Способ молекулярного маркирования, основанный на микросателлитных локусах, предназначенный для идентификации генотипов ивы



Способ молекулярного маркирования, основанный на микросателлитных локусах, предназначенный для идентификации генотипов ивы
Способ молекулярного маркирования, основанный на микросателлитных локусах, предназначенный для идентификации генотипов ивы
Способ молекулярного маркирования, основанный на микросателлитных локусах, предназначенный для идентификации генотипов ивы
Способ молекулярного маркирования, основанный на микросателлитных локусах, предназначенный для идентификации генотипов ивы
Способ молекулярного маркирования, основанный на микросателлитных локусах, предназначенный для идентификации генотипов ивы
Способ молекулярного маркирования, основанный на микросателлитных локусах, предназначенный для идентификации генотипов ивы
Способ молекулярного маркирования, основанный на микросателлитных локусах, предназначенный для идентификации генотипов ивы
Способ молекулярного маркирования, основанный на микросателлитных локусах, предназначенный для идентификации генотипов ивы
Способ молекулярного маркирования, основанный на микросателлитных локусах, предназначенный для идентификации генотипов ивы
Способ молекулярного маркирования, основанный на микросателлитных локусах, предназначенный для идентификации генотипов ивы

 

C12N15/00 - Получение мутаций или генная инженерия; ДНК или РНК, связанные с генной инженерией, векторы, например плазмиды или их выделение, получение или очистка; использование их хозяев (мутанты или микроорганизмы, полученные генной инженерией C12N 1/00,C12N 5/00,C12N 7/00; новые виды растений A01H; разведение растений из тканевых культур A01H 4/00; новые виды животных A01K 67/00; использование лекарственных препаратов, содержащих генетический материал, который включен в клетки живого организма, для лечения генетических заболеваний, для генной терапии A61K 48/00 пептиды вообще C07K)

Владельцы патента RU 2630662:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН) (RU)

Изобретение относится к области биохимии и генетики растений. Предлагается способ молекулярно-генетической идентификации растений ивы на основе микросателлитных (SSR) маркеров, который включает в себя выделение ДНК из исследуемых образцов, проведение ПЦР, электрофоретическое разделение продуктов амплификации ДНК, документирование результатов ПЦР, определение длин амплифицированных фрагментов ДНК путем сравнения со стандартами молекулярной массы, получение таблицы многолокусных генотипов по микросателлитным локусам и сравнение полученных генотипов с генотипами исходных растений. Способ позволяет установить идентичность особей и оценить вероятность встречаемости мультилокусных генотипов и случайного совпадения неродственных или родственных особей. Изобретение также позволяет осуществлять надежную и достоверную идентификацию генотипов ивы на индивидуальном уровне и может быть использовано для широкого спектра видов рода Salix, являясь, таким образом, универсальным. 2 з.п. ф-лы, 4 ил., 3 табл.

 

Изобретение относится к области молекулярной биологии и генетики растений, в частности к способу молекулярно-генетической идентификации особей ивы на основе генетических маркеров - микросателлитных локусов. Изобретение позволяет осуществлять надежную и достоверную идентификацию генотипов ивы на индивидуальном уровне и может быть использовано для широкого спектра видов рода Salix, являясь, таким образом, универсальным.

Микросателлитные локусы представляют собой участки дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), содержащие простые короткие тандемно повторяющиеся моно-, ди-, три-, тетра- или пентануклеотидные (нуклеотид - элементарная «буква» в генетическом коде организма) мотивы, которые локализованы в геномах большинства видов эукариот. Отсюда их альтернативные названия - локусы с простыми повторами последовательностей (SSR, от английского Simple Sequence Repeat) или короткие тандемные повторы (STR, от английского Short Tandem Repeats). Микросателлитные маркеры наилучшим образом подходят для идентификации и дискриминации (различения) индивидуальных генотипов, поскольку содержат большое число аллелей (у древесных растений до 10-20 и более на локус), и возможность использовать наборы локусов позволяет получать уникальные генетические «портреты» особей с крайне низкой вероятностью случайного повторения (от 10-4 до <10-15 в зависимости от числа локусов и аллелей) (Brown et al., In methods of genome analysis in plants, Ed. P.P. Jauhar, N.-Y., London, Tokyo, 1996, P. 147-159).

