Вязкость среды как инструмент контроля предела обнаружения иммунохроматографических тест-систем

Изобретение относится к аналитической химии и представляет собой способ иммунохроматографического анализа. Иммунохроматографический тест основан на взаимодействии конъюгата специфические антитела-коллоидный маркер с определяемым соединением (антигеном) в ходе движения реагентов вдоль тест-полоски. В зависимости от наличия антигена происходит образование специфических комплексов, обеспечивающих окрашивание в аналитической линии теста. Интенсивность окрашивания, а также чувствительность теста напрямую зависят от времени инкубации пробы и коллоидного конъюгата. Значительные возможности по снижению предела обнаружения дает использование мелкопористых, «медленных» рабочих мембран. Сокращение скорости движения увеличивает время специфического взаимодействия и тем самым снижает предел обнаружения системы. Однако часто использование мелкопористых мембран влечет ряд негативных эффектов, особенно при анализе реальных, часто содержащих корпускулярные частицы проб. В таких случаях происходит забивание пор мембраны и полная остановка течения жидкости, а результаты тестирования признаются недействительными. Предложенный подход отличается тем, что для анализа используется крупнопористая мембрана, а для сокращения скорости движения жидкости в пробу вносятся специальные растворы для повышения вязкости раствора, что приводит к увеличению времени протекания вдоль мембраны. Техническим результатом является снижение предела обнаружения аналитической системы. 1 ил.

 

Описание изобретения

Иммунохроматографические тест-полоски применяются в широком диапазоне областей: в медицине, сельском хозяйстве и при контроле окружающей среды. Существует множество тест-систем для определения маркеров заболеваний (онко-, кардиомаркеры и др.), контроля качества пищевых продуктов (тест-системы на микотоксины, антибиотики), для решения социальных проблем (определение наркотических соединений). С учетом свойств определяемого антигена выбираются те или иные схемы формирования детектируемых иммунных комплексов (R.C. Wong, ed. Lateral Flow Immunoassay. 2009, Humana Press: New York. 224.). Следует, тем не менее, отметить, что большинство практических задач требует проведения анализа с предельно низким уровнем минимальной выявляемой концентрации целевого антигена.

Снижение предела обнаружения может обеспечиваться разными способами, среди которых самым простым является использование большого количества окрашенного коллоидного маркера. Однако даже для «сэндвич»-схем анализа такое решение лимитировано числом образованных иммунных комплексов и кинетическими параметрами антител.

Более универсальным является формирование на основе иммунных комплексов структур, содержащих большие количества оптически детектируемых компонентов. Это усиление может достигаться за счет увеличения размеров коллоидных маркеров при проведении дополнительных химических реакций (Yang W., Li X.В., Liu G.W., Zhang В.В., Zhang Y., Kong Т., Tang J.J., Li D.N., Wang Z. A colloidal gold probe-based silver enhancement immunochromatographic assay for the rapid detection of abrin-a. Biosensors and Bioelectronics 2011, 26(8): 3710-3713) или при использовании биоспецифических лиганд-рецепторных взаимодействий (Urusov А.Е., Zherdev A.V., Dzantiev В.В. Use of gold nanoparticle-labeled secondary antibodies to improve the sensitivity of an immunochromatographic assay for aflatoxin B1. Microchimica Acta 2014. 181 (15-16): 1939-1946; Urusov, A. E., Petrakova, A. V., Zherdev, A. V., & Dzantiev, В. B. (2016). "Multistage in one touch" design with a universal labelling conjugate for high-sensitive lateral flow immunoassays. Biosensors and Bioelectronics, 86, 575-579.). Однако оба эти подхода, несмотря на разнообразие вариантов, имеют общие ограничения, такие как необходимость синтеза дополнительных компонентов и/или усложнение процедуры самого анализа.

Самым простым вариантом снижения предела обнаружения является введение стадии прединкубации анализируемой пробы со специфическими антителами. Это позволяет дать значительное количество времени на специфическую стадию иммунохимического распознавания. Однако такой подход требует использования дополнительных реагентов, отдельно разведенных конъюгатов специфических антител и дополнительных стадий осуществления анализа.

Более простой вариант - использование мембран с малым размером пор, движение жидкости по которым происходит значительно медленнее. Однако такие системы становятся чувствительны к матриксу анализируемых образцов и часто требуют их дополнительной очистки. В противном случае поры мембраны забиваются, и анализ не может завершиться формированием окрашенных аналитической и/или контрольной зон.

Предлагается новый вариант снижения предела обнаружения аналитической системы, основанный на изменении скорости движения жидкости вдоль тест-полоски за счет внесения в пробу реагентов, повышающих вязкость раствора. Такой компонент не требует особых условий хранения и может быть включен в состав рабочего буфера для разведения образца. Однако его использование значительно снижает скорость движения жидкости вдоль мембраны, увеличивая продолжительность иммунохимического взаимодействия и не нарушая структуру теста.

