English US version

Способ выделения ренатурированного белка g из маркированного полиакриламидного геля



Способ выделения ренатурированного белка g из маркированного полиакриламидного геля
Способ выделения ренатурированного белка g из маркированного полиакриламидного геля
Способ выделения ренатурированного белка g из маркированного полиакриламидного геля
Способ выделения ренатурированного белка g из маркированного полиакриламидного геля
Способ выделения ренатурированного белка g из маркированного полиакриламидного геля
Способ выделения ренатурированного белка g из маркированного полиакриламидного геля
Способ выделения ренатурированного белка g из маркированного полиакриламидного геля
C07K1/14 - Пептиды (пептиды в пищевых составах A23, например получение белковых композиций для пищевых составов A23J, препараты для медицинских целей A61K; пептиды, содержащие бета-лактамовые кольца, C07D; циклические дипептиды, не содержащие в молекуле любого другого пептидного звена, кроме образующего их кольцо, например пиперазин-2,5-дионы, C07D; алкалоиды спорыньи циклического пептидного типа C07D519/02; высокомолекулярные соединения, содержащие статистически распределенные аминокислотные единицы в молекулах, т.е. при получении предусматривается не специфическая, а случайная последовательность аминокислотных единиц, гомополиамиды и блоксополиамиды, полученные из аминокислот, C08G 69/00; высокомолекулярные продукты, полученные из протеинов, C08H 1/00; получение

Владельцы патента RU 2646103:

Федеральное бюджетное учреждение науки Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии (ФБУН ГНЦ ПМБ) (RU)

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен способ выделения ренатурированного белка G из маркированного полиакриламидного геля. Предложенный способ включает этапы маркирования положения белка G в составе полиакриламидного геля, отделения фрагмента маркированного геля, содержащего белок G, последовательной обработки фрагмента геля денатурирующим буферным раствором, содержащим 20 мМ Трис (рН 8.0), 100 мМ NaCl, 1% Тритон Х-100, 6 М мочевину, 2 М тиомочевину, в течение 1 час и ренатурирующим буферным раствором, содержащим 20 мМ Трис (рН 8.0), 100 мМ NaCl, 2 мМ сульфобетаина, 1 мМ ЭДТА, в течение 3 час при 20°С с трехкратной сменой буфера и завершающей электроэлюцией ренатурированного белка G из измельченного геля в буферном растворе, содержащем 10 мМ калий-фосфатный буфер (рН 7,5), в течение 2 часов и силой тока 200 мА. Предложенный способ может быть использован для выделения белка G, имеющего сохраненные иммунобиологические свойства. 7 ил., 7 пр.

 

Изобретение относится к биотехнологии и описывает сочетанный способ очистки и ренатурации белка G, который может использоваться при создании специфических иммунодиагностических и иммунопрофилактических средств.

Известны многочисленные методы очистки белков, включающие, в том числе, электроэлюцию из агарозных и полиакриламидных гелей, которые широко распространены в повседневной лабораторной практике [Михайлов А.Т., Симирский В.Н. Методы иммунохимического анализа в биологии развития. - М.: Наука, 1991. - 290 с., Финдлей Д.Б. Биологические мембраны: Методы / Под ред. Дж. Финдлея, У. Эванза. М.: Мир, 1990. С. 271-273]. Их популярность связана с возможностью наработать некоторые необходимые для исследователей количества белка и избегать при этом трудоемких этапов выделения индивидуальных белков как и фрагментов ДНК (для выделения последних электроэлюция применяется значительно чаще). При очистке белков электроэлюция может не только выступать в качестве единственного и самостоятельного метода выделения, но и дополняется в некоторых случаях хроматографией, дифференциальным осажденим и другими.

Известны ренатурационные способы, имеющие одно принципиальное сходство, которое заключается в разбавлении концентрированного раствора денатурированного белка специальными буферами, что сопровождается образованием нативной, биологически активной структурой полипептида [Richard R, Burgess 2009. Meth Enzym 463: 259-281].

К настоящему времени опубликованы многочисленные протоколы ренатурации отдельных белков способом, в основе которого лежит разведение ренатурационных растворов, однако, метод имеет несколько существенных недостатков [Cabrita LD, Bottomley SP. 2004. Biotech Ann Rev 10: 31-49]. Известна альтернативная техника перевода белков в растворы с низкой ионной силой, использующая диализ или ультрафильтрацию [Yoshii Н, Furuta Т, Yonehara Т, Ito D, Linko Y-Y, Linko P: Biosci Biotechnol Biochem 2000, 64:1159-1165].

