Способ хемогенетической регистрации и коррекции нейрогенеза на основе генетических конструкций для трансфекции астроцитов и нейронов



Способ хемогенетической регистрации и коррекции нейрогенеза на основе генетических конструкций для трансфекции астроцитов и нейронов
Способ хемогенетической регистрации и коррекции нейрогенеза на основе генетических конструкций для трансфекции астроцитов и нейронов
Способ хемогенетической регистрации и коррекции нейрогенеза на основе генетических конструкций для трансфекции астроцитов и нейронов

 

C12N15/00 - Получение мутаций или генная инженерия; ДНК или РНК, связанные с генной инженерией, векторы, например плазмиды или их выделение, получение или очистка; использование их хозяев (мутанты или микроорганизмы, полученные генной инженерией C12N 1/00,C12N 5/00,C12N 7/00; новые виды растений A01H; разведение растений из тканевых культур A01H 4/00; новые виды животных A01K 67/00; использование лекарственных препаратов, содержащих генетический материал, который включен в клетки живого организма, для лечения генетических заболеваний, для генной терапии A61K 48/00 пептиды вообще C07K)

Владельцы патента RU 2630654:

Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Балтийский федеральный университет имени Иммануила Канта" (БФУ им. И. Канта) (RU)

Изобретение относится к медицине. Изобретение представляет собой способ хемогенетической регистрации и коррекции нейрогенеза на основе генетических конструкций для трансфекции астроцитов и нейронов, при котором используют химическое соединение, обладающее активностью стимуляции и образования нервной ткани и/или ингибирования дегенерации нейронов, где разрабатывают генетические конструкции на основе лентивирусного вектора для специфической трансфекции астроцитов и нейронов, приведенных на фиг. 2 и фиг. 3, обладающие возможностью стимулировать или ингибировать экспрессию таргетных генов в популяциях астроцитов и нейронов, а также экспрессировать в них флуоресцентный маркер. Изобретение позволяет осуществлять клеточно-специфическую трансфекцию различных популяций клеток нервной ткани, в частности астроцитов и нейронов с целью ингибирования и/или активирования нейрогенеза, а также осуществлять визуализацию in vitro трансфецированных клеток за счет встраивания в разрабатываемую генетическую конструкцию флуоресцентных маркеров. 3 ил.

 

Изобретение относится к области молекулярной биологии для регистрации и коррекции нейрогенеза посредством специфической трансфекции клеток астроглии с целью таргентного контроля внутриклеточных каскадов, в частности, для исследования нейродегенеративных заболеваний, а также может быть использовано в области медицины для терапии нейродегенеративных заболеваний.

Известно изобретение «Способ и композиция для стимуляции нейрогенеза и ингибирования дегенерации нейронов» (патент РФ №2440346), содержащее сходное с используемым в заявленном способе химическое соединение, обладающее способностью к стимуляции нейрогенеза и (или) ингибированию нейрональной дегенерации.

Недостатком этого способа является то, что с помощью описанного в нем химического соединения не представляется возможным стимулировать или ингибировать экспрессию таргетных генов в популяциях нейронов мозга, а также экспрессировать в нейронах флуоресцентный маркер.

Наиболее близким по технической сущности заявляемому способу, выбранному в качестве прототипа, является «Способ и композиция для стимуляции нейрогенеза и ингибирования дегенерации нейронов» (патент РФ №2440346 20.01.2012), при котором используется химическое соединение, обладающее активностью стимуляции образования нервной ткани и (или) ингибирования дегенерации нейронов.

Недостатком этого способа является отсутствие возможности стимуляции или ингибирования экспрессии таргетных генов в популяциях астроцитов и нейронов мозга, а также экспрессии в нейронах флуоресцентного маркера.

Задачей заявляемого изобретения является реализация механизма таргентного контроля внутриклеточных каскадов в астроцитах с целью стимулирования нейрогенеза и (или) ингибирования нейрональной дегенерации, в частности, для исследования нейродегенеративных заболеваний путем специфической трансфекции клеток астроглии и нейронов генетическими конструкциями, позволяющими визуализировать отдельные типы клеток головного мозга с помощью флуоресцентных маркеров.