В качестве экономических преимуществ использования микросателлитных маркеров можно отметить, что их анализ, основанный на применении полимеразной цепной реакции (ПЦР), не требует высокого количества и качества матричной ДНК (10-100 нг на реакцию). Благодаря использованию специфических длинных ПЦР-праймеров достигается высокая воспроизводимость результатов микросателлитного анализа. При дальнейшем совершенствовании технологии возможно увеличение производительности анализа путем применения мультиплексных реакций (амплификация нескольких локусов с меченными флуоресцентными метками праймерами в одной пробирке) и автоматизации скрининга.

На данный момент нет запатентованных технических решений по идентификации генотипов ивы, однако известно много запатентованных способов молекулярно-генетической идентификации генотипов других видов растений, основанных на микросателлитных маркерах, преимущественно плодово-ягодных и злаковых культур. Значительно меньше внимания уделено способам молекулярно-генетической идентификации лесных древесных видов растений. Так, известна российская заявка на изобретение № RU2012119341 «Способ молекулярно-генетической идентификации популяций древесных видов растений», наиболее близкая к нашему изобретению, в которой предложен способ молекулярно-генетической идентификации популяций древесных видов растений, характеризующийся тем, что в молекулярно-генетическую формулу и штрихкод, помимо идентификационных фрагментов ДНК разного размера (ISSR), амплифицированных в результате ПЦР, вносят и другие структурные изменения геномов, такие как делеции, дупликации, однонуклеотидные замены (SNP - Single Nucleotide Polymorphism), выявленные при сравнительном анализе нуклеотидных последовательностей после секвенирования геномной ДНК. Однако возможность использования данного способа для идентификации генотипов ивы не оценивалась, а также не оценивалось использование микросателлитных локусов для генетической идентификации особей ивы. Кроме того, способ основан на использовании ISSR- и IRAP-маркеров, относящихся к мультилокусным маркерам, которые, как правило, имеют неизвестную локализацию в хромосоме и используются для молекулярной паспортизации сортов/пород, исследовании генетического разнообразия, а также для филогенетических исследований (Хлесткина, Вавиловский журнал генетики и селекции, 2013, Т. 17, №4, С. 1044-1054). Именно для достижения этих целей данный способ предложен Боронниковой с соавторами. В предложенном нами способе в основу легло использование монолокусных SSR-маркеров, что позволяет осуществлять идентификацию генотипов на индивидуальном уровне и осуществлять отбор элитных генотипов в селекции. Кроме того, нет необходимости в методе секвенирования, что делает наш способ также экономически более выгодным.

Задачей предлагаемого изобретения является обеспечение достоверной и надежной генетической идентификации генотипов ивы на основе применения высокоизменчивых микросателлитных локусов.

Поставленная задача достигается за счет использования набора эффективных и стабильных молекулярных маркеров, позволяющих выявить высокий уровень полиморфизма ДНК и получить четко воспроизводимые результаты.

Схема применения разработанного способа идентификации приведена на фиг. 1. Основным ее функциональным компонентом является набор протестированных пар праймеров для ПЦР-амплификации микросателлитных локусов.

Предлагаемый способ реализуют следующим образом:

1. Производят отбор растительного материала для ДНК-анализа. В качестве материала используют вегетативные ткани листьев или почек.

2. Осуществляют выделение ДНК из растительной ткани по стандартным методам с использованием цетилтриметиламмониумбромида (СТАВ) (Devey et al., Theor. Appl. Genet, 1996, V. 92, P. 673-679, Doyle J.J., Doyle J.L., Focus, 1990, V. 12, P. 12-15).

3. Проводят ПЦР-амплификацию со специфичными праймерами для микросателлитных локусов (табл. 1). Используют 14 пар праймеров и следующие режимы амплификации: для большинства микросателлитных локусов серии SB, а также локуса Sa54B применяют режим ПЦР (табл. 2), включающий предварительную денатурацию ДНК при 94°С в течение 3 мин и 35 циклов, состоящих из 30 с денатурации при 94°С, отжига при 50°С и элонгации 1 мин 30 с при 72°С. Завершающую элонгацию проводят 15 мин при температуре 72°С с последующим охлаждением реакционной смеси до 4°С. Для локуса SB38 режим ПЦР включает предварительную денатурацию ДНК при 94°С в течение 3 мин и 35 циклов, состоящих из 30 с денатурации при 94°С, отжига при 48°С и элонгации 1 мин 30 с при 72°С. Завершающую элонгацию проводят 15 мин при температуре 72°С. Программу завершают охлаждением реакционной смеси до 4°С.

