Фрагменты пищевых белков и способы их применения



Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения
Фрагменты пищевых белков и способы их применения

 


Владельцы патента RU 2634407:

ЭКССЕЛЛА ХЕЛТ ИНК. (US)

Представлены выделенный пищевой белок, нуклеиновая кислота, кодирующая такой белок, вектор экспрессии, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, клетка-хозяин и способ получения такого белка. Представленный пищевой белок содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2580, 2582, 2587, 2595, 2596, 2598, 2599 и 2603. Белок имеет растворимость в воде при рН 7 по меньшей мере 12,5 г/л, а также период его полупереваривания в искусственном желудочном соке составляет менее чем 10 мин. 5 н.п. ф-лы, 2 ил., 14 табл., 12 пр.

 

ССЫЛКА НА РОДСТВЕННУЮ ЗАЯВКУ

[0001] Настоящая заявка заявляет приоритет по предварительной патентной заявке США No. 61/615819, поданной 26 марта 2012 года, содержание которой включено в указанный документ посредством ссылки в полном объеме.

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

[0002] Настоящая заявка содержит перечень последовательностей, который был представлен в формате ASCII через EFS-Web и тем самым включен в указанный документ посредством ссылки в полном объеме. Указанная копия ASCII, созданная 12 марта 2013 года, называется 1005.005-PCT_SL.txt и имеет размер 3234600 байтов.

ВВЕДЕНИЕ

[0003] Пищевой белок является незаменимым питательным веществом для человеческого здоровья и роста. Всемирная организация здравоохранения рекомендует, чтобы пищевой белок составлял от около 10 до 15% потребляемой энергии при энергетическом балансе и стабильности массы. Среднее суточное потребление белка в различных странах указывает на то, что эти рекомендации согласуются с количеством белка, которое потребляется по всему миру. Еда со средним содержанием от 20 до 30% энергии, полученной из белка, соответствует высокобелковой диете в случае потребления при энергетическом балансе.

[0004] В организме не могут синтезироваться определенные аминокислоты, необходимые для здоровья и роста, и вместо этого организм должен получать их из пищи. Этими аминокислотами, которые называются «незаменимыми аминокислотами», являются Гистидин (H), Изолейцин (I), Лейцин (L), Лизин (K), Метионин (M), Фенилаланин (F), Треонин (T), Триптофан (W) и Валин (V). Пищевые белки, которые обеспечивают все незаменимые аминокислоты, называют «высококачественными» белками. Пищевые продукты животного происхождения, такие как мясо, рыба, домашняя птица, яйца и молочные продукты, как правило, считаются источниками высококачественного белка, которые обеспечивают сбалансированное содержание незаменимых аминокислот. Казеин (белок, который обычно встречается в молоке млекопитающих, составляя 80% белков в коровьем молоке) и молочная сыворотка (белок в жидкости, который остается после свертывания и процеживания молока) являются основными источниками высококачественного пищевого белка. Пищевые продукты, которые не обеспечивают сбалансированное содержание незаменимых аминокислот, называют «низкокачественными» белками. Большинство фруктов и овощей являются бедными источниками белка. Некоторые пищевые продукты растительного происхождения, включая бобы, горох, чечевицу, орехи и зерновые культуры (такие как пшеница), являются лучшими источниками белка. Некоторые люди считают, что соевый белок, растительный белок, который получают из соевых бобов, является высококачественным белком.

[0005] Исследования немедленного действия потребления больших количеств белка на людях показали, что включение и в некоторых случаях увеличение содержание белка в рационе может оказывать положительный эффект. Например, исследования показали, что поглощение белка может вызывать чувство насыщения после приема пищи (в том числе за счет подавления чувства голода), вызывать термогенез и ослаблять гликемическую реакцию у людей.

[0006] Исследования высокобелковых диет в отношении потери веса показали, что белок положительным образом влияет на расход энергии и безжировую массу тела. Дальнейшие исследования показали, что переедание приводит к значительно меньшему увеличению массы тела в случае диет, включающих получение по меньшей мере 5% энергии из белка, и что высокобелковая диета уменьшает потребление энергии.

[0007] В клинических исследованиях приводятся доказательства того, что белок предотвращает атрофию мышечной ткани, возникшую вследствие старения или постельного режима. В частности, исследования показали, что белковая добавка увеличивает относительную скорость синтеза белка в мышцах (FSR) на протяжении продолжительного постельного режима, поддерживает массу и силу ног на протяжении продолжительного постельного режима, увеличивает безжировую массу тела, улучшает функциональные показатели походки и равновесия и может выступать в качестве целесообразного вмешательства в случае индивидуумов с риском развития саркопении вследствие неподвижности или продолжительного постельного режима.

[0008] Исследования по усилению анаболизма мышечных белков у спортсменов показали, что белок, предоставленный после физической нагрузки, вызывает большую гипертрофию мышц, чем гипертрофия, которая достигается за счет всего лишь физической нагрузки. Также было показано, что белок, предоставленный после физической нагрузки, поддерживает белковый синтез безо всякого увеличения распада белков, что приводит к суммарному положительному белковому балансу и приросту мышечной массы. Тогда как синтез мышечных белков, по-видимому, происходит дозозависимым образом в ответ на добавку незаменимых аминокислот, не все белки в равной степени участвуют в построении мышц. Например, белки молока, по-видимому, превосходят соевые белки в поддержании прироста мышечной массы в процессе силовых упражнений, тогда как и те, и другие белки превосходят углеводы отдельно. Аминокислота лейцин является важным фактором для стимуляции синтеза мышечных белков.

[0009] Цельные белки, которые обычно встречаются в пищевых продуктах, необязательно обеспечивают аминокислотный состав, который эффективно удовлетворяет потребности млекопитающего, такого как человек, в аминокислотах. В результате, для того чтобы обеспечить минимальные потребности в каждой незаменимой аминокислоте, в рационе должно потребляться большее количество общего белка, чем количество, которое потребовалось бы, если бы качество пищевого белка было более высоким. За счет увеличения качества белка в рационе становится возможным снижение общего количества белка, которое должно потребляться, по сравнению с рационами, которые включают менее качественные белки.

[0010] В целом, более высококачественные белки, которые присутствуют в рационе млекопитающих, считаются более полезными, чем другие белки, которые не являются таковыми. Такие белки являются полезными, например, выступая в качестве компонентов рациона млекопитающих. При определенных обстоятельствах такие белки способствуют поддержанию мышечной массы, индекса массы здорового тела и гликемического баланса помимо всего прочего. Соответственно, существует потребность в источниках белков, которые являются высококачественными.

[0011] Традиционно необходимые смеси аминокислот, такие как смеси, содержащие незаменимые аминокислоты, получали путем гидролиза белка, характеризующегося относительно высокими уровнями незаменимых аминокислот, такого как белок молочной сыворотки, и/или путем объединения свободных аминокислот в смеси, которые при желании также включают гидролизованный белок, такой как белок молочной сыворотки. Смеси такого типа могут иметь горький вкус и могут считаться неподходящими или нежелательными для определенных областей применения. В результате этого, такие смеси иногда включают ароматизирующие вещества для маскировки вкуса свободных аминокислот и/или гидролизованного белка. В некоторых случаях обнаруживают, что композиции, в которых доля содержания аминокислот обеспечивается за счет полипептидов или белков, имеют лучший вкус, чем композиции с высокой долей общих аминокислот, которые получают в виде свободных аминокислот и/или определенных гидролизованных белков. Однако доступность таких композиций была ограниченной, в силу того, что питательные составы традиционно получали из белка, выделенного из натуральных пищевых продуктов, таких как белок молочной сыворотки, выделенный из молока, или соевый белок, выделенный из сои. Аминокислотные профили этих белков необязательно обеспечивают потребности млекопитающего в аминокислотах. В дополнение к этому, продовольственные белки обычно состоят из смесей белков и/или белковых гидролизатов, которые могут различаться по их белковому составу, что, таким образом, приводит к непредсказуемости в отношении их питательной ценности. Более того, ограниченное количество источников таких высококачественных белков означало, что для поглощения в форме белка в больших масштабах доступны только определенные комбинации аминокислот.

[0012] Сельскохозяйственные методы, которые требуются для поставки источников высококачественных белков животного происхождения, таких как казеин и молочная сыворотка, яйца и мясо, а также растительных белков, таких как соя, также требуют значительных затрат энергии и потенциально оказывают вредное воздействие на окружающую среду. Соответственно, в определенных ситуациях было бы полезно иметь альтернативные источники и способы поставки белков для потребления млекопитающими.

[0013] Теоретически, синтетические полипептидные последовательности, содержащие необходимый состав аминокислот, можно сконструировать и получить в лабораторных условиях. Однако этот подход может поднимать различные вопросы, и вследствие этого его не всегда можно применять. Во-первых, специалисты в данной области техники понимают, что достижение высоких уровней производства таких синтетических последовательностей может быть очень сложным. Во-вторых, даже если бы такой синтетический белок синтезировали, его пригодность для использования в составе питательного продукта была бы сомнительной. Например, таким, не встречающимся в природе полипептидом, может быть аллерген или токсин. Соответственно, в некоторых вариантах реализации в данном раскрытии предлагаются естественные белковые или полипептидные последовательности или их варианты.

[0014] В данном раскрытии предлагаются пищевые белки, состоящие из первой полипептидной последовательности, которая является гомологичной фрагменту встречающегося в природе белка. Пищевые белки и фрагменты, из которых они состоят, составляют из подходящих комбинаций аминокислот. Белки могут быть получены с помощью способов, которые для производства не полагаются исключительно на традиционное сельское хозяйство. Например, авторы настоящего изобретения открыли, и в данном раскрытии предлагаются пищевые белки, состоящие из фрагмента встречающегося в природе белка и состоящие из комбинаций аминокислот, в которых соблюдается подходящий уровень по меньшей мере одного соотношения аминокислот с разветвленной цепью к общим аминокислотам, соотношения аминокислоты лейцин к общим аминокислотам и соотношения незаменимых аминокислот к общим аминокислотам. В некоторых вариантах реализации изобретения в пищевых белках по меньшей мере один уровень из а) соотношения аминокислотных остатков с разветвленной цепью к общему количеству аминокислотных остатков, присутствующих в пищевом белке равно или больше, чем соотношение аминокислотных остатков с разветвленной цепью к общему количеству аминокислотных остатков, присутствующих в белке молочной сыворотки; б) соотношения остатков лейцина к общему количеству аминокислотных остатков, присутствующих в пищевом белке, равно или больше, чем соотношение остатков лейцина к общему количеству аминокислотных остатков, присутствующих в белке молочной сыворотки; и в) соотношения остатков незаменимых аминокислот к общему количеству аминокислотных остатков, присутствующих в пищевом белке, равно или больше, чем соотношение остатков незаменимых аминокислот к общему количеству аминокислотных остатков, присутствующих в белке молочной сыворотки.

[0015] В данном раскрытии также предлагаются нуклеиновые кислоты, кодирующие белки, рекомбинантные микроорганизмы, которые продуцируют данные белки, способы получения белков с применением рекомбинантных микроорганизмов, композиции, которые содержат белки, и способы применения данных белков, помимо всего прочего.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0016] В первом аспекте изобретения в данном раскрытии предлагаются выделенные пищевые белки, содержащие первую полипептидную последовательность, которая является гомологичной фрагменту встречающегося в природе белка, при том, что в белке с первой полипептидной последовательностью по меньшей мере одно из: a) соотношение аминокислотных остатков с разветвленной цепью к общему количеству аминокислотных остатков составляет по меньшей мере 24%; б) соотношение остатков Leu к общему количеству аминокислотных остатков составляет по меньшей мере 11%; и в) соотношение остатков незаменимых аминокислот к общему количеству аминокислотных остатков составляет по меньшей мере 49%. В некоторых вариантах реализации изобретения первая полипептидная последовательность дополнительно содержит по меньшей мере 70% гомологичности к фрагменту встречающегося в природе белка. В некоторых вариантах реализации изобретения первая полипептидная последовательность содержит по меньшей мере 95% гомологичности к фрагменту встречающегося в природе белка. В некоторых вариантах реализации изобретения фрагмент встречающегося в природе белка содержит по меньшей мере 25 аминокислотных остатков. В некоторых вариантах реализации изобретения фрагмент встречающегося в природе белка содержит по меньшей мере 50 аминокислотных остатков. В некоторых вариантах реализации изобретения в первой полипептидной последовательности соблюдается следующее: a) соотношение аминокислотных остатков с разветвленной цепью к общему количеству аминокислотных остатков составляет по меньшей мере 24%; б) соотношение остатков Leu к общему количеству аминокислотных остатков составляет по меньшей мере 11%; и в) соотношение остатков незаменимых аминокислот к общему количеству аминокислотных остатков составляет по меньшей мере 49%. В некоторых вариантах реализации первая полипептидная последовательность содержит фрагмент встречающегося в природе пищевого белка. В некоторых вариантах реализации изобретения первая полипептидная последовательность состоит из фрагмента встречающегося в природе пищевого белка.

[0017] В некоторых вариантах реализации изобретения первая полипептидная последовательность не является последовательностью аллергена. В некоторых вариантах реализации изобретения первая полипептидная последовательность характеризуется общей гомологией к известному аллергену, которая составляет менее чем 50%.

[0018] В некоторых вариантах реализации изобретения первая полипептидная последовательность не является последовательностью токсина. В некоторых вариантах реализации изобретения первая полипептидная последовательность характеризуется общей гомологией к известному токсину, которая составляет менее чем 50%.

[0019] В некоторых вариантах реализации изобретения период полупереваривания белка с первой полипептидной последовательностью в искусственном желудочном соке составляет меньше чем 60 минут. В некоторых вариантах реализации изобретения период полупереваривания белка с первой полипептидной последовательностью в искусственном желудочном соке составляет меньше чем 30 минут. В некоторых вариантах реализации изобретения период полупереваривания белка с первой полипептидной последовательностью в искусственном желудочном соке составляет меньше чем 10 минут. В некоторых вариантах реализации изобретения белок с первой полипептидной последовательностью подвергается полному перевариванию в искусственном желудочном соке. В некоторых вариантах реализации изобретения первая полипептидная последовательность содержит по меньшей мере один сайт распознавания протеазой, выбранный из сайта распознавания пепсином, сайта распознавания трипсином и сайта распознавания химотрипсином. В некоторых вариантах реализации изобретения первая полипептидная последовательность не содержит цистеиновых остатков. В некоторых вариантах реализации изобретения первая полипептидная последовательность не содержит дисульфидных связей. В некоторых вариантах реализации первая полипептидная последовательность не подвергается N-связанному гликозилированию. В некоторых вариантах реализации изобретения первая полипептидная последовательность не подвергается O-связанному гликозилированию.

[0020] В некоторых вариантах реализации изобретения первая полипептидная последовательность является устойчивой к агрегации. В некоторых вариантах реализации изобретения первая полипептидная последовательность является анионной при рН 7. В некоторых вариантах реализации изобретения первая полипептидная последовательность имеет растворимость в воде при рН 7 по меньшей мере 12,5 г/л. В некоторых вариантах реализации первая полипептидная последовательность имеет расчетное сольватное число -20 или менее. В некоторых вариантах реализации изобретения первая полипептидная последовательность имеет расчетное число агрегации 0,75 или менее. В некоторых вариантах реализации изобретения первая полипептидная последовательность имеет расчетное число агрегации 0,5 или менее.

[0021] В некоторых вариантах реализации изобретения первая полипептидная последовательность содержит аминокислотную последовательность, выбранную из: i) аминокислотной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 1-SEQ ID NO: 2609; ii) модифицированного производного аминокислотной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 1-SEQ ID NO: 2609; и iii) мутеина на основе аминокислотной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 1-SEQ ID NO: 2609. В некоторых вариантах реализации изобретения первая полипептидная последовательность состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из: i) аминокислотной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 1-SEQ ID NO: 2609, ii) модифицированного производного аминокислотной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 1-SEQ ID NO: 2609 и iii) мутеина на основе аминокислотной последовательности, выбранной из v. В некоторых вариантах реализации изобретения первая полипептидная последовательность по меньшей мере на 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 99,5% гомологична по меньшей мере одной эталонной аминокислотной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 1-SEQ ID NO: 2609.

[0022] В некоторых вариантах реализации изобретения первая полипептидная последовательность представляет собой фрагмент из по меньшей мере 25 аминокислот встречающегося в природе пищевого белка. В некоторых вариантах реализации изобретения первая полипептидная последовательность представляет собой фрагмент из по меньшей мере 50 аминокислот встречающегося в природе пищевого белка. В некоторых вариантах реализации изоляции пищевой белок состоит из первой полипептидной последовательности. В некоторых вариантах реализации изобретения изолированный пищевой белок дополнительно содержит полипептидную метку для аффинной очистки. В некоторых вариантах реализации изобретения метка для аффинной очистки представляет собой полигистидиновую метку.

[0023] В другом аспекте изобретения в данном раскрытии предлагаются выделенные пищевые белки, содержащие первую полипептидную последовательность, которая является гомологичной фрагменту встречающегося в природе белка, при том, что в выделенном пищевом белке соблюдается следующее: a) соотношение аминокислотных остатков с разветвленной цепью к общему количеству аминокислотных остатков составляет по меньшей мере 24%; б) соотношение остатков Leu к общему количеству аминокислотных остатков составляет по меньшей мере 11%; и в) соотношение остатков незаменимых аминокислот к общему количеству аминокислотных остатков составляет по меньшей мере 49%. В некоторых вариантах реализации изобретения выделенный пищевой белок дополнительно содержит по меньшей мере одну из каждой незаменимой аминокислоты. В некоторых вариантах реализации изобретения первая полипептидная последовательность дополнительно содержит по меньшей мере 70% гомологичности к фрагменту встречающегося в природе белка. В некоторых вариантах реализации изобретения первая полипептидная последовательность содержит по меньшей мере 95% гомологичности к фрагменту встречающегося в природе белка. В некоторых вариантах реализации изобретения фрагмент встречающегося в природе белка содержит по меньшей мере 25 аминокислотных остатков. В некоторых вариантах реализации изобретения фрагмент встречающегося в природе белка содержит по меньшей мере 50 аминокислотных остатков. В некоторых вариантах реализации изобретения в выделенном пищевом белке соблюдается следующее: a) соотношение аминокислотных остатков с разветвленной цепью к общему количеству аминокислотных остатков составляет по меньшей мере 24%; б) соотношение остатков Leu к общему количеству аминокислотных остатков составляет по меньшей мере 11%; и в) соотношение остатков незаменимых аминокислот к общему количеству аминокислотных остатков составляет по меньшей мере 49%. В некоторых вариантах реализации изобретения выделенный пищевой белок содержит фрагмент встречающегося в природе пищевого белка. В некоторых вариантах реализации изобретения выделенный пищевой белок состоит из фрагмента встречающегося в природе пищевого белка.

[0024] В некоторых вариантах реализации изобретения выделенный пищевой белок не является аллергеном. В некоторых вариантах реализации изобретения выделенный пищевой белок характеризуется общей гомологией к известному аллергену, которая составляет менее чем 50%.

[0025] В некоторых вариантах реализации изобретения выделенный пищевой белок не является токсином. В некоторых вариантах реализации изобретения общая гомология выделенного пищевого белка с известным токсином составляет менее чем 50%.

[0026] В некоторых вариантах реализации изобретения период полупереваривания выделенного пищевого белка в искусственном желудочном соке составляет меньше чем 60 минут. В некоторых вариантах реализации изобретения период полупереваривания выделенного пищевого белка в искусственном желудочном соке составляет меньше чем 30 минут. В некоторых вариантах реализации изобретения период полупереваривания выделенного пищевого белка в искусственном желудочном соке составляет меньше чем 10 минут. В некоторых вариантах реализации изобретения выделенный пищевой белок поддается полному перевариванию в искусственном желудочном соке. В некоторых вариантах реализации изобретения выделенный пищевой белок содержит по меньшей мере один сайт распознавания протеазой, выбранный из сайта распознавания пепсином, сайта распознавания трипсином и сайта распознавания химотрипсином. В некоторых вариантах реализации изобретения выделенный пищевой белок не содержит цистеиновых остатков. В некоторых вариантах реализации изобретения выделенный пищевой белок не содержит дисульфидных связей. В некоторых вариантах реализации изобретения выделенный пищевой белок не подвергается N-связанному гликозилированию. В некоторых вариантах реализации изобретения выделенный пищевой белок не подвергается O-связанному гликозилированию.

[0027] В некоторых вариантах реализации изобретения выделенный пищевой белок устойчив к агрегации. В некоторых вариантах реализации изобретения выделенный пищевой белок обладает отрицательным зарядом при pH, равном 7. В некоторых вариантах реализации выделенный пищевой белок имеет растворимость в воде при рН 7 по меньшей мере 12,5 г/л. В некоторых вариантах реализации изобретения выделенный пищевой белок имеет расчетное сольватное число, равное -20 или меньше. В некоторых вариантах реализации изобретения выделенный пищевой белок имеет расчетное число агрегации, равное 0,75 или меньше. В некоторых вариантах реализации изобретения выделенный пищевой белок имеет расчетное число агрегации, равное 0,5 или меньше.

[0028] В некоторых вариантах реализации изобретения выделенный пищевой белок содержит аминокислотную последовательность, выбранную из: i) аминокислотной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 1-SEQ ID NO: 2609; ii) модифицированного производного аминокислотной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 1-SEQ ID NO: 2609; и iii) мутеина на основе аминокислотной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 1-SEQ ID NO: 2609. В некоторых вариантах реализации изобретения выделенный пищевой белок состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из: i) аминокислотной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 1-SEQ ID NO: 2609, ii) модифицированного производного аминокислотной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 1-SEQ ID NO: 2609 и iii) мутеина на основе аминокислотной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 1-SEQ ID NO: 2609. В некоторых вариантах реализации изобретения выделенный пищевой белок по меньшей мере на 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 99,5% гомологичен по меньшей мере одной аминокислотной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 1-SEQ ID NO: 2609. В некоторых вариантах реализации изобретения выделенный пищевой белок дополнительно содержат полипептидную метку для аффинной очистки. В некоторых вариантах реализации изобретения метка для аффинной очистки представляет собой полигистидиновую метку.

[0029] В другом аспекте изобретения в данном раскрытии предлагаются выделенные нуклеиновые кислоты, содержащие последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует пищевой белок в соответствии с данным раскрытием. В некоторых вариантах реализации изобретения выделенную нуклеиновою кислоту выбирают из геномной ДНК, кДНК, смысловой РНК и антисмысловой РНК. В некоторых вариантах реализации изобретения выделенная нуклеиновая кислота представляет собой геномную ДНК. В некоторых вариантах реализации изобретения выделенная нуклеиновая кислота представляет собой кДНК. В некоторых вариантах реализации изобретения выделенная нуклеиновая кислота дополнительно содержит последовательность, обеспечивающую контроль экспрессии и функционально связанную с последовательностью нуклеиновой кислоты, которая кодирует пищевой белок. В некоторых вариантах реализации изобретения нуклеиновая кислота, которая кодирует пищевой белок, в соответствии с данным раскрытием, присутствует в векторе. В некоторых вариантах реализации изобретения вектор дополнительно содержит последовательность, обеспечивающую контроль экспрессии и функционально связанную с последовательностью нуклеиновой кислоты, которая кодирует пищевой белок.

[0030] В другом аспекте изобретения в данном раскрытии предложены рекомбинантные микроорганизмы, содержащие по меньшей мере одну нуклеиновую кислоту и вектор в соответствии с данным раскрытием. В некоторых вариантах реализации изобретения рекомбинантный микроорганизм является прокариотическим организмом. В некоторых вариантах реализации изобретения прокариотический организм является гетеротрофным. В некоторых вариантах реализации изобретения прокариотический организм является автотрофным. В некоторых вариантах реализации изобретения прокариотический организм представляет собой бактерию.

[0031] В другом аспекте изобретения в данном раскрытии предложены способы получения пищевого белка в соответствии с данным раскрытием, причем способ включает культивирование рекомбинантного микроорганизма в соответствии с данным раскрытием в условиях, достаточных для продукции пищевого белка рекомбинантным микроорганизмом. В некоторых вариантах реализации изобретения способ дополнительно включает выделение пищевого белка из культуры клеток.

[0032] В другом аспекте изобретения в данном раскрытии питательные композиции содержат пищевой белок данного раскрытия и по меньшей мере один второй компонент. В некоторых вариантах реализации изобретения по меньшей мере один второй компонент выбирают из белка, полипептида, пептида, свободной аминокислоты, углевода, жира, минерала или источника минералов, витамина, добавки, организма, фармацевтического препарата и вспомогательного вещества. В некоторых вариантах реализации изобретения по меньшей мере один второй компонент представляет собой белок. В некоторых вариантах реализации изобретения по меньшей мере один второй компонент представляет собой пищевой белок. В некоторых вариантах реализации изобретения по меньшей мере один второй компонент представляет собой свободную аминокислоту, выбранную из незаменимых аминокислот, заменимых аминокислот, аминокислот с разветвленной цепью, нестандартных аминокислот и модифицированных аминокислот. В некоторых вариантах реализации изобретения по меньшей мере один второй компонент представляет собой свободную аминокислоту, выбранную из незаменимых аминокислот. В некоторых вариантах реализации изобретения по меньшей мере один второй компонент представляет собой свободную аминокислоту, выбранную из аминокислот с разветвленной цепью. В некоторых вариантах реализации изобретения по меньшей мере один второй компонент представляет собой Leu. В некоторых вариантах реализации изобретения по меньшей мере один второй компонент представляет собой липид. В некоторых вариантах реализации изобретения липид выбирают из жира, растительного масла, триглицерида, холестерина, фосфолипида и жирных кислот. В некоторых вариантах реализации изобретения по меньшей мере один второй компонент выбирают из минерала и витамина. В некоторых вариантах реализации изобретения по меньшей мере один второй компонент представляет собой добавку. В некоторых вариантах реализации изобретения по меньшей мере один второй компонент представляет собой организм. В некоторых вариантах реализации изобретения по меньшей мере один второй компонент представляет собой фармацевтический препарат. В некоторых вариантах реализации изобретения по меньшей мере один второй компонент представляет собой вспомогательное вещество. В некоторых вариантах реализации изобретения по меньшей мере одно вспомогательное вещество выбирают из буферного вещества, консерванта, стабилизирующего вещества, связывающего вещества, уплотняющего вещества, смазывающего вещества, усилителя дисперсии, вещества для улучшения распадаемости, ароматизирующего вещества, подсластителя, окрашивающего вещества. В некоторых вариантах реализации изобретения питательную композицию составляют в виде жидкого раствора, взвеси, суспензии, геля, пасты, порошка или твердых частиц.