Поставленная задача решается тем, что в способе хемогенетической регистрации и коррекции нейрогенеза на основе генетических конструкций для трансфекции астроцитов и нейронов, при котором используют химическое соединение, обладающее активностью стимуляции и образования нервной ткани и (или) ингибирования дегенерации нейронов, согласно изобретению, разрабатывают генетические конструкции на основе лентивирусного вектора для специфической трансфекции астроцитов и нейронов, обладающие возможностью стимулировать или ингибировать экспрессию таргетных генов в популяциях астроцитов и нейронов, а также экспрессировать в них флуоресцентный маркер.

Для эффективного ингибирования экспрессии таргетных генов предусмотрено встраивание в последовательность генетической конструкции клеточно-специфических промоторов, обеспечивающих синтез интересующих генов только в определенном типе клеток.

Для управляемого стимулирования нейрогенеза и (или) ингибирования таргетных генов предусмотрено встраивание в последовательность генетической конструкции генов, экспрессия которых активируется под воздействием химических стимулов, что, в свою очередь, приводит к повышению концентрации определенных веществ, оказывающих влияние на выделение глиотрансмиттеров, которые, в свою очередь, оказывают влияние на жизнедеятельность нейронов и нерогенез, в частности, а также обеспечивающих возможность визуализировать отдельные клетки головного мозга за счет флуоресцирования.

Причем в наиболее близком по технической сущности заявляемому способу используется химическое соединение, отличное по своему строению от вирусного вектора и не способное встраивается в геном клеток мозга.

На фиг. 1 представлено схематическое изображение генетической конструкции на основе лентивирусного вектора, специфически трансфецирующего астроциты и (или) нейроны. Генетическая конструкция содержит:

LTR - длинный терминальный повтор лентивируса;

GAL4 - химерный трансактиватор, состоящий части трансактиваторного домена мышиного белка NF-κBp65, слитого с ДНК-связывающим доменом белка дрожжей GAL4;

CMV - минимальный промотор цитомегаловируса человека;

GFAP - компактный промотор глиального фибриллярного кислого белка;

SYN - промотор человеческого синапсина-1;

Case12 - зеленый флуоресцентный Са2+-чувствительный белок;

WPRE - посттранскрипционный регуляторный элемент вируса гепатита сурка.

На фиг. 2 представлено схематическое изображение генетической конструкции для специфической трансфекции астроцитов. Генетическая конструкция LVV-Astro-Case12 содержит:

5' LTR (1-25) - длинный терминальный повтор лентивируса;

RRE - rev-отвечающий элемент;

GAL4 - химерный трансактиватор, состоящий из части трансактиваторного домена мышиного белка NF-κBp65, слитого с ДНК-связывающим доменом белка дрожжей GAL4;

CMV - промотор цитомегаловируса человека;

GFAP - укороченный промотор клеточно-специфического маркера глиального фибриллярного кислого белка (астроцит-специфичный промотор);

Case12 - зеленый флуоресцентный Са2+-чувствительный белок;

MCS - сайт множественного клонирования;

WPRE - посттранскрипционный регуляторный элемент вируса гепатита сурка;

11781 bp - длина последовательности плазмиды, равная 11781 нуклеотиду.

На фиг. 3 представлено схематическое изображение генетической конструкции для специфической трансфекции астроцитов. Генетическая конструкция LVV-Neuron-EGFP содержит:

RRE - rev-отвечающий элемент;

GAL4 - химерный трансактиватор, состоящий из части трансактиваторного домена мышиного белка NF-κBp65, слитого с ДНК-связывающим доменом белка дрожжей GAL4;

CMV - промотор цитомегаловируса человека;

SYN - промотор человеческого синапсина-1 (нейрон-специфичный промотор);

EGFP - зеленый флуоресцентный белок; MCS - сайт множественного клонирования;

WPRE - посттранскрипционный регуляторный элемент вируса гепатита сурка;

11100 bp - длина последовательности плазмиды, равная 11100 нуклеотидам.

Способ осуществляется следующим образом.

Заявленный способ основан на использовании клеточно-специфического промотора для управления одновременной экспрессией нужного трансгена и сильного искусственного активатора транскрипции для усиления транскрипции посредством связывания специфических сайтов связывания, введенных в последовательность промотора. Таким образом, задействуют два клеточно-специфических промотора: один для транскрипции интересующего трансгена, другой для экспрессии трансактиватора.

