерам нуклеотидов с 4153460 до 4155749 комплементарной цепи).
[0250] Способность продуцировать получаемое из пурина вещество также можно усиливать посредством снижения активности инозинмонофосфат-дегидрогеназы (ИМФ). Примеры гена, который кодирует ИМФ дегидрогеназу, включает ген guaB. Примеры гена guaB включают, например, те, которые обладают нуклеотидной последовательностью, зарегистрированной под номером доступа GenBank NC_000964 (кодирующая область соответствует номерам нуклеотидов от 15913 до 17376).
[0251] Кроме того, в качестве способа усиления способности продуцировать получаемое из пурина вещество можно рассматривать амплификацию гена, который кодирует белок, обладающий активностью экскреции получаемого из пурина вещества. Пример бактерии, у которой такой амплифицирован ген, представляет собой бактерию Bacillus, у которой амплифицируют ген rhtA (выложенная японская патентная заявка № 2003-219876).
[0252] Более конкретные примеры микроорганизма, который можно использовать для настоящего изобретения, включают, например, Escherichia coli AJ11442 (NRRL B-12185, FERM BP-1543, см. патент США № 4346170), Brevibacterium lactofermentum AJ3990 (ATCC 31269, см. патент США № 4066501) и т.д. для L-лизина в качестве целевого вещества, Escherichia coli VKPM B-3996 (RIA1867, VKPM B-3996, см. патент США № 5175107), Corynebacterium acetoacidophilum AJ12318 (FERM BP-1172) (см. патент США № 5188949) и т.д. для L-треонина, Escherichia coli AJ12604 (FERM BP-3579, см. публикацию европейского патента № 488,424 A), Brevibacterium lactofermentum AJ12637 (FERM BP-4160, см. французскую выложенную патентную заявку № 2686898) и т.д. для L-фенилаланина, Escherichia coli AJ12624 (FERM BP-3853, см. французскую выложенную патентную заявку № 2680178), Brevibacterium lactofermentum AJ12475 (FERM BP-2922, см. патент США № 5272067) и т.д. для L-глутаминовой кислоты, Escherichia coli AJ11478 (FERM P-5274, см. публикацию японского патента № 62-34397), Brevibacterium lactofermentum AJ3718 (FERM P-2516, см. патент США № 3970519) и т.д. для L-лейцина, Escherichia coli KX141 (VKPM B-4781, см. публикацию европейского патента № 519,113 A), Brevibacterium flavum AJ12149 (FERM BP-759, см. патент США № 4656135) и т.д. для L-изолейцина, Escherichia coli VL1970 (VKPM B-4411, см. публикацию европейского патента № 519,113 A), Brevibacterium lactofermentum AJ12341 (FERM BP-1763, см. патент США № 5188948) и т.д. для L-валина и Corynebacterium glutamicum AJ12092 (FERM BP-6906) для L-аргинина.
[0253] Получения целевого вещества с использованием настоящего изобретения можно достигать посредством управления концентрацией аммиака, чтобы она находилась в пределах определенного диапазона концентраций в течение по меньшей мере требуемого периода, то есть, по меньшей мере части периода, в пределах всего культурального процесса во время ферментации.
[0254] Требуемый период в пределах всего культурального процесса во время ферментации обозначает период, в котором культивирование осуществляют при концентрации аммиака, которой управляют на определенной концентрации. Предпочтительно осуществлять управление во время периода, в котором осуществляют получение вещества. Например, когда способ по настоящему изобретению включает стадию пролиферации микроорганизма, обладающего способностью продуцировать вещество (фаза пролиферации), и стадию получения вещества (фаза получения вещества), концентрацией аммиака можно управлять на определенной концентрации в фазе получения вещества, и концентрацией аммиака можно управлять или не управлять на определенной концентрации в фазе пролиферации для пролиферации микроорганизма.
[0255] «Фаза пролиферации» обозначает этап, когда источник углерода в первую очередь используют для клеточного роста, то есть этап, когда микроорганизм пролиферирует логарифмически, который может представлять собой период в пределах 3 часов, предпочтительно 6 часов, более предпочтительно 10 часов от начала культивирования. «Фаза получения вещества» обозначает этап, когда источник углерода преимущественно используют для получения вещества, который может представлять собой период после 3 часов, предпочтительно после 6 часов, более предпочтительно после 10 часов от начала культивирования.
[0256] Определенный диапазон концентраций можно использовать как для способа осуществления культивирования при управлении концентрацией аммиака, чтобы она находилась в пределах определенного диапазона, так и для способа осуществления культивирования при управлении концентрацией аммиака, чтобы она была не выше, чем определенная концентрация.