[0033] В другом аспекте изобретения в данном раскрытии предложены способы получения питательной композиции данного раскрытия, включающие получение пищевого белка в соответствии с данным раскрытием и объединение пищевого белка по меньшей мере с одним вторым компонентом.

[0034] В другом аспекте изобретения в данном раскрытии предлагаются способы поддержания или увеличения по меньшей мере одного из мышечной массы, мышечной силы и функциональных способностей субъекта, причем указанный способ реализации изобретения включает предоставление субъекту достаточного количества пищевого белка по данному раскрытию, питательной композиции по данному раскрытию или питательной композиции, приготовленной способом согласно данному раскрытию. В некоторых вариантах реализации изобретения субъектом является по меньшей мере один из: субъекта пожилого возраста, субъекта с серьезным соматическим заболеванием и страдающего от белково-энергетической недостаточности. В некоторых вариантах реализации изобретения субъект потребляет пищевой белок по данному раскрытию, питательную композицию по данному раскрытию или питательную композицию, приготовленную способом согласно данному раскрытию, согласованно с выполнением физической нагрузки. В некоторых вариантах реализации изобретения субъект потребляет пищевой белок по данному раскрытию, питательную композицию по данному раскрытию или питательную композицию, приготовленную способом согласно данному раскрытию, оральным, энтеральным или парентеральным путем.

[0035] В другом аспекте изобретения в данном раскрытии предложены способы поддержания или достижения желательного индекса массы тела субъекта, причем указанный способ включает предоставление субъекту достаточного количества пищевого белка по данному раскрытию, питательной композиции по данному раскрытию или питательной композиции, приготовленной способом согласно данному раскрытию. В некоторых вариантах реализации изобретения субъектом является по меньшей мере один из: субъекта пожилого возраста, субъекта с серьезным соматическим заболеванием и субъекта, страдающего от белково-энергетической недостаточности. В некоторых вариантах реализации изобретения субъект потребляет пищевой белок по данному раскрытию, питательную композицию по данному раскрытию или питательную композицию, приготовленную способом согласно данному раскрытию, согласованно с выполнением физической нагрузки. В некоторых вариантах реализации изобретения субъект потребляет пищевой белок по данному раскрытию, питательную композицию по данному раскрытию или питательную композицию, приготовленную способом согласно данному раскрытию, оральным, энтеральным или парентеральным путем.

[0036] В другом аспекте изобретения в данном раскрытии предложены способы предоставления белка субъекту с белково-энергетической недостаточностью, причем способ включает предоставление субъекту достаточного количества пищевого белка по данному раскрытию, питательной композиции по данному раскрытию или питательной композиции, приготовленной способом согласно данному раскрытию. В некоторых вариантах реализации субъект потребляет пищевой белок по данному раскрытию, питательную композицию по данному раскрытию или питательную композицию, приготовленную способом согласно данному раскрытию, согласованно с выполнением физической нагрузки. В некоторых вариантах реализации изобретения субъект потребляет пищевой белок по данному раскрытию, питательную композицию по данному раскрытию или питательную композицию, приготовленную способом согласно данному раскрытию, оральным, энтеральным или парентеральным путем.

[0037] В другом аспекте изобретения в данном раскрытии предложены способы увеличения термогенеза у субъекта, причем указанный способ реализации изобретения включает предоставление субъекту достаточного количества пищевого белка по данному раскрытию, питательной композиции по данному раскрытию или питательной композиции, приготовленной способом согласно данному раскрытию. В некоторых вариантах реализации изобретения субъект потребляет пищевой белок по данному раскрытию, питательную композицию по данному раскрытию или питательную композицию, приготовленную способом согласно данному раскрытию, согласованно с выполнением физической нагрузки. В некоторых вариантах реализации изобретения субъект страдает ожирением. В некоторых вариантах реализации изобретения субъект потребляет пищевой белок по данному раскрытию, питательную композицию по данному раскрытию или питательную композицию, приготовленную способом согласно данному раскрытию, оральным, энтеральным или парентеральным путем.

[0038] В другом аспекте изобретения в данном раскрытии предложены способы индукции по меньшей мере одного из чувства насыщения и чувства сытости у субъекта, причем указанный способ включает предоставление субъекту достаточного количества пищевого белка по данному раскрытию, питательной композиции по данному раскрытию или питательной композиции, приготовленной способом согласно данному раскрытию. В некоторых вариантах реализации изобретения субъект страдает ожирением. В некоторых вариантах реализации изобретения субъект потребляет пищевой белок по данному раскрытию, питательную композицию по данному раскрытию или питательную композицию, приготовленную способом согласно данному раскрытию, согласованно с выполнением физической нагрузки. В некоторых вариантах реализации изобретения субъект потребляет пищевой белок по данному раскрытию, питательную композицию по данному раскрытию или питательную композицию, приготовленную способом согласно данному раскрытию, оральным, энтеральным или парентеральным путем.

[0039] В другом аспекте изобретения в данном раскрытии предложены способы лечения по меньшей мере одного из кахексии, саркопении и слабости у субъекта, причем указанный способ реализации изобретения включает предоставление субъекту достаточного количества пищевого белка по данному раскрытию, питательной композиции по данному раскрытию или питательной композиции, приготовленной способом согласно данному раскрытию. В некоторых вариантах реализации изобретения субъект потребляет пищевой белок по данному раскрытию, питательную композицию по данному раскрытию или питательную композицию, приготовленную способом согласно данному раскрытию, оральным, энтеральным или парентеральным путем.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ ИЗОБРАЖЕНИЙ

[0040] На фигуре 1 проиллюстрирована двухмерная гистограмма, на которой обозначено относительное правдоподобие (в логарифмическом масштабе) экспрессии белка при скрининге в E. coli в зависимости от сольватного числа (ось y) и агрегационного числа (ось х).

[0041] На фигуре 2 проиллюстрирована двухмерная гистограмма, на которой обозначено относительное правдоподобие (в логарифмическом масштабе) для белка, который экспрессирован в растворимой форме, при скрининге в E. coli в зависимости от сольватного числа (ось y) и агрегационного числа (ось х).

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0042] Если в данном документе не указано иное, научные и технические термины, использованные в связи с настоящим раскрытием, должны иметь значения, которые обычно понятны специалистам в данной области техники. Дополнительно, если не требуется иное по контексту, термины в единственном числе должны включать форму множественного числа и термины во множественном числе должны включать форму единственного числа. В общих чертах, использованная терминология и методики биохимии, энзимологии, молекулярной и клеточной биологии, микробиологии, генетики и химии белков и нуклеиновых кислот, а также гибридизации, описанные в данном документе, хорошо известны и широко используются в данной области техники. Определенные ссылочные материалы и другие документы, цитированные в данном документе, явным образом включены в указанный документ посредством ссылки. В дополнение к этому, все данные UniProt/SwissProt, цитированные в данном документе, тем самым включены в указанный документ посредством ссылки. В случае противоречий настоящее описание, включающее определения, будет иметь преимущественную силу. Материалы, способы и примеры служат только в иллюстративных целях и не носят ограничительного характера.

[0043] Способы и методики настоящего раскрытия, как правило, осуществляют в соответствии с традиционными способами, которые широко известны в данной области техники и которые описаны в различных общих и более специализированных ссылочных материалах, которые цитируются и обсуждаются на протяжении всего настоящего описания, если не указано иное. См., например, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001); Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992, и дополнения к 2002); Taylor and Drickamer, Introduction to Glycobiology, Oxford Univ. Press (2003); Worthington Enzyme Manual, Worthington Biochemical Corp., Freehold, N.J.; Handbook of Biochemistry: Section A Proteins, Vol I, CRC Press (1976); Handbook of Biochemistry: Section A Proteins, Vol II, CRC Press (1976); Essentials of Glycobiology, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1999). Многие методики молекулярной биологии и генетики, применимые к цианобактериям, описаны в Heidorn et al., «Synthetic Biology in Cyanobacteria: Engineering and Analyzing Novel Functions,» Methods in Enzymology, Vol. 497, Ch. 24 (2011), который тем самым включен в указанный документ посредством ссылки.

[0044] Настоящее раскрытие относится к данным, введенным в базу данных по последовательностям (например, UniProt/SwissProt), для определенных последовательностей белков и генов, которые опубликованы в Интернете, а также другой информации в Интернете. Специалист в данной области техники понимает, что информация в Интернете, включающая данные, введенные в базу данных по последовательностям, периодически обновляется, и что, например, идентификационный номер, который используется для обозначения конкретной последовательности, может изменяться. В случае обращения к общедоступной базе данных, содержащей информацию о последовательностях или другую информацию в Интернете, понятно, что могут происходить такие изменения, и конкретные варианты реализации информации в Интернете могут сменять друг друга. Поскольку специалист в данной области техники может найти эквивалентную информацию через поиск в Интернете, ссылка на адрес веб-страницы в Интернете или данные, введенные в базу данных по последовательностям, свидетельствует о доступности и свободном распространении рассматриваемой информации.

[0045] Перед описанием и раскрытием настоящих белков, композиций, способов и других вариантов реализации изобретения надо понимать, что терминология, использованная в данном документе, приводится только с целью описания конкретных вариантов реализации и не носит ограничительного характера. Надо отметить, что используемые в настоящем описании и прилагаемой формуле изобретения формы единственного числа включают объекты ссылки в форме множественного числа, если контекст явно не подразумевает иного.

[0046] Термин «содержащий», в контексте данного документа, является синонимом по отношению к терминам «включающий» или «содержащий в себе» и является включающим или неограничивающим и не исключает дополнительные, неперечисленные детали, элементы или этапы способа реализации изобретения.

[0047] В данном раскрытии упоминаются аминокислоты. Полное название данных аминокислот используют взаимозаменяемо со стандартными трехбуквенными обозначениями и однобуквенными сокращениями для каждой аминокислоты. Во избежание неправильного толкования, этими аминокислотами являются: Аланин (Ala, A), Аргинин (Arg, R), Аспарагин (Asn, N), Аспарагиновая кислота (Asp, D), Цистеин (Cys, C), Глутаминовая кислота (Glu, E), Глутамин (Gln, Q), Глицин (Gly, G), Гистидин (His, H), Изолейцин (Ile, I), Лейцин (Leu, L), Лизин (Lys, K), Метионин (Met, M), Фенилаланин (Phe, F), Пролин (Pro, P), Серин (Ser, S), Треонин (Thr, T), Триптофан (Trp, W), Тирозин (Tyr, Y), Валин (Val, V).

[0048] В контексте данного документа термин «in vitro» относится к событиям, которые происходят в искусственной среде, например, в пробирке или реакционном сосуде, в культуре клеток, в чашке Петри и т.д., а не внутри организма (например, животного, растения или микроорганизма).

[0049] В контексте данного документа термин «in vivo» относится к событиям, которые происходят внутри организма (например, животного, растения или микроорганизма).

[0050] В контексте данного документа термин «выделенный» относится к веществу или соединению, которое (1) отделили по меньшей мере от некоторых из компонентов, с которыми оно было связано при первоначальном получении (либо в природе, либо в экспериментальных условиях) и/или (2) получено, приготовлено и/или изготовлено человеком. Выделенные вещества и/или соединения можно отделить по меньшей мере от около 10%, около 20%, около 30%, около 40%, около 50%, около 60%, около 70%, около 80%, около 90% или более других компонентов, с которыми они были первоначально связаны. В некоторых вариантах реализации изобретения выделенные средства являются чистыми более чем на около 80%, около 85%, около 90%, около 91%, около 92%, около 93%, около 94%, около 95%, около 96%, около 97%, около 98%, около 99% или более чем на около 99%. В контексте данного документа вещество является «чистым», если оно по существу не содержит других компонентов.

[0051] В контексте данного документа «аминокислота с разветвленной цепью» представляет собой аминокислоту, выбранную из Лейцина, Изолейцина и Валина.

[0052] В контексте данного документа «незаменимая аминокислота» представляет собой аминокислоту, выбранную из Гистидина, Изолейцина, Лейцина, Лизина, Метионина, Фенилаланина, Треонина, Триптофана и Валина.

[0053] Термин «пептид» в контексте данного документа относится к короткому полипептиду, например, полипептиду, который обычно содержит менее чем около 50 аминокислот и, более типично, менее чем около 30 аминокислот. Указанный термин в контексте данного документа охватывает аналоги и миметики, которые имитируют структурную и, таким образом, биологическую функцию.

[0054] Термин «полипептид» охватывает как встречающиеся в природе, так и не встречающиеся в природе белки и фрагменты, мутанты, производные и их аналоги. Полипептид может быть мономерным или полимерным. Дополнительно полипептид может содержать ряд разных доменов, каждый из которых обладает одной или несколькими различными активностями. Во избежание неправильного толкования, «полипептид» может иметь любую длину больше двух аминокислот.

[0055] Термин «выделенный белок» или «выделенный полипептид» означает белок или полипептид, который в силу своего происхождения или источника получения (1) не связан с природными компонентами, которые сопровождают его в естественном состоянии, (2) характеризуется чистотой, которая не встречается в природе, при том, что чистоту можно регулировать относительно присутствия другого клеточного материала (например, не содержит других белков из одного и того же вида) (3) экспрессируется клеткой из другого вида или (4) не встречается в природе (например, он представляет собой фрагмент полипептида, который встречается в природе, или включает аминокислотные аналоги или производные, которые не встречаются в природе, или связи, отличные от стандартных пептидных связей). Соответственно, полипептид, который синтезируют с помощью химических методов или синтезируют в клеточной системе, отличающейся от клетки, в которой он образуется в природе, будет считаться «выделенным» из компонентов, с которыми он связан в природе. Можно сделать так, чтобы полипептид или белок также по существу не содержал компонентов, с которыми он связан в природе, путем выделения с использованием методик очистки белков, широко известных в данной области техники. Таким образом, согласно такому определению «выделенный» необязательно требует, чтобы указанный белок, полипептид, пептид или олигопептид, описанный в данном случае, был физически выделен из клетки, в которой он синтезировался.

[0056] Термин «полипептидный фрагмент» в контексте данного документа относится к полипептиду, в котором имеется делеция, например, аминоконцевая и/или карбоксиконцевая делеция по сравнению с полноразмерным полипептидом, таким как встречающийся в природе белок. В одном варианте реализации изобретения полипептидный фрагмент представляет собой непрерывную последовательность, в которой аминокислотная последовательность данного фрагмента идентична по соответствующим положениям встречающейся в природе последовательности. Длина фрагментов обычно составляет по меньшей мере 5, 6, 7, 8, 9 или 10 аминокислот, или по меньшей мере 12, 14, 16 или 18 аминокислот, или по меньшей мере 20 аминокислот, или по меньшей мере 25, 30, 35, 40 или 45 аминокислот, или по меньшей мере 50 или 60 аминокислот, или по меньшей мере 70 аминокислот.

[0057] Термин «слитый белок» относится к полипептиду, содержащему полипептид или фрагмент, соединенному с гетерологичными аминокислотными последовательностями. Слитые белки являются подходящими, потому что их можно сконструировать таким образом, чтобы они содержали два или более необходимых функциональных элемента, которые можно получить из двух или более разных белков. Слитый белок содержит по меньшей мере 10 непрерывных аминокислот из представляющего интерес полипептида или по меньшей мере 20 или 30 аминокислот, или по меньшей мере 40, 50 или 60 аминокислот, или по меньшей мере 75, 100 или 125 аминокислот. Длина гетерологичного полипептида, включенного в состав слитого белка, обычно составляет по меньшей мере 6 аминокислот или по меньшей мере 8 аминокислот, или по меньшей мере 15, 20 или 25 аминокислот. Слитые белки, которые включают большие полипептиды, такие как Fc-область IgG и даже целые белки, такие как белки, содержащие хромофор зеленого флуоресцентного белка («GFP»), имеют особенную практическую ценность. Слитые белки можно получить с использованием технологии рекомбинантной ДНК путем конструирования последовательности нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид или его фрагмент, в рамке считывания с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей другой белок или пептид, и затем путем экспрессии слитого белка. В качестве альтернативы слитый белок можно получить с помощью химических методов путем перекрестного сшивания полипептида или его фрагмента с другим белком.

[0058] В контексте данного документа белок обладает «гомологией» или является «гомологичным» по отношению ко второму белку, если последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует указанный белок, имеет схожую последовательность с последовательностью нуклеиновой кислоты, которая кодирует второй белок. В качестве альтернативы белок обладает гомологией по отношению ко второму белку, если два белка имеют схожие аминокислотные последовательности. (Соответственно, термин «гомологичные белки» определяется таким образом, что он означает, что два белка имеют схожие аминокислотные последовательности). В контексте данного документа гомологию между двумя областями аминокислотной последовательности (особенно, что касается предсказанных степеней структурного сходства) истолковывают таким образом, что она подразумевает функциональное сходство.

[0059] В тех случаях, когда термин «гомологичный» используют в отношении белков или пептидов, признано, что положения остатков, которые не являются идентичными, часто отличаются по консервативным аминокислотным заменам. «Консервативная аминокислотная замена» представляет собой замену, при которой аминокислотный остаток заменяется на другой аминокислотный остаток, имеющий боковую цепь (R-группу) со схожими химическими свойствами (например, заряд или гидрофобность). В целом, консервативная аминокислотная замена по существу не изменяет функциональные свойства белка. В случаях, когда две или более аминокислотные последовательности отличаются друг от друга по консервативным заменам, идентичность последовательностей в процентах или степень гомологии можно повысить, чтобы ввести поправку на консервативную природу замены. Способы введения таких корректив широко известны специалистам в данной области техники. См., например, Pearson, 1994, Methods Mol. Biol. 24:307-31 и 25:365-89.

[0060] Каждая из следующих шести групп содержит аминокислоты, которые являются консервативными заменами друг для друга: 1) Серин, Треонин; 2) Аспарагиновая кислота, Глутаминовая кислота; 3) Аспарагин, Глутамин;4) Аргинин, Лизин; 5) Изолейцин, Лейцин, Метионин, Аланин, Валин и 6) Фенилаланин, Тирозин, Триптофан.

[0061] Гомологию последовательностей в случае полипептидов, которую также называют идентичностью последовательностей в процентах, обычно измеряют с применением программного обеспечения для анализа последовательностей. См., например, пакет программ для анализа последовательностей Genetics Computer Group (GCG), Wisconsin Biotechnology Center, 910 University Avenue, Madison, Wis. 53705. Программное обеспечение для анализа белков сопоставляет схожие последовательности с применением меры гомологии, которая присваивается различным заменам, делециям и другим модификациям, включающим консервативные аминокислотные замены. Например, GCG имеет программы, такие как «Gap» и «Bestfit», которые можно применять с использованием параметров, принимающих значение по умолчанию, для определения гомологии последовательностей или идентичности последовательностей между близкородственными полипептидами, такими как гомологичные полипептиды из разных видов организмов, или между белком дикого типа и его мутеином. См., например, GCG Version 6.1.

[0062] Иллюстративный алгоритм при сопоставлении конкретной полипептидной последовательности с базой данных, содержащей большое количество последовательностей из разных организмов, имеет компьютерная программа BLAST (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990); Gish and States, Nature Genet. 3:266-272 (1993); Madden et al., Meth. Enzymol. 266:131-141 (1996); Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 (1997); Zhang and Madden, Genome Res. 7:649-656 (1997)), особенно blastp или tblastn (Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 (1997)).

[0063] Иллюстративными параметрами для BLASTp являются: ожидаемое значение: 10 (по умолчанию); Filter: seg (по умолчанию); штраф за открытие пробела: 11 (по умолчанию); штраф за удлинение пробела: 1 (по умолчанию); максимальные выравнивания: 100 (по умолчанию); длина слова: 11 (по умолчанию); № описаний: 100 (по умолчанию); матрица штрафов: BLOWSUM62. Длина полипептидных последовательностей, которые сопоставляют в отношении гомологии, как правило, будет составлять по меньшей мере около 16 аминокислотных остатков или по меньшей мере около 20 остатков, или по меньшей мере около 24 остатков, или по меньшей мере около 28 остатков, или более чем около 35 остатков. При поиске в базе данных, содержащей последовательности из большого количества разных организмов, может быть целесообразным сопоставление аминокислотных последовательностей. Поиск в базе данных с применением аминокислотных последовательностей можно оценить с помощью алгоритмов, известных в данной области техники, отличных от blastp. Например, полипептидные последовательности можно сопоставить с применением FASTA, программа GCG Version 6.1. FASTA обеспечивает возможность выравнивания и определения идентичности последовательностей в процентах областей наилучшего перекрывания между запрашиваемыми и найденными последовательностями. Pearson, Methods Enzymol. 183:63-98 (1990). Например, идентичность последовательностей в процентах между аминокислотными последовательностями можно определить с применением FASTA с параметрами, принимающими значение по умолчанию (длина слова 2 и матрица баллов PAM250), в соответствии с GCG Version 6.1, которая включена в указанный документ посредством ссылки.

[0064] В некоторых вариантах реализации изобретения полимерные молекулы (например, полипептидная последовательность или последовательность нуклеиновой кислоты) считаются «гомологичными» друг с другом, если их последовательности идентичны по меньшей мере на 25%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 35%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 45%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 55%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 65%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 99%. В некоторых вариантах реализации изобретения полимерные молекулы считаются «гомологичными» друг с другом, если их последовательности схожи по меньшей мере на 25%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 35%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 45%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 55%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 65%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 99%. Термин «гомологичный» обязательно относится к сопоставлению по меньшей мере двух последовательностей (нуклеотидных последовательностей или аминокислотных последовательностей). В некоторых вариантах реализации изобретения две нуклеотидные последовательности считаются гомологичными, если полипептиды, которые они кодируют, являются по меньшей мере на около 50% идентичными, по меньшей мере на около 60% идентичными, по меньшей мере на около 70% идентичными, по меньшей мере на около 80% идентичными или по меньшей мере на около 90% идентичными в случае по меньшей мере одного фрагмента, состоящего по меньшей мере из около 20 аминокислот. В некоторых вариантах реализации изобретения гомологичные нуклеотидные последовательности отличаются способностью кодировать фрагмент, состоящий по меньшей мере из 4-5 однозначно определенных аминокислот. Для того чтобы нуклеотидные последовательности считались гомологичными, необходимо учитывать как идентичность, так и приблизительное пространственное распределение этих аминокислот по отношению друг к другу. В некоторых вариантах реализации изобретения нуклеотидных последовательностей длиной менее чем 60 нуклеотидов гомологию определяют по способности кодировать фрагмент, состоящий по меньшей мере из 4-5 однозначно определенных аминокислот. В некоторых вариантах реализации изобретения две белковые последовательности считаются гомологичными, если белки являются по меньшей мере на около 50% идентичными, по меньшей мере на около 60% идентичными, по меньшей мере на около 70% идентичными, по меньшей мере на около 80% идентичными или по меньшей мере на около 90% идентичными в случае одного фрагмента, состоящего по меньшей мере из около 20 аминокислот.

[0065] В контексте данного документа «модифицированное производное» относится к полипептидам или их фрагментам, которые по существу являются гомологичными по первичной структуре с эталонной полипептидной последовательностью, но которые включают, например, химические и биохимические модификации in vivo или in vitro, или которые включают аминокислоты, которые не встречаются в эталонном полипептиде. Такие модификации включают, например, ацетилирование, карбоксилирование, фосфорилирование, гликозилирование, убиквитинирование, мечение, например, радиоактивными изотопами, и различные ферментативные модификации, которые без труда понятны специалистам в данной области техники. Для достижения таких целей в данной области техники широко известен целый ряд подходящих способов мечения полипептидов и замещающих групп или меток, и они включают радиоактивные изотопы, такие как 125I, 32P, 35S и 3H, лиганды, которые связываются с меченными антилигандами (например, антителами), флуорофоры, хемилюминесцентные средства, ферменты и антилиганды, которые могут выступать в качестве специфических элементов пары по связыванию для меченного лиганда. Выбор метки зависит от требуемой чувствительности, легкости конъюгирования с праймером, требований к стабильности и доступных измерительных приборов. Способы мечения полипептидов широко известны в данной области техники. См., например, Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992 и дополнения к 2002).

[0066] В контексте данного документа «полипептидный мутант» или «мутеин» относится к полипептиду, в последовательности которого содержится инсерция, дупликация, делеция, реаранжировка или замена одной или нескольких аминокислот по сравнению с аминокислотной последовательностью эталонного белка или полипептида, такого как естественный белок или белок дикого типа. Мутеин может иметь одну или несколько аминокислотных точечных замен, при которых одна аминокислота в данном положении заменяется другой аминокислотой, одну или несколько инсерций и/или делеций, при которых соответственно происходит встраивание или удаление одной или нескольких аминокислот в последовательности эталонного белка, и/или усечения аминокислотной последовательности либо на одном, либо обоих N- или С-концах. Мутеин может обладать такой же или другой биологической активностью по сравнению с эталонным белком.

[0067] В некоторых вариантах реализации изобретения общая гомология последовательности мутеина с соответствующим эталонным белком составляет, например, по меньшей мере 85%. В некоторых вариантах реализации изобретения общая гомология последовательности мутеина с белком дикого типа составляет по меньшей мере 90%. В других вариантах реализации изобретения идентичность последовательности мутеина составляет по меньшей мере 95% или 98%, или 99%, или 99,5%, или 99,9% общей идентичности последовательностей.

[0068] В контексте данного документа «полипептидная метка для аффинной очистки» представляет собой любой полипептид, который имеет партнера по связыванию, который можно применять для выделения или очистки второго белка или полипептидной последовательности, представляющих интерес, слитых с первым «меченым» полипептидом. Несколько примеров широко известны в данной области техники и включают метку His-6, эпитоп FLAG, эпитоп c-myc, Strep-TAGII, биотиновую метку, глутатион 5-трансферазу (GST), белок, связывающий хитин (CBP), белок, связывающий мальтозу (MBP) или аффинную метку, включающую металл.

[0069] В контексте данного документа «рекомбинантный» относится к биомолекуле, например, гену или белку, который (1) выделили из естественной среды, (2) не связан со всем или частью полинуклеотида, в котором ген встречается в природе, (3) функционально связан с полинуклеотидом, с которым он не связан в природе или (4) не встречается в природе. Термин «рекомбинантный» можно использовать в отношении изолятов клонированной ДНК, полинуклеотидных аналогов, синтезированных с помощью химических методов, или полинуклеотидных аналогов, которые синтезированы с помощью биологических методов с применением гетерологичных систем, а также белков и/или мРНК, кодируемых такими нуклеиновыми кислотами. Соответственно, например, белок, синтезированный микроорганизмом, будет считаться рекомбинантным, например, если он синтезирован на основе мРНК, синтезированной на основе рекомбинантного гена, который присутствует в клетке.