Используемые генетические конструкции представляют собой разнонаправленную лентивирусную векторную систему, содержащую усиленные в части транскрипционной активности промотор человеческого синапсина-1 (SYN, клеточно-специфический промотор для нейронов) и промотор компактного глиального фибриллярного кислого белка (GFAP, клеточно-специфический промотор для астроцитов), а также в противоположной ориентации промотор, полученный из цитомегаловируса человека (CMV), расположенный в нуклеотидной последовательности выше клеточно-специфических промоторов. Таким образом, создают синтетические разнонаправленные промоторы, фланкированные двумя генами экспрессионной кассеты. Искусственный активатор транскрипции транскрибирует 5'-конец кассеты. Последовательность кассеты, расположенная по ходу транскрипции, управляет синтезом интересующего гена.

Генетическая конструкция для специфической трансфекции астроцитов (Фиг. 2) построена с использованием лентивирусного вектора на основе самоинактивированного ВИЧ и включает, по меньшей мере,

rev-отвечающий элемент (RRE),

химерный трансактиватор, состоящий из части трансактиваторного домена мышиного белка NF-κBp65, слитого с ДНК-связывающим доменом белка дрожжей GAL4 (GAL4),

промотор цитомегаловируса человека (CMV) в противоположной ориентации,

укороченный промотор клеточно-специфического маркера глиального фибриллярного кислого белка (GFAP) для трансфекции астроцитов,

генетически кодируемый кальциевый индикатор - Case12 в качестве маркерного гена,

сайт множественного клонирования (MCS),

посттранскрипционный регуляторный элемент вируса гепатита сурка (WPRE) для повышения титра вектора и улучшения экспрессии трансгена.

Генетическая конструкция для специфической трансфекции нейронов (Фиг. 3) построена с использованием лентивирусного вектора на основе самоинактивированного ВИЧ и включает, по меньшей мере,

rev-отвечающий элемент (RRE),

химерный трансактиватор, состоящий части трансактиваторного домена мышиного белка NF-κBp65, слитого с ДНК-связывающим доменом белка дрожжей GAL4 (GAL4),

промотор цитомегаловируса человека (CMV) в противоположной ориентации,

промотор человеческого синапсина-1 (SYN) для специфической трансфекции нейронов,

флуоресцентный белок - EGFP в качестве маркерного гена,

сайт множественного клонирования (MCS),

посттранскрипционный регуляторный элемент вируса гепатита сурка (WPRE) для повышения титра вектора и улучшения экспрессии трансгена.

Продуцирование генетических конструкций осуществляется в культуре клеток HEK293FT посредством транзиентной котрансфекции сконструированной генетической конструкции, упаковочного вектора pNHP и плазмиды pHEF-VSVG, кодирующей оболочку.

Трансфецирование культур первичных астроцитов и нейронов, полученных из трехдневных крысят и выращиваемых для астроцитов - на модифицированной Дульбекко среде Игла (DMEM) (с 4,5 г/л глюкозы, глутамином, и пируватом) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки, для нейронов - на модифицированной Дульбекко среде Игла (DMEM) (с 4,5 г/л глюкозы, глутамином, и пируватом) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки и 5% лошадиной сыворотки, осуществляют следующим образом: за день до трансфекции клетки высеивали в 24-луночные культуральные планшеты с плотностью клеток 5×104 на лунку и инкубировали в течение 8-14 часов, после чего астроциты и нейроны трансфецировали разработанными генетическими конструкциями (каждая культура соответствующей конструкцией) в присутствии полибрена (8 мкг/мл), промывали фосфатным буфером и культивировали в течение 40-52 часов в среде DMEM.

Использование заявленного изобретения позволяет осуществлять клеточно-специфическую трансфекцию различных популяций клеток нервной ткани, в частности, астроцитов и нейронов с целью ингибирования и (или) активирования нейрогенеза, а также осуществлять визуализацию in vitro трансфецированных клеток за счет встраивания в разрабатываемую конструкцию флуоресцентных маркеров.

Способ хемогенетической регистрации и коррекции нейрогенеза на основе генетических конструкций для трансфекции астроцитов и нейронов, при котором используют химическое соединение, обладающее активностью стимуляции и образования нервной ткани и/или ингибирования дегенерации нейронов, отличающийся тем, что разрабатывают генетические конструкции на основе лентивирусного вектора для специфической трансфекции астроцитов и нейронов, приведенных на фиг. 2 и фиг. 3, обладающие возможностью стимулировать или ингибировать экспрессию таргетных генов в популяциях астроцитов и нейронов, а также экспрессировать в них флуоресцентный маркер.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области биохимии, в частности к способу получения синтетической CG-богатой генетической последовательности для синтеза гетерологичных белков.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к гуманизированному антителу, которое связывается с эпитопом С3 компонента комплемента человека. Также раскрыты ДНК, кодирующая указанное антитело, экспрессионный вектор, для экспрессии указанного антитела, а также штамм клеток яичников китайского хомячка, который продуцирует указанное антитело.