[0257] Настоящее изобретение можно применять к способу культивирования, в котором бикарбонат-ионы и/или карбонат-ионы служат противоионами аминокислот (далее в настоящем документе это может быть описано как карбонатная ферментация). Когда получают основную аминокислоту, такую как L-лизин, получение можно осуществлять с помощью способа, в котором ферментацию осуществляют посредством управления давлением в ферментационном резервуаре, чтобы оно было положительным во время ферментации, или посредством подачи газообразного диоксида углерода или газовой смеси, содержащей газообразный диоксид углерода, в среду, чтобы обеспечивать период культивирования, в котором среда содержит 20 мМ или больше бикарбонат-ионов и/или карбонат-ионов с тем, чтобы эти бикарбонат-ионы и/или карбонат-ионы служили в качестве противоионов для катионов, преимущественно содержащих основную аминокислоту, и после чего собирают целевую основную аминокислоту (выложенная японская патентная заявка № 2002-65287, опубликованная заявка на патент США № 2002/0025564, EP 1813677 A).
[0258] Требуемый период в пределах всего культурального процесса во время ферментации в способе культивирования, в котором бикарбонат-ионы и/или карбонат-ионы служат в качестве противоионов основной аминокислоты, и сбора целевой основной аминокислоты конкретно не ограничен при условии, что достигают желаемой производительности, но, в частности, например, может составлять не меньше чем одна десятая, предпочтительно не меньше чем одна пятая от всего культурального процесса во время основной ферментации. Более конкретно, это может включать период, в котором pH среды возрастает из-за сокращения противоионов, таких как сульфат- и хлорид-ионы, используемые в среде, и при этом происходит накопление целевого основного вещества.
[0259] При карбонатной ферментации давлением в ферментационном резервуаре можно управлять, чтобы оно было положительным во время ферментации, и/или газообразный диоксид углерода или газовую смесь, которая содержит газообразный диоксид углерода, можно подавать в среду. Обе вышеуказанные операции предпочтительно осуществляют с тем, чтобы имел место период культивирования, где предпочтительно 20 мМ или больше, более предпочтительно 30 мМ или больше, особенно предпочтительно 40 мМ или больше бикарбонат-ионов и/или карбонат-ионов присутствует в среде. Внутреннее давление в ферментационном резервуаре, подаваемое количество газообразного диоксида углерода или газовой смеси, которая содержит газообразный диоксид углерода, или ограниченный объем подачи газа можно определять, например, посредством измерения бикарбонат-ионов или карбонат-ионов в среде, или pH или концентрации аммиака в среде.
[0260] В соответствии с карбонатной ферментацией возможно снижать pH среды с тем, чтобы количество бикарбонат-ионов и/или карбонат-ионов, присутствующих в среде, которые необходимы в качестве противоионов, составляло меньше того, которое используют в стандартных способах. Когда pH управляют с использованием аммиака, аммиак подают для того, чтобы увеличивать pH, и он может служить в качестве источника азота для основной аминокислоты. Примеры катионов, отличных от основной аминокислоты, в среде включают K, Na, Mg, Ca и т.д., которые происходят из компонентов среды. Они предпочтительно существуют в количестве 10% или меньше, предпочтительно 5% или меньше, более предпочтительно 2% или меньше от всех катионов.
[0261] Кроме того, во время ферментации в ферментационном резервуаре можно создавать положительное внутреннее давление, например, делая давление подаваемого газа выше, чем давление на выпуске. Делая внутреннее давление в ферментационном резервуаре положительным, газообразный диоксид углерода, образуемый посредством ферментации, растворяется в среде для культивирования для того, чтобы генерировать бикарбонат-ионы или карбонат-ионы, и они могут служить в качестве противоионов основной аминокислоты. Внутреннее давление в ферментационном резервуаре составляет, в частности, от 0,03 до 0,2 МПа, предпочтительно от 0,05 до 0,15 МПа, более предпочтительно от 0,1 до 0,3 МПа, в значениях манометрического давления (разность давлений относительно атмосферного давления). Кроме того, посредством подачи газообразного диоксида углерода или газовой смеси, которая содержит газообразный диоксид углерода, в среду для культивирования, газообразный диоксид углерода может растворяться в среде. Кроме того, при подаче газообразного диоксида углерода или газовой смеси, содержащей диоксид углерода, в среду, внутреннее давление в ферментационном резервуаре можно корректировать так, чтобы оно было положительным.
[0262] Внутреннее давление в ферментационном резервуаре можно корректировать так, чтобы оно было положительным, например, делая давление подаваемого газа выше, чем давление на выпуске. В частности, предпочтительно осуществлять культивирование при корректировке парциального давления кислорода выше, чем таковое у диоксида углерода. Кроме того, когда газообразный диоксид углерода подают в среду, например, среду можно барботировать чистым диоксидом углерода или газовой смесью, которая содержит 5% об. диоксида углерода или больше.