[0070] Термин «полинуклеотид», «молекула нуклеиновой кислоты», «нуклеиновая кислота» или «последовательность нуклеиновой кислоты» относится к полимерной форме нуклеотидов, длиной по меньшей мере 10 оснований. Термин охватывает молекулы ДНК (например, кДНК или геномную или синтетическую ДНК) и молекулы РНК (например, мРНК или синтетическую РНК), а также аналоги ДНК или РНК, содержащие не встречающиеся в природе нуклеотидные аналоги, не встречающиеся в природе межнуклеозидные связи или и то, и другое. Нуклеиновая кислота может иметь любую топологическую конформацию. Например, нуклеиновая кислота может иметь одноцепочечную, двухцепочечную, трехцепочечную, квадруплексную, частично двухцепочечную, с разветвленной структурой, шпилечную, кольцевую или запертую конформацию.

[0071] «Синтетическая» РНК, ДНК или сополимер представляют собой полимер, который создается вне клетки, например, полимер, который синтезируется с помощью химических методов.

[0072] Термин «фрагмент нуклеиновой кислоты» в контексте данного документа относится к последовательности нуклеиновой кислоты, в которой присутствует делеция, например, 5’-концевая или 3’-концевая делеция в сопоставлении с полноразмерной эталонной нуклеотидной последовательностью. В одном варианте реализации изобретения фрагмент нуклеиновой кислоты представляет собой непрерывную последовательность, причем нуклеотидная последовательность данного фрагмента идентична соответствующим положениям, которые находятся во встречающейся в природе последовательности. В некоторых вариантах реализации изобретения длина фрагментов составляет по меньшей мере 10, 15, 20 или 25 нуклеотидов или по меньшей мере 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140 или 150 нуклеотидов. В некоторых вариантах реализации изобретения фрагмент последовательности нуклеиновой кислоты представляет собой фрагмент последовательности открытой рамки считывания. В некоторых вариантах реализации изобретения такой фрагмент кодирует полипептидный фрагмент (как определено в данном документе) белка, кодируемого нуклеотидной последовательностью открытой рамки считывания.

[0073] В контексте данного документа эндогенная последовательность нуклеиновой кислоты в геноме организма (или белковый продукт, кодируемый данной последовательностью) считается «рекомбинантным» в данном документе, если гетерологичная последовательность располагается рядом с эндогенной последовательностью нуклеиновой кислоты таким образом, что изменяется экспрессия этой эндогенной последовательности нуклеиновой кислоты. В этом контексте гетерологичная последовательность представляет собой последовательность, которая в природе не располагается рядом с эндогенной последовательностью нуклеиновой кислоты, независимо от того, является ли сама гетерологичная последовательность эндогенной (происходит из одной и той же клетки-хозяина или ее потомства) или экзогенной (происходит из другой клетки-хозяина или ее потомства) или нет. К примеру, последовательность промотора может заменяться (например, посредством гомологичной рекомбинации) естественным промотором гена в геноме клетки-хозяина, таким образом, что изменяется характер экспрессии данного гена. Этот ген в данном случае становится «рекомбинантным», потому что его отделили по меньшей мере от некоторых последовательностей, которые фланкируют его в природе.

[0074] Нуклеиновая кислота также считается «рекомбинантной», если она содержит любые модификации, которые не встречаются в природе в соответствующей нуклеиновой кислоте в геноме. Например, эндогенная кодирующая последовательность считается «рекомбинантной», если она содержит инсерцию, делецию или точечную мутацию после искусственного введения, например, посредством вмешательства человека. «Рекомбинантная нуклеиновая кислота» также включает нуклеиновую кислоту, интегрированную в хромосому клетки-хозяина в гетерологичном сайте, и конструкт, состоящий из нуклеиновой кислоты, который присутствует в виде эписомы.

[0075] В контексте данного документа словосочетание «вырожденный вариант» эталонной последовательности нуклеиновой кислоты охватывает последовательности нуклеиновых кислот, которые могут транслироваться в соответствии со стандартным генетическим кодом, с получением аминокислотной последовательности, идентичной последовательности, которая транслируется из эталонной последовательности нуклеиновой кислоты. Термин «вырожденный олигонуклеотид» или «вырожденный праймер» применяют для обозначения олигонуклеотида, способного к гибридизации с целевыми последовательностями нуклеиновых кислот, которые необязательно идентичны по последовательности но, которые гомологичны друг другу в пределах одного или нескольких конкретных сегментов.

[0076] Термин «идентичность последовательностей в процентах» или «идентичные» применительно к последовательностям нуклеиновых кислот относится к остаткам, которые находятся в двух последовательностях, которые являются одинаковыми при выравнивании в случае максимального совпадения. Длина последовательностей, которая используется для сопоставления идентичности, может превышать длину фрагмента, состоящего по меньшей мере из около девяти нуклеотидов, обычно по меньшей мере из около 20 нуклеотидов, более типично по меньшей мере из около 24 нуклеотидов, обычно по меньшей мере из около 28 нуклеотидов, более типично по меньшей мере из около 32 нуклеотидов и даже более типично по меньшей мере из около 36 или более нуклеотидов. Существует целый ряд разных алгоритмов, известных в данной области техники, которые можно применять для измерения идентичности нуклеотидных последовательностей. Например, полинуклеотидные последовательности можно сопоставить с применением FASTA, Gap или Bestfit, которые представляют собой программы, находящиеся в Wisconsin Package Version 10,0, Genetics Computer Group (GCG), Madison, Wis. FASTA обеспечивает возможность выравнивания и определения идентичности последовательностей в процентах областей наилучшего перекрывания между запрашиваемыми и найденными последовательностями. Pearson, Methods Enzymol. 183:63-98 (1990). Например, идентичность последовательностей в процентах между последовательностями нуклеиновых кислот можно определить с применением FASTA с параметрами, принимающими значение по умолчанию (длина слова 6 и фактор NOPAM в случае матрицы баллов) или с применением Gap с параметрами, принимающими значение по умолчанию в соответствии с GCG Version 6.1, которая включена в указанный документ посредством ссылки. В качестве альтернативы последовательности можно сопоставить с применением компьютерной программы BLAST (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990); Gish and States, Nature Genet. 3:266-272 (1993); Madden et al., Meth. Enzymol. 266:131-141 (1996); Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 (1997); Zhang and Madden, Genome Res. 7:649-656 (1997)), особенно blastp или tblastn (Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 (1997)).

[0077] Термин «существенная гомология» или «существенное сходство» при ссылке на нуклеиновую кислоту или ее фрагмент означает, что при оптимальном выравнивании с соответствующими нуклеотидными инсерциями или делециями с другой нуклеиновой кислотой (или ее комплементарной цепью), идентичность нуклеотидных последовательностей составляет по меньшей мере около 76%, 80%, 85% или по меньшей мере около 90% или по меньшей мере около 95%, 96%, 97%, 98% или 99% нуклеотидных оснований, которую измеряют с помощью любого широко известного алгоритма определения идентичности последовательностей, такого как FASTA, BLAST или Gap, как обсуждалось выше.

[0078] В качестве альтернативы существенная гомология или сходство имеется в тех случаях, когда нуклеиновая кислота или ее фрагмент гибридизируется с другой нуклеиновой кислотой, с цепью другой нуклеиновой кислоты или с ее комплементарной цепью в жестких условиях гибридизации. «Жесткие условия гибридизации» и «жесткие условия отмывки» применительно к экспериментам по гибридизации нуклеиновых кислот зависят от ряда разных физических параметров. На гибридизацию нуклеиновых кислот будут воздействовать такие условия, как концентрация солей, температура, растворители, состав оснований гибридизируемых видов, длина комплементарной области и количество несовпадений нуклеотидных оснований между гибридизируемыми нуклеиновыми кислотами, что без труда понятно специалистам в данной области техники. Специалист в данной области техники знает, как варьировать этими параметрами для достижения конкретной жесткости гибридизации.

[0079] В целом, «жесткую гибридизацию» осуществляют при около 25°C ниже тепловой точки плавления (Tm) в случае конкретного ДНК-гибрида при определенном наборе условий. «Жесткую отмывку» осуществляют при температурах на около 5°C ниже Tm в случае конкретного ДНК-гибрида при определенном наборе условий. Tm представляет собой температуру, при которой 50% целевой последовательности гибридизируется с идеально подобранным зондом. См. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ded., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989), страница 9,51, который содержится в данном документе в виде ссылки. Для целей данного документа «жесткие условия» определяют для гибридизации в жидкой фазе в виде гибридизации в воде (т.е., в отсутствие формамида) в 6xSSC (где 20xSSC содержит 3,0 M NaCl и 0,3 M цитрат натрия), 1% SDS при 65°C в течение 8-12 часов с последующими двумя отмывками в 0,2xSSC, 0,1% SDS при 65°C в течение 20 минут. Специалистам понятно, что гибридизация при 65°C будет происходить с разными скоростями в зависимости от ряда факторов, включающих длину и процент идентичности последовательностей, которые подвергают гибридизации.

[0080] В контексте данного документа «последовательность, обеспечивающая контроль экспрессии», относится к полинуклеотидным последовательностям, которые необходимы для оказания влияния на экспрессию кодирующих последовательностей, с которыми они функционально связаны. Последовательности, обеспечивающие контроль экспрессии, представляют собой последовательности, которые контролируют транскрипцию, посттранскрипционные события и трансляцию последовательностей нуклеиновых кислот. Последовательности, обеспечивающие контроль экспрессии, включают соответствующие последовательности для инициации транскрипции, терминации, промоторные и энхансерные последовательности; эффективные сигналы для процессинга РНК, такие как сигналы сплайсинга и полиаденилирования; последовательности, которые стабилизируют цитоплазматическую мРНК; последовательности, которые повышают эффективность трансляции (например, сайты связывания рибосом); последовательности, которые повышают стабильность белков; и при желании последовательности, которые повышают секрецию белков. Природа таких эталонных последовательностей отличается в зависимости от организма хозяина; у прокариот такие эталонные последовательности, как правило, включают промотор, сайт связывания рибосом и последовательность для терминации транскрипции. Подразумевается, что термин «эталонные последовательности» охватывает, как минимум, любой компонент, присутствие которого имеет существенное значение для экспрессии, и также может охватывать дополнительный компонент, присутствие которого является преимущественным, например, лидерные последовательности и последовательности партнера по слиянию.

[0081] В контексте данного документа термин «функционально связанные последовательности, обеспечивающие контроль экспрессии», относится к связи, при которой последовательность, обеспечивающая контроль экспрессии, примыкает к гену, представляющему интерес, для контроля гена, представляющего интерес, а также относится к последовательностям, обеспечивающим контроль экспрессии, которые действуют в трансположении или на расстоянии для контроля гена, представляющего интерес.

[0082] В контексте данного документа подразумевается, что «вектор» относится к молекуле нуклеиновой кислоты, способной транспортировать другую нуклеиновую кислоту, с которой он был связан. Одним из типов вектора является «плазмида», которая, как правило, относится к петле, состоящей из кольцевой двухцепочечной ДНК, в которую можно лигировать дополнительные сегменты ДНК, но также включает линейные двухцепочечные молекулы, такие как молекулы, полученные в результате амплификации с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), или в результате обработки кольцевой плазмиды рестриктазой. Другие векторы включают космиды, бактериальные искусственные хромосомы (BAC) и искусственные хромосомы дрожжей (YAC). К другому типу вектора относится вирусный вектор, отличающийся тем, что дополнительные сегменты ДНК можно лигировать в вирусный геном (обсуждается более подробно ниже). Определенные векторы способны к автономной репликации в клетке хозяина, в которую их вводят (например, векторы, имеющие точку начала репликации, которая функционирует в клетке хозяина). Другие векторы могут интегрироваться в геном клетки-хозяина после введения в клетку хозяина и вследствие этого могут реплицироваться наряду с геномом клетки-хозяина. Более того, определенные векторы способны направлять экспрессию генов, с которыми они функционально связаны. Такие векторы в данном документе называются «рекомбинантными экспрессирующими векторами» (или просто «экспрессирующими векторами»).

[0083] Подразумевается, что термин «рекомбинантная клетка хозяина» (или просто «рекомбинантная клетка» или «клетка хозяина») в контексте данного документа относится к клетке, в которую ввели рекомбинантную нуклеиновую кислоту, такую как рекомбинантный вектор. В отдельных случаях определение «клетка» заменяют названием, которое конкретизирует тип клетки. Например, «рекомбинантным микроорганизмом» является рекомбинантная клетка хозяина, которая представляет собой клетку-хозяина микроорганизма и «рекомбинантной цианобактерией» является рекомбинантная клетка хозяина, которая представляет собой клетку-хозяина цианобактерии. Надо понимать, что такие термины предназначены для обозначения не только конкретной исследуемой клетки, но и потомства такой клетки. Поскольку в последующих поколениях могут происходить определенные модификации либо вследствие мутации, либо влияния окружающей среды, такое потомство фактически не должно быть идентичным родительской клетке, но, тем не менее, охватывается термином «рекомбинантная клетка хозяина», «рекомбинантная клетка» и «клетка хозяина» в контексте данного документа. В качестве рекомбинантной клетки хозяина может выступать выделенная клетка или клеточная линия, выращенная в культуре, или клетка, которая находится в живой ткани или организме.

[0084] В контексте данного документа термин «гетеротрофный» относится к организму, который не может фиксировать углерод и использует органический углерод для роста.

[0085] В контексте данного документа термин «автотрофный» относится к организму, который продуцирует сложные органические соединения (такие как углеводы, жиры и белки) из простых неорганических молекул с использованием энергии света (путем фотосинтеза) или неорганических химических реакций (хемосинтез).

[0086] В контексте данного документа «мышечная масса» относится к весу мышц в организме субъекта. Мышечная масса включает скелетные мышцы, гладкие мышцы (такие как сердечные мышцы и мышцы пищеварительной системы) и воду, которая содержится в этих мышцах. Мышечную массу конкретных мышц можно определить с применением двухэнергетической рентгеновской абсорбциометрии (ДЭРА) (Padden-Jones et al., 2004). Общую безжировую массу тела (за вычетом жира), общую массу тела и содержание минералов в кости также можно измерить с помощью ДЭРА. В некоторых вариантах реализации изобретения определяют изменение массы конкретной мышцы субъекта, например, с помощью ДЭРА, и данное изменение применяют в качестве показателя общего изменения мышечной массы субъекта. Соответственно, например, если субъект потребляет пищевой белок, который раскрывается в данном документе, и через некоторое время увеличивается масса конкретной мышцы или группы мышц, можно сделать вывод, что у субъекта произошло увеличение мышечной массы.

[0087] В контексте данного документа термин «мышечная сила» относится к величине усилия, которое может производиться мышцей за счет одиночного максимального усилия. Существует два типа мышечной силы, статическая сила и динамическая сила. Статическая сила относится к изометрическому сокращению мышцы, если мышца развивает усилие, тогда как длина мышцы остается неизменной и/или когда не двигаются суставы. Примеры включают удерживание или перемещение объекта или отталкивание от стены. Динамическая сила относится к усилию, развиваемому мышцей, которое приводит к движению. В качестве динамической силы может выступать изотоническое сокращение, если мышца укорачивается при постоянной нагрузке, или изокинетическое сокращение, если мышца сокращается и укорачивается с постоянной скоростью. Динамическая сила также может включать изоинерционную силу.

[0088] Если не указано иное, «мышечная сила» относится к максимальной динамической мышечной силе. Максимальную силу называют «одним повторением с максимальным весом» (1ПМ). Это измерение веса наибольшего груза (в килограммах), который можно полностью сдвинуть (поднять, толкнуть или потянуть) за раз без незасчитанной попытки или травмы. Это значение можно измерить непосредственно, но для этого требуется, чтобы вес увеличивался до тех пор, пока субъект не сможет довести действие до завершения. В качестве альтернативы 1ПМ оценивают путем вычисления максимального количества повторов упражнений, которые субъект может выполнить с использованием груза, который составляет меньше максимального количества, которое субъект может сдвинуть. Разгибание ног и сгибание ног часто оценивают в клинических испытаниях (Borsheim et al., «Effect of amino acid supplementation on muscle mass, strength and physical function in elderly,» Clin Nutr 2008;27:189-195; Paddon-Jones, et al., «Essential amino acid and carbohydrate supplementation ameliorates muscle protein loss in humans during 28 days bed rest,» J Clin Endocrinol Metab 2004;89:4351-4358).

[0089] В контексте данного документа «функциональная работоспособность» относится к функциональному тесту, в котором моделируется повседневная деятельность. «Функциональную работоспособность» измеряют с помощью любого подходящего общепринятого упражнения, включая степ-упражнение на скорость (подняться и спуститься со скамейки высотой 4 дюйма 5 раз на скорость), упражнение «лечь на пол и встать на время» (из положения стоя принять положение лежа на спине на полу, а затем вернуться в исходное положение, на скорость) и батарею упражнений на физическую результативность (упражнение на статическое равновесие, упражнение «встать со стула, сесть на стул» и упражнение «ходьба на короткое расстояние») (Borsheim et al., «Effect of amino acid supplementation on muscle mass, strength and physical function in elderly,» Clin Nutr 2008;27:189-195).

[0090] В контексте данного документа «индекс массы тела» или «ИМТ», или «индекс Кетле» представляет собой вес субъекта в килограммах, деленный на квадрат высоты субъекта в метрах (кг/м2).

[0091] В случае взрослых людей частое применение ИМТ предназначено для оценки того, насколько вес тела отдельного человека отклоняется от нормального или желательного веса, характерного для человека с его или ее высотой. Избыток или нехватка веса могут частично приходиться на телесный жир, хотя другие факторы, такие как мускулатура также значительно влияют на ИМТ. Всемирная организация здравоохранения рассматривает ИМТ, меньший чем 18,5, как недостаточный вес, который может свидетельствовать о недостаточности питания, нарушении режима питания или других проблемах со здоровьем, тогда как ИМТ, больший чем 25, считается избыточным весом, а выше 30 считается ожирением (World Health Organization. BMI classification. Accessed March 19, 2012 http://apps.who.int/bmi/index.jsp?introPage=intro_3.html). В контексте данного документа, «желательный индекс массы тела» представляет собой индекс массы тела от около 18,5 до около 25. Соответственно, если у субъекта ИМТ ниже около 18,5, тогда желательно увеличить ИМТ субъекта. Если вместо этого у субъекта ИМТ выше около 25, тогда желательно снизить ИМТ у субъекта.

[0092] В контексте данного документа млекопитающее «пожилого возраста» представляет собой млекопитающее, которое испытывает возрастные изменения по меньшей мере одного из индекса массы тела и мышечной массы (например, возрастная саркопения). В некоторых вариантах реализации изобретения человек «пожилого возраста» - это человек в возрасте по меньшей мере 50 лет, по меньшей мере 60 лет, по меньшей мере 65 лет, по меньшей мере 70 лет, по меньшей мере 75 лет, по меньшей мере 80 лет, по меньшей мере 85 лет, по меньшей мере 90 лет, по меньшей мере 95 лет или по меньшей мере 100 лет. В некоторых вариантах реализации изобретения и животное пожилого возраста, млекопитающее или человек - это человек, который испытал потерю мышечной массы, если исходить из мышечной массы пикового периода жизни, по меньшей мере на 5%, по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 15%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 25%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 35%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 45%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 55% или по меньшей мере на 60%. Поскольку известно, что возрастные изменения по меньшей мере одного из индекса массы тела и мышечной массы коррелируют с увеличением возраста, в некоторых вариантах реализации изобретения млекопитающее пожилого возраста идентифицируют или определяют просто на основе возраста. Соответственно, в некоторых вариантах реализации изобретения людей «пожилого возраста» идентифицируют или просто определяют, исходя из того факта, что их возраст составляет по меньшей мере 60 лет, по меньшей мере 65 лет, по меньшей мере 70 лет, по меньшей мере 75 лет, по меньшей мере 80 лет, по меньшей мере 85 лет, по меньшей мере 90 лет, по меньшей мере 95 лет или по меньшей мере 100 лет, и не прибегая к помощи измерения по меньшей мере одного из индекса массы тела и мышечной массы.

[0093] В контексте данного документа пациент «страдает серьезным соматическим заболеванием», если у пациента из-за физической болезни происходит изменение по меньшей мере одного из индекса массы тела и мышечной массы (например, саркопения). В некоторых вариантах реализации изобретения пациент прикован к постели в течение по меньшей мере 25%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или 100% от времени бодрствования. В некоторых вариантах реализации изобретения пациент находится без сознания. В некоторых вариантах реализации изобретения пациент был прикован к постели, как описано в данном абзаце, в течение по меньшей мере 1 суток, 2 суток, 3 суток, 4 суток, 5 суток, 10 суток, 2 недель, 3 недель, 4 недель, 5 недель, 10 недель или дольше.

[0094] В контексте данного документа «белково-энергетическая недостаточность» относится к форме недостаточности, при которой происходит неполноценное поглощение белка. Типы данной недостаточности включают квашиоркор (преобладает белковая недостаточность), маразм (нехватка как калорийного, так и белкового питания) и маразматический квашиоркор (присутствуют признаки выраженной нехватки белка и выраженной калорийной недостаточности, иногда рассматривается как наиболее сложная форма недостаточности).

[0095] В контексте данного документа «кахексия» относится к многостороннему клиническому синдрому, который приводит к атрофии и потере веса. Она представляет собой сложное заболевание, при котором катаболизм белков превышает анаболизм белков, что делает мышечную атрофию главным признаком данного заболевания. В дополнение к нарушениям белкового обмена, она также характеризуется отсутствием аппетита и воспалением. Эти нарушения плюс нарушения белкового обмена в разной степени отвечают на пищевую терапию.

[0096] В контексте данного документа «термогенез» - это процесс теплопродукции, который происходит в организме млекопитающего. Термогенез сопровождается увеличением расхода энергии. Точнее говоря, термогенез - это энергия, сгораемая после метаболизма компонента пищи (такого, как белок). Это можно также назвать тепловым эффектом пищи. Общий расход энергии отдельным человеком равен сумме расхода энергии в состоянии покоя (энергия, которая потребляется в состоянии покоя в состоянии ограничения пищи для поддержания базального метаболизма), теплового эффекта пищи и расхода энергии, связанного с двигательной активности. Расход энергии в состоянии покоя приходится на около 65-75% общего расхода энергии у людей. Количество и активность мышечной массы является одним источником влияния на расход энергии в состоянии покоя. Потребление адекватного количества белка для поддержания мышц также влияет на расход энергии в состоянии покоя. При поглощении белка имеется тенденция к увеличению расхода энергии после еды; это тепловой эффект пищи. Тепловой эффект пищи приходится на около 10% общего расхода энергии у людей. Тогда как это небольшая доля общего расхода энергии, небольшое увеличение этого значения может влиять на вес тела. Белок имеет более высокий тепловой эффект, чем жир или углевод; этот эффект наряду с другими влияниями белка на метаболизм делает его пригодным субстратом для контроля веса, ведения сахарного диабета и других заболеваний.

[0097] В контексте данного документа «насыщение» - это явление, при котором наступает чувство сытости в процессе приема пищи или уменьшается желание поесть. Это приводит к прекращению или сокращению приема пищи.

[0098] В контексте данного документа «сытость» - это явление, при котором остается чувство сытости после еды, что проявляется в виде периода исключения приема пищи после еды.

[0099] В контексте данного документа «физическая нагрузка» в наиболее широком смысле представляет собой любую физическую активность, которая улучшает или поддерживает физическую форму и общее состояние здоровья и здорового образа жизни. Физическую нагрузку осуществляют по разным причинам, включая укрепление мышц и сердечнососудистой системы, оттачивание спортивных навыков, потерю веса или поддержание веса, а также с целью получения удовольствия.

[00100] В контексте данного документа «достаточное количество» представляет собой количество белка или полипептида, раскрытых в данном документе, достаточное для вызова желаемого эффекта. Например, если необходимо увеличить мышечную массу, достаточное количество является количеством, которое через некоторое время вызывает увеличение мышечной массы у субъекта. Достаточное количество белка или полипептидного фрагмента можно предоставить непосредственно, т.е. путем введения белка или полипептидного фрагмента субъекту, или его можно предоставить в составе композиции, содержащей белок или полипептидный фрагмент. Способы введения обсуждаются в других разделах в данном документе.

[00101] В контексте данного документа термин «млекопитающее» относится к любому представителю таксономического класса млекопитающих, включающего плацентарных млекопитающих и сумчатых млекопитающих. Соответственно, «млекопитающее» включает людей, приматов, сельскохозяйственных животных и лабораторных млекопитающих. Иллюстративные млекопитающие включают грызуна, мышь, крысу, кролика, собаку, кошку, овцу, лошадь, козу, ламу, крупный рогатый скот, примата, свинью и любое другое млекопитающее. В некоторых вариантах реализации изобретения млекопитающее по меньшей мере представляет собой одно из трансгенного млекопитающего, генетически модифицированного млекопитающего и клонированного млекопитающего.