Предложен ряд методических подходов, имеющих целью преодолеть концентрационный барьер [Li М, Poliakov A, Danielson UH, Su Z, Janson JC: Biotechnol Lett 2003, 5:1729-1734].

Однако все вышеуказанные методы приводят к агрегации, очень низкому выходу и сильному разбавлению конечного раствора.

Технический результат предлагаемого изобретения заключается в том, что не изменяется антигенная и функциональная активность белка, что сохраняет иммунобиологические и функциональные свойства очищенного белка и позволяет включать его в состав иммунохимических тест-систем.

Технический результат достигается путем получения очищенного белка при помощи препаративного электрофореза в денатурирующих условиях в присутствии додецилсульфата натрия с последующей ренатурацией в геле и электороэлюции биологически активного восстановленного белка, а ренатурация биологически активной третичной структуры белка G оценивается по восстановлению его антителсвязывающей способности в иммунохимических тестах.

Технический результат достигается тем, что лизированную бактериальную культуру, продуцировавшую белок G преимущественно в составе телец включения, центрифугируют в течение 15 мин при 1500×g. Полученный осадок переосаждают при тех же условиях при 10°С, ресуспендируют в растворе 8 М мочевины, содержащем 10 мM Трис-HCI (рН 8,0) и 1,5 мM ЭДТА и перемешивают длительное время для наиболее полного растворения. Полученную суспензию центрифугируют при 14000×g в течение 30 мин и 12°С. Отбирают надосадочную фракцию и используют ее для фракционирования белков при помощи препаративного электрофореза в полиакриламидном геле в редуцирующих условиях (ДСН-ПААГ). По завершении электрофореза гели подвергают экспресс окраске холодным 0,4 М раствором калия хлористого с целью экспресс-идентификации. Идентифицированную полосу белка G вырезают из геля и промывают денатурирующим буфером, содержащим 20 мМ Трис (рН 8.0), 100 мМ NaCl, 1% Тритон Х-100, 6 М мочевину, 2 М тиомочевину в течение 1 час, после чего погружают гель в ренатурационный буфер, содержащий 20 мМ Трис (рН 8.0), 100 мМ NaCl, 2 мМ сульфобетаин, 1 мМ ЭДТА. Ренатурацию проводят при умеренном перемешивании емкости с гелем в течение 3 час при 20°С, буфер меняют три раза, строго контролируя его температуру, после чего промывают деионизованной водой и замораживают при - 80°С или жидким азотом. Гель измельчают в замороженном состоянии и проводят электроэлюцию ренатурированного белка в течение 2 час и силой тока 200 мА в буферном растворе, содержащем 10 мМ калий-фосфатный буфер (рН 7,5). Элюированный белок концентрируют ультрафильтрацией над мембраной YM-10 и диализуют против того же буфера, раствор меняют три раза. Полученный таким образом белок G представляет собой высокоочищенный препарат, обладающий присущими ему иммунобиологическими свойствами.

Изобретение иллюстрируется следующими фигурами:

Фиг. 1. Электрофорез препаратов белка G на различных этапах выделения.

Фиг. 2. Иммуноферментный анализ препаратов белка G.

Фиг. 3. Непрямой твердофазный иммуноферментный анализ препаратов белка G.

Фиг. 4. Электрофорез и иммуноблот белка G, обработанный различными иммуноглобулинами.

Фиг. 5. Определение иммунохимических свойств ренатурированного белка G при помощи дот-блота по схеме иммуноблота с электропереносом белков после электрофореза в ДСН-ПААГ.

Фиг. 6. Определение иммунохимических свойств ренатурированного белка G при помощи дот-блота.

Фиг. 7. Определение иммунохимических свойств ренатурированного белка G при помощи непрямого дот-блота с исключением возможного неспецифического взаимодействия конъюгатов и белка G.

Пример 1. Условия ренатурации белка G.

