Способ изготовления вакцины против бруцеллеза мелкого рогатого скота

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для изготовления вакцины против бруцеллеза мелкого рогатого скота из штамма Brucella melitensis Rev-1. Способ изготовления вакцины против бруцеллеза мелкого рогатого скота предусматривает посев и выращивание штамма Brucella melitensis Rev-1 на питательной среде, содержащей панкреатический гидролизат казеина глубокой степени расщепления, экстракта дрожжей, натрий хлористый, глюкозу, глицерин и агар-агар в заданном соотношении компонентов в течение 72 часов при 37°C. Выросшую вакцинную культуру смывают с поверхности агара средой высушивания и доводят до концентрации 80-140 млрд м.к. в 1 мл. Проверяют на чистоту и диссоциацию, расфасовывают в ампулы и подвергают лиофильной сушке. Изобретение позволяет увеличить выход штамма Brucella melitensis Rev-1 в S-форме. 1 табл., 1 пр.

 

Изобретение относится к области ветеринарии, в частности к изготовлению вакцины против бруцеллеза мелкого рогатого скота.

В настоящее время для профилактики бруцеллеза овец и коз широко используют вакцину, изготовленную из штамма Brucella melitensis Rev-1.

Выращивание штамма Rev-1 при изготовлении вакцины проводят на триптиказо-соевом агаре, агаре Альбими, сывороточно-декстрозном агаре (см. Дж. Альтон, Л.М. Джонс «Методы лабораторных исследований по бруцеллезу», ВОЗ, Женева, 1968, стр. 77-79). Ингредиенты, входящие в первые две среды, в нашей стране не выпускают, а применение агара-заменителя Альбими в производстве вакцины нерационально из-за недостаточного выхода бакмассы. На других питательных средах (печеночные, мясные, картофельные среды, эритритагар, агар Д и т.д.), применяемых для культивирования бруцелл (см. кн. “Бруцеллез”, под ред. П.А. Вершиловой, М., 1961, стр. 208-210), штамм Rev-1 растет плохо и диссоциирует.

Известен способ получения живой вакцины из штамма В.melitensis Rev-1, заключающийся в выращивании его на сывороточно-декстрозном агаре на основе мясо-пептонного бульона (см. Производство вакцины Rev-1. G.G. Alton WHO/Bruc. 70.321; Питательная среда для изготовления вакцины из штамма B.melitensis Rev-1. Разработка и производство диагностических сухих питательных сред и микротестсистем. Мат. междунар. науч. конф., посвящ. 70-летию НПО «Питательные среды», Махачкала, 1998, с. 116-117). Недостатком данного способа является необходимость добавления в питательную среду перед засевом культуры бруцелл штамма Rev-1 до 10% стерильной сыворотки крови животных, а также то, что основой среды служат мясной бульон и пептон.

Изготовление питательной среды на основе высокоценного пищевого продукта - мяса экономически не оправдано, а добавление дефицитной и дорогостоящей сыворотки крови, помимо экономической нецелесообразности, вызывает дополнительные трудности, связанные со стерильным внесением ее в готовую среду и возможностью загрязнения вакцины посторонней микрофлорой.

Целью настоящего изобретения является разработка способа изготовления живой вакцины против бруцеллеза овец и коз из штамма Rev-1, состоящей из типичных для данного штамма однородных клеток бруцелл в S-форме и не имеющей диссоциированных микроорганизмов с использованием питательной среды, изготовленной из непищевого сырья и без добавления сыворотки крови животных.

Поставленная цель достигается тем, что для изготовления вакцины с целью увеличения выхода микробной массы и во избежание диссоциации бруцелл, культуру штамма В.melitensis Rev-1 выращивают на питательной среде, основой которой является панкреатический гидролизат казеина с добавлением в качестве источника витаминов и других ростовых факторов экстракта кормовых или хлебных дрожжей.

Питательная среда состоит из равных объемов панкреатического гидролизата казеина глубокой степени расщепления и экстракта дрожжей, разведенных после смешивания дистиллированной водой до содержания аминного азота 110-130 мг % с добавлением 0,5% хлористого натрия, 1% глюкозы, 2% глицерина и 2-3,5% агар-агара. При выращивании на такой питательной среде достигается лучший рост бруцелл штамма Rev-1, больший выход бактериальной массы без диссоциированных клеток и обладающий лучшей жизнеспособностью, а также высокими иммуногенными свойствами.