Рассмотрим структуру предлагаемой иммунохроматографической тест-системы. В ее состав входит пластиковая подложка, на которой зафиксирована рабочая и конечная впитывающая мембраны. Процедура проведения анализа и детекции его результата такие же, как и для стандартной иммунохроматографической тест-полоски, - нижний край тест-полоски опускается в соответствующий раствор, где инкубируется 30 минут. После завершения всех стадий формирования детектируемого комплекса окрашивание аналитической зоны (и при необходимости его интенсивность) оцениваются визуально или с помощью фотометрического оборудования.

Данное методическое решение обладает существенными преимуществами по сравнению с известными разработками иммунохроматографических тестов, в которых также реализуется усиление детектируемого сигнала. Ниже представлено сопоставление разработки с двумя ее аналогами.

Аналог №1

Использование двух конъюгатов антител с частицами коллоидного золота двух размеров описано в работе Choi D.H., Lee S.K., Oh Y.K., Bae B.W., Lee S.D., Kim S., Shin Y., Kim M.G. A dual gold nanoparticle conjugate-based lateral flow assay (LFA) method for the analysis of troponin I. Biosensors and Bioelectronics 2010, 25(8), 1999-2002. В состав тест-полоски входят две последовательно расположенные мембраны, пропитанные этими конъюгатами. Первый конъюгат содержит антитела против бычьего сывороточного альбумина, второй - бычий сывороточный альбумин и специфические антитела против детектируемого антигена. Используются коллоиды разного размера, что позволяет, с одной стороны, разделить их в процессе движения по мембране, препятствуя смешиванию до достижения контрольной и аналитических зон, а с другой - усилить аналитический сигнал. Однако данный подход имеет ряд недостатков:

- требует синтеза дополнительных реагентов;

- чувствителен к компонентам пробы, так как происходит формирование более сложного комплекса-агрегата.

Аналог №2

Использование дополнительных мембран с высушенным в высокой концентрации белком (в частности, с бычьим сывороточным альбумином, БСА). Установка такой прослойки между мембранами под образец/конъюгат и рабочей нитроцеллюлозной подложкой позволяет значительно снизить скорость движения потока (Petrakova A.V., Urusov А.Е., Voznyak M.V., Zherdev A.V., Dzantiev В.В. 2015. Immunochromatographic test system for the detection of T-2 toxin. Applied Biochemistry and Microbiology, 51(6), 688-694.).

При проведении анализа поток жидкости проходит через мембрану под образец и мембрану под конъюгат. Реагенты вымываются из мембран и смешиваются с пробой. Следующие мембраны содержат большое количество белка, и ток жидкости останавливается, не переходя на рабочую мембрану. Задержка лимитирована скоростью растворения белка и составляет обычно от 1 до 3 минут. За это время происходит иммуноспецифическая реакция с образованием комплексов антиген-антитело-золотая частица. Как было показано авторами в публикации - такой задержки достаточно для значительного повышения чувствительности аналитической системы.

Данный подход имеет следующие потенциальные недостатки:

- Технологическая сложность установки дополнительного количества мембран на ограниченном участке клеевой подложки.

- Низкая стабильность при хранении - большое количество белка, за полтора-два года хранения может значительно потерять свою растворимость.

- Снижение амплитуды сигнала - избыток белка может привести к блокировке поверхности мембраны и вызвать стерические затруднения иммуноспецифического взаимодействия при образовании на фазе комплексов коллоидный маркер-антитело-антиген (для конкурентной схемы анализа) или коллоидный маркер-антитело-антиген-антитело (для «сэндвич»-схемы анализа).

Эффективность предложенного в патенте подхода подтверждается представленным ниже примером.

Пример 1. Определение тропонина иммунохроматографическим методом.

Предварительно собирали иммунохроматографическую тест-полоску, включавшую в себя следующие компоненты - пластиковая подложка, с закрепленными на ней рабочей мембраной, впитывающей подложкой, мембранами под конъюгат и образец. В качестве рабочей мембраны выбрана Millipore HF 120. На нитроцеллюлозную мембрану наносили специфические антитела к тропонину из концентрации 0,3 мг/мл и объема 0,1 мкл на 1 мм полосы. В контрольную зону наносили антивидовы антитела (иммуноглобулины козы против иммуноглобулинов мыши) в концентрации 0,5 мг/мл и объема 0,1 мкл на 1 мм полоски. Для нанесения реагентов использовали диспенсер «IsoFlow» фирмы «Imagene Technology» (США). Полученные листы нарезали на индивидуальные тест-полоски шириной 4 мм.