Настоящее изобретение относится к биохимии, в частности к способу стимуляции ангиогенеза в ишемизированных тканях и комбинированному лекарственному средству для его осуществления.

Настоящее изобретение относится к области биохимии, биотехнологии и молекулярной биологии, в частности к способу увеличения эффективности проникновения ДНК в митохондрии эукариотических клеток.

Изобретение относится к биотехнологии. Описана Фармацевтическая композиция для профилактики или лечения заболевания, связанного с hsp47, содержащая носитель для лекарственного средства и двухнитиевую молекулу нуклеиновой кислоты, где носитель для лекарственного средства содержит ретиноид и липид, где двухнитевая молекула нуклеиновой кислоты содержит структуру:5' (N)x-Z 3' (антисмысловая нить)3' Z'-(N')y-z'' 5' (смысловая нить),где каждый N и N' представляет собой нуклеотид, который является немодифицированным или модифицированным или нестандартной составляющей.

Настоящее изобретение относится к биохимии, в частности к одноцепочечной молекуле нуклеиновой кислоты, которая подавляет экспрессию целевого гена. Указанная молекула в порядке от 5’-конца к 3’-концу содержит 5’-концевой участок Xc, линкерный участок Lx, внутренний участок Z, линкерный участок Ly и 3’-концевой участок Yc.

Изобретение относится к биохимии. Описан способ перепрограммирования клетки в менее дифференцированное состояние, включающий культивирование дифференцированной клетки в среде для перепрограммирования, содержащей альбумин, где альбумин обработан ионообменной смолой или древесным углем, трансфицирование клетки одной или более синтетических молекул РНК, где указанные одна или более синтетических молекул РНК включают по меньшей мере одну молекулу РНК, кодирующую один или более факторов перепрограммирования, и где указанное трансфицирование приводит к получению клетки, экспрессирующей один или более факторов перепрограммирования; и повторение стадии (b) по меньшей мере дважды в течение 5 последовательных дней с получением клетки, перепрограммированной в менее дифференцированное состояние.

Группа изобретений относится к области биотехнологии. Представлены способы повышения экспрессии гена сиалидазы 4 (NEU4) с использованием олигонуклеотида, который специфически связывается с природным антисмысловым полинуклеотидом для гена NEU4.

Изобретение относится к области биохимии. Предложена молекула двухцепочечной малой интерферирующей нуклеиновой кислоты (миНК) для ингибирования экспрессии вируса гепатита В (HBV).

Изобретение относится к области биохимии, в частности к способу получения безмаркерных трансгенных растений каланхоэ, экспрессирующих ген цекропина P1. Изобретение позволяет создавать биобезопасные лекарственные растения каланхоэ с высоким уровнем накопления целевого продукта и в сокращенные по времени сроки.

Изобретение относится к области биохимии и генетики растений. Предлагается способ молекулярно-генетической идентификации растений ивы на основе микросателлитных (SSR) маркеров, который включает в себя выделение ДНК из исследуемых образцов, проведение ПЦР, электрофоретическое разделение продуктов амплификации ДНК, документирование результатов ПЦР, определение длин амплифицированных фрагментов ДНК путем сравнения со стандартами молекулярной массы, получение таблицы многолокусных генотипов по микросателлитным локусам и сравнение полученных генотипов с генотипами исходных растений. Способ позволяет установить идентичность особей и оценить вероятность встречаемости мультилокусных генотипов и случайного совпадения неродственных или родственных особей. Изобретение также позволяет осуществлять надежную и достоверную идентификацию генотипов ивы на индивидуальном уровне и может быть использовано для широкого спектра видов рода Salix, являясь, таким образом, универсальным. 2 з.п. ф-лы, 4 ил., 3 табл.