A. Пищевые белки

[00102] Для целей данного раскрытия «пищевой белок» представляет собой белок, которые содержит необходимое количество незаменимых аминокислот. В некоторых вариантах реализации изобретения пищевой белок содержит по меньшей мере 30% незаменимых аминокислот по весу. В некоторых вариантах реализации изобретения пищевой белок содержит по меньшей мере 40% незаменимых аминокислот по весу. В некоторых вариантах реализации пищевой белок содержит по меньшей мере 50% незаменимых аминокислот по весу. В некоторых вариантах реализации изобретения пищевой белок содержит или состоит из белка или фрагмента белка, который встречается у пищевых видов. В самом широком смысле «съедобный вид» охватывает любой вид, который, как известно, употребляет в пищу по меньшей мере один тип млекопитающего в отсутствие вредного действия. Вредное действие включает отравляющее действие и токсическое действие. В некоторых вариантах реализации изобретения съедобный вид представляет собой вид, который, как известно, едят люди в отсутствие вредного действия. Некоторые съедобные виды являются редким, но известным компонентом рациона всего лишь небольшой группы видов млекопитающих в ограниченном географическом местоположении, тогда как другие виды являются основным компонентом рациона повсеместно в большей части мира. В других вариантах реализации съедобный вид представляет собой вид, который, как известно, ранее не употребляло в пищу никакое млекопитающее, но который, как показано, является съедобным после пробы. Съедобные виды включают, но без ограничений, Gossypiumturneri, Pleurotuscornucopiae, Glycinemax, Oryzasativa, Thunnusobesus, Abiesbracteata, Acomysignitus, Lathyrusaphaca, Bosgaurus, Raphicerusmelanotis, Phocagroenlandica, Acipensersinensis, Viverratangalunga, Pleurotussajor-caju, Fagopyrumtataricum, Pinusstrobus, Ipomoeanil, Taxuscuspidata, Ipomoeawrightii, Myaarenaria, Actinidiadeliciosa, Gazellagranti, Populustremula, Prunusdomestica, Larusargentatus, Viciavillosa, Sargocentronpunctatissimum, Silenelatifolia, Lagenodelphishosei, Spisulasolidissima, Crossarchusobscurus, Phaseolusangularis, Lathyrusvestitus, Oncorhynchusgorbuscha, Alligatormississippiensis, Pinushalepensis, Laruscanus, Brassicanapus, Silenecucubalus, Phocafasciata, Gazellabennettii, Pinustaeda, Taxuscanadensis, Zamiafurfuracea, Pinusyunnanensis, Pinuswallichiana, Asparagusofficinalis, Capsicumbaccatum, Pinuslongaeva, Taxusbaccata, Pinussibirica, Citrussinensis, Sargocentronxantherythrum, Bisonbison, Gazellathomsonii, Viciasativa, Brantacanadensis, Apiumgraveolens, Acercampestre, Coriandrumsativum, Sileneconica, Lactucasativa, Capsicumchinense, Abiesveitchii, Caprahircus, Gazellaspekei, Oncorhynchusketa, Ipomoeaobscura, Cucumismelovar. conomon, Phocahispida, Vulpesvulpes, Ipomoeaquamoclit, Solanumhabrochaites, Populussp., Pinusrigida, Quercuslyrata, Phaseoluscoccineus, Larusridibundus, Sargocentronspiniferum, Thunnusthynnus, Vulpeslagopus, Bosgaurusfrontalis, Aceropalus, Acerpalmatum, Quercusilex, Pinusmugo, Grusantigone, Pinusuncinata, Prunusmume, Oncorhynchustschawytscha, Gazellasubgutturosa, Vulpeszerda, Pinuscoulteri, Gossypiumbarbadense, Acerpseudoplatanus, Oncorhynchusnerka, Susbarbatus, Fagopyrumesculentumsubsp. Ancestrale, Cynaracardunculus, Phaseolusaureus, Populusnigra, Gossypiumschwendimanii, Solanumchacoense, Quercusrubra, Cucumissativus, Equusburchelli, Oncorhynchuskisutch, Pinusradiata, Phocavitulinarichardsi, Grusnigricollis, Abiesgrandis, Oncorhynchusmasou, Spinaciaoleracea, Solanumchilense, Addaxnasomaculatus, Ipomoeabatatas, Equusgrevyi, Abiessachalinensis, Pinuspinea, Hipposideroscommersoni, Crocusnudiflorus, Citrusmaxima, Acipensertransmontanus, Gossypiumgossypioides, Viverrazibetha, Quercuscerris, Anserindicus, Pinusbalfouriana, Sileneotites, Oncorhynchussp., Viverramegaspila, Bosmutusgrunniens, Pinuselliottii, Equushemionuskulan, Capraibexibex, Alliumsativum, Raphanussativus, Pinusechinata, Prunusserotina, Sargocentrondiadema, Silenegallica, Brassicaoleracea, Daucuscarota, Oncorhynchusmykiss, Brassicaoleraceavar. alboglabra, Gossypiumhirsutum, Abiesalba, Citrusreticulata, Cichoriumintybus, Bossauveli, Lamaglama, Zeamays, Acorusgramineus, Vulpesmacrotis, Ovisammondarwini, Raphicerussharpei, Pinuscontorta, Bosindicus, Caprasibirica, Pinusponderosa, Prunusdulcis, Solanumsogarandinum, Ipomoeaaquatica, Lagenorhynchusalbirostris, Oviscanadensis, Prunusavium, Gazelladama, Thunnusalalunga, Silenepratensis, Pinuscembra, Crocussativus, Citrulluslanatus, Gazellarufifrons, Brassicatournefortii, Caprafalconeri, Bubalusmindorensis, Pinuspalustris, Prunuslaurocerasus, Grusvipio, Ipomoeapurpurea, Pinusleiophylla, Lagenorhynchusobscurus, Raphiceruscampestris, Brassicarapasubsp. Pekinensis, Acmellaradicans, Ipomoeatriloba, Pinuspatula, Cucumismelo, Pinusvirginiana, Solanumlycopersicum, Pinusdensiflora, Pinusengelmannii, Quercusrobur, Ipomoeasetosa, Pleurotusdjamor, Hipposiderosdiadema, Ovisaries, Sargocentronmicrostoma, Brassicaoleraceavar. italica, Capracylindricornis, Populuskitakamiensis, Alliumtextile, Viciafaba, Fagopyrumesculentum, Bisonpriscus, Quercussuber, Lagophyllaramosissima, Acrantophismadagascariensis, Acipenserbaerii, Capsicumannuum, Triticumaestivum, Xenopuslaevis, Phocasibirica, Acipensernaccarii, Actinidiachinensis, Ovisdalli, Solanumtuberosum, Bubaluscarabanensis, Citrusjambhiri, Bisonbonasus, Equusasinus, Bubalusdepressicornis, Pleurotuseryngii, Solanumdemissum, Ovisvignei, Zeamayssubsp. Parviglumis, Lathyrustingitanus, Welwitschiamirabilis, Grusrubicunda, Ipomoeacoccinea, Alliumcepa, Gazellasoemmerringii, Brassicarapa, Lamavicugna, Solanumperuvianum, Xenopusborealis, Capracaucasica, Thunnusalbacares, Equuszebra, Gallusgallus, Solanumbulbocastanum, Hipposiderosterasensis, Lagenorhynchusacutus, Hippopotamusamphibius, Pinuskoraiensis, Acermonspessulanum, Populusdeltoides, Populustrichocarpa, Acipenserguldenstadti, Pinusthunbergii, Brassicaoleraceavar. capitata, Abyssocottuskorotneffi, Gazellacuvieri, Abieshomolepis, Abiesholophylla, Gazellagazella, Pinusparviflora, Brassicaoleraceavar. acephala, Cucurbitapepo, Pinusarmandii, Abiesmariesii, Thunnusthynnusorientalis, Citrusunshiu, Solanumcheesmanii, Lagenorhynchusobliquidens, Acerplatanoides, Citruslimon, Acrantophisdumerili, Solanumcommersonii, Gossypiumarboreum, Prunuspersica, Pleurotusostreatus, Abiesfirma, Gazellaleptoceros, Salmosalar, Homarusamericanus, Abiesmagnifica, Bosjavanicus, Phocalargha, Suscebifrons, Solanummelongena, Phocavitulina, Pinussylvestris, Zamiafloridana, Vulpescorsac, Alliumporrum, Phocacaspica, Vulpeschama, Taxuschinensis, Brassicaoleraceavar. botrytis, Anseranseranser, Phaseoluslunatus, Brassicacampestris, Acersaccharum, Pinuspumila, Solanumpennellii, Pinusedulis, Ipomoeacordatotriloba, Populusalba, Oncorhynchusclarki, Quercuspetraea, Susverrucosus, Equuscaballusprzewalskii, Populuseuphratica, Xenopustropicalis, Taxusbrevifolia, Lamaguanicoe, Pinusbanksiana, Solanumnigrum, Suscelebensis, Brassicajuncea, Lagenorhynchuscruciger, Populustremuloides, Pinuspungens, Bubalusquarlesi, Quercusgamelliflora, Ovisorientalismusimon, Bubalusbubalis, Pinusluchuensis, Susphilippensis, Phaseolusvulgaris, Salmotrutta, Acipenserpersicus, Solanumbrevidens, Pinusresinosa, Hippotragusniger, Capranubiana, Asparagusscaber, Ipomoeaplatensis, Susscrofa, Capraaegagrus, Lathyrussativus, Sargocentrontiere, Hippoglossushippoglossus, Acorusamericanus, Equuscaballus, Bostaurus, Barbareavulgaris, Lamaguanicoepacos, Pinuspinaster, Octopusvulgaris, Solanumcrispum, Hippotragusequinus, Equusburchelliiantiquorum, Crossarchusalexandri, Ipomoeaalba, Triticummonococcum, Populusjackii, Lagenorhynchusaustralis, Gazelladorcas, Quercuscoccifera, Ansercaerulescens, Acoruscalamus, Pinusroxburghii, Pinustabuliformis, Zamiafischeri, Gruscarunculatus, Acomyscahirinus, Cucumismelovar. reticulatus, Galluslafayettei, Pisumsativum, Pinusattenuata, Pinusclausa, Gazellasaudiya, Capraibex, Ipomoeatrifida, Zealuxurians, Pinuskrempfii, Acomyswilsoni, Petroselinumcrispum, Quercuspalustris, Triticumtimopheevi, Meleagrisgallopavo, Brassicaoleracea, Brassicaoleracea, Betavulgaris, Solanumlycopersicum, Phaseolusvulgaris, Xiphiasgladius, Moronesaxatilis, Micropterussalmoides, Placopectenmagellanicus, Sprattussprattus, Clupeaharengus, Engraulisencrasicolus, Cucurbita maxima, Agaricus bisporus, Musa acuminata x balbisiana, Malus domestica, Cicer arietinum, Anas platyrhynchos, Vaccinium macrocarpum, Rubus idaeus x strigosus, Vaccinium angustifolium, Fragaria ananassa, Rubus fruticosus, Cucumis melo, Ananas comosus, Cucurbita pepo, Cucurbita moschata, Sus scrofa domesticus, Ocimum basilicum, Rosmarinus officinalis, Foeniculum vulgare, Rheum rhabarbarum, Carica papaya, Mangifera indica, Actinidia deliciosa, Prunus armeniaca, Prunus avium, Cocos nucifera, Olea europaea, Pyrus communis, Ficus carica, Passiflora edulis, Oryza sativa subsp. Japonica, Oryza sativa subsp. Indica, Coturnix coturnix, Saccharomyces cerevisiae.

[00103] В некоторых вариантах реализации изобретения пищевой белок содержит или состоит из производного или мутеина на основе белка или фрагмента белка, который встречается у пищевых видов. Такой пищевой белок можно назвать «сконструированным пищевым белком». В таких вариантах реализации изобретения естественный белок или его фрагмент представляет собой «эталонный» белок или полипептид, а сконструированный пищевой белок или его первая полипептидная последовательность содержит по меньшей мере одну модификацию последовательности по сравнению с аминокислотной последовательностью эталонного белка или полипептида. Например, в некоторых вариантах реализации изобретения сконструированный пищевой белок или его первая полипептидная последовательность по меньшей мере на 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 99,5% гомологична по меньшей мере одной аминокислотной последовательности эталонного пищевого белка. Обычно соотношение по меньшей мере одного из аминокислотных остатков с разветвленной цепью к общему количеству аминокислотных остатков, остатков незаменимых аминокислот к общему количеству аминокислотных остатков и лейциновых остатков к общему количеству аминокислотных остатков, которое присутствует в сконструированном пищевом белке или его первой полипептидной последовательности является большим, чем соответствующее соотношение по меньшей мере одного из аминокислотных остатков с разветвленной цепью к общему количеству аминокислотных остатков, остатков незаменимых аминокислот к общему количеству аминокислотных остатков и лейциновых остатков к общему количеству аминокислотных остатков, которое присутствует в эталонном пищевом белке или полипептидной последовательности.

[00104] В некоторых вариантах реализации изобретения пищевой белок представляет собой основной белок в пище или его производное, или мутеин, или представляет собой фрагмент основного белка в пище или его производное, или мутеин. Основной белок представляет собой белок, который присутствует в более высокой концентрации в пище по отношению к другим белкам, которые присутствуют в пище. В качестве пищи может выступать известный компонент рациона небольшой группы видов млекопитающих в ограниченном географическом местоположении или основной компонент рациона повсеместно в большей части мира. В некоторых вариантах реализации изобретения основной белок в пище выбирают из белков куриного яйца, таких как овальбумин, овотрансферрин и овомукоид; белков мяса, таких как миозин, актин, тропомиозин, коллаген и тропонин; белков зерна, таких как казеин, альфа 1 казеин, альфа 2 казеин, бета-казеин, каппа-казеин, бета-лактоглобулин, альфа-лактоглобулин, глицинин, бета-конглицинин, глютелин, проламин, глиадин, глютенин, альбумин, глобулин; куриных мышечных белков, таких как альбумин, енолаза, креатинкиназа, фосфоглицератмутаза, триозофосфатизомераза, аполипопротеин, овотрансферрин, фосфоглюкомутаза, фосфоглицераткиназа, глицерин-3-фосфат дегидрогеназа, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа, гемоглобин, кофилин, гликогенфосфорилаза, фруктозо-1,6-бисфосфатаза, актин, миозин, a-цепи тропомиозин, казеинкиназа, гликогенфосфорилаза, фруктозо-1,6-бисфосфатаза, альдолаза, тубулин, виментин, эндоплазмин, лактатдегидрогеназа, дестрин, транстиретин, фруктозодифосфатальдолаза, карбоангидраза, альдегиддегидрогеназа, аннексин, аденозилгомоцистеиназа; свиных мышечных белков, таких как актин, миозин, енолаза, титин, кофилин, фосфоглицераткиназа, енолаза, пируватдегидрогеназа, гликогенфосфорилаза, триозофосфатизомераза, миокиназа; и рыбьих белков, таких как парвальбумин, пируватдегидрогеназа, десмин и триозофосфатизомераза.

[00105] Три естественных источника белка, которые, как правило, считаются хорошими источниками высококачественных аминокислот, представляют собой белок молочной сыворотки, яичный белок и соевый белок. Каждый источник содержит множество белков. В Таблице 1 представлено весовое соотношение каждой аминокислоты в источнике белка (г AК/г белка), выраженное в процентах.

Таблица 1
Аминокислота Молочная сыворотка Яйцо Соя
Изолейцин 6,5% 5,5% 5,0%
Лейцин 11,0% 8,6% 8,0%
Лизин 9,1% 7,2% 6,3%
Метионин 2,1% 3,1% 1,3%
Фенилаланин 3,4% 5,3% 1,2%
Треонин 7,0% 4,8% 3,7%
Триптофан 1,7% 1,2% 1,3%
Валин 6,2% 6,1% 4,9%
Гистидин 2,0% 2,4% 2,7%
Другие 51,7% 49,5% 60,4%

[00106] Таблица 2 представляет весовое соотношение аминокислот в каждом источнике белка, а именно незаменимых аминокислот, аминокислот с разветвленными цепями (L, I и V) и лейцина (L) (отдельно).

Таблица 2
Источник белка Незаменимые аминокислоты Аминокислоты с разветвленными цепями Лейцин
Молочная сыворотка 49,0% 23,7% 11,0%
Яйцо 50,5% 20,1% 8,6%
Соя 39,6% 17,9% 8,0%

[00107] Источниками, на которые можно полагаться для определения содержания аминокислот в молочной сыворотке, являются: Belitz HD., Grosch W. и Schieberle P. Food Chemistry (4th Ed). Springer-Verlag, Berlin Heidelberg 2009; http://www.gnc.com/product/index.jsp?productId=2986027; http://www.nutrabio.com/Products/whey_protein_concentrate.htm; и http://nutrabio.com/Products/whey_protein_isolate.htm. Для получения числовых значений, представленных в Таблицах 1 и 2, усреднили значения по содержанию аминокислот, полученные из этих источников. Источником для соевого белка является Egg, National Nutrient Database for Standard Reference, Release 24 (http://ndb.nal.usda.gov/ndb/foods/list). Источником для соевого белка является Self Nutrition Data (http://nutritiondata.self.com/facts/legumes-and-legume-products/4389/2).

[00108] В контексте данного документа «белок молочной сыворотки» или «молочная сыворотка» означает смесь белков, которые имеют аминокислотный состав в соответствии с Таблицами 1 и 2. В контексте данного документа белок молочной сыворотки содержит 49% незаменимых аминокислот, 24% аминокислот с разветвленными цепями и 11% лейцина по весу.

[00109] В контексте данного документа «яичный белок» или «яйцо» означает смесь белков, которые имеют аминокислотный состав в соответствии с Таблицами 1 и 2. В контексте данного документа, яичный белок содержит 51% незаменимых аминокислот, 20% аминокислот с разветвленными цепями и 9% лейцина по весу.

[00110] В контексте данного документа «соевый белок» или «соя» означает смесь белков, которые имеют аминокислотный состав в соответствии с Таблицами 1 и 2. В контексте данного документа соевый белок содержит 40% незаменимых аминокислот, 18% аминокислот с разветвленными цепями и 8% лейцина по весу.

[00111] В отдельных случаях в данном документе долю аминокислоты (аминокислот) конкретного типа, входящих в состав полипептида, белка или композиции, определяют количественно на основе весового соотношения аминокислоты (аминокислот) данного типа к общему весу аминокислот, которые присутствуют в рассматриваемом полипептиде, белке или композиции. Это значение рассчитывают путем деления веса конкретной аминокислоты (аминокислот), которые присутствуют в полипептиде, белке или композиции, на вес всех аминокислот, которые присутствуют в полипептиде, белке или композиции.

[00112] В иных случаях применяют соотношение аминокислотного (аминокислотных) остатков конкретного типа, которые присутствуют в полипептиде или белке, к общему количеству аминокислот, которые присутствуют в рассматриваемом полипептиде или белке. Это значение рассчитывают путем деления количества рассматриваемой аминокислоты (аминокислот), которая(ые) присутствует(ют) в каждой молекуле полипептида или белка, на общее количество аминокислотных остатков, которое присутствует в каждой молекуле полипептида или белка. Специалисту в данной области техники понятно, что эти два способа реализации изобретения являются взаимозаменяемыми и что весовое соотношение типа аминокислоты (аминокислот), которые присутствуют в полипептиде или белке, можно преобразовать в соотношение аминокислотного остатка (остатков) конкретного типа и наоборот.

[00113] В определенных вариантах реализации изобретения в данном документе весовое соотношение аминокислот с разветвленными цепями, лейцина и/или незаменимых аминокислот в молочной сыворотке, яйце или сое применяют в качестве критерия для определения аминокислотного состава полипептида, белка или композиции, содержащей по меньшей мере один из полипептида и белка. В случае таких вариантов реализации изобретения понятно, что эти два показателя не совсем равноценны, но также понятно, что эти показатели приводят к измерениям, которые являются достаточно сходными для применения в данных целях. Например, в тех случаях, когда представляющий интерес белок отличается тем, что соотношение аминокислотных остатков с разветвленной цепью к общему количеству аминокислотных остатков равно или более чем 24% (весовое соотношение аминокислотных остатков с разветвленной цепью, которые присутствуют в молочной сыворотке), это является точным описанием содержания аминокислот с разветвленной цепью в белке. В то же время, весовое соотношение аминокислотных остатков с разветвленной цепью, которые присутствуют в белке, необязательно в точности должно равняться 24%. Даже в этом случае специалист в данной области техники понимает, что это полезное сопоставление. Если известно общее количество аминокислотных остатков, которое присутствует в представляющем интерес белке, специалист в данной области техники также может определить весовое соотношение аминокислотных остатков с разветвленной цепью в представляющем интерес белке.

[00114] В некоторых вариантах реализации изобретения в настоящем документе фрагмент встречающегося в природе пищевого белка выбирают и, необязательно, выделяют. В некоторых вариантах реализации изобретения фрагмент содержит по меньшей мере 25 аминокислот. В некоторых вариантах реализации изобретения фрагмент содержит по меньшей мере 50 аминокислот. В некоторых вариантах реализации изобретения фрагмент состоит из по меньшей мере 25 аминокислот. В некоторых вариантах реализации изобретения фрагмент состоит из по меньшей мере 50 аминокислот. В некоторых вариантах реализации изобретения предлагают выделенный рекомбинантный пищевой белок. В некоторых вариантах реализации изобретения пищевой белок содержит первую полипептидную последовательность и первая полипептидная последовательность содержит фрагмент из по меньшей мере 25 или по меньшей мере 50 аминокислот встречающегося в природе пищевого белка. В некоторых вариантах реализации изобретения пищевые белки выделяют. В некоторых вариантах реализации изобретения пищевые белки являются рекомбинантными. В некоторых вариантах реализации изобретения пищевые белки содержат первую полипептидную последовательность, которая содержит фрагмент из по меньшей мере 50 аминокислот встречающегося в природе пищевого белка. В некоторых вариантах реализации изобретения пищевые белки являются выделенными рекомбинантными пищевыми белками. В некоторых вариантах реализации изобретения выделенные рекомбинантные пищевые белки, описанные в данном документе, предлагают в неизолированной и/или не-рекомбинантной форме.

[00115] В некоторых вариантах реализации изобретения пищевой белок в соответствии с данным раскрытием содержит первую полипептидную последовательность, которая содержит фрагмент встречающегося в природе пищевого белка. В некоторых вариантах реализации пищевого белка пищевой белок состоит из первой полипептидной последовательности. В некоторых вариантах реализации пищевого белка пищевой белок состоит из фрагмента встречающегося в природе пищевого белка.

[00116] В некоторых вариантах реализации изобретения пищевой белок в соответствии с данным раскрытием содержит первую полипептидную последовательность, которая содержит отношение аминокислотных остатков с разветвленной цепью к общему количеству аминокислотных остатков, которое равно или больше, чем отношение количества аминокислотных остатков с разветвленной цепью к общему количеству аминокислотных остатков, которые присутствуют по меньшей мере в одном из белка молочной сыворотки, яичного белка и соевого белка. Таким образом, в таких вариантах реализации изобретения пищевой белок содержит первую полипептидную последовательность, в которой соблюдается соотношение аминокислотных остатков с разветвленной цепью к общему количеству аминокислотных остатков равное или больше, чем соотношение, выбранное из 24%, 20% и 18%.

[00117] В некоторых вариантах реализации изобретения пищевой белок в соответствии с данным раскрытием содержит первую полипептидную последовательность, в которой соблюдается соотношение остатков L к общему количеству аминокислотных остатков равно или больше, чем соотношение остатков L к общему количеству аминокислотных остатков, которое присутствует по меньшей мере в одном из белка молочной сыворотки, яичного белка и соевого белка. Соответственно, в таких вариантах реализации изобретения в пищевом белке соотношение остатков L к общему количеству аминокислотных остатков равно или больше, чем соотношение, выбранное из 11%, 9% и 8%.

[00118] В некоторых вариантах реализации изобретения пищевой белок в соответствии с данным раскрытием содержит первую полипептидную последовательность, в которой соблюдается соотношение остатков незаменимых аминокислот к общему количеству аминокислотных остатков равно или больше, чем соотношение остатков незаменимых аминокислот к общему количеству аминокислотных остатков, которое присутствует по меньшей мере в одном из белка молочной сыворотки, яичного белка, соевого белка и белка желатина. Соответственно, в таких вариантах реализации изобретения в пищевом белке соотношение остатков незаменимых аминокислот к общему количеству аминокислотных остатков равно или больше, чем соотношение, выбранное из 49%, 51% и 40%.

[00119] В некоторых вариантах реализации изобретения пищевой белок содержит первую полипептидную последовательность, в котором соблюдается соотношение аминокислотных остатков с разветвленной цепью к общему количеству аминокислотных остатков равное или больше, чем соотношение аминокислотных остатков с разветвленной цепью к общему количеству аминокислотных остатков, которое присутствует по меньшей мере в одном из белка молочной сыворотки, яичного белка и соевого белка; и содержит первую полипептидную последовательность, в которой соблюдается соотношение остатков L к общему количеству аминокислотных остатков равное или больше, чем соотношение остатков L к общему количеству аминокислотных остатков, которое присутствует по меньшей мере в одном из белка молочной сыворотки, яичного белка и соевого белка. В некоторых подобных вариантах реализации изобретения пищевой белок дополнительно содержит первую полипептидную последовательность, в которой соблюдается соотношение остатков незаменимых аминокислот к общему количеству аминокислотных остатков равное или больше, чем соотношение остатков незаменимых аминокислот к общему количеству аминокислотных остатков, которое присутствует по меньшей мере в одном из белка молочной сыворотки, яичного белка и соевого белка.

[00120] В некоторых вариантах реализации изобретения пищевой белок содержит первую полипептидную последовательность, в которой соблюдается соотношение аминокислотных остатков с разветвленной цепью к общему количеству аминокислотных остатков равное или больше 24% и соотношение остатков L к общему количеству аминокислотных остатков равное или больше 11%. В некоторых таких вариантах реализации изобретения пищевой белок дополнительно содержит первую полипептидную последовательность, в которой соблюдается соотношение остатков незаменимых аминокислот к общему количеству аминокислотных остатков равное или больше 49%.

[00121] В некоторых вариантах реализации изобретения пищевой белок содержит первую полипептидную последовательность, в которой соблюдается соотношение аминокислотных остатков с разветвленной цепью к общему количеству аминокислотных остатков равное или больше чем 20% и соотношение остатков L к общему количеству аминокислотных остатков равное или более чем 9%. В некоторых таких вариантах реализации изобретения пищевой белок дополнительно содержит первую полипептидную последовательность, в которой соблюдается соотношение остатков незаменимых аминокислот к общему количеству аминокислотных остатков равное или более чем 51%.

[00122] В некоторых вариантах реализации изобретения пищевой белок содержит первую полипептидную последовательность, в которой соблюдается соотношение аминокислотных остатков с разветвленной цепью к общему количеству аминокислотных остатков равно или более чем 18% и соотношение остатков L к общему количеству аминокислотных остатков равное или более чем 8%. В некоторых таких вариантах реализации изобретения пищевой белок дополнительно содержит первую полипептидную последовательность, в которой соблюдается соотношение остатков незаменимых аминокислот к общему количеству аминокислотных остатков равное или более чем 40%.