[0263] Указанные выше способы растворения бикарбонат-ионов и/или карбонат-ионов в среде можно использовать по отдельности, или два или более из них можно использовать в комбинации.
[0264] В стандартных способах достаточное количество сульфата аммония или хлорида аммония обычно добавляют в среду, чтобы служить в качестве противоанионов основной аминокислоты, подлежащей получению, а также в качестве питательного компонента в среду добавляют продукты расщепления белков серной кислотой или соляной кислотой и т.д. Следовательно, в среде присутствуют сульфат-ионы и хлорид-ионы, образуемые из них. Следовательно, концентрация слабокислых карбонат-ионов чрезвычайно низка во время культивирования, например, имеет порядок ч./млн. Приведенный выше вариант осуществления настоящего изобретения отличается тем, что снижены сульфат-ионы и хлорид-ионы, и газообразный диоксид углерода, высвобождаемый микроорганизмом во время ферментации, растворяется в среде в указанном выше ферментационном окружении и используется в качестве противоионов. Следовательно, в приведенном выше варианте осуществления настоящего изобретения не требуется добавлять сульфат-ионы или хлорид-ионы в среду в количестве большем, чем количество, необходимое для роста. Предпочтительно подходящее количество сульфата аммония или тому подобного добавляют в среду на раннем этапе культивирования, и добавление заканчивают в середине культивирования. Альтернативно, можно подавать сульфат аммония или тому подобное, при этом сохраняя баланс с растворенными в среде карбонат-ионами или бикарбонат-ионами. Кроме того, в качестве источника азота основной аминокислоты в среду можно подавать аммиак. Аммиак можно подавать в среду по отдельности или вместе с другими газами.
[0265] Более низкие концентрации анионов, отличных от бикарбонат-ионов и/или карбонат-ионов, в среде более предпочтительны при условии, что они присутствуют в количествах, которые необходимы для роста микроорганизма. Примеры таких анионов включают хлорид-ионы, сульфат-ионы, фосфат-ионы, ионизированные органические кислоты, гидроксид-ионы и так далее. Суммарная молярная концентрация этих других ионов обычно составляет предпочтительно 900 мМ или ниже, более предпочтительно 700 мМ или ниже, еще более предпочтительно 500 мМ или ниже, более предпочтительно 300 мМ или ниже, особенно предпочтительно 200 мМ или ниже.
[0266] Снижение количества сульфат-ионов и/или хлорид-ионов, подлежащего использованию, представляет собой одну из целей вышеприведенного варианта осуществления настоящего изобретения, и суммарное количество сульфат-ионов или хлорид-ионов или и тех и других, содержащихся в среде, обычно составляет 700 мМ или ниже, предпочтительно 500 мМ или ниже, более предпочтительно 300 мМ или ниже, еще более предпочтительно 200 мМ или ниже, особенно предпочтительно 100 мМ или ниже.
[0267] Если сульфат аммония добавляют в среду в качестве источника противоионов основной аминокислоты, газообразный диоксид углерода в среде для культивирования обычно устраняют с помощью сульфат-ионов. Однако в приведенном выше варианте осуществления настоящего изобретения нет необходимости добавлять избыточное количество сульфата аммония в среду, и, следовательно, газообразный диоксид углерода может легко растворяться в ферментационной среде.
[0268] Кроме того, в приведенном выше варианте осуществления настоящего изобретения предпочтительно управлять полной концентрацией аммиака в среде до такой степени, чтобы «не ингибировать продуцирование основной аминокислоты». Примеры условий для достижения такой цели включают, например, те, которые обеспечивают выход и/или производительность предпочтительно 50% или больше, более предпочтительно 70% или больше, особенно предпочтительно 90% или больше от выхода и/или производительности, достигаемых при оптимальных условиях. В частности, полная концентрация аммиака в среде составляет, например, 300 мМ или ниже, 250 мМ или ниже, 200 мМ или ниже, 100 мМ или ниже или 50 мМ или ниже. Степень диссоциации аммиака снижается с увеличением pH. Неионизированный аммиак более токсичен для бактерий, чем ионы аммония. Следовательно, верхний предел полной концентрации аммиака следует определять в зависимости от pH среды для культивирования. То есть с увеличением pH среды для культивирования происходит снижение приемлемой полной концентрации аммиака. Следовательно, указанную выше полную концентрацию аммиака, «которая не ингибирует продуцирование основной аминокислоты», предпочтительно определяют для каждого конкретного значения pH. Однако диапазон полной концентрации аммиака, которая приемлема при наивысшем уровне pH во время культивирования, можно использовать в качестве верхнего предела полной концентрации аммиака на всем протяжении всего периода культивирования.