Приготовление гидролизата казеина

Сухой казеин в количестве 1 кг заливают 10 литрами теплой дистиллированной воды, подщелачивают до рН - 8,5-9,0 и оставляют на несколько часов для разбухания. Затем при постоянном перемешивании подогревают до 80-90°C и температуру в этих пределах поддерживают до растворения казеина. В процессе растворения казеина рН смеси снижается, и поэтому периодически добавляют 20% раствор щелочи (NaOH) для поддержания рН на уровне 8,5-9,0 до полного растворения казеина.

Полученный раствор остужают до 45°C и к нему добавляют 50-100 г в зависимости от активности, панкреатина или же фарш поджелудочной железы крупного рогатого скота в количестве 0,5-1 кг.

Гидролиз проводят в течение 3-4 часов при температуре 45°C при постоянном перемешивании, поддерживая рН на уровне 8,5-9,0. Содержание аминного азота в готовом гидролизате должно быть 600-800 мг %.

При медленном гидролизе и содержании аминного азота менее 600 мг % панкреатин добавляют повторно.

По достижении аминного азота до 600-800 мг % гидролиз прекращают добавлением 100-120 мг уксусной кислоты.

Гидролизат кипятят в течение 10 минут, после чего его охлаждают и оставляют до следующего дня для отстаивания.

Отстоявшийся гидролизат декантируют и фильтруют через ватно-марлевой фильтр.

Приготовление экстракта дрожжей

Берут 1 кг светлых сортов кормовых или прессованных пекарских дрожжей и добавляют к ним 10 литров дистиллированной воды. Смесь тщательно перемешивают, кипятят в течение 10-15 минут и в горячем виде фильтруют до прозрачности.

Приготовление питательной среды

Для изготовления среды смешивают панкреатический гидролизат казеина и экстракт дрожжей в равных количествах и разводят дистиллированной водой до содержания аминного азота 110-130 мг %.

Смесь подогревают и после закипания к ней добавляют предварительно вымоченный в воде в течение 12 часов Корсаковский агар-агар высшего или первого сорта из расчета 3-3,5% для четвертей или матровых колб и 2% для пробирок и чашек.

После полного расплавления агар-агара в среду вносят 0,5% хлористого натрия, 1% глюкозы и 2% глицерина, доводят рН до 7,2-7,3 и, периодически перемешивая, ее кипятят еще 10-15 минут. Затем питательную среду фильтруют через ватный или полотняный фильтр, разливают в матровые колбы, четверти или другие необходимые емкости и стерилизуют при температуре 110-112°C в течение 30 минут.

После стерилизации матровые колбы ставятся в горизонтальном положении для застывания агара, а четверти обкатывают для распределения питательной среды по всей их внутренней поверхности.

До засева вакцинной культуры питательную среду в колбах, четвертях, чашках и пробирках выдерживают в течение 48 часов при температуре 37°C для подсушивания поверхности и контроля стерильности.

Выращивание культуры

Выращивание культуры Rev-1 для получения вакцины проводят на вышеуказанной питательной среде в матровых колбах, четвертях, пробирках или других емкостях.

Для засева серии вакцинной культуры проводят предварительную расплодку штамма в пробирках, матровых колбах или четвертях.

Вначале производственный штамм Rev-1 засевают в пробирки на косой агар. Берут одну пробирку 3-4-суточного роста эталонной культуры, разводят стерильным буферным раствором рН 6,6-6,8 так, чтобы получилась концентрация 10-6 и 10-7.

Из каждого разведения 0,1 мл культуры штамма засевают по 3 бактериологические чашки.

Через 5 суток выращивания в термостате при температуре 37°C чашки просматривают на чистоту и типичность роста культуры, проверяют морфологию клеток и на диссоциацию методом окраски колоний по Уайт -Уильсону.