Анализ осуществляется следующим образом. Анализируемые пробы предварительно разводили буфером для образца, содержащим усилитель вязкости карбоксиметилцеллюлозную соль натрия. В полученный раствор вносили известную концентрацию антигена (проверка методом «введено-найдено»). После чего край полоски погружали в полученную смесь и инкубировали в течение 30 минут.

Для сравнения было проведено тестирование с теми же полосками по традиционной методике - без добавления усилителя вязкости и при времени инкубации 15 минут.

Результат детектировали визуально и фотометрически по окрашиванию аналитической и контрольной зон. В последнем варианте тест-полоски сканировали на сканере Lide 90 (Canon) с разрешением 600 dpi, без автоматического контрастирования и цветокоррекции. На полученных цифровых изображениях выделяли прямоугольную область, захватывающую не менее чем 90% окрашенной зоны, и с помощью программы Total Lab (Nonlinear Dynamics, Великобритания) получали численное значение интенсивности окрашивания аналитической зоны.

Интенсивности окрашивания аналитических зон тест-полосок после тестирования проб с разным содержанием антигена представлены на фиг. 1. Как следует из полученных концентрационных зависимостей, предел обнаружения тропонина (концентрация, соответствующая достоверному - более 20% - снижению интенсивности окрашивания по сравнению с пробой, не содержащей тропонин) при использовании нового метода анализа схемы без усиления составляет 1 нг/мл, в то время как для предложенной схемы он равен 0,08 нг/мл (выигрыш по пределу обнаружения более чем в 10 раз).

Краткое описание чертежей

На фиг. 1 представлены калибровочные кривые определения тропонина в предлагаемой и традиционной иммунохроматографических системах, 1 - предлагаемая схема проведения анализа, 2 - традиционная схема.

Способ снижения предела обнаружения иммунохроматографических тестов, основанный на оценке интенсивности окрашенной линии в аналитической зоне тест-полоски, отличающийся тем, что в раствор пробы добавляются агенты, увеличивающие вязкость жидкости, т.е. время протекания пробы вдоль рабочей мембраны, а следовательно, время иммунохимической реакции и способствует снижению предела обнаружения.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области биологии и медицины. Предложен способ экстракции ДНК, пригодной для проведения количественной ПЦР в реальном времени, из сухих пятен цельной крови новорожденных, нанесенных на фильтровальную карточку для неонатального скрининга.

Настоящее изобретение относится к иммунологии. Предложено антитело к молекуле отталкивающего направляющего сигнала а (RGMa).

Изобретения относятся к клеткам и тестам, которые могут использоваться для идентификации модуляторов рецепторов сладкого вкуса. Предложены способ идентификации модулятора ощущения сладкого вкуса и выделенная клетка U2-OS.

Настоящее изобретение относится к новым ДНК-аптамерам, способным прочно и специфически связываться с гельзолином. Кроме того, изобретение относится к применению этих аптамеров для оценки уровня гельзолина в данном образце и для очистки немеченного гельзолина и его аналогов в большом объёме.
Изобретение относится к области экологии и может быть использовано для экологического картирования, выявления неблагоприятных участков исследуемых регионов и дифференцированной оценки Cа-Sr статуса различных по площади территорий.

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для прогнозирования риска возникновения преэклампсии у женщин русской национальности, являющихся уроженками Центрально-Черноземного региона России.

Изобретение относится к медицине, в частности к травматологии и ортопедии и может быть использовано для диагностики перипротезной инфекции суставов при эндопротезировании.

Изобретение относится к области молекулярной биологии и медицинской генетики. Предложен способ прогнозирования развития криоглобулинемического васкулита у больных хроническим гепатитом С (ХГС).

Изобретение относится к области медицины, в частности к акушерству и гинекологии, и предназначено для диагностики хронического эндометрита (ХЭ) в среднюю стадию фазы секреции.

Группа изобретений относится к электрохимическим сенсорам для количественного определения глюкозы. Раскрыт сенсор глюкозы, содержащий фермент глюкозооксидазу, заключенную внутри сшитого гидрофильного сополимера в контакте с поверхностью электрода, при этом сополимер имеет первые звенья мономера 2-гидроксиэтилметакрилата, вторые звенья мономера структурной формулы (V) (V),где Y представляет собой -O-; R2 представляет собой метил; и z представляет собой среднее значение, составляющее от 2 до 250; и третьи звенья производных метакрилата, содержащие гидрофильные поперечные связи формулы (IIIa) (IIIa)где w находится в диапазоне 0-10.

Изобретение относится к нефтегазовой промышленности и может применяться для исследования газогидродинамических процессов, происходящих в скважинах газоконденсатных месторождений.