[0269] С другой стороны, полная концентрация аммиака, который выполняет функцию источника азота, необходимого для роста микроорганизма и продуцирования основного вещества, конкретно не ограничена, и ее можно надлежащим образом определять при условии, что сниженный уровень источника азота, который может вести к непрерывному истощению аммиака во время культивирования, не снижает производительность микроорганизма по целевому веществу. Например, концентрацию аммиака можно измерять с течением времени во время культивирования, и если происходит истощение аммиака в среде, небольшое количество аммиака можно добавлять в среду. Несмотря на то, что полная концентрация аммиака после добавления аммиака конкретно не ограничена, полная концентрация аммиака может составлять, например, предпочтительно 1 мМ или выше, более предпочтительно 10 мМ или выше, особенно предпочтительно 20 мМ или выше.
[0270] Кроме того, при ферментации L-глутаминовой кислоты можно осуществлять культивирование с преципитацией L-глутаминовой кислоты в среде посредством использования жидкой среды, которую корректируют так, чтобы она имела условия, в которых происходит преципитация L-глутаминовой кислоты. Условия, в которых происходит преципитация L-глутаминовой кислоты, например, представляют собой pH от 5,0 до 4,0, предпочтительно от pH 4,5 до 4,0, более предпочтительно pH от 4,3 до 4,0, особенно предпочтительно pH 4,0 (публикация европейского патента № 1078989 A).
[Пример] [0271] Получение L-аргинина с использованием аппарата по настоящему изобретению
[0272] В этом примере представлен пример применения культивирования с управлением аммиаком, используя аппарат по настоящему изобретению для получения L-аргинина с помощью дифтериеподобной бактерии. В качестве L-аргинин-продуцирующего штамма использовали Corynebacterium glutamicum AJ12092 (FERM BP-6906).
[0273] Аппарат по настоящему изобретению, используемый в этом примере, имеет конфигурацию, которая описана далее.
Датчик 10 аммиака:
Датчик 10 аммиака содержит датчик с внутренним электродом с использованием проницаемой для аммиака мембраны и показывает изменение напряжения в ответ на неионизированный аммиак. Его вставляли в культуральный резервуар 200.
Аппарат 100 для управления аммиаком:
Использовали компьютер, который имеет накопительную часть 106, управляющую часть 103, сигнальную входную часть 108, соединенную с датчиком 10 аммиака, и управляющую выходную часть 104, соединенную с подающим аммиак устройством 300. Накопительная часть 106 хранит калибровочную кривую, которая представляет зависимость между концентрацией неионизированного аммиака в культуральном резервуаре 200, и напряжением, измеряемым с использованием датчика 10 аммиака. Управляющая часть 102 выполняет стадию вычисления концентрации аммиака по измерению напряжения с использованием датчика 10 аммиака и вычисление концентрации неионизированного аммиака в культуральном резервуаре 200 по напряжению с использованием калибровочной кривой, и стадию указания подачи аммиака, когда вычисляемая концентрация неионизированного аммиака ниже, чем заданная контрольная концентрация, которая указывает подающему аммиак устройству 300 подавать аммиак в культуральный резервуар 200.
Подающее аммиак устройство 300:
Подающее аммиак устройство 300 имеет контейнер, который содержит водный раствор сульфата аммония, и его располагают с тем, чтобы водный раствор сульфата аммония мог капать из контейнера в культуральный резервуар с использованием перистальтического насоса, и оно капает раствор с заданной скоростью капания на основании сигнала, посылаемого от аппарата 100 для управления аммиаком.