Применение электрофореза позволяет решить две задачи: во-первых, разделить сложную белковую смесь с выделением зоны, содержащей гомогенный белок, и, во-вторых, создать условия, ограничивающие подвижность молекул белка и предотвратить агрегацию в процессе ренатурации. Предварительные опыты показали, что приемлемое разрешение белков электрофорезом достигается при нанесении на препаративный мини-гель 250 мкл препарата белков, растворенных в 8 М мочевине. Маркировку геля проводят при помощи предокрашенных белковых маркеров молекулярных масс, которые вносят в отдельный колодец препаративного мини-геля. После одновременного разделения маркеров и образца, находящегося в препаративной части геля, полосу с маркерами отделяют, окрашивают препаративную часть отдельно, используя раствор хлористого калия, после чего сопоставляют разделенные части геля для точной идентификации положения белка G.

Для экспресс-окраски и идентификации термоденатурированного ДСН белка G, находящегося в составе геля, используют обработку холодным 0,4 М раствором калия хлористого (Фиг. 1, линия 1. Числами в верхней части фигуры обозначены линии: 1 - фрагмент геля, окрашенный хлористым калием после разделения клеточного лизата, содержащего белок G; 2 - клеточный лизат; 3 - белок G, ренатурированный и выделенный из фрагмента геля; 4 - препарат как в линии 3, разведенный в 15 раз; 5 - маркеры молекулярных масс, числовые значения приведены в правой части фигуры и выражены в килодальтонах; 6 - надосадочная фракция клеточного лизата, содержащая растворимые белки; 7 - белок G, выделенный из растворимой фракции клеточного лизата при помощи аффинной хроматографии на IgG Sepharose® 6 FF с привитыми иммуноглобулинами человека из нормальной сыворотки крови).

Идентифицированную полосу белка G вырезают из геля и насыщают буфером, содержащим 20 мМ Трис (рН 8.0), 100 мМ NaCl, 1% Тритон Х-100, 6 М мочевину и 2 М тиомочевину в течение 1 час, при этом происходит удаление хлористого калия, замещение ДСН тритоном Х-100, а 6 М мочевина в составе буферного раствора поддерживает денатурирующие условия для молекул белка G. Гель помещают в ренатурационный буфер, содержащий 20 мМ Трис (рН 8.0), 100 мМ NaCl, 2 мМ сульфобетаин, 1 мМ ЭДТА. Ренатурацию проводят с контролем температуры в течение 3 час при 20°С при умеренном перемешивании емкости с гелем и трехкратной сменой буфера, после чего промывают деионизованной водой, замораживают, измельчают в замороженном состоянии и проводят электроэлюцию ренатурированного белка из диспергированного геля в течение 2 час и силой тока 200 мА в буферном растворе, содержащем 10 мМ калий-фосфатный буфер (рН 7,5). Результаты электроэлюции контролируют ДСН-ПААГ (Фиг. 1). Было выделено до 1,8 мг белка G после электрофореза в геле мини-формата с использованием аппарата MiniVE, GE Healthcare, ренатурации и электроэлюции. Функциональную активность очищенного и ренатурированного белка G в дальнейшем подтверждают иммуноферментным анализом и иммуноблотами.

Пример 2. Применение буферного раствора с увеличенной концентрацией денатурирующего компонента.

Электрофорез проводят как в примере 1, вместе с тем, для растворения препарата белков используют буфер состава - 125 мМ трис-HCl, рН 6,8, 4% додецилсульфата натрия (SDS), 20% глицерина, 10% 2-меркаптоэтанола и 0,02% бромфенолового синего. Растворение белков достигается прогреванием проб, суспензированных в этом буфере в объемном соотношении 1:1 в течение 15 мин [Laemmli, U.K. (1970). Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227 (5259): 680-685]. Определяют положение полосы белка G, вырезают ее из геля и помещают для насыщения в буферный раствор, содержащий 25 мМ Трис (рН 8.0-8.2), 1% Тритон Х-100 и 8 М мочевину в течение 1-2 час, в результате чего происходит удаление хлористого калия, введенного для обратимой окраски геля, замещение ДСН тритоном Х-100, а 8 М мочевина в составе денатурирующего буферного раствора поддерживает условия, при которых полипептидные цепи молекулы белка G находятся в «развернутом» состоянии. Гель с денатурированным белком помещают в ренатурационный буфер, содержащий 25 мМ Трис (рН 8.0), 150 мМ NaCl, 0,02% твин-80, 1 мМ ЭДТА и инкубируют при умеренном перемешивании буфера в емкости с гелем в течение 18 час при 12-14°С. Объем буфера должен не менее чем в 200 раз превосходить объем полоски геля. Полученные результаты аналогичны примеру 1.