4. Проводят фрагментный анализ ПЦР-продуктов (амплификатов) с помощью электрофореза в вертикальных блоках 6% полиакриламидного геля (ПААГ) в трис-ЭДТА-боратной буферной системе. После электрофореза гели окрашивают в водном растворе бромистого этидия и визуализируют в УФ-свете.

5. Графические изображения гелей (электрофореграммы) перехватывают с помощью фото- или видеосистемы гель-документации, сохраняют на магнитных носителях информации и обрабатывают в графических редакторах. Размер амплифицированных фрагментов определяют с помощью соответствующего программного обеспечения. В качестве стандартного маркера длины используют ДНК плазмиды pBR322 Е. coli, обработанную эндонуклеазой рестрикции HpaII, или аналогичный маркер молекулярного веса для фрагментного анализа в диапазоне 50-300 пар нуклеотидов (п.н.).

6. Проводят составление таблицы многолокусных генотипов по микросателлитным локусам. Длины амплифицированных фрагментов микросателлитных локусов (в парах оснований) заносят в электронную таблицу MS Excel, по два столбца на локус (табл. 3). В случае отсутствия генотипа по какому-либо локусу (пропуск данных) указывают «0».

7. Осуществляют сравнение полученных генотипов с генотипами исходных растений с целью установления идентичности особей (визульно или с помощью свободно распространяемой надстройки для MS Excel - GenAlEx - текущей версии 6.5 или более поздней) (Peakall, Smouse, Mol. Ecol. Notes, 2006, V. 6, P. 288-295; Peakall, Smouse, Bioinformatics, 2012, V. 28, P. 2537-2539).

8. Проводят оценку вероятности встречаемости мультилокусных генотипов и случайного совпадения неродственных или родственных генотипов.

Техническим результатом, достигаемым при реализации настоящего изобретения, является надежная, статистически достоверная идентификация генотипов ивы, при этом действие изобретения распространяется на все виды ивы, произрастающие на территории РФ, в том числе на наиболее распространенные виды: Salix alba L., S. bebbiana, S. babilonica, S. daphnoides, S. kangensis, S. caspica, S. elegantissima, S. caprea, S.fragilis, S. lanata, S. acutifolia, S. repens, S. viminalis, S. purpurea, S. pentandra, S. rorida, S. aurita, S. tenuifolia, S. Integra, S. udensis, а также на другие виды рода Salix.

Зависимость PI и PIsibs от числа используемых локусов (фиг. 2) наглядно демонстрирует, что практически нулевая вероятность случайного совпадения генотипов достигается уже при использовании первых шести локусов. Использование всех 14 локусов намного перекрывает заявленную достоверность и статистическую значимость анализа. Максимально возможная вероятность совпадения генотипов равна 1,3⋅10-5 (примерно одно совпадение на 75000 сравнений).

Предлагаемое изобретение является промышленно применимым и может быть использовано для идентификации генотипов ивы с целью создания быстрорастущих и высокопродуктивных ивовых плантаций на основе элитных генотипов.

Примеры электрофореграмм, демонстрирующих полиморфизм длин амплифицированных фрагментов микросателлитных локусов, приведены на фиг. 3, 4.

Изобретение иллюстрируют следующие таблицы.

Таблица 1. Микросателлитные локусы ивы и их характеристики.

Таблица 2. Режимы ПЦР микросателлитных локусов ивы.

Таблица 3. Пример формата.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1. Схема применения способа молекулярного маркирования для идентификации генотипов ивы.

Фиг. 2. Зависимость вероятности случайного совпадения генотипов от числа используемых микросателлитных локусов.

Фиг. 3. Электрофореграмма локуса SB880 тестируемых элитных генотипов ивы. Генотип: 1 - Sir1 (184/151); 2 - Slu (184/166); 3 - S2u (184/151); 4- S5u (166/166); 5- S6u (166/166); 6 - S7u (160/151); 7 - маркер длин фрагментов ДНК; 8 - S11u (166/151); 9 - S12u (160/15 1); 10 - Sh5 (184/166); 11 - Sh6 (166/166); 12 - S9 (199/166); 13 - S14 (184/166); 14 - Scl (184/169).

Фиг. 4. Электрофореграмма локуса SB904 тестируемых элитных генотипов ивы. Генотип: 1 - Sfrl (121/109); 2 - Slu (112/109); 3 - S2u (121/109); 4- S5u (94/94); 5- S6u (94/94); 6 - S7u (109/109); 7 - маркер длин фрагментов ДНК; 8 - S11u (118/118); 9 - S12u (121/112); 10 - Sh5 (109/103); 11 - Sh6 (118/109); 12 - S9 (118/94); 13 - S14 (112/109); 14 - Scl (109/109).