[0274] (1) Управление концентрацией аммиака при Arg ферментации, используя аппарат по настоящему изобретению
L-аргинин получали при управлении полной концентрацией аммиака, которая по существу снижается с ростом культуры, чтобы она была постоянной, с использованием аппарата по настоящему изобретению. При этом получении задавали условия трех типов 20 мМ, 100 мМ и 300 мМ в качестве концентрации, на которой следует управлять полной концентрацией аммиака в среде. 1 Н KOH капали в 300 мл среды для получения L-аргинина, показанной в таблице 1, которую содержали в ферментационном бак для того, чтобы корректировать pH среды до 6,9. Сульфат аммония смешивали со средой для получения L-аргинина с тем, чтобы начальная полная концентрация аммиака составляла 20 мМ, 100 мМ или 300 мМ. Штамм AJ12092 Corynebacterium glutamicum наносили на всю поверхность чашки с агаровой средой CM-Dex, приведенной в таблице 2, и культивировали при 31,5°C в течение 24 часов, и клетки, выращенные на агаровой среде одной чашки инокулировали в ферментационный бак. Культивирование осуществляли на скорости перемешивания 700 об./мин с поддержанием температуры 31,5°C и с аэрацией 300 мл/минута воздуха, дезинфицированного с использованием фильтра. pH среды, который по существу снижается с ростом культуры, поддерживали равным 6,9 посредством добавления 6 Н KOH. Кроме того, отдельно стерилизованный раствор глюкозы 692 г/л (содержащий 0,05 мл/л пеногасителя GD-113) соответствующим образом добавляли с тем, чтобы поддерживать концентрацию глюкозы в среде, которая по существу снижается с ростом культуры, равной приблизительно 40 г/л. Культивирование осуществляли в течение 52 часов. Когда концентрация неионизированного аммиака становилась ниже, чем заданное значение, водный раствор сульфата аммония автоматически капали с помощью аппарата по настоящему изобретению с тем, чтобы поддерживать заданную полную концентрацию аммиака, и тем самым управляли полной концентрацией аммиака, чтобы она была постоянной во время культивирования. В частности, концентрацию неионизированного аммиака в среде измеряли в реальном времени датчиком аммиака, вставленным в ферментационный бак, и отдельно стерилизованный водный раствор сульфата аммония 450 г/л автоматически капали в среду из подающего аммиак устройства с тем, чтобы поддерживать целевую полную концентрацию аммиака. Как результат, Arg ферментацию можно осуществлять при автоматическом поддержании целевой концентрации неионизированного аммиака и полной концентрации аммиака, как показано на фиг. 7, простым путем с использованием аппарата по настоящему изобретению. Для управления полной концентрацией аммиака, чтобы она составляла 20 мМ, 100 мМ и 300 мМ, водный раствор сульфата аммония 450 г/л капали со скоростью 0,77 мл/ч, 0,90 мл/ч и 1,30 мл/ч (средняя скорость за весь период культивирования), соответственно. Когда управляли полной концентрацией аммиака, чтобы она составляла 300 мМ, осуществляли проверку с использованием внешнего датчика аммиака и образца, собранного в середине культивирования (8 часов), и достаточно изменяли щелочность для превращения содержащихся ионов аммония в недиссоциированный аммиак.
[0275] С помощью результатов продемонстрировано, что при получении L-аминокислоты посредством ферментации, культивирование можно осуществлять при автоматическом управлении концентрацией аммиака в среде (концентрацией неионизированного аммиака и полной концентрацией аммиака), чтобы она была постоянной, чрезвычайно простым образом с использованием аппарата по настоящему изобретению.
[0276] (2) Усовершенствование производительности по Arg, обеспечиваемое использованием аппарата по настоящему изобретению
После этого сравнивали количество получаемого Arg, достигаемое при управлении полной концентрацией аммиака с использованием аппарата по настоящему изобретению, и то же, достигаемое посредством управления полной концентрацией аммиака с использованием обыкновенного ручного способа управления. Задавали полную концентрацию аммиака 300 мМ, которая представляла собой концентрацию, на которой следовало осуществлять управление. 1 Н KOH капали в 300 мл среды для получения L-аргинина, приведенной в таблице 1, которую содержали в ферментационном баке для того, чтобы корректировать pH среды до 6,9. Сульфат аммония смешивали в среде для получения L-аргинина с тем, чтобы начальная концентрация аммиака составляла 300 мМ. Штамм AJ12092 Corynebacterium glutamicum наносили на всю поверхность чашки с агаровой средой CM-Dex, приведенной в таблице 2, и культивировали при 31,5°C в течение 24 часов, и клетки, выращенные на агаровой среде одной чашки, инокулировали в ферментационный бак. Культивирование осуществляли при скорости перемешивания 700 об./мин с поддержанием температуры 31,5°C и при аэрации 300 мл/минута воздуха, дезинфицированного с использованием фильтра. pH среды, который по существу снижается с ростом культуры, поддерживали равным 6,9 посредством добавления 6 Н KOH. Кроме того, отдельно стерилизованный раствор глюкозы 692 г/л (содержащий 0,05 мл/л пеногасителя GD-113) соответствующим образом добавляли с тем, чтобы поддерживать концентрацию глюкозы в среде, которая по существу снижается с ростом культуры, равной приблизительно 40 г/л. Культивирование осуществляли в течение 52 часов. Полной концентрацией аммиака управляли способами двух типов, т.е. способом использования аппарата по настоящему изобретению подобно описанному в предыдущем разделе, и способом добавления вручную 3 мл водного раствора сульфата аммония 450 г/л, когда полная концентрация аммиака становилась ниже, чем заданная значения (контрольное значение). Как результат, когда использовали аппарат по настоящему изобретению, можно было автоматически управлять полной концентрацией аммиака. С другой стороны, когда полной концентрацией аммиака управляли вручную, водный раствор сульфата аммония добавляли вручную 17 раз во время культивирования в течение 52 часов. Кроме того, как показано на фиг. 8, когда использовали аппарат по настоящему изобретению, происходило накопление аргинина в более высокой концентрации по сравнению со случаем, когда полной концентрацией аммиака управляли вручную. Кроме того, что касается полного количества получаемого аргинина, в случае использования аппарата по настоящему изобретению получали 11,1 г аргинина, тогда как в случае ручного управления получали 9,5 г аргинина.