При отсутствии диссоциации из неокрашенных, бактериологических чашек отбирают типичные колонии, которые отсевают на пробирки с косым агаром. После выдерживания посевов в течение 48 часов в термостате при температуре 37°C и проверки на чистоту культуру пересевают на требуемое количество пробирок с той же питательной средой. Пробирки выдерживают в течение 48 часов при температуре 37°C. Из этих пробирок получают рабочие культуры штамма Rev-1, используемые для засева очередных серий вакцины.

Пробирки с рабочей культурой штамма Rev-1 хранят в запаянном виде в холодильнике при температуре +4-8°С и пригодны для использования в течение 30 дней.

Для получения взвеси клеток с целью засева серии вакцины необходимо рабочие культуры размножить в нужном количестве в пробирках, матровых колбах или четвертях, смыть стерильным, забуферным (рН 6,6-6,8) физраствором так, чтобы получилась концентрация 2-3 млрд микробов, тел в 1 мл по оптическому бруцеллезному стандарту мутности. Такой расплодкой в количестве 4-5 мл засевают матровые колбы (матрасы) или четверти данной серии.

Выращивание культуры B. melitensis Rev-1 для получения вакцины на вышеуказанной питательной среде проводят в течение 72 часов при температуре 37°С. Выросшую вакцинную культуру, с поверхности агара, смывают средой высушивания.

Среду высушивания готовят следующим образом: в 1 литре кипящей дистиллированной воды растворяют 15 г желатина, после ее растворения добавляют 100 г сахарозы. Затем кипятят 5-6 минут, доводят рН до 7,2-7,3, фильтруют через полотняный фильтр, стерилизуют при 1 атмосфере 30 минут. После стерилизации среда должна иметь рН 6,8-7,0.

В каждую колбу или четверть вводят такое количество среды высушивания, чтобы концентрация бакмассы была в пределах 80-140 млрд микробных тел в 1 мл.

Суспензию бруцелл, полученную из колб или четвертей сливают в общую бутыль. После проверки на чистоту и диссоциацию расфасовывают в ампулы по 2 или 4 мл и подвергают лиофильной сушке.

Предлагаемый способ изготовления вакцины обеспечивает, по сравнению с существующим, увеличение выхода препарата в 1,2-1,3 раза. Полученная при этом вакцина состоит из однородных клеток в S-форме, типичной для штамма Rev-1 морфологии, и не имеющих признаков диссоциации.

Пример

Предлагаемая питательная среда, изготовленная на основе панкреатического гидролизата казеина и экстракта дрожжей, разлитая по 250,0 мл в 10 матровых колб, была испытана для изготовления живой вакцины против бруцеллеза овец и коз из штамма B. melitensis Rev-1.

Для сравнения результатов культуру штамма B. melitensis Rev-1 для изготовления вакцины выращивали и на сывороточно-декстрозном агаре на основе мясо-пептонного бульона с добавлением 10% стерильной сыворотки крови крупного рогатого скота. Данную питательную среду разливали в матровые колбы также по 250,0 мл в каждую колбу. Засевали культурой B. melitensis Rev-1 10 матровых колб со средой.

Культуру B. melitensis Rev-1 на обеих питательных средах выращивали при температуре 36-37°С в течение 72 часов. Основные данные, характеризующие результаты использования обеих питательных сред для выращивания штамма B. melitensis Rev-1 и изготовления из этого штамма вакцины против бруцеллеза овец и коз, представлены в следующей таблице.

Таблица. Основные результаты выращивания культуры штамма Brucella melitensis Rev-1 для получения бакмассы и изготовления вакцины против бруцеллеза овец и коз при использовании испытуемой питательной среды (новый вариант) и ранее применявшейся питательной среды (старый вариант).

Таким образом, в результате проведенных исследований по испытанию предлагаемой нами питательной среды, изготовленной на основе панкреатического гидролизата казеина и экстракта хлебных дрожжей, установлены пригодность данной среды и целесообразность ее применения для выращивания штамма B. melitensis Rev-1 при изготовлении из этого штамма живой вакцины против бруцеллеза овец и коз. При этом показано, что применение указанной питательной среды позволяет получить бакмассу бруцелл штамма Rev-1 типичной для данного штамма морфологии в S-форме, не содержащую диссоциированных микробных клеток и 1,2 раза больше, чем при применении сывороточно-декстрозного агара, изготовленного на основе мясопептонного бульона с добавлением 10% сыворотки крови крупного рогатого скота.