Пример 3. Использование буферных растворов с компонентами, обеспечивающими тиол-дисульфидное равновесие.

Электрофорез проводят как в предыдущих примерах, однако, для обработки гелевых полос, содержащих белок G, используют буферные растворы, которые на этапе денатурации обеспечивают расщепление возможных дисульфидных связей между цистеинами полипептидной цепи, а на этапе ренатурации - их восстановление. Денатурирующий буфер содержит 20 мМ Трис (рН 8.0), 8 М мочевину, 0,3% саркозил, 20 мМ CHAPS и 10 мМ 2-меркаптоэтанол. Для ренатурации белка полоску геля помещают в 200-кратный избыток (по объему) буферного раствора, содержащего 20 мМ Трис (рН 8.0), 150 мМ натрия хлористого, 20 мМ CHAPS, 5 мМ цистеина и 50 мМ цистина. Перед этим этапом температура буферного раствора должна быть обязательно доведена до 18°С. Наличие в буфере цистеин/цистиновой пары, слабощелочная среда, умеренная температура и продолжительная инкубация (не менее 12 час) способствуют восстановлению дисульфижных связей. Полученные результаты аналогичны примеру 1.

Пример 4. Твердофазный иммуноферментный анализ.

Планшеты (96 лунок) сенсибилизируют последовательным внесением в каждую лунку 100 мкл раствора, содержащего 0,1 М карбонатный буфер (рН 9,6) и 800 нг белка G с инкубацией при температуре 6°С в течение 18 час, после чего проводят четырехкратную промывку 10 мМ фосфатно-солевым буферным раствором (рН 7,2), содержащим 0,05% твина-20 (ФСБТ). Неспецифическую сорбцию блокируют 1% раствором бычьего сывороточного альбумина в ФСБТ в течение 2 час при 37°С, причем на этом этапе объем наполнения лунок составлял 120 мкл. Лунки промывают, как описано ранее, но трехкратно, после чего сразу же наполняют предварительно приготовленными растворами нормальных иммуноглобулинов кролика в ФСБТ. Иммуноглобулины разводят, начиная с наибольшей концентрации, составлявшей 2500 нг/мл с кратностью разведения 2,5. Последующие стадии анализа проводят аналогично с включением промежуточных промывок ФСБТ между каждой инкубацией. Этапы включали инкубацию с раствором биотинилированных антикроличьих F(ab)2 фрагментов антител (1:3000, 2 час, 37°С) в ФСБТ, с раствором стрептавидин-пероксидазы (1:4000, 1 час, 37°С), визуализацию субстратом и остановку реакции 2 М раствором серной кислоты. Субстратом служил 0,1% раствор о-фенилендиамина и 0,03% раствор перекиси водорода в 50 мМ цитрат-фосфатном буфере (рН 5,0) (Фиг. 2. Буквами в верхней части фигуры обозначены кривые: А, В - лунки сенсибилизированы белком G, очищенным аффинной хроматографией на IgG Sepharose® 6 FF с привитыми иммуноглобулинами человека из нормальной сыворотки крови; С, D - лунки сенсибилизированы белком G, ренатурированного и выделенного электроэлюцией из полиакриламидного геля). Титрование IgG на планшетах, сенсибилизированных различными препаратами белка G, представлено S-образными кривыми, горизонтальные участки которых в области высоких концентраций соответствуют области насыщения. Восходящие участки кривых А и В расположены в области концентраций IgG от 2,5 нг/мл до 80 нг/мл, для кривых С и D - от 10 нг/мл до 300 нг/мл. Принимая во внимание одинаковые номинальные концентрации белка G в препаратах, установленное различие концентрационных интервалов показывает сниженную долю функционально-активных молекул белка G в ренатурированном препарате по сравнению с белком G, очищенным аффинной хроматографией на IgG Sepharose® 6 FF с привитыми иммуноглобулинами человека из нормальной сыворотки крови.

Пример 5. Непрямой твердофазный иммуноферментный анализ.