[0277] Проверку с использованием внешнего датчика аммиака осуществляли, используя среду для культивирования, собранную в середине культивирования (8 часов), и достаточно изменяли щелочность для превращения содержащихся ионов аммония в недиссоциированный аммиак.
[0278] С помощью результатов демонстрировали, что при получении L-аминокислоты посредством ферментации культивирование можно осуществлять при автоматическом управлении концентрацией аммиака в среде (концентрацией неионизированного аммиака и полной концентрацией аммиака), чтобы она была постоянной, чрезвычайно простым образом и, кроме того, также можно усовершенствовать способность продуцировать L-аминокислоты, используя аппарат по настоящему изобретению.
[0279]
| Таблица 1 Среда для получения L-аргинина |
|||
| Для начальной концентрации аммиака 20 мМ | Для начальной концентрации аммиака 100 мМ | Для начальной концентрации аммиака 300 мМ | |
| Глюкоза | 40 г/л | 40 г/л | 40 г/л |
| Гидролизат соевого белка (6,57 мл/л гидролизата, который имеет 35 г/л азота по массе) | 0,23 г/л (в пересчете на массу азота) |
0,23 г/л (в пересчете на массу азота) |
0,23 г/л (в пересчете на массу азота) |
| KH2PO4 | 1,00 г/л | 1,00 г/л | 1,00 г/л |
| (NH4)2SO4 | 1,32 г/л | 6,6 г/л | 19,8 г/л |
| MgSO4⋅7H2O | 0,40 г/л | 0,40 г/л | 0,40 г/л |
| FeSO4⋅7H2O | 10 мг/л | 10 мг/л | 10 мг/л |
| MnSO4⋅5H2O | 10 мг/л | 10 мг/л | 10 мг/л |
| Гидрохлорид тиамина | 0,5 мг/л | 0,5 мг/л | 0,5 мг/л |
| Биотин | 0,5 мг/л | 0,5 мг/л | 0,5 мг/л |
| GD-113 (пеногаситель) | 0,05 мл/л | 0,05 мл/л | 0,05 мл/л |
pH среды корректировали до 6,0 с использованием водного раствора KOH и автоклавировали при 120°C в течение 20 минут.
[0280]
| Таблица 2 Агаровая среда CM-Dex |
||
| Глюкоза | 5,0 | г/л |
| Полипептон | 10,0 | г/л |
| Дрожжевой экстракт | 10,0 | г/л |
| KH2PO4 | 1,0 | г/л |
| MgSO4⋅7H2O | 0,4 | г/л |
| FeSO4⋅7H2O | 10,0 | мг/л |
| MnSO4⋅5H2O | 10,0 | мг/л |
| Мочевина | 3,0 | г/л |
| Гидролизат соевого белка | 1,2 | г/л |
| (34,3 мл/л гидролизата, который содержит 35 г/л азота по массе) | (в пересчете на массу азота) | |
| Биотин | 10,0 | мкг/л |
| Агар | 20,0 | г/л |
pH среды корректировали до 7,5 с использованием водного раствора KOH и автоклавировали при 120°C в течение 20 минут. После автоклавирования среду выливали в чашку Петри, и она образовывала гель.
[0281] С помощью результатов демонстрировали, что при получении L-аминокислоты посредством ферментации культивирование можно осуществлять при управлении концентрацией аммиака в среде, чтобы она была постоянной, чрезвычайно простым образом, используя аппарат по настоящему изобретению.
Промышленная применимость
[0282] Как подробно изложено выше, в соответствии с настоящим изобретением, культивирование можно осуществлять при непрерывном и произвольном управлении концентрацией аммиака в среде для культивирования, и, следовательно, его можно использовать в области химической промышленности, включая микробиологическую промышленность и так далее.