[00123] В некоторых вариантах реализации изобретения пищевой белок содержит первую полипептидную последовательность, в которой соблюдается соотношение аминокислотных остатков с разветвленной цепью к общему количеству аминокислотных остатков равное или больше чем соотношение аминокислотных остатков с разветвленной цепью к общему количеству аминокислотных остатков, которое присутствует по меньшей мере в одном из белка молочной сыворотки, яичного белка и соевого белка; и содержит первую полипептидную последовательность, в которой соблюдается соотношение количества незаменимых аминокислотных остатков к общему количеству аминокислотных остатков, равное или больше, чем соотношение количества незаменимых аминокислотных остатков к общему количеству аминокислотных остатков, которое присутствует по меньшей мере в одном из белка молочной сыворотки, яичного белка и соевого белка. В некоторых вариантах реализации изобретения пищевой белок содержит первую полипептидную последовательность, в которой соблюдается соотношение аминокислотных остатков с разветвленной цепью к общему количеству аминокислотных остатков равное или более чем 24%, а соотношение количества незаменимых аминокислотных остатков к общему количеству аминокислотных остатков равно или более чем 49%. В некоторых вариантах реализации пищевой белок содержит первую полипептидную последовательность, в которой соблюдается соотношение аминокислотных остатков с разветвленной цепью к общему количеству аминокислотных остатков равное или более чем 20%, а соотношение количества незаменимых аминокислотных остатков к общему количеству аминокислотных остатков равно или более чем 51%. В некоторых вариантах реализации пищевой белок содержит первую полипептидную последовательность, в которой соблюдается соотношение аминокислотных остатков с разветвленной цепью к общему количеству аминокислотных остатков равное или более чем 18%, а соотношение количества незаменимых аминокислотных остатков к общему количеству аминокислотных остатков равно или более чем 40%.

[00124] В некоторых вариантах реализации изобретения пищевой белок содержит первую полипептидную последовательность, в которой соблюдается соотношение остатков L к общему количеству аминокислотных остатков равное или больше, чем соотношение остатков L к общему количеству аминокислотных остатков, которое присутствует по меньшей мере в одном из белка молочной сыворотки, яичного белка и соевого белка; и содержит первую полипептидную последовательность, в которой соблюдается соотношение количества незаменимых аминокислотных остатков к общему количеству аминокислотных остатков, равное или больше, чем соотношение количества незаменимых аминокислотных остатков к общему количеству аминокислотных остатков, которое присутствует по меньшей мере в одном из белка молочной сыворотки, яичного белка и соевого белка. В некоторых вариантах реализации изобретения пищевой белок содержит первую полипептидную последовательность, в которой соблюдается соотношение остатков L к общему количеству аминокислотных остатков, равное или более чем 11%, а соотношение количества незаменимых аминокислотных остатков к общему количеству аминокислотных остатков равно или более чем 49%. В некоторых вариантах реализации изобретения пищевой белок содержит первую полипептидную последовательность, в которой соблюдается соотношение остатков L к общему количеству аминокислотных остатков равное или более чем 9%, а соотношение количества незаменимых аминокислотных остатков к общему количеству аминокислотных остатков равно или более чем 51%. В некоторых вариантах реализации изобретения пищевой белок содержит первую полипептидную последовательность, в которой соблюдается соотношение остатков L к общему количеству аминокислотных остатков равное или более чем 8%, а соотношение количества незаменимых аминокислотных остатков к общему количеству аминокислотных остатков, равное или более чем 40%.

[00125] В некоторых вариантах реализации изобретения пищевой белок содержит первую полипептидную последовательность, которая содержит первую полипептидную последовательность, в которой соблюдается соотношение аминокислотных остатков с разветвленной цепью к общему количеству аминокислотных остатков равное или более чем 24%, соотношение остатков L к общему количеству аминокислотных остатков равно или более чем 11%, соотношение количества незаменимых аминокислотных остатков к общему количеству аминокислотных остатков, равное или более чем 49%, содержит по меньшей мере одну из каждой незаменимой аминокислоты и первую полипептидную последовательность выбирают из от SEQ ID NO: 1 до SEQ ID NO: 1000. В некоторых вариантах реализации изобретения первую полипептидную последовательность выбирают из модифицированного производного от SEQ ID NO: 1 до SEQ ID NO: 1000. В некоторых вариантах реализации первую полипептидную последовательность выбирают из мутеина от SEQ ID NO: 1 до SEQ ID NO: 1000.

[00126] В некоторых вариантах реализации пищевого белка первая полипептидная последовательность содержит первую полипептидную последовательность, в которой соблюдается соотношение аминокислотных остатков с разветвленной цепью к общему количеству аминокислотных остатков равное или более чем 24%, соотношение остатков L к общему количеству аминокислотных остатков равное или более чем 11%, соотношение количества незаменимых аминокислотных остатков к общему количеству аминокислотных остатков, равное или более чем 49%, содержит по меньшей мере одну из каждой незаменимой аминокислоты и первую полипептидную последовательность выбирают из от SEQ ID NO: 1001 до SEQ ID NO: 1414. В некоторых вариантах реализации изобретения первую полипептидную последовательность выбирают из модифицированного производного от SEQ ID NO: 1001 до SEQ ID NO: 1414. В некоторых вариантах реализации изобретения первую полипептидную последовательность выбирают из мутеина от SEQ ID NO: 1001 до SEQ ID NO: 1414.

[00127] В некоторых вариантах реализации пищевого белка первая полипептидная последовательность содержит первую полипептидную последовательность, в которой соблюдается соотношение аминокислотных остатков с разветвленной цепью к общему количеству аминокислотных остатков равное или более чем 24%, соотношение количества незаменимых аминокислотных остатков к общему количеству аминокислотных остатков, равное или более чем 49%, содержит по меньшей мере одну из каждой незаменимой аминокислоты и первую полипептидную последовательность выбирают из от SEQ ID NO: 1415 до SEQ ID NO: 1899. В некоторых вариантах реализации изобретения первую полипептидную последовательность выбирают из модифицированного производного от SEQ ID NO: 1415 до SEQ ID NO: 1899. В некоторых вариантах реализации изобретения первую полипептидную последовательность выбирают из мутеина от SEQ ID NO: 1415 до SEQ ID NO: 1899.

[00128] В некоторых вариантах реализации пищевого белка первая полипептидная последовательность содержит первую полипептидную последовательность, в которой соблюдается соотношение количества незаменимых аминокислотных остатков к общему количеству аминокислотных остатков, равное или более чем 49%, и соотношение остатков L к общему количеству аминокислотных остатков, равное или более чем 11%, содержит по меньшей мере одну из каждой незаменимой аминокислоты, и первую полипептидную последовательность выбирают из от SEQ ID NO: 1900 до SEQ ID NO: 2102. В некоторых вариантах реализации изобретения первую полипептидную последовательность выбирают из модифицированного производного от SEQ ID NO: 1900 до SEQ ID NO: 2102. В некоторых вариантах реализации изобретения первую полипептидную последовательность выбирают из мутеина от SEQ ID NO: 1900 до SEQ ID NO: 2102.

[00129] В некоторых вариантах реализации пищевого белка первая полипептидная последовательность содержит первую полипептидную последовательность, в которой соблюдается соотношение аминокислотных остатков с разветвленной цепью к общему количеству аминокислотных остатков равное или более чем 24%, соотношение остатков L к общему количеству аминокислотных остатков, равное или более чем 11%, содержит по меньшей мере одну из каждой незаменимой аминокислоты, и первую полипептидную последовательность выбирают из от SEQ ID NO: 2103 до SEQ ID NO: 2518. В некоторых вариантах реализации изобретения первую полипептидную последовательность выбирают из модифицированного производного от SEQ ID NO: 2103 до SEQ ID NO: 2518. В некоторых вариантах реализации изобретения первую полипептидную последовательность выбирают из мутеина от SEQ ID NO: 2103 до SEQ ID NO: 2518.

[00130] В некоторых вариантах реализации пищевого белка первая полипептидная последовательность содержит первую полипептидную последовательность, в которой соблюдается соотношение аминокислотных остатков с разветвленной цепью к общему количеству аминокислотных остатков, равное или более чем 24%, и соотношение остатков L к общему количеству аминокислотных остатков, равное или более чем 11%, и содержит по меньшей мере одну из каждой незаменимой аминокислоты.

[00131] В некоторых вариантах реализации пищевого белка первая полипептидная последовательность содержит первую полипептидную последовательность, в которой соблюдается соотношение аминокислотных остатков с разветвленной цепью к общему количеству аминокислотных остатков, равное или более чем 24%, и соотношение количества незаменимых аминокислотных остатков к общему количеству аминокислотных остатков, равное или более чем 49%.

[00132] В некоторых вариантах реализации пищевого белка первая полипептидная последовательность содержит первую полипептидную последовательность, в которой соблюдается соотношение остатков L к общему количеству аминокислотных остатков, равное или более чем 11%, и соотношение количества незаменимых аминокислотных остатков к общему количеству аминокислотных остатков, равное или более чем 49%.

[00133] В некоторых вариантах реализации пищевого белка первая полипептидная последовательность содержит первую полипептидную последовательность, в которой соблюдается соотношение количества незаменимых аминокислотных остатков к общему количеству аминокислотных остатков, равное или более чем 49%, и содержит по меньшей мере одну из каждой незаменимой аминокислоты.

[00134] В некоторых вариантах реализации пищевого белка первая полипептидная последовательность содержит первую полипептидную последовательность, в которой соблюдается соотношение аминокислотных остатков с разветвленной цепью к общему количеству аминокислотных остатков, равное или более чем 24%, и содержит по меньшей мере одну из каждой незаменимой аминокислоты.

[00135] В некоторых вариантах реализации пищевого белка первая полипептидная последовательность содержит первую полипептидную последовательность, в которой соблюдается соотношение остатков L к общему количеству аминокислотных остатков, равное или более чем 11%, и содержит по меньшей мере одну из каждой незаменимой аминокислоты.

[00136] В некоторых вариантах реализации пищевого белка первая полипептидная последовательность содержит первую полипептидную последовательность, в которой соблюдается соотношение остатков L к общему количеству аминокислотных остатков, равное или более чем 11%.

[00137] В некоторых вариантах реализации пищевого белка пищевой белок дополнительно содержит вторую полипептидную последовательность. В некоторых вариантах реализации вторая полипептидная последовательность состоит из от 3 до 10, от 5 до 20, от 10 до 30, от 20 до 50, от 25 до 75, от 50 до 100 или от 100 до 200 аминокислот. В некоторых вариантах реализации изобретения вторая полипептидная последовательность не является производной от встречающегося в природе пищевого белка. В некоторых вариантах реализации изобретения вторую полипептидную последовательность выбирают из метки для аффинной очистки, линкера белковых доменов и сайта распознавания протеазы. В некоторых вариантах реализации изобретения метка для аффинной очистки является полигистидиновой меткой. В некоторых вариантах реализации изобретения линкер белковых доменов содержит по меньшей мере одну копию последовательности GGSG. В некоторых вариантах реализации изобретения протеазу выбирают из пепсина, трипсина и химотрипсина.

[00138] В некоторых вариантах реализации изобретения рекомбинантный пищевой белок состоит из первой полипептидной последовательности и второй полипептидной последовательности.

[00139] В некоторых вариантах реализации изобретения пищевой белок дополнительно содержит третью полипептидную последовательность, которая содержит фрагмент из по меньшей мере 25 или по меньшей мере 50 аминокислот встречающегося в природе пищевого белка. В некоторых вариантах реализации изобретения первая и третья полипептидные последовательности являются одинаковыми. В некоторых вариантах реализации изобретения первая и третья последовательности полипептида различны. В некоторых вариантах реализации изобретения первая и третья полипептидные последовательности получают из одного и того же встречающегося в природе пищевого белка. В некоторых вариантах реализации изобретения порядок первой и третьей полипептидных последовательностей в изолированном рекомбинантном пищевом белке такой же, как и порядок первой и третьей полипептидных последовательностей во встречающемся в природе пищевом белке. В некоторых вариантах реализации изобретения порядок первой и третьей полипептидных последовательностей в пищевом белке отличается от порядка первой и третьей полипептидных последовательностей во встречающемся в природе пищевом белке. В некоторых вариантах реализации изобретения первая и третья полипептидные последовательности являются производными от различных встречающихся в природе пищевых белков. В некоторых вариантах реализации вторая полипептидная последовательность граничит с первой и третьей полипептидными последовательностями.

[00140] В некоторых вариантах реализации пищевого белка первая и/или третья полипептидная последовательность содержит фрагмент встречающегося в природе пищевого белка и соотношение аминокислотных остатков с разветвленной цепью к общему количеству аминокислотных остатков, присутствующих в первой и/или третьей полипептидной последовательности равна или больше соотношения аминокислотных остатков с разветвленной цепью к общему количеству аминокислотных остатков, присутствующих по меньшей мере в одном из белка молочной сыворотки, яичного белка и соевого белка.

[00141] В некоторых вариантах реализации пищевого белка первая и/или третья полипептидная последовательность содержит первую и/или третью полипептидную последовательность, которая содержит фрагмент встречающегося в природе пищевого белка и соотношение остатков L к общему количеству аминокислотных остатков, присутствующих в первой и/или третьей полипептидной последовательности, равное или больше, чем соотношение остатков L к общему количеству аминокислотных остатков, которое присутствует по меньшей мере в одном из белка молочной сыворотки, яичного белка и соевого белка.

[00142] В некоторых вариантах реализации пищевого белка первая и/или третья полипептидная последовательность содержит первую и/или третью полипептидную последовательность, которая содержит фрагмент встречающегося в природе пищевого белка и соотношение остатков незаменимых аминокислот к общему количеству аминокислотных остатков, присутствующих в первой и/или третьей полипептидной последовательности, равное или больше, чем соотношение остатков незаменимых аминокислот к общему количеству аминокислотных остатков, которое присутствует по меньшей мере в одном из белка молочной сыворотки, яичного белка и соевого белка.

[00143] В некоторых вариантах реализации пищевого белка первая и/или третья полипептидная последовательность содержит первую и/или третью полипептидную последовательность, которая содержит фрагмент встречающегося в природе пищевого белка и соотношение аминокислотных остатков с разветвленной цепью к общему количеству аминокислотных остатков, присутствующих в первой и/или третьей полипептидной последовательности, равное или больше, чем соотношение аминокислотных остатков с разветвленной цепью к общему количеству аминокислотных остатков, которое присутствует по меньшей мере в одном из белка молочной сыворотки, яичного белка и соевого белка; и в первой и/или третьей полипептидной последовательности соблюдается соотношение остатков L к общему количеству аминокислотных остатков равное или больше, чем соотношение остатков L к общему количеству аминокислотных остатков, которое присутствует по меньшей мере в одном из белка молочной сыворотки, яичного белка и соевого белка. В некоторых подобных вариантах реализации в первой и/или третьей полипептидной последовательности дополнительно соблюдается соотношение остатков незаменимых аминокислот к общему количеству аминокислотных остатков равное или больше, чем соотношение остатков незаменимых аминокислот к общему количеству аминокислотных остатков, которое присутствует по меньшей мере в одном из белка молочной сыворотки, яичного белка и соевого белка.

[00144] В некоторых вариантах реализации пищевого белка первая и/или третья полипептидная последовательность содержит первую и/или третью полипептидную последовательность, в которой соблюдается соотношение аминокислотных остатков с разветвленной цепью к общему количеству аминокислотных остатков равное или больше 24% и соотношение остатков L к общему количеству аминокислотных остатков равное или больше 11%. В некоторых подобных вариантах реализации белка в первой и/или третьей полипептидной последовательности дополнительно соблюдается соотношение остатков незаменимых аминокислот к общему количеству аминокислотных остатков равное или больше 49%.

[00145] В некоторых вариантах реализации изобретения встречающийся в природе пищевой белок, из которого получают фрагмент, представляет собой пищевой белок, отличный по меньшей мере от одного пищевого белка, выбранного из яичных белков, таких как овальбумин, овотрансферрин и овомукоид; белков мяса, таких как миозин, актин, тропомиозин, коллаген и тропонин; белков молока, таких как молочная сыворотка и казеин; белков зерна, таких как казеин, альфа-1-казеин, альфа-2-казеин, бета-казеин, каппа-казеин, бета-лактоглобулин, альфа-лактоглобулин, глицинин, бета-конглицинин, глютелин, проламин, глиадин, глютенин, альбумин, глобулин; куриных мышечных белков, таких как альбумин, енолаза, креатинкиназа, фосфоглицератмутаза, триозофосфатизомераза, аполипопротеин, овотрансферрин, фосфоглюкомутаза, фосфоглицераткиназа, глицерин-3-фосфат дегидрогеназа, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа, гемоглобин, кофилин, гликогенфосфорилаза, фруктозо-1,6-бисфосфатаза, актин, миозин, a-цепь тропомиозина, казеинкиназа, гликогенфосфорилаза, фруктозо-1,6-бисфосфатаза, альдолаза, тубулин, виментин, эндоплазмин, лактатдегидрогеназа, дестрин, транстиретин, фруктозодифосфатальдолаза, карбоангидраза, альдегиддегидрогеназа, аннексин, аденозилгомоцистеиназа; свиных мышечных белков, таких как актин, миозин, енолаза, титин, кофилин, фосфоглицераткиназа, енолаза, пируватдегидрогеназа, гликогенфосфорилаза, триозофосфатизомераза, миокиназа; и рыбьих белков, таких как парвальбумин, пируватдегидрогеназа, десмин и триозофосфатизомераза.

[00146] Фенилкетонурия (ФКУ) представляет собой аутосомное рецессивное метаболическое генетическое нарушение, которое характеризуется мутацией гена печеночного фермента фенилаланин гидроксилазы (ФАГ), которая приводит его в нефункциональное состояние. Этот фермент необходим для превращения фенилаланина в тирозин. В тех случаях, когда активность ФАГ снижается, фенилаланин накапливается и превращается в фенилпируват (также известный как фенилкетон), который обнаруживается в моче. Нелеченные дети являются здоровыми при рождении, но не проходят определяющие этапы развития в раннем возрасте, у них развивается микроцефалия и проявляется прогрессирующее ухудшение мозговой деятельности. Гиперактивность, отклонения от нормы, фиксируемые на электроэнцефалограмме, и припадки, а также серьезные затруднения при обучении являются основными клиническими проблемами в более позднем возрасте. Кожа, волосы, пот и моча (вследствие накопления фенилацетата) обладают специфическим запахом; а также наблюдается склонность к гипопигментации и экземе. Все пациенты, страдающие ФКУ, должны соблюдать специальную диету с низким содержанием Phe. Соответственно, для пациентов, страдающих ФКУ, необходимы пищевые белки, содержащие малое количество или не содержащие остатков Phe. Такие белки можно получить путем отбора пищевых белков, которые предлагаются в данном документе, которые имеют несколько или не имеют ни одного остатка Phe. Соответственно, в некоторых вариантах реализации в пищевом белке соотношение остатков Phe к общему количеству аминокислотных остатков равно или ниже чем 5%, 4%, 3%, 2% или 1%. В некоторых вариантах реализации изобретения пищевой белок содержит 10 или меньше остатков Phe, 9 или меньше остатков Phe, 8 или меньше остатков Phe, 7 или меньше остатков Phe, 6 или меньше остатков Phe, 5 или меньше остатков Phe, 4 или меньше остатков Phe, 3 или меньше остатков Phe, 2 или меньше остатков Phe, 1 остаток Phe или не содержит остатка Phe. В некоторых вариантах реализации изобретения пищевой белок не содержит никаких остатков Phe.

[00147] Аргинин представляет собой условно незаменимую аминокислоту, что означает, что большую часть времени он может вырабатываться в человеческом организме и не обязательно должен быть получен непосредственно с приемом пищи. Отдельные люди, которые не употребляют достаточного количества пищи, люди пожилого возраста или люди с определенными физическими состояниями (например, сепсис) не могут производить достаточных количеств аргинина и вследствие этого нуждаются в увеличении потребления пищевых продуктов, содержащих аргинин. Считается, что аргинин обладает полезными для здоровья свойствами, включающими уменьшение времени заживления повреждений (в частности, кости) и снижение кровяного давления, в частности, высокого кровяного давления на протяжении беременности с повышенным риском (предэклампсия). В дополнение к этому, исследования показали, что добавка L-аргинина в корм является полезной для повышения репродуктивной способности свиней со встречающейся в природе задержкой внутриутробного развития, повышения отложения белка и постнатального роста молочных поросят, нормализации уровней глюкозы в плазме у крыс с сахарным диабетом, индуцированным стрептозотоцином, уменьшения жировой массы у тучных диабетических крыс Цукера (ZDF) и улучшения сосудистой функции у диабетических крыс. Для того чтобы объединить эти полезные свойства по меньшей мере с одним полезным свойством пищевых белков, раскрытых в данном документе, в некоторых вариантах реализации пищевых белков, раскрытых в данном документе, в пищевом белке соотношение аргининовых остатков к общему количеству аминокислотных остатков, которые находятся в пищевом белке, равно или больше чем 3%, равно или больше чем 4%, равно или больше чем 5%, равно или больше чем 6%, равно или больше чем 7%, равно или больше чем 8%, равно или больше чем 9%, равно или больше чем 10%, равно или больше чем 11% или равно или больше чем 12%.

[00148] Перевариваемость представляет собой параметр, имеющий отношение к питательной ценности и полезным свойствам пищевых белков. Информация, касающаяся относительной завершенности переваривания, может выступать в качестве прогностического параметра биодоступности пептида (Daniel, H., 2003. Molecular and Integrative Physiology of Intestinal Peptide Transport. Annual Review of Physiology, Volume 66, pp. 361-384). В некоторых вариантах реализации пищевые белки, раскрытые в данном документе, подвергают скринингу для оценки их перевариваемости. Перевариваемость пищевых белков можно оценить любым подходящим способом, известным в данной области техники. В некоторых вариантах реализации изобретения перевариваемость оценивают с помощью физиологически значимой in vitro реакции переваривания, которая включает одну или обе фазы переваривания белка, переваривание в искусственном желудочном соке и переваривание в искусственном кишечном соке (см., например, Moreno, et al., 2005. Stability of the major allergen Brazil nut 2S albumin (Ber e 1) to physiologically relevant in vitro gastrointestinal digestion. FEBS Journal, pp. 341-352; Martos, G., Contreras, P., Molina, E. & Lopez-Fandino, R., 2010. Egg White Ovalbumin Digestion Mimicking Physiological Conditions. Journal of Agricultural and food chemistry, pp. 5640-5648; Moreno, F.J., Mackie, A.R. & Clare Mills, E.N., 2005. Phospholipid interactions protect the milk allergen a-Lactalbumin from proteolysis during in vitro digestion. Journal of agricultural and food chemistry, pp. 9810-9816). Вкратце, тестируемые белки последовательно подвергают воздействию искусственного желудочного сока (SGF) в течение 120 минут (период времени, который требуется, чтобы 90% жидкой пищи прошло через желудок в тонкий кишечник; См. Kong, F. & Singh, R.P., 2008. Disintegration of Solid Foods in Human Stomach. Journal of Food Science, pp. 67-80) и затем переносят в искусственную дуоденальную жидкость (SDF) для переваривания в течение дополнительных 120 минут. Образцы на разных стадиях переваривания (например, 2, 5, 15, 30, 60 и 120 минут) анализируют путем электрофореза (например, электрофореза на чипе или SDS−PAGE) для мониторинга размера и количества интактного белка, а также любых больших перевариваемых фрагментов (например, больших чем 4 кДа). Исчезновение белка с течением времени свидетельствует о скорости, с которой белок переваривается в данном анализе. Посредством мониторинга количества интактного белка, которое наблюдают с течением времени, в случае SGF рассчитывают время (τ1/2) полупереваривания, и если обнаруживают интактный белок после обработки SGF, рассчитывают τ1/2 переваривания для SIF. Этот анализ можно использовать для оценки относительной перевариваемости (т.е. по сравнению с эталонным белком, таким как белок молочной сыворотки) или для оценки абсолютной перевариваемости. В некоторых вариантах реализации изобретения перевариваемость пищевого белка является более высокой (т.е., SGF τ1/2, и/или SIF τ1/2 является более коротким), чем белка молочной сыворотки. В некоторых вариантах реализации SGF τ1/2 пищевого белка составляет 30 минут или меньше, 20 минут или меньше, 15 минут или меньше, 10 минут или меньше, 5 минут или меньше, 4 минуты или меньше, 3 минуты или меньше, 2 минуты или меньше или 1 минуту или меньше. В некоторых вариантах реализации изобретения SIF τ1/2 пищевого белка составляет 30 минут или меньше, 20 минут или меньше, 15 минут или меньше, 10 минут или меньше, 5 минут или меньше, 4 минуты или меньше, 3 минуты или меньше, 2 минуты или меньше или 1 минуту или меньше. В некоторых вариантах реализации изобретения пищевой белок не поддается обнаружению ни в одном, ни в обоих анализах SGF и SIF через 2 минуты, 5 минут, 15 минут, 30 минут, 60 минут или 120 минут. В некоторых вариантах реализации изобретения пищевой белок подвергается перевариванию с постоянной скоростью и/или с контролируемой скоростью в одной или обеих из SGF и SIF. В таких вариантах реализации изобретения скорость переваривания пищевого белка нельзя оптимизировать для достижения максимально возможной скорости переваривания. В таких вариантах реализации изобретения скорость всасывания белка после поглощения млекопитающим может быть более медленной, и общий период времени, в течение которого происходит всасывание после поглощения, может быть более долгим, чем в случае пищевых белков похожего аминокислотного состава, которые подвергаются перевариванию с более высокой начальной скоростью в одной или обеих из SGF и SIF. В некоторых вариантах реализации изобретения происходит полное или по существу полное переваривание пищевого белка SGF. В некоторых вариантах реализации изобретения по существу не происходит переваривание пищевого белка или не происходит переваривание SGF; в большинстве таких вариантов реализации изобретения переваривание белка происходит в SIF.

[00149] Оценка перевариваемости белка также может дать представление о потенциальной аллергенности белка, поскольку белки или большие фрагменты белков, которые являются устойчивыми к пищеварительным протеазам, могут обладать более высоким риском вызывать аллергическую реакцию (Goodman, R.E. et al., 2008. Allergenicity assessment of genetically modified crops - what makes sense? Nature Biotechnology, pp. 73-81). Для обнаружения и идентификации пептидов, которые имеют очень малый размер для анализа с помощью электрофореза на чипе, можно использовать жидкостную хроматографию и масс-спектрометрию. В образцах SGF пептиды можно непосредственно обнаружить и идентифицировать с помощью LC/MS. Белки, полученные после переваривания в SIF, могут потребовать очистки для удаления желчных кислот до обнаружения и идентификации с помощью LC/MS.

[00150] В некоторых вариантах реализации изобретения перевариваемость пищевого белка оценивают с помощью идентификации и определение числа сайтов распознавания протеазой, отвечающей за переваривание, в аминокислотной последовательности белка. В некоторых вариантах реализации изобретения пищевой белок содержит по меньшей мере один сайт распознавания протеазой, выбранный из сайта распознавания пепином, сайта распознавания трипсином и сайта распознавания химотрипсином.