1. Способ молекулярно-генетической идентификации генотипов ивы на основе микросателлитных (SSR) маркеров, заключающийся в выделении ДНК из исследуемых образцов, проведении ПЦР, электрофоретическом разделении продуктов амплификации ДНК, документировании результатов ПЦР с помощью системы гель-документации, определении длин амплифицированных фрагментов ДНК путем сравнения со стандартами молекулярной массы, получении таблицы многолокусных генотипов по микросателлитным локусам, сравнении полученных генотипов с генотипами исходных растений с целью установления идентичности особей и оценки вероятности встречаемости мультилокусных генотипов и случайного совпадения неродственных или родственных генотипов, отличающийся тем, что амплификацию ДНК проводят по следующему набору микросателлитных локусов с использованием фланкирующих их праймеров:

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что пригоден для идентификации элитных генотипов ивы, культивируемых с помощью микроклонального размножения или иными способами размножения, и любых прочих генотипов ивы на любых стадиях индивидуального развития.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что основан на применении универсального набора генетических маркеров, пригодных для идентификации растений, принадлежащих к различным видам рода Salix.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к медицине. Изобретение представляет собой способ хемогенетической регистрации и коррекции нейрогенеза на основе генетических конструкций для трансфекции астроцитов и нейронов, при котором используют химическое соединение, обладающее активностью стимуляции и образования нервной ткани и/или ингибирования дегенерации нейронов, где разрабатывают генетические конструкции на основе лентивирусного вектора для специфической трансфекции астроцитов и нейронов, приведенных на фиг.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к способу получения синтетической CG-богатой генетической последовательности для синтеза гетерологичных белков.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к гуманизированному антителу, которое связывается с эпитопом С3 компонента комплемента человека. Также раскрыты ДНК, кодирующая указанное антитело, экспрессионный вектор, для экспрессии указанного антитела, а также штамм клеток яичников китайского хомячка, который продуцирует указанное антитело.

Настоящее изобретение относится к биохимии, в частности к способу стимуляции ангиогенеза в ишемизированных тканях и комбинированному лекарственному средству для его осуществления.

Настоящее изобретение относится к области биохимии, биотехнологии и молекулярной биологии, в частности к способу увеличения эффективности проникновения ДНК в митохондрии эукариотических клеток.

Изобретение относится к биотехнологии. Описана Фармацевтическая композиция для профилактики или лечения заболевания, связанного с hsp47, содержащая носитель для лекарственного средства и двухнитиевую молекулу нуклеиновой кислоты, где носитель для лекарственного средства содержит ретиноид и липид, где двухнитевая молекула нуклеиновой кислоты содержит структуру:5' (N)x-Z 3' (антисмысловая нить)3' Z'-(N')y-z'' 5' (смысловая нить),где каждый N и N' представляет собой нуклеотид, который является немодифицированным или модифицированным или нестандартной составляющей.

Настоящее изобретение относится к биохимии, в частности к одноцепочечной молекуле нуклеиновой кислоты, которая подавляет экспрессию целевого гена. Указанная молекула в порядке от 5’-конца к 3’-концу содержит 5’-концевой участок Xc, линкерный участок Lx, внутренний участок Z, линкерный участок Ly и 3’-концевой участок Yc.

Изобретение относится к биохимии. Описан способ перепрограммирования клетки в менее дифференцированное состояние, включающий культивирование дифференцированной клетки в среде для перепрограммирования, содержащей альбумин, где альбумин обработан ионообменной смолой или древесным углем, трансфицирование клетки одной или более синтетических молекул РНК, где указанные одна или более синтетических молекул РНК включают по меньшей мере одну молекулу РНК, кодирующую один или более факторов перепрограммирования, и где указанное трансфицирование приводит к получению клетки, экспрессирующей один или более факторов перепрограммирования; и повторение стадии (b) по меньшей мере дважды в течение 5 последовательных дней с получением клетки, перепрограммированной в менее дифференцированное состояние.

Группа изобретений относится к области биотехнологии. Представлены способы повышения экспрессии гена сиалидазы 4 (NEU4) с использованием олигонуклеотида, который специфически связывается с природным антисмысловым полинуклеотидом для гена NEU4.

Изобретение относится к области биохимии. Предложена молекула двухцепочечной малой интерферирующей нуклеиновой кислоты (миНК) для ингибирования экспрессии вируса гепатита В (HBV).