Описание номеров позиций
[0283] 100 Аппарат для управления аммиаком
102 Управляющая часть
102a Часть создания калибровочной кривой
102b Часть вычисления концентрации неионизированного аммиака
102c Часть измерения значения pH
102d Часть вычисления полной концентрации аммиака
102e Часть указания подачи аммиака
102f Часть измерения напряжения для проверки
102g Проверяющая часть
104 Управляющая выходная часть
106 Накопительная часть
106a Файл кривой диссоциации аммиака
106b Файл калибровочной кривой
106c Файл концентрации неионизированного аммиака
106d Файл значений pH
106e Файл полной концентрации аммиака
108 Сигнальная входная часть
10 Датчик аммиака
11, 13 NH3 усилитель
12 Внешний датчик аммиака
20 Датчик pH
21 pH усилитель
200 Культуральный резервуар
300 Подающее аммиак устройство
30 Аммиачный резервуар
31 Переключатель
32 Клапан
1. Способ получения основной аминокислоты посредством ферментации, который включает культивирование микроорганизма, обладающего способностью продуцировать основную аминокислоту в культуральном резервуаре, содержащем среду для культивирования, и сбор основной аминокислоты из культуры, причем микроорганизм культивируют при управлении концентрацией аммиака среды для культивирования с помощью способа управления аммиаком для управления концентрацией аммиака среды для культивирования, содержащейся в культуральном резервуаре, причем концентрацией аммиака в культуральном резервуаре управляют посредством использования аппарата для управления аммиаком, который содержит по меньшей мере подающее аммиак устройство, которое подает аммиак в культуральный резервуар, датчик аммиака, который реагирует на неионизированный аммиак в среде для культивирования, содержащейся в культуральном резервуаре, и управляющую часть, соединенную с подающим аммиак устройством и датчиком аммиака, и этот способ включает следующие стадии, осуществляемые с помощью управляющей части:
стадия вычисления концентрации неионизированного аммиака для вычисления концентрации неионизированного аммиака в культуральном резервуаре посредством подстановки сигнала от датчика аммиака в калибровочную кривую, представляющую собой зависимость между концентрацией неионизированного аммиака в культуральном резервуаре и сигналом от датчика аммиака, и
стадия указания подачи аммиака для указания подающему аммиак устройству подавать аммиак в культуральный резервуар, когда вычисляемая концентрация неионизированного аммиака ниже, чем заданная концентрация.
2. Способ по п. 1, в котором целевое вещество представляет собой основную аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из L-лизина, L-аргинина и L-гистидина.
3. Способ по п. 1 или 2, который включает снижение количества сульфат-ионов и/или хлорид-ионов, используемых в качестве противоионов основной аминокислоты, посредством регулирования полной концентрации аммиака в среде для культивирования, чтобы она находилась в пределах диапазона концентраций аммония, составляющей 300 мМ или ниже во время по меньшей мере части всего процесса культивирования.
4. Способ по п. 3, в котором диапазон концентраций аммония составляет 200 мМ или ниже.
5. Способ по п. 3, в котором диапазон концентраций аммония составляет 100 мМ или ниже.
6. Способ по п. 1 или 2, в котором способ управления аммиаком дополнительно включает стадию создания калибровочной кривой для создания калибровочной кривой, представляющей собой зависимость между концентрацией неионизированного аммиака в культуральном резервуаре и сигналом от датчика аммиака.
7. Способ управления аммиаком по п. 1 или 2, в котором аппарат для управления аммиаком дополнительно соединяют с датчиком pH для измерения значения pH среды для культивирования, содержащейся в культуральном резервуаре,
этот способ дополнительно включает следующую стадию, выполняемую с помощью управляющей части:
стадия вычисления полной концентрации аммиака для вычисления полной концентрации аммиака по концентрации неионизированного аммиака, вычисляемой на стадии вычисления концентрации неионизированного аммиака, и значению pH, измеряемому датчиком pH, на основании предварительно созданной кривой диссоциации аммиака для среды культивирования, представляющей собой существующее соотношение концентрации неионизированного аммиака и концентрации ионов аммония в среде для культивирования, содержащейся в культуральном резервуаре, при каждом значении pH, и
причем на стадии указания подачи аммиака полную концентрацию аммиака используют взамен концентрации неионизированного аммиака.
8. Способ по п. 7, в котором способ управления аммиаком включает предоставление внешнего датчика аммиака вне культурального резервуара для измерения концентрации неионизированного аммиака, и
получение сигнала от внешнего датчика аммиака посредством измерения концентрации неионизированного аммиака среды для культивирования, которую после сбора из культурального резервуара делают достаточно щелочной для превращения иона аммония в неионизированный аммиак с использованием внешнего датчика аммиака в качестве сигнала для проверки и
этот способ дополнительно включает следующую стадию, выполняемую с помощью управляющей части:
проверочная стадия для проверки калибровочной кривой с тем, чтобы концентрация неионизированного аммиака, вычисляемая по сигналу для проверки на основании калибровочной кривой, составляла полную концентрацию аммиака, вычисляемую на стадии вычисления полной концентрации аммиака.
9. Способ управления аммиаком по п. 8, в котором аппарат для управления аммиаком соединяют с внешним датчиком аммиака, и
этот способ дополнительно включает следующую стадию, выполняемую с помощью управляющей части:
стадия ввода сигнала для проверки для ввода сигнала от внешнего датчика аммиака в качестве сигнала для проверки.