[00151] В контексте данного документа «сайт распознавания пепином» представляет собой любой сайт в полипептидной последовательности, который, как показано экспериментальным путем, расщепляется пепсином. В некоторых вариантах реализации изобретения он представляет собой пептидную связь после (т.е. за) аминокислотного остатка, выбранного из Phe, Trp, Tyr, Leu, Ala, Glu и Gln, при условии, что следующий остаток не является аминокислотным остатком, выбранным из Ala, Gly и Val.

[00152] В контексте данного документа «сайт распознавания трипсином» представляет собой любой сайт в полипептидной последовательности, который, как показано экспериментальным путем, расщепляется трипсином. В некоторых вариантах реализации изобретения он представляет собой пептидную связь после аминокислотного остатка, выбранного из Lys или Arg, при условии, что следующий остаток не является пролином.

[00153] В контексте данного документа «сайт распознавания химотрипсином» представляет собой любой сайт в полипептидной последовательности, который, как показано экспериментальным путем, расщепляется химотрипсином. В некоторых вариантах реализации изобретения он представляет собой пептидную связь после аминокислотного остатка, выбранного из Phe, Trp, Tyr и Leu.

[00154] Цистеиновые остатки, соединенные дисульфидной связью в белке, проявляют тенденцию к снижению скорости переваривания белка по сравнению с тем, что было бы в отсутствие дисульфидной связи. Например, было показано, что скорость переваривания белка b-лактоглобулина повышается в тех случаях, когда расщепляются его дисульфидные мостики (I.M. Reddy, N.K.D. Kella, and J.E. Kinsella. «Structural and Conformational Basis of the Resistance of B-Lactoglobulin to Peptic and Chymotryptic Digestion». J. Agric. Food Chem. 1988, 36, 737-741). Соответственно, перевариваемость пищевого белка с меньшим количеством дисульфидных связей обычно бывает более высокой, чем в случае сравнимого пищевого белка с большим количеством дисульфидных связей. В некоторых вариантах реализации изобретения пищевые белки, раскрытые в данном документе, подвергают скринингу для установления количества цистеиновых остатков, которые присутствуют в каждом белке, и, в частности, для обеспечения отбора пищевого белка, содержащего относительно низкое количество цистеиновых остатков. Например, можно идентифицировать встречающиеся в природе пищевые белки или фрагменты, которые не содержат ни одного остатка Cys или которые содержат относительно низкое количество остатков Cys, как, например, 10 или меньше остатков Cys, 9 или меньше остатков Cys, 8 или меньше остатков Cys, 7 или меньше остатков Cys, 6 или меньше остатков Cys, 5 или меньше остатков Cys, 4 или меньше остатков Cys, 3 или меньше остатков Cys, 2 или меньше остатков Cys, 1 остаток Cys или ни одного остатка Cys. В некоторых вариантах реализации во встречающемся в природе пищевом белке или его фрагменте удаляют один или несколько остатков Cys посредством делеции и/или посредством замены другой аминокислотой. В некоторых вариантах реализации удаляют или заменяют 1 остаток Cys, удаляют или заменяют 1 или больше остатков Cys, удаляют или заменяют 2 или больше остатков Cys, удаляют или заменяют 3 или больше остатков Cys, удаляют или заменяют 4 или больше остатков Cys, удаляют или заменяют 5 или больше остатков Cys, удаляют или заменяют 6 или больше остатков Cys, удаляют или заменяют 7 или больше остатков Cys, удаляют или заменяют 8 или больше остатков Cys, удаляют или заменяют 9 или больше остатков Cys или удаляют или заменяют 10 или больше остатков Cys. В некоторых вариантах реализации в пищевом белке данного раскрытия соотношение остатков Cys к общему количеству аминокислотных остатков равно или ниже чем 5%, 4%, 3%, 2% или 1%. В некоторых вариантах реализации изобретения пищевой белок содержит 10 или меньше остатков Cys, 9 или меньше остатков Cys, 8 или меньше остатков Cys, 7 или меньше остатков Cys, 6 или меньше остатков Cys, 5 или меньше остатков Cys, 4 или меньше остатков Cys, 3 или меньше остатков Cys, 2 или меньше остатков Cys, 1 остаток Cys или ни одного остатка Cys. В некоторых вариантах реализации изобретения пищевой белок содержит 1 или меньше остатков Cys. В некоторых вариантах реализации изобретения пищевой белок не содержит ни одного остатка Cys.

[00155] В качестве альтернативы или в дополнение к этому, дисульфидные связи, которые присутствуют или могут присутствовать в пищевом белке, можно удалить. Дисульфидные связи можно удалить с использованием химических методов путем восстановления дисульфидной группы с образованием двух тиоловых групп с помощью восстанавливающих средств, таких как бета-меркаптоэтанол, дитиотреитол (ДТТ) или трис(2-карбоксиэтил)фосфин (TCEP). Тиоловые группы затем можно ковалентно модифицировать или «блокировать» с помощью реактивов, таких как иодоацетамид, N-этилмалеимид или сульфит натрия (см., например, Crankshaw, M.W. and Grant, G.A. 2001. Modification of Cysteine. Current Protocols in Protein Science. 15.1.1-15.1.18).

[00156] Эукариотические белки часто являются гликозилированными, а углеводные цепи, которые присоединены к белкам, выполняют различные функции. N-связанное и O-связанное гликозилирование - две наиболее распространенные формы гликозилирования, встречающегося в белках. N-связанное гликозилирование представляет собой присоединение молекулы сахара к атому азота в аминокислотном остатке в белке. N-связанное гликозилирование происходит по остаткам Аспарагина и Аргинина. O-связанное гликозилирование представляет собой присоединение молекулы сахара к атому кислорода в аминокислотном остатке в белке. O-связанное гликозилирование происходит по остаткам Треонина и Серина.

[00157] Гликозилированные белки часто являются более растворимыми, нежели их негликозилированные формы. В контексте белковых препаратов надлежащее гликозилирование обычно придает высокую активность, надлежащее связывание антигена, лучшую стабильность в крови и т.д. Однако гликозилирование обязательно означает, что белок «несет на себе» молекулы сахара. Такие молекулы сахара могут снижать практическую ценность пищевых белков данного раскрытия, включая рекомбинантные пищевые белки. Например, как показано в примерах, сравнение переваривания гликозилированных и негликозилированных форм одних и тех же белков показывает, что негликозилированные формы подвергаются перевариванию быстрее, чем гликозилированные формы. Поэтому, в некоторых вариантах реализации изобретения пищевые белки в соответствии с данным раскрытием имеют низкую степень гликозилирования или являются негликозилированными. Например, в некоторых вариантах реализации изобретения в пищевых белках соотношение негликозилированных аминокислотных остатков к общему количеству аминокислотных остатков составляет по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%. В некоторых вариантах реализации изобретения пищевые белки являются негликозилированными.

[00158] В некоторых вариантах реализации изобретения пищевой белок в соответствии с данным раскрытием подвергается дегликозилированию после получения и после выделения. Пищевые белки с низкой степенью или без гликозилирования можно получить любым способом, известным в данной области техники. Например, можно использовать ферментативные и/или химические методы (Biochem. J. (2003) 376, p339-350.). Ферменты коммерчески производят в лабораторных масштабах для удаления N-связанных и O-связанных олигосахаридов. Химические способы включают применение трифторметансульфоновой кислоты для избирательного разрушения N-связанных и O-связанных пептид-сахаридных связей. Этот способ реализации изобретения часто приводит к более полному дегликозилированию, чем применение ферментативных способов.

[00159] В других вариантах реализации изобретения пищевой белок в соответствии с данным раскрытием получают с низкой степенью или без гликозилирования с помощью организма хозяина. Большинство бактерий и других прокариот обладают очень ограниченными способностями для гликозилирования белков, особенно гетерологичных белков. Соответственно, в некоторых вариантах реализации данного раскрытия пищевой белок получают с применением технологии рекомбинантной ДНК в микроорганизме таким образом, что уровень гликозилирования рекомбинантного белка является низким или гликозилирование вообще не происходит. В некоторых вариантах реализации изобретения уровень гликозилирования рекомбинантного пищевого белка является более низким, чем уровень гликозилирования белка, который встречается в организме, из которого его получают.

[00160] В некоторых вариантах реализации изобретения в пищевом белке или полипептиде в соответствии с данным раскрытием соотношение аминокислот, выбранных из Asn, Arg, Ser и Thr, к общим аминокислотам составляет 20% или меньше, 19% или меньше, 18% или меньше, 17% или меньше, 16% или меньше, 15% или меньше, 14% или меньше, 13% или меньше, 12% или меньше, 11% или меньше, 10% или меньше, 9% или меньше, 8% или меньше, 7% или меньше, 6% или меньше, 5% или меньше, 4% или меньше, 3% или меньше, 2% или меньше, 1% или меньше. В некоторых вариантах реализации пищевой белок или полипептид в соответствии с данным раскрытием не содержит аминокислот, выбранных из Asn, Arg, Ser и Thr. В некоторых вариантах реализации изобретения пищевой белок или полипептид в соответствии с данным раскрытием содержит менее чем 20, меньше чем 19, меньше чем 18, меньше чем 17, меньше чем 16, меньше чем 15, менее чем 14, менее чем 13, менее чем 12, менее чем 11, менее чем 10, менее чем 9, менее чем 8, менее чем 7, менее чем 6, менее чем 5, менее чем 4, менее чем 3, менее чем 2, менее чем 1 или не содержит аминокислот, выбранных из Asn, Arg, Ser и Thr.

[00161] В некоторых вариантах реализации пищевых белков, раскрытых в данном документе, пищевой белок является растворимым. Растворимость пищевых белков можно измерить с помощью любого способа, известного в данной области техники. В некоторых вариантах реализации растворимость исследуют путем концентрирования центрифугированием с последующими анализами концентраций белка. Образцы пищевых белков тестируют на концентрацию белка в 20 мМ HEPES pH 7,5 в соответствии с протоколами с использованием двух способов, анализа белка с помощью Coomassie Plus (Брэдфорд) (Thermo Scientific) и анализа белка с помощью бицинхониновой кислоты (BCA) (Sigma-Aldrich). На основе этих измерений 10 мг белка добавляют в центрифужный концентратор Amicon Ultra, 3 кДа (Millipore). Образцы концентрируют путем центрифугирования при 10000 Xg в течение 30 минут. Конечные, в данном случае концентрированные, образцы исследуют на преципитацию белка и затем тестируют на концентрацию белка, как указано выше, с использованием двух способов, Брэдфорда и BCA.

[00162] В некоторых вариантах реализации пищевые белки имеют конечный предел растворимости по меньшей мере 5 г/л, 10 г/л, 20 г/л, 30 г/л, 40 г/л, 50 г/л или 100 г/л при физиологическом pH. В некоторых вариантах реализации изобретения растворимость пищевых белков составляет более чем 50%, более чем 60%, более чем 70%, более чем 80%, более чем 90%, более чем 95%, более чем 96%, более чем 97%, более чем 98%, более чем 99% или более чем 99,5%, причем не наблюдается никакой преципитации белка при концентрации, большей чем 5 г/л или 10 г/л, или 20 г/л, или 30 г/л, или 40 г/л, или 50 г/л, или 100 г/л при физиологическом pH. В некоторых вариантах реализации изобретения растворимость пищевого белка является более высокой, чем растворимость, о которой обычно сообщают в исследованиях, в которых изучают пределы растворимости белков молочной сыворотки (12,5 г/л; Pelegrine et al., Lebensm.-Wiss. U.-Technol. 38 (2005) 77-80) и сои (10 г/л; Lee et al., JAOCS 80(1) (2003) 85-90).

[00163] В контексте данного документа «стабильный» белок - это белок, которые устойчив к изменениям (например, разворачиванию, окислению, агрегации, гидролизу и т.д.), которые изменяют биофизические (например, растворимость), биологические (например, перевариваемость) или структурные (например, доля аминокислоты лейцина) характеристики представляющего интерес белка.

[00164] Стабильность белков можно измерить с помощью различных анализов, известных в данной области техники, и можно отобрать пищевые белки, раскрытые в данном документе и характеризующиеся стабильностью выше порогового уровня. В некоторых вариантах реализации изобретения выбирают белок, который проявляет термостабильность, которая сравнима с или лучше, чем термостабильность белка молочной сыворотки. Термостабильность представляет собой свойство, с помощью которого можно предсказать срок годности пищевого белка. В некоторых вариантах реализации данного анализа стабильность образцов пищевого белка определяют путем контроля образования агрегатов с применением эксклюзионной хроматографии (SEC) после воздействия предельных температур. Образцы тестируемого белка, растворенного в воде, помещают в нагревательный блок при 90°C, и образцы вынимают через 0, 1, 5, 10, 30 и 60 минут для анализа с помощью SEC. Белок обнаруживают путем контроля абсорбции при 214 нм, а агрегаты отличаются пиками, которые элюируют быстрее, чем представляющий интерес белок. Отсутствие общего изменения площади пика свидетельствует об отсутствии преципитации белка на протяжении тепловой обработки. В процессе такого анализа было показано, что белок молочной сыворотки быстро образует ~80% агрегатов при воздействии 90°C.

[00165] В некоторых вариантах реализации изобретения термостабильность пищевого белка определяют путем медленного нагревания образца от 25°C до 95°C в присутствии гидрофобного красителя (например, ProteoStat® Thermal shift stability assay kit, Enzo Life Sciences), который связывается с агрегированными белками, которые образуются по мере денатурации белка с увеличением температуры (Niesen, F.H., Berglund, H. & Vadadi, M., 2007. The use of differential scanning fluorimetry to detect ligand interactions that promote protein stability. Nature Protocols, Volume 2, pp. 2212-2221). После связывания флуоресценция красителя значительно усиливается, что регистрируется прибором для ПЦР в режиме реального времени и представляется в виде кривой плавления белка (Lavinder, J.J., Hari, S.B., Suillivan, B.J. & Magilery, T.J., 2009. High-Throughput Thermal Scanning: A General, Rapid Dye-Binding Thermal Shift Screen for Protein Engineering. Journal of the American Chemical Society, pp. 3794-3795). По завершении анализа теплового сдвига образцы исследуют на наличие нерастворимых преципитатов и дополнительно анализируют путем аналитической эксклюзионной хроматографии (SEC).

[00166] В некоторых вариантах реализации изобретения пищевой белок по данному раскрытию проявляет устойчивость к агрегации, проявляя, например, менее чем 80% агрегации, 10% агрегации или не поддающуюся обнаружению агрегацию при повышенных температурах (например, 50°C, 60°C, 70°C, 80°C, 85°C, 90°C или 95°C).

[00167] Одно преимущество стабильных пищевых белков, которые раскрываются в данном документе, заключается в том, что их можно хранить в течение длительного периода времени до использования, в отдельных случаях без необходимости в рефрижерации или охлаждении. В некоторых вариантах реализации изобретения пищевые белки подвергаются сушке (например, путем лиофилизации). В некоторых вариантах реализации изобретения пищевые белки сохраняют стабильность после лиофилизации. В некоторых вариантах реализации изобретения такие лиофилизированные пищевые белки сохраняют их стабильность после растворения (например, жидкий состав).

[00168] В случае большинства вариантов реализации изобретения было бы предпочтительно, чтобы пищевой белок не обладал чрезмерно высокой аллергенностью. Соответственно, в некоторых вариантах реализации оценивают потенциальную аллергенность пищевого белка. Это может быть сделано любым подходящим способом, известным в данной области техники. В некоторых вариантах реализации рассчитывают показатель аллергенности. Показатель аллергенности представляет собой меру, основанную на первичной последовательности, на основе рекомендаций ВОЗ (http://www.fao.org/ag/agn/food/pdf/allergygm.pdf) для оценки того, насколько белок похож на любой известный аллерген, при этом первичная гипотеза заключается в том, что высокий процент идентичности между целевым и известным аллергеном, вероятно, свидетельствует о перекрестной реактивности. Для заданного белка вероятность вызова аллергической реакции можно оценить посредством одного или обоих тестов из пары тестов, дополняющих друг друга, на основе сравнения гомологии последовательностей. Первый тест позволяет определить процент идентичности белка по всей последовательности посредством глобально-глобального выравнивания последовательностей с последовательностями базы данных известных аллергенов с использованием алгоритма FASTA с матрицей замен BLOSUM50, штрафом за открытие пробела 10 и штрафом за удлинение пробела 2. Предполагалось, что белки с общей гомологией, меньшей чем 50%, вряд ли являются аллергенными (Goodman R.E. et al. Allergenicity assessment of genetically modified crops-what makes sense? Nat. Biotech. 26, 73-81 (2008); Aalberse R.C. Structural biology of allergens. J. Allergy Clin. Immunol. 106, 228-238 (2000)).

[00169] В некоторых вариантах реализации пищевого белка общая гомология пищевого белка с любым известным аллергеном, находящимся в базе данных, которую применяли для данного анализа, составляет менее чем 50%. В некоторых вариантах реализации изобретения применяют предел гомологии, меньший чем 40%. В некоторых вариантах реализации изобретения применяют предел гомологии, меньший чем 30%. В некоторых вариантах реализации изобретения применяют предел гомологии, меньший чем 20%. В некоторых вариантах реализации изобретения применяют предел гомологии, меньший чем 10%. В некоторых вариантах реализации изобретения применяют предел от 40% до 50%. В некоторых вариантах реализации изобретения применяют предел от 30% до 50%. В некоторых вариантах реализации изобретения применяют предел от 20% до 50%. В некоторых вариантах реализации изобретения применяют предел от 10% до 50%. В некоторых вариантах реализации изобретения применяют предел от 5% до 50%. В некоторых вариантах реализации изобретения применяют предел от 0% до 50%. В некоторых вариантах реализации изобретения применяют предел общей гомологии с любым известным аллергеном, находящимся в базе данных, которую применяли для данного анализа, который составляет больше чем 50%. В некоторых вариантах реализации изобретения применяют предел от 50% до 60%. В некоторых вариантах реализации изобретения применяют предел от 50% до 70%. В некоторых вариантах реализации изобретения применяют предел от 50% до 80%. В некоторых вариантах реализации изобретения применяют предел от 50% до 90%. В некоторых вариантах реализации изобретения применяют предел от 55% до 60%. В некоторых вариантах реализации изобретения применяют предел от 65% до 70%. В некоторых вариантах реализации изобретения применяют предел от 70% до 75%. В некоторых вариантах реализации изобретения применяют предел от 75% до 80%.

[00170] Второй тест позволяет оценить локальную аллергенность вдоль белковой последовательности путем определения локальной аллергенности всех возможных непрерывных фрагментов, состоящих из 80 аминокислот, посредством глобально-локального выравнивания последовательностей каждого фрагмента с последовательностями базы данных известных аллергенов с использованием алгоритма FASTA с матрицей замен BLOSUM50, штрафом за открытие пробела 10 и штрафом за удлинение пробела 2. Самый высокий процент идентичности любого фрагмента, состоящего из 80 аминокислот, с любым аллергеном, принимают за конечный вес в случае представляющего интерес белка. В руководствах ВОЗ предлагается использование предела идентичности с этим фрагментом, который составляет 35%. В некоторых вариантах реализации пищевого белка локальная гомология всех возможных фрагментов пищевого белка с любым известным аллергеном, находящимся в базе данных, которую использовали для данного анализа с использованием данного теста, составляет менее чем 35%. В некоторых вариантах реализации изобретения применяют предел гомологии, меньший чем 30%. В некоторых вариантах реализации изобретения применяют предел гомологии от 30% до 35%. В некоторых вариантах реализации изобретения применяют предел гомологии от 25% до 30%. В некоторых вариантах реализации изобретения применяют предел гомологии от 20% до 25%. В некоторых вариантах реализации изобретения применяют предел гомологии от 15% до 20%. В некоторых вариантах реализации изобретения применяют предел гомологии от 10% до 15%. В некоторых вариантах реализации изобретения применяют предел гомологии от 5% до 10%. В некоторых вариантах реализации изобретения применяют предел гомологии от 0% до 5%. В некоторых вариантах реализации изобретения применяют предел гомологии, больший чем 35%. В некоторых вариантах реализации изобретения применяют предел гомологии от 35% до 40%. В некоторых вариантах реализации изобретения применяют предел гомологии от 40% до 45%. В некоторых вариантах реализации изобретения применяют предел гомологии от 45% до 50%. В некоторых вариантах реализации изобретения применяют предел гомологии от 50% до 55%. В некоторых вариантах реализации изобретения применяют предел гомологии от 55% до 60%. В некоторых вариантах реализации изобретения применяют предел гомологии от 65% до 70%. В некоторых вариантах реализации изобретения применяют предел гомологии от 70% до 75%. В некоторых вариантах реализации изобретения применяют предел гомологии от 75% до 80%.

[00171] С этой целью специалисты в данной области техники способны определить и использовать подходящую базу данных известных аллергенов. В некоторых вариантах реализации базу данных составляют по заказу путем отбора белков из нескольких источников баз данных. В некоторых вариантах реализации изобретения потребительская база данных содержит объединенные перечни аллергенов, составленные с помощью Food Allergy Research and Resource Program (http://www.allergenonline.org/), аннотаций UNIPROT (http://www.uniprot.org/docs/allergen) и структурной базы данных аллергенных белков (SDAP, http://fermi.utmb.edu/SDAP/sdap_lnk.html). Эта база данных включает все аллергены, признанные в настоящее время Международным союзом обществ иммунологии (МСОИ, http://www.allergen.org/), а также большое количество дополнительных аллергенов, которые еще не получили официального названия. В некоторых вариантах реализации изобретения база данных содержит подгруппу известных аллергенных белков доступных в известных базах данных; то есть, база данных представляет собой избранную пользователем подгруппу известных аллергенных белков. В некоторых вариантах реализации изобретения база данных известных аллергенов содержит по меньшей мере 10 белков, по меньшей мере 20 белков, по меньшей мере 30 белков, по меньшей мере 40 белков, по меньшей мере 50 белков, по меньшей мере 100, белков, по меньшей мере 200 белков, по меньшей мере 300 белков, по меньшей мере 400 белков, по меньшей мере 500 белков, по меньшей мере 600 белков, по меньшей мере 700 белков, по меньшей мере 800 белков, по меньшей мере 900 белков, по меньшей мере 1000 белков, по меньшей мере 1100 белков, по меньшей мере 1200 белков, по меньшей мере 1300 белков, по меньшей мере 1400 белков, по меньшей мере 1500 белков, по меньшей мере 1600 белков, по меньшей мере 1700 белков, по меньшей мере 1800 белков, по меньшей мере 1900 белков или по меньшей мере 2000 белков. В некоторых вариантах реализации изобретения база данных известных аллергенов содержит от 100 до 500 белков, от 200 до 1000 белков, от 500 до 1000 белков и от 500 до 1000 белков и или от 1000 до 2000 белков.

[00172] В некоторых вариантах реализации изобретения все из (или избранную подгруппу) непрерывных аминокислотных фрагментов пищевого белка разной длины (например, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10, 8 или 6 аминокислотных фрагментов) тестируют в сопоставлении с базой данных аллергенов, и для дальнейшего изучения потенциальной аллергенности идентифицируют пептидные последовательности, которые обладают 100% идентичностью, 95% или более высокой идентичностью, 90% или более высокой идентичностью, 85% или более высокой идентичностью, 80% или более высокой идентичностью, 75% или более высокой идентичностью, 70% или более высокой идентичностью, 65% или более высокой идентичностью, 60% или более высокой идентичностью, 55% или более высокой идентичностью, или 50% или более высокой идентичностью.

[00173] Другой способ предсказания аллергенности белка заключается в оценке гомологии данного белка с белком человеческого происхождения. Иммунная система человека регулярно подвергается воздействию множества потенциально аллергенных белков и обладает внутренним свойством различать белки организма хозяина и экзогенные белки. Точная природа этого свойства не всегда понятна, и существуют многие заболевания, которые возникают в результате неспособности организма различать свое и чужое (например, артрит). Тем не менее, основная гипотеза заключается в том, что менее вероятно, чтобы белки, которые имеют некоторую степень гомологии последовательностей с человеческими белками, вызвали иммунный ответ. В частности, было показано, что в случае некоторых семейств белков с известными представителями, обладающими аллергенными свойствами (тропомиозины, парвальбумины, казеины), те белки, которые имеют большую гомологию последовательностей с их человеческими аналогами по сравнению с известными аллергенными белками, не считаются аллергенными (Jenkins J.A. et al. Evolutionary distance from human homologs reflects allergenicity of animcal food proteins. J. Allergy Clin Immunol. 120 (2007): 1399-1405). Для заданного белка измеряют степень гомологии с белками человека путем определения максимального процента идентичности белка с белками базы данных по человеческим белкам (например, базы данных UNIPROT) на основе глобально-локального выравнивания с использованием алгоритма FASTA с матрицей замен BLOSUM50, штрафом за открытие пробела 10 и штрафом за удлинение пробела 2. В соответствии с Jenkins et al. (Jenkins J.A. et al. Evolutionary distance from homologs reflects allergenicity of animal food proteins. J. Allergy Clin Immunol. 120 (2007): 1399-1405) менее вероятно, чтобы белки, обладающие идентичностью последовательностей с человеческим белком выше около 62%, были аллергенными. С этой целью специалисты в данной области техники способны определить и использовать подходящую базу данных известных человеческих белков, например, через поиск в базе данных UNIPROT (http://www.uniprot.org). В некоторых вариантах реализации изобретения базу данных составляют по заказу путем отбора белков из нескольких источников баз данных. Разумеется, что база данных может, но не обязательно должна, быть исчерпывающей. В некоторых вариантах реализации изобретения база данных содержит подгруппу человеческих белков; то есть, база данных представляет собой избранную пользователем подгруппу человеческих белков. В некоторых вариантах реализации база данных по человеческим белкам содержит по меньшей мере 10 белков, по меньшей мере 20 белков, по меньшей мере 30 белков, по меньшей мере 40 белков, по меньшей мере 50 белков, по меньшей мере 100 белков, по меньшей мере 200 белков, по меньшей мере 300 белков, по меньшей мере 400 белков, по меньшей мере 500 белков, по меньшей мере 600 белков, по меньшей мере 700 белков, по меньшей мере 800 белков, по меньшей мере 900 белков, по меньшей мере 1000 белков, по меньшей мере 2000 белков, по меньшей мере 3000 белков, по меньшей мере 4000 белков, по меньшей мере 5000 белков, по меньшей мере 6000 белков, по меньшей мере 7000 белков, по меньшей мере 8000 белков, по меньшей мере 9000 белков или по меньшей мере 10000 белков. В некоторых вариантах реализации изобретения база данных содержит от 100 до 500 белков, от 200 до 1000 белков, от 500 до 1000 белков и от 500 до 1000 белков, и от 1000 до 2000 белков, от 1000 до 5000 белков или от 5000 до 10000 белков. В некоторых вариантах реализации изобретения база данных содержит по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или по меньшей мере 99% всех известных человеческих белков.