Изобретение относится к области гидродинамики и может быть использовано при разработке теплообменных аппаратов, использующих эффект начального участка. Установка для идентификации турбулентного начального участка в каналах малого поперечного сечения содержит емкость для исследуемой ньютоновской жидкости и теплообменник, представляющий собой трубопровод, состоящий из нескольких параллельных участков, соединенных между собой.

Изобретение относится к области измерительной техники, а именно в химической и нефтехимической отраслях промышленности на любых предприятиях и заводах, где вязкость изготовляемых ими продуктов является основным показателем качества.

Капиллярное устройство для индикаторов отображения текучей среды, содержащих ограничитель текучей среды и капиллярную трубку. Ограничитель текучей среды содержит сквозное отверстие малого диаметра.

Изобретение может быть использовано в нефтяной, автомобильной, авиационной, машиностроительной отраслях промышленности. С помощью устройства определяются плотность, динамическая и кинематическая вязкость жидкости.

Изобретение относится к области технической физики, в частности к способам измерения вязкости газов, и может найти применение в различных отраслях промышленности и в лабораторной практике.

Изобретение относится к области измерительной техники и может быть использовано для определения вязкости текучей среды. Предложены измерительное электронное устройство (20) и способ получения вязкости текучей среды потока при заданной эталонной температуре.

Изобретение относится к области технической физики, а именно к технике определения вязкостных свойств жидких сред. Вискозиметр содержит вертикальный калиброванный капилляр, заполненный исследуемой жидкостью.

Изобретение относится к области измерительной техники, в частности к бесконтактным аэродинамическим способам контроля поверхностного натяжения жидкостей, и может найти применение в химической промышленности и энергетике.

Изобретение относится к области микрофлюидики и может быть использовано для создания течения в капле жидкости и перемешивания жидкостей в малых объемах. Предложенный способ заключается в том, что каплю жидкости, в которой нужно создать течение, помещают на горизонтально расположенную тонкую упругую пластину со свободными краями, в которой возбуждают изгибные колебания с частотой собственных колебаний в интервале звуковых и ультразвуковых частот пьезоэлектрическим преобразователем.

Изобретение относится к биотехнологии. Конкретно, изобретение относится к предупреждению феномена усиления токсичности глазных инстилляций при совместном применении комбинации лекарственных препаратов. Используют культуры клеток конъюнктивы, при этом осуществляют подбор оптимальных концентраций глазных препаратов путем оценки метаболитической активности культуры клеток конъюнктивы качественно через морфологическую оценку с помощью визуального контроля и количествено с помощью МТТ-теста. Оценка осуществляется при воздействии указанных глазных препаратов или их комбинаций в различных концентрациях. Оценивают продукцию цитокинов в сравнении с контролем по уровню транскрипции после 48 ч инкубирования с указанными глазными препаратами или их комбинацией в подобранной концентрации. В качестве контроля используют не обработанную культуру клеток конъюнктивы. Усиление продукции цитокинов указывает на отсутствие усиления токсичности глазных инстилляций при совместном применении лекарственных препаратов, что позволяет применять проверенную комбинацию лекарственных препаратов для лечения воспалительных заболеваний конъюнктивы и роговицы. Изобретение может быть использовано для предупреждения феномена усиления токсичности глазных инстилляций при совместном применении комбинации лекарственных препаратов. 4 з.п. ф-лы, 3 ил., 3 табл., 1 пр.

Изобретение относится к аналитической химии и представляет собой способ иммунохроматографического анализа. Иммунохроматографический тест основан на взаимодействии конъюгата специфические антитела-коллоидный маркер с определяемым соединением в ходе движения реагентов вдоль тест-полоски. В зависимости от наличия антигена происходит образование специфических комплексов, обеспечивающих окрашивание в аналитической линии теста. Интенсивность окрашивания, а также чувствительность теста напрямую зависят от времени инкубации пробы и коллоидного конъюгата. Значительные возможности по снижению предела обнаружения дает использование мелкопористых, «медленных» рабочих мембран. Сокращение скорости движения увеличивает время специфического взаимодействия и тем самым снижает предел обнаружения системы. Однако часто использование мелкопористых мембран влечет ряд негативных эффектов, особенно при анализе реальных, часто содержащих корпускулярные частицы проб. В таких случаях происходит забивание пор мембраны и полная остановка течения жидкости, а результаты тестирования признаются недействительными. Предложенный подход отличается тем, что для анализа используется крупнопористая мембрана, а для сокращения скорости движения жидкости в пробу вносятся специальные растворы для повышения вязкости раствора, что приводит к увеличению времени протекания вдоль мембраны. Техническим результатом является снижение предела обнаружения аналитической системы. 1 ил.

Наверх