Изобретение относится к биохимии. Описана двухцепочечная рибонуклеиновая кислота (дцРНК) для ингибирования экспрессии гена АРОС3, где указанная дцРНК содержит (а) смысловую цепь, состоящую из нуклеотидной последовательности GcuuAAAAGGGAcAGuAuudTsdT, и антисмысловую цепь, состоящую из нуклеотидной последовательности AAuACUGUCCCUUUuAAGCdTsdT; (b) смысловую цепь, состоящую из нуклеотидной последовательности GCUUAAAAGGGACAGUAUUdTsdT, и антисмысловую цепь, состоящую из нуклеотидной последовательности AAUACUGUCCCUUUUAAGCdTsdT, (c) смысловую цепь, состоящую из нуклеотидной последовательности GfcUfuAfaAfaGfgGfaCfaGfuAfuUfdTsdT, и антисмысловую цепь, состоящую из нуклеотидной последовательности aAfuAfcUfgUfcCfcUfuUfuAfaGfcdTsdT, или (d) смысловую цепь, состоящую из нуклеотидной последовательности GcuuAAAAGGGAcAGuAuudTsdT, и антисмысловую цепь, состоящую из нуклеотидной последовательности AAuACuGUCCCuuuuAagcdTsdT, где нуклеотиды, обозначенные строчными буквами, представляют собой 2'-О-метилнуклеотиды; Gf, Af, Uf и Cf представляют собой 2'-фторнуклеотиды; и s представляет собой фосфоротиоатную связь. Также описана фармацевтическая композиция для ингибирования экспрессии гена АРОС3, содержащая указанную дцРНК. Представлены способы ингибирования экспрессии АРОС3 в клетке и лечения нарушения, опосредованного экспрессией АРОС3, включающие использование указанной дцРНК. Изобретение расширяет арсенал средств, предназначенных для лечения нарушения, опосредованного экспрессией АРОС3. 4 н. и 8 з.п. ф-лы, 4 ил., 12 табл., 7 пр.

Изобретение относится к области биотехнологии и медицины. Описан способ химической модификации антитромбинового аптамера и к получения нового антитромбинового аптамера, обладающего антикоагулянтными свойствами и пролонгированной антитромботической активностью. В изобретении описан аптамерный ДНК олигонуклеотид, специфически связывающийся с тромбином и характеризующийся нуклеотидной последовательностью общей формулы GGTTGGTGTGGTTGGTGGTTGGTGTGGTTGG, в котором по крайней мере один из нуклеотидов модифицирован для возможности связывания с молекулой полиэтиленгликоля и увеличения времени нахождения данного олигонуклеотида в кровотоке. В предпочтительных вариантах изобретения модификация произведена по тиминам в позициях 7, 9, 16, 23 и/или 25. Модифицированный аптамер обладает улучшенными фармакокинетическими параметрами, низкой токсичностью и высоким сродством к тромбину человека. Изобретение может быть использовано в качестве антикоагулянтного и антитромботического лекарственного средства для профилактики или лечения тромбозов различной природы. 4 н. и 7 з.п. ф-лы, 5 ил., 2 пр.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к способу получения безмаркерных трансгенных растений каланхоэ перистого, экспрессирующих ген цекропина Р1. Изобретение обеспечивает получение и тестирование безмаркерных растений каланхоэ с повышенными антибиотическими свойствами за короткий промежуток времени для использования в фармакологии и медицине. 8 з.п. ф-лы, 4 ил., 1 табл., 12 пр.

Изобретение относится к области биотехнологии и рыбоводства и касается способа получения ДНК из яйцеклеток рыб. Представленный способ включает пробоподготовку и выделение ДНК. В процессе пробоподготовки яйцеклетки осеменяют генетически инактивированной спермой для получения гиногенетических эмбрионов, из которых после вылупления выделяют ДНК. Перед инактивацией сперму разбавляют 0,9%-ным раствором хлорида натрия в соотношении 1:12, инактивацию проводят УФ-излучением в дозе 300 Дж/м2, а выделение ДНК осуществляют методом солевой экстракции путем лизиса образца в гомогенизационном буфере с протеиназой К с дальнейшим встряхиванием с хлоридом натрия, очисткой смесью хлороформ: изоамиловый спирт и осаждением ДНК из очищенного лизата этиловым спиртом. Изобретение позволяет облегчить выделение и увеличить количество ядерной ДНК, пригодной для проведения молекулярно-генетического анализа, в частности использования ПЦР при проведении анализа ядерных генетических материалов. 4 ил., 2 пр.
Наверх