Способ изготовления вакцины против бруцеллеза мелкого рогатого скота, включающий посев и выращивание бруцелл штамма B. melitensis Rev-1 на питательной среде, состоящей из равных объемов панкреатического гидролизата казеина глубокой степени расщепления и экстракта дрожжей, разведенных после смешивания дистиллированной водой до содержания аминного азота 110-130 мг % с добавлением 0,5% хлористого натрия, 1% глюкозы, 2% глицерина и 2-3,5% агар-агара, их смыв, разбавление средой высушивания до содержания 80-140 млрд микробных клеток в 1 мл, расфасовку в ампулы и лиофильную сушку.



 

Похожие патенты:

Группа изобретений относится к штаммам бактерий рода Lactobacillus, композициям на их основе и их применению. Предложены штамм бактерий Lactobacillus paracasei DSM 25832, штамм бактерий Lactobacillus plantarum DSM 25833, штамм бактерий Lactobacillus plantarum DSM 25834, штамм бактерий Lactobacillus plantarum DSM 25835, штамм бактерий Lactobacillus plantarum DSM 25836 и штамм бактерий Lactobacillus plantarum DSM 25837.

Группа изобретений относится к биотехнологии. Предложены рекомбинантный модифицированный глюкагоноподобный пептид-1 человека (рмГПП-1), способ его получения и штамм-продуцент E.coli ВКПМ В-12555.

Группа изобретений относится к молочной промышленности. Способ изготовления состава ароматизированного молока, содержащего штамм Lactococcus lactis подвид lactis биовар diacetylactis DL2126, VTT Е-123249 в качестве продуцирующего диацетил штамма и диацетил в количестве по меньшей мере 50 мг/кг в молочной среде, осуществляют следующим образом.

Группа изобретений относится к микробиологии и биотехнологии. Заявлены - штамм Lactobacillus gasseri ВКМ B-2918D, обладающий антагонистической активностью по отношению к штаммам Escherichia coli, и композиция, содержащая штамм Lactobacillus gasseri ВКМ B-2918D и лактоферрин.

Изобретение относится к промышленной и экологической микробиологии. Предложен способ очистки содержащих толуол сточных вод нефтеперерабатывающих и нефтехимических предприятий.

Группа изобретений относится к штаммам бактерий рода Propionibacterium, композициям на их основе и их применению. Предложены штамм Propionibacterium acidipropionici DSM 25845, штамм Propionibacterium freudenreichii подвида shermanii DSM 25846, штамм Propionibacterium freudenreichii DSM 25847, штамм Propionibacterium thoenii DSM 25848 и штамм Propionibacterium thoenii DSM 25849.

Изобретение относится к области ветеринарной микробиологии. Способ получения питательной среды для транспортировки патологического материала, содержащего возбудитель некробактериоза животных, предусматривает получение фильтрата золотистого стафилококка путем высева суточной культуры золотистого стафилококка в мясопептонном бульоне с добавлением 10% хлорида натрия и культивирования в термостате при температуре 37°С в течение 8-10 дней с последующим инактивированием в водяной бане в течение 30 мин при температуре 90-95°С.
Изобретения относятся к экологии. Биологически активный препарат, ускоряющий минерализацию останков, включает смесь спор непатогенных бактерий, принадлежащих к виду Bacillus, причем дополнительно включает компонент, сдерживающий влагу - глинистый нетоксичный минерал, способный разбухать при гидратации в 14-16 раз, питательные вещества, витамины, микроэлементы и источник тепловой активации для поддержания жизнедеятельности непатогенных бактерий в виде пероксида калия K2O2 и/или пероксида натрия Na2O2.

Изобретение относится к биотехнологии. Штамм Xanthomonas campestris 2017, обладающий способностью продуцировать ксантан, депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов под регистрационным номером ВКПМ В-12968.

Группа изобретений относится к биотехнологии. Штамм Lactobacillus rhamnosus, предназначенный для удаления и/или нейтрализации токсичных продуктов, депонирован в CNCM под регистрационным номером I-4719.