Изобретение относится к биохимии. Описана двухцепочечная рибонуклеиновая кислота (дцРНК) для ингибирования экспрессии гена АРОС3, где указанная дцРНК содержит (а) смысловую цепь, состоящую из нуклеотидной последовательности GcuuAAAAGGGAcAGuAuudTsdT, и антисмысловую цепь, состоящую из нуклеотидной последовательности AAuACUGUCCCUUUuAAGCdTsdT; (b) смысловую цепь, состоящую из нуклеотидной последовательности GCUUAAAAGGGACAGUAUUdTsdT, и антисмысловую цепь, состоящую из нуклеотидной последовательности AAUACUGUCCCUUUUAAGCdTsdT, (c) смысловую цепь, состоящую из нуклеотидной последовательности GfcUfuAfaAfaGfgGfaCfaGfuAfuUfdTsdT, и антисмысловую цепь, состоящую из нуклеотидной последовательности aAfuAfcUfgUfcCfcUfuUfuAfaGfcdTsdT, или (d) смысловую цепь, состоящую из нуклеотидной последовательности GcuuAAAAGGGAcAGuAuudTsdT, и антисмысловую цепь, состоящую из нуклеотидной последовательности AAuACuGUCCCuuuuAagcdTsdT, где нуклеотиды, обозначенные строчными буквами, представляют собой 2'-О-метилнуклеотиды; Gf, Af, Uf и Cf представляют собой 2'-фторнуклеотиды; и s представляет собой фосфоротиоатную связь. Также описана фармацевтическая композиция для ингибирования экспрессии гена АРОС3, содержащая указанную дцРНК. Представлены способы ингибирования экспрессии АРОС3 в клетке и лечения нарушения, опосредованного экспрессией АРОС3, включающие использование указанной дцРНК. Изобретение расширяет арсенал средств, предназначенных для лечения нарушения, опосредованного экспрессией АРОС3. 4 н. и 8 з.п. ф-лы, 4 ил., 12 табл., 7 пр.

Изобретение относится к области биотехнологии и медицины. Описан способ химической модификации антитромбинового аптамера и к получения нового антитромбинового аптамера, обладающего антикоагулянтными свойствами и пролонгированной антитромботической активностью. В изобретении описан аптамерный ДНК олигонуклеотид, специфически связывающийся с тромбином и характеризующийся нуклеотидной последовательностью общей формулы GGTTGGTGTGGTTGGTGGTTGGTGTGGTTGG, в котором по крайней мере один из нуклеотидов модифицирован для возможности связывания с молекулой полиэтиленгликоля и увеличения времени нахождения данного олигонуклеотида в кровотоке. В предпочтительных вариантах изобретения модификация произведена по тиминам в позициях 7, 9, 16, 23 и/или 25. Модифицированный аптамер обладает улучшенными фармакокинетическими параметрами, низкой токсичностью и высоким сродством к тромбину человека. Изобретение может быть использовано в качестве антикоагулянтного и антитромботического лекарственного средства для профилактики или лечения тромбозов различной природы. 4 н. и 7 з.п. ф-лы, 5 ил., 2 пр.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к способу получения безмаркерных трансгенных растений каланхоэ перистого, экспрессирующих ген цекропина Р1. Изобретение обеспечивает получение и тестирование безмаркерных растений каланхоэ с повышенными антибиотическими свойствами за короткий промежуток времени для использования в фармакологии и медицине. 8 з.п. ф-лы, 4 ил., 1 табл., 12 пр.

Изобретение относится к области биотехнологии и рыбоводства и касается способа получения ДНК из яйцеклеток рыб. Представленный способ включает пробоподготовку и выделение ДНК. В процессе пробоподготовки яйцеклетки осеменяют генетически инактивированной спермой для получения гиногенетических эмбрионов, из которых после вылупления выделяют ДНК. Перед инактивацией сперму разбавляют 0,9%-ным раствором хлорида натрия в соотношении 1:12, инактивацию проводят УФ-излучением в дозе 300 Дж/м2, а выделение ДНК осуществляют методом солевой экстракции путем лизиса образца в гомогенизационном буфере с протеиназой К с дальнейшим встряхиванием с хлоридом натрия, очисткой смесью хлороформ: изоамиловый спирт и осаждением ДНК из очищенного лизата этиловым спиртом. Изобретение позволяет облегчить выделение и увеличить количество ядерной ДНК, пригодной для проведения молекулярно-генетического анализа, в частности использования ПЦР при проведении анализа ядерных генетических материалов. 4 ил., 2 пр.
Наверх