[00174] В некоторых вариантах реализации пищевого белка указанный пищевой белок по меньшей мере на 20% гомологичен человеческому белку. В некоторых вариантах реализации используют предел гомологии по меньшей мере 30%. В некоторых вариантах реализации изобретения применяют предел гомологии по меньшей мере 40%. В некоторых вариантах реализации изобретения по меньшей мере применяют предел гомологии по меньшей мере 50%. В некоторых вариантах реализации изобретения применяют предел гомологии по меньшей мере 60%. В некоторых вариантах реализации изобретения применяют предел гомологии по меньшей мере 70%. В некоторых вариантах реализации изобретения применяют предел гомологии по меньшей мере 80%. В некоторых вариантах реализации изобретения применяют предел гомологии по меньшей мере 62%. В некоторых вариантах реализации изобретения применяют предел гомологии от по меньшей мере 20% до по меньшей мере 30%. В некоторых вариантах реализации изобретения применяют предел гомологии от по меньшей мере 30% до по меньшей мере 40%. В некоторых вариантах реализации изобретения применяют предел гомологии от по меньшей мере 50% до по меньшей мере 60%. В некоторых вариантах реализации изобретения применяют предел гомологии от по меньшей мере 60% до по меньшей мере 70%. В некоторых вариантах реализации изобретения применяют предел гомологии от по меньшей мере 70% до по меньшей мере 80%.

[00175] В случае большинства вариантов реализации было бы предпочтительным, чтобы пищевой белок не обладал чрезвычайно высокой токсичностью. Соответственно, в некоторых вариантах реализации изобретения оценивают потенциальную токсичность пищевого белка. Это можно сделать любым подходящим способом, известным в данной области техники. В некоторых вариантах реализации изобретения рассчитывают показатель токсичности путем определения процента идентичности данного белка с белками баз данных по токсичным белкам (например, токсичным белками, идентифицированным с помощью базы данных UNIPROT). Глобально-глобальное выравнивание представляющего интерес белка в сопоставлении с базой данных известных токсинов, осуществляют с использованием алгоритма FASTA с матрицей замен BLOSUM50, штрафом за открытие пробела 10 и штрафом за удлинение пробела 2. В некоторых вариантах реализации пищевого белка указанный пищевой белок менее чем на 35% гомологичен известному токсину. В некоторых вариантах реализации изобретения применяют предел гомологии, меньее чем 35%. В некоторых вариантах реализации изобретения применяют предел гомологии от 30% до 35%. В некоторых вариантах реализации изобретения применяют предел гомологии от 25% до 35%. В некоторых вариантах реализации изобретения применяют предел гомологии от 20% до 35%. В некоторых вариантах реализации изобретения применяют предел гомологии от 15% до 35%. В некоторых вариантах реализации изобретения применяют предел гомологии от 10% до 35%. В некоторых вариантах реализации изобретения применяют предел гомологии от 5% до 35%. В некоторых вариантах реализации изобретения применяют предел гомологии от 0% до 35%. В некоторых вариантах реализации изобретения применяют предел гомологии, больший чем 35%. В некоторых вариантах реализации изобретения применяют предел гомологии от 35% до 40%. В некоторых вариантах реализации применяют предел гомологии от 35% до 45%. В некоторых вариантах реализации изобретения применяют предел гомологии от 35% до 50%. В некоторых вариантах реализации изобретения применяют предел гомологии от 35% до 55%. В некоторых вариантах реализации изобретения применяют предел гомологии от 35% до 60%. В некоторых вариантах реализации изобретения применяют предел гомологии от 35% до 70%. В некоторых вариантах реализации изобретения применяют предел гомологии от 35% до 75%. В некоторых вариантах реализации изобретения применяют предел гомологии от 35% до 80%. С этой целью специалисты в данной области техники способны определить и использовать подходящую базу данных известных токсинов, например, через поиск в базе данных UNIPROT (http://www.uniprot.org). В некоторых вариантах реализации изобретения базу данных составляют по заказу путем отбора белков, идентифицированных как токсины, из нескольких источников баз данных. В некоторых вариантах реализации изобретения база данных содержит подгруппу известных токсичных белков; то есть, база данных представляет собой избранную пользователем подгруппу известных токсичных белков. В некоторых вариантах реализации изобретения база данных по токсичным белкам содержит по меньшей мере 10 белков, по меньшей мере 20 белков, по меньшей мере 30 белков, по меньшей мере 40 белков, по меньшей мере 50 белков, по меньшей мере 100, белков, по меньшей мере 200 белков, по меньшей мере 300 белков, по меньшей мере 400 белков, по меньшей мере 500 белков, по меньшей мере 600 белков, по меньшей мере 700 белков, по меньшей мере 800 белков, по меньшей мере 900 белков, по меньшей мере 1000 белков, по меньшей мере 2000 белков, по меньшей мере 3000 белков, по меньшей мере 4000 белков, по меньшей мере 5000 белков, по меньшей мере 6000 белков, по меньшей мере 7000 белков, по меньшей мере 8000 белков, по меньшей мере 9000 белков или по меньшей мере 10000 белков. В некоторых вариантах реализации изобретения база данных содержит от 100 до 500 белков, от 200 до 1000 белков, от 500 до 1000 белков и от 500 до 1000 белков, и от 1000 до 2000 белков, от 1000 до 5000 белков или от 5000 до 10000 белков.

[00176] В случае некоторых вариантов реализации изобретения было бы предпочтительным, чтобы пищевой белок не обладал антипитательным действием («антипитательностью»), как белки, которые обладают потенциалом предотвращать всасывание питательных веществ из пищи. Примеры антипитательных факторов включают ингибиторы протеаз, которые ингибируют действие трипсина, пепсина и других протеаз в кишечнике, что предотвращает переваривание и последующее всасывание белка. Соответственно, в некоторых вариантах реализации изобретения оценивают потенциальную антипитательность пищевого белка. Это может быть сделано любым подходящим способом, известным в данной области техники. В некоторых вариантах реализации изобретения рассчитывают показатель антипитательности путем определения процента идентичности белков с белками баз данных по известным ингибиторам протеаз (например, ингибиторам протеаз, идентифицированным с помощью базы данных UNIPROT). Глобально-глобальное выравнивание представляющего интерес белка в сопоставлении с базой данных известных ингибиторов протеаз осуществляют с использованием алгоритма FASTA с матрицей замен BLOSUM50, штрафом за открытие пробела 10 и штрафом за удлинение пробела 2 для определения того, гомологичен ли пищевой белок известному антипищевому белку. В некоторых вариантах реализации пищевого белка указанный пищевой белок обладает общей гомологией с любым известным антипищевым белком (например, любым известным ингибитором протеаз), находящимся в базе данных, которую использовали для данного анализа, меньше чем на 35%. В некоторых вариантах реализации изобретения применяют предел идентичности, меньший чем 35%. В некоторых вариантах реализации используют предел от 30% до 35%. В некоторых вариантах реализации изобретения применяют предел от 25% до 35%. В некоторых вариантах реализации изобретения применяют предел от 20% до 35%. В некоторых вариантах реализации изобретения применяют предел от 15% до 35%. В некоторых вариантах реализации изобретения применяют предел от 10% до 35%. В некоторых вариантах реализации изобретения применяют предел от 5% до 35%. В некоторых вариантах реализации изобретения применяют предел от 0% до 35%. В некоторых вариантах реализации изобретения применяют предел идентичности больший чем 35%. В некоторых вариантах реализации изобретения применяют предел от 35% до 40%. В некоторых вариантах реализации изобретения применяют предел от 35% до 45%. В некоторых вариантах реализации изобретения применяют предел от 35% до 50%. В некоторых вариантах реализации изобретения применяют предел от 35% до 55%. В некоторых вариантах реализации изобретения применяют предел от 35% до 60%. В некоторых вариантах реализации изобретения применяют предел от 35% до 70%. В некоторых вариантах реализации изобретения применяют предел от 35% до 75%. В некоторых вариантах реализации изобретения применяют предел от 35% до 80%. С этой целью специалисты в данной области техники способны определить и использовать подходящую базу данных известных ингибиторов протеаз, например, через поиск в базе данных UNIPROT (http://www.uniprot.org). В некоторых вариантах реализации изобретения базу данных составляют по заказу путем отбора идентифицированных белков-ингибиторов протеаз, начиная с нескольких источников баз данных. В некоторых вариантах реализации изобретения база данных содержит подгруппу известных ингибиторов протеаз, доступных в базах данных; то есть, база данных представляет собой избранную пользователем подгруппу известных белков-ингибиторов протеаз. В некоторых вариантах реализации база данных известных белков-ингибиторов протеаз содержит по меньшей мере 10 белков, по меньшей мере 20 белков, по меньшей мере 30 белков, по меньшей мере 40 белков, по меньшей мере 50 белков, по меньшей мере 100, белков, по меньшей мере 200 белков, по меньшей мере 300 белков, по меньшей мере 400 белков, по меньшей мере 500 белков, по меньшей мере 600 белков, по меньшей мере 700 белков, по меньшей мере 800 белков, по меньшей мере 900 белков, по меньшей мере 1000 белков, по меньшей мере 1100 белков, по меньшей мере 1200 белков, по меньшей мере 1300 белков, по меньшей мере 1400 белков, по меньшей мере 1500 белков, по меньшей мере 1600 белков, по меньшей мере 1700 белков, по меньшей мере 1800 белков, по меньшей мере 1900 белков или по меньшей мере 2000 белков. В некоторых вариантах реализации изобретения база данных известных белков-ингибиторов протеаз содержит от 100 до 500 белков, от 200 до 1000 белков, от 500 до 1000 белков и от 500 до 1000 белков или от 1000 до 2000 белков или от 2000 до 3000 белков.

[00177] В других вариантах реализации изобретения применяют пищевой белок, который действительно обладает некоторой степенью активности ингибитора протеаз. Например, в некоторых вариантах реализации изобретения такой белок может быть полезным, потому что он задерживает переваривание с помощью протеаз в тех случаях, когда пищевой белок потребляется таким образом, что указанный пищевой белок проходит большое расстояние внутри желудочно-кишечного тракта до того, как он подвергается перевариванию, таким образом, задерживая всасывание. Например, в некоторых вариантах реализации изобретения пищевой белок ингибирует желудочное переваривание, но не кишечное переваривание.

[00178] Delaney B. et al. (Evaluation of protein safety in the context of agricultural biotechnology. Food. Chem. Toxicol. 46 (2008: S71-S97)) предполагают, что следует избегать как известных токсичных, так и антипищевых белков при оценке безопасности потенциального пищевого белка. В некоторых вариантах реализации пищевого белка указанный пищевой белок обладает подходящим низким уровнем общей гомологии с белками базы данных по известным токсичным белкам и/или подходящим низким уровням общей гомологии с белками базы данных известных антипищевых белков (например, ингибиторов протеаз), как определено в данном документе.

[00179] Одно свойство, которое может повысить полезность пищевого белка, представляет собой его заряд (или заряд на аминокислоту). Пищевые белки с более высоким зарядом могут в некоторых вариантах реализации обладать необходимыми свойствами, такими как повышенная растворимость, повышенная стабильность, устойчивость к агрегации и необходимые профили вкуса. Например, из заряженного пищевого белка, который обладает повышенной растворимостью, можно составить напиток или жидкий состав, который включает высокую концентрацию пищевого белка в относительно небольшом объеме раствора, таким образом, обеспечивая доставку большой дозы белкового питания на единицу объема. Заряженный пищевой белок, который обладает повышенной растворимостью, можно применять, например, в спортивных напитках или восстановительных напитках, отличающихся тем, что потребитель (например, спортсмен) может по желанию употреблять пищевой белок до, на протяжении или после двигательной активности. Заряженный пищевой белок, который обладает повышенной растворимостью, также можно, в частности, применять в клинических условиях, отличающихся тем, что субъект (например, пациент или пожилой человек) нуждается в белковом питании, но не может употреблять твердые пищевые продукты или большие объемы жидкостей.

[00180] Например, суммарный заряд (ЗарядP) полипептида при pH 7 можно рассчитать с помощью следующей формулы:

[00181] ЗарядP = -0,002-(C)(0,045)-(D)(0,999)-(E)(0,998)+(H)(0,091)+(K)(1,0)+(R)(1,0)-(Y)(-0,001),

[00182] где C представляет собой количество цистеиновых остатков, D представляет собой количество остатков аспарагиновой кислоты, E представляет собой количество остатков глутаминовой кислоты, H представляет собой количество гистидиновых остатков, K представляет собой количество лизиновых остатков, R представляет собой количество аргининовых остатков и Y представляет собой количество тирозиновых остатков в полипептиде. Заряд на аминокислоту (ЗарядA) полипептида можно рассчитать путем деления суммарного заряда (ЗарядP) на количество аминокислотных остатков (N), т.е. ЗарядA = ЗарядP/N. (См. Bassi S (2007), «A Primer on Python for Life Science Researchers.» PLoS Comput Biol 3(11): e199. doi:10,1371/journal.pcbi.0030199).

[00183] Одной мерой оценки гидрофильности и потенциальной растворимости заданного белка является сольватное число. Сольватное число определяют как общую свободную энергию сольватации (т.е. изменение свободной энергии, связанное с переходом из газовой фазы в разбавленный раствор) для всех боковых цепей аминокислот, если бы сольватация каждого остатка проходила независимо, нормализованную на общее количество остатков в последовательности. Свободные энергии сольватации боковых цепей находят путем вычислений посредством расчета разницы электростатической энергии между диэлектрической проницаемостью вакуума 1 и диэлектрической проницаемостью воды 80 (решая уравнение Пуассона-Больцмана), а также энергии Ван-дер-Ваальса для неполярных молекул с использованием линейной модели для площади поверхности, доступной растворителю (D. Sitkoff, K.A. Sharp, B. Honig. «Accurate Calculation of Hydration Free Energies Using Macroscopic Solvent Models». J. Phys. Chem. 98, 1994). В случае аминокислот с ионизируемыми боковым ицепями (Arg, Asp, Cys, Glu, His, Lys и Tyr) применяют среднюю свободную энергию сольватации на основе относительных вероятностей для каждого ионизированного состояния при точно определенном pH. Сольватные числа начинаются с 0 и продолжаются до отрицательных значений, и чем более отрицательное сольватное число, тем более гидрофильным и потенциально растворимым будет белок согласно прогнозам. В некоторых вариантах реализации пищевого белка указанный пищевой белок имеет сольватное число, равное -10 или меньше при pH, равном 7. В некоторых вариантах реализации пищевого белка указанный пищевой белок имеет сольватное число, равное -15 или меньше при pH, равном 7. В некоторых вариантах реализации пищевого белка указанный пищевой белок имеет сольватное число, равное -20 или меньше при pH, равном 7. В некоторых вариантах реализации пищевого белка указанный пищевой белок имеет сольватное число, равное -25 или меньше при pH, равном 7. В некоторых вариантах реализации пищевого белка указанный пищевой белок имеет сольватное число, равное -30 или меньше при pH, равном 7. В некоторых вариантах реализации пищевого белка указанный пищевой белок имеет сольватное число, равное -35 или меньше при pH, равном 7. В некоторых вариантах реализации пищевого белка указанный пищевой белок имеет сольватное число, равное -40 или меньше при pH 7.

[00184] Сольватное число является функцией pH в силу того, что pH зависит от молярного соотношения недиссоциированной слабой кислоты ([HA]) к сопряженному основанию ([A-]), как определено уравнением Хендерсона-Хассельбаха:

[00185]

[00186] Все слабые кислоты имеют разные свободные энергии сольватации по сравнению с сопряженными с ними основаниями, и свободная энергия сольватации, примененная для заданного остатка при расчете сольватного числа при заданном pH представляет собой взвешенное среднее этих двух значений.

[00187] Соответственно, в некоторых вариантах реализации пищевого белка указанный пищевой белок имеет сольватное число, равное -10 или меньше при кислом pH. В некоторых вариантах реализации пищевого белка указанный пищевой белок имеет сольватное число, равное -15 или меньше при кислом pH. В некоторых вариантах реализации пищевого белка указанный пищевой белок имеет сольватное число, равное -20 или меньше при кислом pH. В некоторых вариантах реализации пищевого белка указанный пищевой белок имеет сольватное число, равное -25 или меньше при кислом pH. В некоторых вариантах реализации пищевого белка указанный пищевой белок имеет сольватное число, равное -30 или меньше при кислом pH. В некоторых вариантах реализации пищевого белка указанный пищевой белок имеет сольватное число, равное -35 или меньше при кислом pH. В некоторых вариантах реализации пищевого белка указанный пищевой белок имеет сольватное число, равное -40 или меньше при кислом pH.

[00188] Соответственно, в некоторых вариантах реализации пищевого белка указанный пищевой белок имеет сольватное число, равное -10 или меньше при щелочном pH. В некоторых вариантах реализации пищевого белка указанный пищевой белок имеет сольватное число, равное -15 или меньше при щелочном pH. В некоторых вариантах реализации пищевого белка указанный пищевой белок имеет сольватное число, равное -20 или меньше при щелочном pH. В некоторых вариантах реализации пищевого белка указанный пищевой белок имеет сольватное число, равное -25 или меньше при щелочном pH. В некоторых вариантах реализации пищевого белка указанный пищевой белок имеет сольватное число, равное -30 или меньше при щелочном pH. В некоторых вариантах реализации пищевого белка указанный пищевой белок имеет сольватное число, равное -35 или меньше при щелочном pH. В некоторых вариантах реализации пищевого белка указанный пищевой белок имеет сольватное число, равное -40 или меньше при щелочном pH.

[00189] Соответственно, в некоторых вариантах реализации пищевого белка указанный пищевой белок имеет сольватное число, равное -10 или меньше при диапазоне pH, выбранном из 2-3, 3-4, 4-5, 5-6, 6-7, 7-8, 8-9, 9-10, 10-11 и 11-12. В некоторых вариантах реализации пищевого белка указанный пищевой белок имеет сольватное число, равное -15 или меньше при диапазоне pH, выбранном из 2-3, 3-4, 4-5, 5-6, 6-7, 7-8, 8-9, 9-10, 10-11 и 11-12. В некоторых вариантах реализации пищевого белка указанный пищевой белок имеет сольватное число, равное -20 или меньше при диапазоне pH, выбранном из 2-3, 3-4, 4-5, 5-6, 6-7, 7-8, 8-9, 9-10, 10-11 и 11-12. В некоторых вариантах реализации пищевого белка указанный пищевой белок имеет сольватное число, равное -25 или меньше при диапазоне pH, выбранном из 2-3, 3-4, 4-5, 5-6, 6-7, 7-8, 8-9, 9-10, 10-11 и 11-12. В некоторых вариантах реализации пищевого белка указанный пищевой белок имеет сольватное число, равное -30 или меньше при диапазоне pH, выбранном из 2-3, 3-4, 4-5, 5-6, 6-7, 7-8, 8-9, 9-10, 10-11 и 11-12. В некоторых вариантах реализации пищевого белка указанный пищевой белок имеет сольватное число, равное -35 или меньше при диапазоне pH, выбранном из 2-3, 3-4, 4-5, 5-6, 6-7, 7-8, 8-9, 9-10, 10-11 и 11-12. В некоторых вариантах реализации пищевого белка указанный пищевой белок имеет сольватное число, равное -40 или меньше при диапазоне pH, выбранном из 2-3, 3-4, 4-5, 5-6, 6-7, 7-8, 8-9, 9-10, 10-11 и 11-12.

[00190] Число агрегации представляет собой основанную на первичной последовательности меру оценки гидрофобности и вероятности агрегации заданного белка. С помощью шкалы гидрофобности Кайта и Дулитла (Kyte J, Doolittle RF (May 1982) «A simple method for displaying the hydropathic character of a protein». J. Mol. Biol.157 (1): 105-32), по которой получают положительные значения для гидрофобных остатков и отрицательные значения для гидрофильных остатков, рассчитывают среднюю гидрофобность белковой последовательности с использованием скользящего среднего значения для пяти остатков. Число агрегации получают из полученного в результате графика путем определения площади под кривой в случае значений, больших чем ноль, и путем нормализации по общей длине белка. Основная гипотеза заключается в том, что агрегация является результатом того, что две или более гидрофобных зон сближаются с исключением воды и уменьшением доступности поверхностных групп, и вероятность того, что белок будет агрегировать, является функцией того, насколько плотно упакованы его гидрофобные (т.е. склонные к агрегации) остатки. Агрегационные числа начинаются с 0 и продолжаются до положительных значений, и чем меньше число агрегации, тем менее гидрофобным и потенциально менее склонным к агрегации будет белок по прогнозам. В некоторых вариантах реализации пищевого белка указанный пищевой белок имеет число агрегации, равное 2 или меньше. В некоторых вариантах реализации пищевого белка указанный пищевой белок имеет число агрегации, равное 1,5 или меньше. В некоторых вариантах реализации пищевого белка указанный пищевой белок имеет число агрегации, равное 1 или меньше. В некоторых вариантах реализации пищевого белка указанный пищевой белок имеет число агрегации, равное 0,9 или меньше. В некоторых вариантах реализации пищевого белка указанный пищевой белок имеет число агрегации, равное 0,8 или меньше. В некоторых вариантах реализации пищевого белка указанный пищевой белок имеет число агрегации, равное 0,7 или меньше. В некоторых вариантах реализации пищевого белка указанный пищевой белок имеет число агрегации, равное 0,6 или меньше. В некоторых вариантах реализации пищевого белка указанный пищевой белок имеет число агрегации, равное 0,5 или меньше. В некоторых вариантах реализации пищевого белка указанный пищевой белок имеет число агрегации, равное 0,4 или меньше. В некоторых вариантах реализации пищевого белка указанный пищевой белок имеет число агрегации, равное 0,3 или меньше. В некоторых вариантах реализации пищевого белка указанный пищевой белок имеет число агрегации, равное 0,2 или меньше. В некоторых вариантах реализации пищевого белка указанный пищевой белок имеет число агрегации, равное 0,1 или меньше.

[00191] В некоторых случаях необходима экспрессия в растворимой форме, потому что она увеличивает количество и/или выход пищевого белка и облегчает один или несколько из выделения и очистки пищевого белка. В некоторых вариантах реализации изобретения пищевые белки данного раскрытия экспрессированы в растворимой форме в организме хозяина. Сольватное число и число агрегации можно использовать для предсказания экспрессии в растворимой форме рекомбинантных пищевых белков в организме хозяина. Как показано в Примере 8, в данном раскрытии приводятся доказательства, которые приводят к предположению, что пищевые белки с сольватными числами ≤-20 и агрегационными числами ≤0,75 с большей вероятностью будут экспрессироваться с использованием технологии рекомбинантной ДНК в конкретной экспрессирующей системе E. coli. Более того, эти данные также предполагают, что пищевые белки с сольватными числами ≤-20 и агрегационными числами ≤0,5 с большей вероятностью будут экспрессироваться в растворимой форме в этой системе. Вследствие этого, в некоторых вариантах реализации пищевой белок данного раскрытия имеет сольватное число, равное -20 или меньше. В некоторых вариантах реализации изобретения пищевой белок имеет число агрегации, равное 0,75 или меньше. В некоторых вариантах реализации изобретения пищевой белок имеет число агрегации, равное 0,5 или меньше. В некоторых вариантах реализации изобретения пищевой белок имеет сольватное число, равное -20 или меньше и число агрегации, равное 0,75 или меньше. В некоторых вариантах реализации изобретения пищевой белок имеет сольватное число, равное -20 или меньше и число агрегации, равное 0,5 или меньше.

[00192] Определенные свободные аминокислоты и смеси свободных аминокислот, как известно, обладают горьким или в иных случаях неприятным вкусом. В дополнение к этому, гидролизаты распространенных белков (например, молочной сыворотки и сои) часто обладают горьким или неприятным вкусом. В некоторых вариантах реализации изобретения пищевые белки, раскрытые и описанные в данном документе, не обладают горьким или неприятным вкусом. В некоторых вариантах реализации изобретения пищевые белки, раскрытые и описанные в данном документе, обладают более приемлемым вкусом, по сравнению по меньшей мере с одним из: свободных аминокислот, смесей свободных аминокислот и/или белковых гидролизатов. В некоторых вариантах реализации изобретения пищевые белки, раскрытые и описанные в данном документе, обладают вкусом, который равняется или превосходит по меньшей мере вкус белка молочной сыворотки.

[00193] Белки, как известно, обладают вкусами, которые охватывают пять установленных вкусовых качеств: сладкий, кислый, горький, соленый и умами. Вкус конкретного белка (или его отсутствие) может быть связан с несколькими факторами, включающими первичную структуру, присутствие заряженных боковых цепей, и электрическими и конформационными особенностями белка. В некоторых вариантах реализации изобретения пищевые белки, раскрытые и описанные в данном документе, конструируют таким образом, чтобы они обладали желательным вкусом (например, сладкий, соленый, умами) и/или не обладали нежелательным вкусом (например, горький, кислый). В этом контексте «конструирование» включает, например, выбор встречающегося в природе белка, включающего в себя признаки, которые обеспечивают получение желательного вкусового свойства, а также создание мутеинов встречающихся в природе белков, которые обладают желательными вкусовыми качествами. Например, пищевые белки можно сконструировать таким образом, чтобы они взаимодействовали со специфическими вкусовыми рецепторами, такими как рецепторы сладкого вкуса (гетеродимер T1R2-T1R3) или рецепторы умами (гетеродимер T1R1-T1R3, mGluR4 и/или mGluR1). Дополнительно пищевые белки можно сконструировать таким образом, чтобы они не взаимодействовали или слабо взаимодействовали с другими вкусовыми рецепторами, такими как рецепторы горького вкуса (рецепторы T2R).

[00194] Пищевые белки, раскрытые и описанные в данном документе, также могут вызывать разные физические ощущения во рту при употреблении, которые иногда называют «вкусовым впечатлением». Вкусовое впечатление о пищевых белках может быть обусловлено одним или несколькими факторами, включающими первичную структуру, присутствие заряженных боковых цепей, и электрическими и конформационными особенностями белка. В некоторых вариантах реализации изобретения пищевые белки вызывают маслянистое или жироподобное вкусовое впечатление при употреблении.