10. Способ получения основной аминокислоты посредством ферментации, который включает культивирование микроорганизма, обладающего способностью продуцировать основную аминокислоту в культуральном резервуаре, содержащем среду для культивирования, чтобы продуцировать и накапливать основную аминокислоту в среде для культивирования, причем полную концентрацию аммиака среды для культивирования регулируют так, чтобы она находилась в определенном диапазоне концентраций во время по меньшей мере части всего процесса культивирования с использованием аппарата для управления аммиаком, который содержит по меньшей мере подающее аммиак устройство, которое подает аммиак в культуральный резервуар, датчик аммиака и управляющую часть, причем:
датчик аммиака реагирует на неионизированный аммиак в среде для культивирования, содержащейся в культуральном резервуаре,
управляющая часть соединена с подающим аммиак устройством и датчиком аммиака,
управляющая часть создает калибровочную кривую, которая представляет собой зависимость между концентрацией неионизированного аммиака среды для культивирования и сигналом от датчика аммиака,
вычисляет концентрацию неионизированного аммиака среды для культивирования посредством подстановки сигнала от датчика аммиака в калибровочную кривую, и
указывает подающему аммиак устройству подавать аммиак в культуральный резервуар, когда вычисляемая концентрация неионизированного аммиака ниже, чем заданная концентрация.
11. Способ по п. 10, в котором целевое вещество представляет собой основную аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из L-лизина, L-аргинина и L-гистидина.
12. Способ по п. 10 или 11, который включает снижение количества сульфат-ионов и/или хлорид-ионов, используемых в качестве противоионов основной аминокислоты, посредством регулирования полной концентрации аммиака в среде для культивирования, чтобы она находилась в пределах диапазона концентраций аммония, составляющей 300 мМ или ниже во время по меньшей мере части всего процесса культивирования.
13. Способ по п. 12, в котором диапазон концентраций аммония составляет 200 мМ или ниже.
14. Способ по п. 12, в котором диапазон концентраций аммония составляет 100 мМ или ниже.
15. Способ по пп.10-11, 13-14, в котором аппарат для управления аммиаком дополнительно соединяют с датчиком pH для измерения значения pH среды для культивирования, содержащейся в культуральном резервуаре, и
причем управляющая часть дополнительно вычисляет полную концентрацию аммиака по вычисляемой концентрации неионизированного аммиака и значению pH, измеряемому датчиком pH, на основании предварительно созданной кривой диссоциации аммиака для среды для культивирования, представляющей существующее соотношение концентрации неионизированного аммиака и концентрации ионов аммония в среде для культивирования, при каждом значении pH, и
полную концентрацию аммиака используют вместо концентрации неионизированного аммиака.
16. Способ по п. 14, в котором управляющая часть дополнительно проверяет калибровочную кривую с тем, чтобы концентрация неионизированного аммиака, вычисляемая по сигналу для проверки на основании калибровочной кривой, составляла полную концентрацию аммиака, вычисляемую с помощью средства вычисления полной концентрации аммиака, и
сигнал для проверки представляет собой:
сигнал, получаемый с использованием внешнего датчика аммиака, предусмотренного снаружи культурального резервуара, для измерения концентрации неионизированного аммиака посредством подготовки внешнего датчика аммиака и
измерения концентрации неионизированного аммиака среды для культивирования, которую после сбора из культурального резервуара делают достаточно щелочной для превращения иона аммония в неионизированный аммиак, с использованием внешнего датчика аммиака.
17. Способ по п. 15, в котором аппарат для управления аммиаком соединен с внешним датчиком аммиака, и
причем управляющая часть дополнительно вводит сигнал от внешнего датчика аммиака в качестве сигнала для проверки.
18. Способ по пп. 10-11, 13-14, в котором аппарат для управления аммиаком выполнен с возможностью поддерживать полную концентрацию аммиака в заданном диапазоне.
19. Способ по пп. 10-11, 13-14, в котором аппарат для управления аммиаком дополнительно содержит пользовательский интерфейс.
20. Способ по пп. 10-11, 13-14, в котором аппарат для управления аммиаком выполнен с возможностью управления аммиаком в среде для культивирования в реальном времени.
21. Способ по пп. 10-11, 13-14, в котором аппарат для управления аммиаком выполнен с возможностью управления аммиаком в среде для культивирования одного или более культуральных резервуаров.
22. Способ по пп. 10-11, 13-14, в котором аппарат для управления аммиаком выполнен с возможностью управления аммиаком в среде для культивирования с интервалами 5 минут или меньше.
23. Способ по п.15, в котором аппарат для управления аммиаком выполнен с возможностью проверки калибровочной кривой с интервалами 12 часов или меньше.
24. Способ по пп.10-11, 13-14 в котором аппарат для управления аммиаком выполнен с возможностью управления аммиаком в течение по меньшей мере части периода культивирования или всего периода культивирования.