Группа изобретений относится к штаммам бактерий рода Lactobacillus, композициям на их основе и их применению. Предложены штамм бактерий Lactobacillus paracasei DSM 25832, штамм бактерий Lactobacillus plantarum DSM 25833, штамм бактерий Lactobacillus plantarum DSM 25834, штамм бактерий Lactobacillus plantarum DSM 25835, штамм бактерий Lactobacillus plantarum DSM 25836 и штамм бактерий Lactobacillus plantarum DSM 25837.

Изобретение относится к применению пробиотического бактериального штамма Lactobacillus reuteri DSM 17938 и/или Bifidobacterium longum АТСС BAA-999 в производстве питательной композиции для субъекта.

Изобретение относится к области биохимии. Описан способ дифференциации штаммов Yersinia pestis на основной и неосновные подвиды методом ПЦР в режиме реального времени.

Изобретение относится к биотехнологии, иммунологии, микробиологии и ветеринарии и может быть использовано в биотехнологии при производстве инактивированной вакцины против кампилобактериоза КРС.

Группа изобретений относится к микробиологии и биотехнологии. Заявлены - штамм Lactobacillus gasseri ВКМ B-2918D, обладающий антагонистической активностью по отношению к штаммам Escherichia coli, и композиция, содержащая штамм Lactobacillus gasseri ВКМ B-2918D и лактоферрин.

Изобретение относится к промышленной и экологической микробиологии. Предложен способ очистки содержащих толуол сточных вод нефтеперерабатывающих и нефтехимических предприятий.

Группа изобретений относится к штаммам бактерий рода Propionibacterium, композициям на их основе и их применению. Предложены штамм Propionibacterium acidipropionici DSM 25845, штамм Propionibacterium freudenreichii подвида shermanii DSM 25846, штамм Propionibacterium freudenreichii DSM 25847, штамм Propionibacterium thoenii DSM 25848 и штамм Propionibacterium thoenii DSM 25849.

Изобретение относится к области ветеринарной микробиологии. Способ получения питательной среды для транспортировки патологического материала, содержащего возбудитель некробактериоза животных, предусматривает получение фильтрата золотистого стафилококка путем высева суточной культуры золотистого стафилококка в мясопептонном бульоне с добавлением 10% хлорида натрия и культивирования в термостате при температуре 37°С в течение 8-10 дней с последующим инактивированием в водяной бане в течение 30 мин при температуре 90-95°С.

Изобретение относится к биотехнологии. Штамм Bacillus megaterium 874, обладающий иммуномодулирующей способностью, депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под регистрационным номером ВКПМ В-12251 и может быть использован для снижения аллергии и добавлен в пищевые продукты.

Изобретение относится к биотехнологии. Штамм Xanthomonas campestris 2017, обладающий способностью продуцировать ксантан, депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов под регистрационным номером ВКПМ В-12968.

Группа изобретений относится к ветеринарии и касается вакцины для птиц и может быть использована для профилактики инфекций, вызываемых Salmonella. Композиция вакцины по изобретению включает в качестве активного ингредиента структуру, содержащую О-антиген, полученный от Salmonella, при условии, что указанная структура не содержит целую клетку, причем указанная структура, содержащая О-антиген, представляет собой липополисахарид, содержащий Липид А.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для изготовления вакцины против бруцеллеза мелкого рогатого скота из штамма Brucella melitensis Rev-1. Способ изготовления вакцины против бруцеллеза мелкого рогатого скота предусматривает посев и выращивание штамма Brucella melitensis Rev-1 на питательной среде, содержащей панкреатический гидролизат казеина глубокой степени расщепления, экстракта дрожжей, натрий хлористый, глюкозу, глицерин и агар-агар в заданном соотношении компонентов в течение 72 часов при 37°C. Выросшую вакцинную культуру смывают с поверхности агара средой высушивания и доводят до концентрации 80-140 млрд м.к. в 1 мл. Проверяют на чистоту и диссоциацию, расфасовывают в ампулы и подвергают лиофильной сушке. Изобретение позволяет увеличить выход штамма Brucella melitensis Rev-1 в S-форме. 1 табл., 1 пр.

Наверх