[00195] В некоторых вариантах реализации изобретения пищевой белок содержит от 20 до 5000 аминокислот, 20-2000 аминокислот, 20-1000 аминокислот, 20-500 аминокислот, 20-250 аминокислот, 20-200 аминокислот, 20-150 аминокислот, 20-100 аминокислот, 20-40 аминокислот, 30-50 аминокислот, 40-60 аминокислот, 50-70 аминокислот, 60-80 аминокислот, 70-90 аминокислот, 80-100 аминокислот, по меньшей мере 25 аминокислот, по меньшей мере 30 аминокислот, по меньшей мере 35 аминокислот, по меньшей мере 40 аминокислот, по меньшей мере 45 аминокислот, по меньшей мере 50 аминокислотам, по меньшей мере 55 аминокислот, по меньшей мере 60 аминокислот, по меньшей мере 65 аминокислот, по меньшей мере 70 аминокислот, по меньшей мере 75 аминокислот, по меньшей мере 80 аминокислот, по меньшей мере 85 аминокислот, по меньшей мере 90 аминокислот, по меньшей мере 95 аминокислот, по меньшей мере 100 аминокислот, по меньшей мере 105 аминокислот, по меньшей мере 110 аминокислот, по меньшей мере 115 аминокислот, по меньшей мере 120 аминокислот, по меньшей мере 125 аминокислот, по меньшей мере 130 аминокислот, по меньшей мере 135 аминокислот, по меньшей мере 140 аминокислот, по меньшей мере 145 аминокислот, по меньшей мере 150 аминокислот, по меньшей мере 155 аминокислот, по меньшей мере 160 аминокислот, по меньшей мере 165 аминокислот, по меньшей мере 170 аминокислот, по меньшей мере 175 аминокислот, по меньшей мере 180 аминокислот, по меньшей мере 185 аминокислот, по меньшей мере 190 аминокислот, по меньшей мере 195 аминокислот, по меньшей мере 200 аминокислот, по меньшей мере 205 аминокислот, по меньшей мере 210 аминокислот, по меньшей мере 215 аминокислот, по меньшей мере 220 аминокислот, по меньшей мере 225 аминокислот, по меньшей мере 230 аминокислот, по меньшей мере 235 аминокислот, по меньшей мере 240 аминокислот, по меньшей мере 245 аминокислот или по меньшей мере 250 аминокислот. В некоторых вариантах реализации пищевой белок состоит из от 20 до 5000 аминокислот, 20-2000 аминокислот, 20-1000 аминокислот, 20-500 аминокислот, 20-250 аминокислот, 20-200 аминокислот, 20-150 аминокислот, 20-100 аминокислот, 20-40 аминокислот, 30-50 аминокислот, 40-60 аминокислот, 50-70 аминокислот, 60-80 аминокислот, 70-90 аминокислот, 80-100 аминокислот, по меньшей мере 25 аминокислот, по меньшей мере 30 аминокислот, по меньшей мере 35 аминокислот, по меньшей мере 40 аминокислот, по меньшей мере 2455 аминокислот, по меньшей мере 50 аминокислот, по меньшей мере 55 аминокислот, по меньшей мере 60 аминокислот, по меньшей мере 65 аминокислот, по меньшей мере 70 аминокислот, по меньшей мере 75 аминокислот, по меньшей мере 80 аминокислот, по меньшей мере 85 аминокислот, по меньшей мере 90 аминокислот, по меньшей мере 95 аминокислот, по меньшей мере 100 аминокислот, по меньшей мере 105 аминокислот, по меньшей мере 110 аминокислот, по меньшей мере 115 аминокислот, по меньшей мере 120 аминокислот, по меньшей мере 125 аминокислот, по меньшей мере 130 аминокислот, по меньшей мере 135 аминокислот, по меньшей мере 140 аминокислот, по меньшей мере 145 аминокислот, по меньшей мере 150 аминокислот, по меньшей мере 155 аминокислот, по меньшей мере 160 аминокислот, по меньшей мере 165 аминокислот, по меньшей мере 170 аминокислот, по меньшей мере 175 аминокислот, по меньшей мере 180 аминокислот, по меньшей мере 185 аминокислот, по меньшей мере 190 аминокислот, по меньшей мере 195 аминокислот, по меньшей мере 200 аминокислот, по меньшей мере 205 аминокислот, по меньшей мере 210 аминокислот, по меньшей мере 215 аминокислот, по меньшей мере 220 аминокислот, по меньшей мере 225 аминокислот, по меньшей мере 230 аминокислот, по меньшей мере 235 аминокислот, по меньшей мере 240 аминокислот, по меньшей мере 245 аминокислот или по меньшей мере 250 аминокислот.

B. Нуклеиновые кислоты

[00196] Также в данном документе предложены нуклеиновые кислоты, кодирующие пищевые полипептиды или белки. В некоторых вариантах реализации изобретения нуклеиновую кислоту выделяют. В некоторых вариантах реализации изобретения нуклеиновую кислоту подвергают очистке.

[00197] В некоторых вариантах реализации изобретения нуклеиновая кислота содержит последовательность, которая кодирует первую полипептидную последовательность, раскрытую в разделе A выше. В некоторых вариантах реализации изобретения нуклеиновая кислота состоит из последовательности нуклеиновой кислоты, которая кодирует первую полипептидную последовательность, раскрытую в разделе A выше. В некоторых вариантах реализации изобретения нуклеиновая кислота содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует пищевой белок, раскрытый в разделе A выше. В некоторых вариантах реализации изобретения нуклеиновая кислота состоит из последовательности нуклеиновой кислоты, которая кодирует пищевой белок, раскрытый в разделе A выше. В некоторых вариантах реализации последовательности нуклеиновой кислоты нуклеиновая кислота, которая кодирует первую полипептидную последовательность, функционально связана по меньшей мере с одной последовательностью, обеспечивающей контроль экспрессии. Например, в некоторых вариантах реализации последовательности нуклеиновой кислоты нуклеиновая кислота, которая кодирует первую полипептидную последовательность, функционально связана с промотором, как, например, с промотором, описанным в разделе D ниже.

[00198] Соответственно, в некоторых вариантах реализации изобретения молекула нуклеиновой кислоты по данному раскрытию кодирует полипептид или белок, который как таковой представляет собой пищевой полипептид или белок. Такую молекулу нуклеиновой кислоты можно назвать «нуклеиновой кислотой, кодирующей пищевой белок». В некоторых вариантах реализации изобретения нуклеиновая кислота, кодирующая пищевой белок, кодирует полипептид или белок, в котором по меньшей мере одно из: a) соотношение аминокислотных остатков с разветвленной цепью к общему количеству аминокислотных остатков составляет по меньшей мере 24%; б) соотношение остатков Leu к общему количеству аминокислотных остатков составляет по меньшей мере 11%; и в) соотношение остатков незаменимых аминокислот к общему количеству аминокислотных остатков составляет по меньшей мере 49%. В некоторых вариантах реализации изобретения нуклеиновая кислота, кодирующая пищевой белок, содержит по меньшей мере 10 нуклеотидов, по меньшей мере 20 нуклеотидов, по меньшей мере 30 нуклеотидов, по меньшей мере 40 нуклеотидов, по меньшей мере 50 нуклеотидов, по меньшей мере 60 нуклеотидов, по меньшей мере 70 нуклеотидов, по меньшей мере 80 нуклеотидов, по меньшей мере 90 нуклеотидов, по меньшей мере 100 нуклеотидов, по меньшей мере 200 нуклеотидов, по меньшей мере 300 нуклеотидов, по меньшей мере 400 нуклеотидов, по меньшей мере 500 нуклеотидов, по меньшей мере 600 нуклеотидов, по меньшей мере 700 нуклеотидов, по меньшей мере 800 нуклеотидов, по меньшей мере 900 нуклеотидов, по меньшей мере 1000 нуклеотидов. В некоторых вариантах реализации нуклеиновая кислота, кодирующая пищевой белок, содержит от 10 до 100 нуклеотидов, от 20 до 100 нуклеотидов, от 10 до 50 нуклеотидов или от 20 до 40 нуклеотидов. В некоторых вариантах реализации изобретения нуклеиновая кислота, кодирующая пищевой белок, содержит всю или часть открытой рамки считывания, которая кодирует встречающийся в природе пищевой полипептид или белок. В некоторых вариантах реализации нуклеиновая кислота, кодирующая пищевой белок, состоит из открытой рамки считывания, которая кодирует фрагмент встречающегося в природе пищевого белка, отличающаяся тем, что открытая рамка считывания не кодирует весь встречающийся в природе пищевой белок.

[00199] В некоторых вариантах реализации изобретения нуклеиновая кислота, кодирующая пищевой белок, представляет собой кДНК.

[00200] В некоторых вариантах реализации изобретения предлагаются молекулы нуклеиновой кислоты, которые содержат последовательность, которая является по меньшей мере на 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 99,9% идентичной встречающейся в природе питательной нуклеиновой кислоте. В некоторых вариантах реализации изобретения предложены нуклеиновые кислоты, которые гибридизуются в жестких условиях гибридизации по меньшей мере с одной эталонной питательной нуклеиновой кислотой.

[00201] Пищевые нуклеиновые кислоты и их фрагменты, предложенные в данном раскрытии, характеризуются пригодностью для применения в целом ряде систем и способов. Например, данные фрагменты можно использовать в качестве зондов в различных методах гибридизации. В зависимости от способа в качестве целевых последовательностей нуклеиновых кислот может выступать либо ДНК, либо РНК. Целевые последовательности нуклеиновых кислот можно фракционировать (например, с помощью гель-электрофореза) до гибридизации, или гибридизацию можно осуществлять на образцах in situ. Специалистам в данной области техники понятно, что зонды для нуклеиновой кислоты с известной последовательностью находят применение при определении структуры хромосом (например, с помощью блоттинга по Саузерну) и при измерении экспрессии генов (например, с помощью нозерн-блоттинга). В таких экспериментах во фрагменты последовательности предпочтительно вводят детектируемую метку, с тем, чтобы можно было выявить их специфическую гибридизацию с целевыми последовательностями и при желании определить количественно. Специалистам в данной области техники понятно, что фрагмент нуклеиновой кислоты по данному раскрытию можно применять в широком спектре методик блоттинга, которые специально не описаны в данном документе.

[00202] Также следует учесть, что фрагменты последовательностей нуклеиновых кислот, раскрытых в данном документе, также находят применение в качестве зондов при иммобилизации на микрочипах. Способы создания микрочипов путем осаждения и фиксации нуклеиновых кислот на подложках широко известны в данной области техники. Они рассматриваются в DNA Microarrays: A Practical Approach (Practical Approach Series), Schena (ed.), Oxford University Press (1999) (ISBN: 0199637768); Nature Genet. 21(1)(suppl):1-60 (1999); Microarray Biochip: Tools and Technology, Schena (ed.), Eaton Publishing Company/BioTechniques Books Division (2000) (ISBN: 1881299376), раскрытия которых включены в указанный документ посредством ссылки во всей их полноте. Например, общепризнано, что применение микрочипов для анализа экспрессии генов, содержащих фрагменты последовательностей нуклеиновых кислот, например, таких как фрагменты последовательностей нуклеиновых кислот, раскрытых в данном документе, имеет практическую ценность для применения фрагментов последовательностей в области клеточной и молекулярной биологии. Другие области применения фрагментов последовательностей, иммобилизованных на микрочипах, описаны в Gerhold et al., Trends Biochem. Sci. 24:168-173 (1999) and Zweiger, Trends Biotechnol. 17:429-436 (1999); DNA Microarrays: A Practical Approach (Practical Approach Series), Schena (ed.), Oxford University Press (1999) (ISBN: 0199637768); Nature Genet. 21(1)(suppl):1-60 (1999); Microarray Biochip: Tools and Technology, Schena (ed.), Eaton Publishing Company/BioTechniques Books Division (2000) (ISBN: 1881299376).

C. Векторы

[00203] Также предлагаются векторы, включая экспрессирующие векторы, которые содержат по меньшей мере одну из молекул нуклеиновых кислот, раскрытых в данном документе, которые дополнительно описаны в данном документе. В некоторых вариантах реализации изобретения векторы содержат по меньшей мере одну молекулу выделенной нуклеиновой кислоты, кодирующую пищевой белок, который раскрывается в данном документе. В альтернативных вариантах реализации изобретения данные векторы содержат такую молекулу нуклеиновой кислоты, которая функционально связана с одной или несколькими последовательностями, обеспечивающими контроль экспрессии. Таким образом, данные векторы можно применять для экспрессии по меньшей мере одного рекомбинантного белка в рекомбинантной клетке микроорганизма-хозяина.

[00204] Подходящие векторы для экспрессии нуклеиновых кислот в микроорганизмах широко известны специалистам в данной области техники. Подходящие векторы для применения в цианобактериях описаны, например, в Heidorn et al., «Synthetic Biology in Cyanobacteria: Engineering and Analyzing Novel Functions,» Methods in Enzymology, Vol. 497, Ch. 24 (2011). Иллюстративные реплицирующиеся векторы, которые можно применять для инженерии цианобактерий, которые раскрываются в данном документе, включают pPMQAK1, pSL1211, pFC1, pSB2A, pSCR119/202, pSUN119/202, pRL2697, pRL25C, pRL1050, pSG111M и pPBH201.

[00205] Другие векторы, такие как pJB161, в состав которых можно включить последовательности нуклеиновых кислот, раскрытые в данном документе, также можно применять. Векторы, такие как pJB161, содержат последовательности, которые гомологичны последовательностям, которые присутствуют в плазмидах, эндогенных для определенных фотосинтетических микроорганизмов (например, плазмиды pAQ1, pAQ3 и pAQ4 определенных видов Synechococcus). Примеры таких векторов и практическое руководство по их применению известны в данной области техники и приводятся, например, в Xu et al., «Expression of Genes in Cyanobacteria: Adaptation of Endogenous Plasmids as Platforms for High-Level Gene Expression in Synechococcus sp. PCC 7002,» Chapter 21 в Robert Carpentier (ed.), «Photosynthesis Research Protocols,» Methods in Molecular Biology, Vol. 684, 2011, который таким образом включен в указанный документ посредством ссылки. Рекомбинация между pJB161 и эндогенными плазмидами in vivo приводит к образованию генно-инженерных микроорганизмов, экспрессирующих представляющие интерес гены в своих эндогенных плазмидах. В качестве альтернативы можно сконструировать векторы для рекомбинации с хромосомой клетки-хозяина или можно сконструировать вектор для репликации и экспрессии представляющих интерес генов независимо от хромосомы клетки-хозяина или любых эндогенных плазмид клетки-хозяина.

[00206] Дополнительным примером вектора, подходящего для получения рекомбинантного белка, является система pET (Novagen®). Эта система была подробно охарактеризована для применения в E. coli и других микроорганизмах. В этой системе целевые гены клонируют в плазмиды pET под контролем сильных сигналов регуляции транскрипции и (в некоторых случаях) трансляции из генома бактериофага Т7; экспрессию индуцируют путем введения источника РНК-полимеразы T7 в клетку хозяина. РНК-полимераза T7 является настолько избирательной и активной, что при полной индукции почти все ресурсы микроорганизма перестраиваются на экспрессию целевого гена; целевой продукт может содержать больше чем 50% общего белка клетки через несколько часов после индукции. Также можно уменьшить уровень экспрессии всего лишь за счет снижения концентрации индуктора. Уменьшение уровня экспрессии может повысить выход растворимых форм некоторых целевых белков. В некоторых вариантах реализации изобретения эта система также позволяет поддерживать целевые гены в транскрипционно неактивном неиндуцированном состоянии.

[00207] В некоторых вариантах реализации изобретения, включающих применение этой системы, целевые гены клонируют с помощью клеток-хозяев, которые не содержат ген РНК-полимеразы T7, таким образом, устраняя потенциальные проблемы, связанные с нестабильностью плазмид вследствие производства белков, потенциально токсичных для клетки-хозяина. После того как плазмида введена в неэкспрессирующие клетки-хозяева, для индукции экспрессии целевого белка можно либо инфицировать эти клетки λCE6, фагом, который несет ген РНК-полимеразы T7 под контролем промоторов λ pL и pI, либо перенести плазмиду в «способные к экспрессии клетки-хозяева», имеющие в хромосоме копию гена РНК-полимеразы T7 под контролем lacUV5. Во втором случае экспрессию индуцируют путем добавления ИПТГ или лактозы в бактериальную культуру или с применением среды для аутоиндукции. Другие плазмидные системы, которые контролируются lac-оператором, но не требуют присутствия гена РНК-полимеразы T7 и зависят от собственной РНК-полимеразы E. coli, включают плазмиду серии pTrc (Invitrogen) или плазмиду серии pQE (QIAGEN).

[00208] В других вариантах реализации изобретения ее можно клонировать непосредственно в систему экспрессии клетки-хозяина. Доступно два типа промоторов T7 и несколько типов клеток-хозяев, которые отличаются по силе подавления базальных уровней экспрессии, обеспечивая значительную гибкость и возможность оптимизировать экспрессию большого числа целевых генов.

[00209] Подходящие векторы для экспрессии нуклеиновых кислот в клетках млекопитающих обычно содержат функциональные эталонные элементы, представленные вирусными регуляторными элементами. Например, широко применяемые промоторы получают из вируса полиома, Аденовируса 2, цитомегаловируса или вируса обезьян 40.

D. Промоторы

[00210] Промоторы, подходящие для экспрессии рекомбинантных генов, описанных в данном документе, включают как конститутивные, так и индуцируемые/репрессируемые промоторы. Примеры индуцируемых/репрессируемых промоторов включают промоторы, индуцируемые никелем (например, PnrsA, PnrsB; см., например, Lopez-Mauy et al., Cell (2002) v.43: 247-256), и промоторы, репрессируемые мочевиной, как, например, PnirA (описанные, например, в Qi et al., Applied and Environmental Microbiology (2005) v.71: 5678-5684). Дополнительные примеры индуцируемых/репрессируемых промоторов включают PnirA (промотор, который управляет экспрессией гена nirA, который индуцируется нитратом и репрессируется мочевиной) и Psuf (промотор, который управляет экспрессией гена sufB, который индуцируется при недостатке железа). Примеры конститутивных промоторов включают Pcpc (промотор, который управляет экспрессией оперона cpc), Prbc (промотор, который управляет экспрессией рубиско), PpsbAII (промотор, который управляет экспрессией PpsbAII), Pcro (промотор фага лямбда, который управляет экспрессией cro). В других вариантах реализации для контроля экспрессии можно использовать промотор PaphIl и/или a laclq-Ptrc. В случаях, когда экспрессируют множество рекомбинантных генов в генно-инженерном микроорганизме, разные гены могут контролироваться разными промоторами или идентичными промоторами в отдельных оперонах, или экспрессия двух или больше генов может контролироваться единственным промотором в составе оперона.

[00211] Дополнительно неограничивающие примеры индуцируемых промоторов могут включать, но без ограничений, промоторы, индуцируемые экспрессией экзогенного белка (например, РНК-полимеразы T7, РНК-полимеразы SP6), присутствием малой молекулы (например, ИПТГ, галактозы, тетрациклина, стероидного гормона, абсцизовой кислоты), отсутствием малых молекул (например, CO2, железа, азота), металлами или ионами металлов (например, меди, цинка, кадмия, никеля) и факторами окружающей среды (например, тепла, холода, стресса, света, темноты) и фазой роста. В некоторых вариантах реализации изобретения индуцируемый промотор тонко регулируется таким образом, что в отсутствие индукции, по существу, не происходит инициация транскрипции при участии данного промотора. В некоторых вариантах реализации изобретения индукция данного промотора по существу не изменяет уровень транскрипции посредством других промоторов. Также, в общем, соединение или условие, которое индуцирует индуцируемый промотор, не обязательно должно изначально присутствовать в организме или окружающей среде, где будет происходить экспрессия.

[00212] В некоторых вариантах реализации изобретения индуцируемый промотор индуцируется ограничением подачи CO2 в культуру цианобактерий. В качестве неограничивающего примера индуцируемого промотора могут выступать последовательности промоторов генов PCC 6803 Synechocystis, экспрессия которых повышается в условиях ограничения CO2, как, например, промоторы генов cmp, генов ntp, генов ndh, генов sbt, генов chp и генов rbc, или его вариант или фрагмент.

[00213] В некоторых вариантах реализации изобретения индуцируемый промотор индуцируется посредством дефицита железа или посредством вхождения в стационарную фазу роста. В некоторых вариантах реализации изобретения в качестве индуцируемого промотора могут выступать вариантные последовательности на основе последовательности промотора генов цианобактерий, экспрессия которых повышается в условиях дефицита Fe, как, например, isiA, или в тех случаях, когда культура входит в стационарную фазу роста, как, например, isiA, phrA, sigC, sigB и гены sigh, или его вариант или фрагмент.

[00214] В некоторых вариантах реализации изобретения индуцируемый промотор индуцируется металлом или ионом металлов. В качестве неограничивающего примера, индуцируемый промотор может индуцироваться медью, цинком, кадмием, ртутью, никелем, золотом, серебром, кобальтом и висмутом или их ионами. В некоторых вариантах реализации изобретения индуцируемый промотор индуцируется никелем или ионом никеля. В некоторых вариантах реализации изобретения индуцируемый промотор индуцируется ионом никеля, таким как Ni2+. В другом иллюстративном варианте реализации изобретения индуцируемый промотор представляет собой промотор, индуцируемый никелем, из Synechocystis PCC 6803. В другом варианте реализации изобретения индуцируемый промотор может индуцироваться медью или ионом меди. Еще в одном варианте реализации изобретения индуцируемый промотор может индуцироваться цинком или ионом цинка. Еще в одном варианте реализации изобретения индуцируемый промотор может индуцироваться кадмием или ионом кадмия. Еще в одном варианте реализации изобретения индуцируемый промотор может индуцироваться ртутью или ионом ртути. В альтернативном варианте реализации изобретения индуцируемый промотор может индуцироваться золотом или ионом золота. В другом альтернативном варианте реализации изобретения индуцируемый промотор может индуцироваться серебром или ионом серебра. Еще в одном альтернативном варианте реализации изобретения индуцируемый промотор может индуцироваться кобальтом или ионом кобальта. Еще в одном альтернативном варианте реализации изобретения индуцируемый промотор может индуцироваться висмутом или ионом висмута.

[00215] В некоторых вариантах реализации изобретения промотор индуцируют путем воздействия на клетку, содержащую индуцируемый промотор, металлом или ионом металлов. На клетку можно подействовать металлом или ионом металла путем добавления металла в среду для выращивания микроорганизмов. В определенных вариантах реализации изобретения металл или ион металла, добавленный в среду для выращивания микроорганизмов, можно эффективно выделить из среды. В других вариантах реализации изобретения металл или ион металла, оставшийся в среде после выделения, по существу не препятствует дальнейшей переработке среды или бактериальных генных продуктов.

[00216] Дополнительно неограничивающие примеры конститутивных промоторов включают конститутивные промоторы из грамотрицательных бактерий или бактериофага, размножающегося в грамотрицательной бактерии. Например, можно применять промоторы для генов, кодирующих продукты высокоэкспрессированных генов грамотрицательных бактерий, такие как промотор для Lpp, OМПа, рРНК и рибосомных белков. В качестве альтернативы можно применять регулируемые промоторы в штамме, в котором отсутствует регуляторный белок для этого промотора. Например, в качестве конститутивных промоторов можно применять Plac, Ptac и Ptrc, в штаммах, в которых отсутствует Lacl. Подобным образом можно применять P22 PR и PL в штаммах, в которых отсутствует репрессорный белок лямбда C2, а лямбда PR и PL можно применять в штаммах, в которых отсутствует репрессорный белок лямбда C1. В одном варианте реализации изобретения конститутивный промотор получают из бактериофага. В другом варианте реализации изобретения конститутивный промотор получают из бактериофага Salmonella. Еще в одном варианте реализации изобретения конститутивный промотор получают из цианофага. В некоторых вариантах реализации изобретения конститутивный промотор представляет собой промотор Synechocystis. Например, в качестве конститутивного промотора может выступать промотор PpsbAll или его вариантные последовательности, промотор Prbc или его вариантные последовательности, промотор Pcpc или его вариантные последовательности и промотор PrnpB или его вариантные последовательности.

E. Клетки-хозяева

[00217] Также предлагаются клетки-хозяева, трансформированные молекулами нуклеиновой кислоты, или векторы, раскрытые в данном документе, и их потомки. В некоторых вариантах реализации изобретения клетки-хозяева представляют собой микробные клетки. В некоторых вариантах реализации изобретения клетки-хозяева несут последовательности нуклеиновых кислот на векторах, которые могут, но не обязательно должны, быть свободно реплицирующимися векторами. В других вариантах реализации изобретения нуклеиновые кислоты интегрировались в геном клетки-хозяина и/или в эндогенную плазмиду клетки-хозяина. Трансформированные клетки-хозяева находят применение, например, при получении рекомбинантных пищевых белков, раскрытых в данном документе.

[00218] Термин «микроорганизмы» включает прокариотические и эукариотические микробные виды из доменов Archaea, Bacteria и Eucarya, причем последние включают дрожжи и мицелиальные грибы, простейших, водоросли или более высокоорганизованные одноклеточные организмы. Термины «микробные клетки» и «микробы» используются взаимозаменяемо с термином микроорганизм.

[00219] Целый ряд микроорганизмов-хозяев можно трансформировать последовательностью нуклеиновой кислоты, раскрытой в данном документе, и в некоторых вариантах реализации изобретения ее можно применять для получения рекомбинантного пищевого белка, раскрытого в данном документе. Подходящие микроорганизмы-хозяева включают как автотрофные, так и гетеротрофные микробы. В случае некоторых применений автотрофные микроорганизмы позволяют снизить затраты органического топлива и/или электроэнергии, которые требуются для получения пищевого белка, кодируемого рекомбинантной последовательностью нуклеиновой кислоты, которую вводят в микроорганизм-хозяин. Это, в свою очередь, в случае некоторых применений снижает расходы и/или воздействие на окружающую среду, связанные с производством пищевого белка, и/или снижает расходы и/или отрицательное воздействие на окружающую среду по сравнению с расходами и/или воздействием на окружающую среду, связанными с получением альтернативных пищевых белков, как, например, из молочной сыворотки, яйца и сои. Например, расходы и/или отрицательное воздействие на окружающую среду, связанные с получением пищевого белка, раскрытого в данном документе, с применением микроорганизма-хозяина, который раскрывается в данном документе, в некоторых вариантах реализации ниже расходов и/или отрицательного воздействия на окружающую среду, связанных с получением белка из молочной сыворотки в форме, подходящей для потребления человеком, посредством переработки коровьего молока.

[00220] Неограничивающие примеры гетеротрофов включают Escherichia coli, Sa