Для проведения непрямого твердофазного ИФА каждую лунку планшета (96 лунок) сенсибилизируют, заполняя 100 мкл раствора, содержащего 0,1 М карбонатный буфер (рН 9,6) и 500 нг иммуноглобулинов нормальной сыворотки кролика с инкубацией при температуре 6°С в течение 18 час, после чего проводят четырехкратную промывку ФСБТ. Неспецифическую сорбцию блокируют 1% раствором бычьего сывороточного альбумина в ФСБТ в течение 2 час при 37°С, причем на этом этапе объем наполнения лунок составлял 120 мкл. В последующем, этапы анализа проводят аналогично, с промежуточными промывками ФСБТ и включают инкубацию с приготовленными предварительно разведениями белка G (начиная с наибольшей концентрации 600 нг/мл), с кратностью 2,5, с раствором нормальной сыворотки мыши (1:350, 2 час, 37°С), раствором антимышиных антител, конъюгированных с пероксидазой хрена (1:4000, 2 час, 37°С), и субстратом. Раствор субстрата содержал 0,1% о-фенилендиамина и 0,03% перекиси водорода в 50 мМ цитрат-фосфатном буфере (рН 5,0). Реакцию останавливают 2 М раствором серной кислоты. (Фиг. 3 показывает, что белок G титруется и интервале концентраций от 10 нг/мл до 150 нг/мл для кривых А и В и от 20 нг/мл до 300 нг/мл для кривых С и D. Буквами в верхней части фигуры обозначены кривые титрования: А, В - белка G, очищенного аффинной хроматографией на IgG Sepharose® 6 FF с привитыми иммуноглобулинами человека из нормальной сыворотки крови; С, D - белка G, ренатурированного и выделенного электроэлюциией из полиакриламидного геля.) Различие интервалов титрования и их параллельный характер указывают на концентрационные, но не функциональные различия двух использованных препаратов белка G.

Пример 6. Иммуноблот.

Разделение очищенного белка G и предокрашенных маркеров проводили ДСН-электрофорезом в 12,5% полиакриламидном геле в редуцирующих условиях в режиме постоянного тока 20 мА. После завершения ДСН-ПААГ гель освобождали от стеклянных пластин и помещали на 15 мин в буферный раствор, содержащий 25 мМ трис основной, 192 мМ глицин, 0,1% SDS, 20% этанол (рН 8,3). Раствор в кювете с гелем периодически перемешивают. Гель с необходимыми прокладками помещают в устройство для переноса, накладывают на него нитроцеллюлозную мембрану со стороны анода, слои фильтровальной бумаги для уплотнения, предварительно увлажненные буфером, электроды и подключают ток. Перенос белков на нитроцеллюлозную мембрану проводят перпендикулярно первому направлению разделения при постоянном токе 400 мА и температуре 22°С, в течение 1 час, после чего мембрану осторожно извлекают и немедленно помещают в блокирующий раствор, содержащий 1% бычий сывороточный альбумин, или 5% обезжиренное молоко в ФСБТ. Подавление неспецифических взаимодействий проводят при перемешивании раствора на качалке в течение 2 час при 37°С. Для промывки мембран и разведения белков на каждом промежуточном этапе используют ФСБТ. Блокированную и промытую мембрану разрезают на части, каждую из которых инкубируют в отдельных кюветах с различными растворами нормальных сывороток в течение 2 час при 37°С, после чего промывают и инкубируют при тех же условиях с соответствующими растворами конъюгатов антивидовых антител с пероксидазой хрена. Далее промывают ФСБТ и помещают в раствор хромогенного субстрата, содержащего 3,3'-диаминобензидин (0,5 мг/мл), хлорид никеля (0,1 мг/мл), 0,03% Н2О2, 0,05 М Трис-HCl (рН 7,6). Перекись водорода добавляют после растворения всех компонентов субстрата и используют его немедленно, реакцию останавливают, промывая окрашенные фрагменты мембран дистиллированной водой (Фиг. 4. Числами в верхней части фигуры обозначены линии: 1, 2, 3, 4 - фрагменты мембран иммуноблота; 5 - фрагмент геля, окрашенный кумасси G-250; 3 - предокрашенные маркеры молекулярных масс, числовые значения приведены в правой части фигуры и выражены в килодальтонах, все остальные линии содержат очищенный белок G. Обработка мембран: линия 1 - сыворотка крови человека; линия 2 - сыворотка крови мышей; линия 4 - сыворотка крови кролика.). Анализ иммуноблотов позволяет сделать заключение о том, что белок G денатурируется в результате термообработки образцов в присутствии 0,1% ДСН буфера Лэмли перед электрофорезом, утрачивает способность связывать различные иммуноглобулины G и остается преимущественно в денатурированном состоянии после переноса на нитроцеллюлозную мембрану, что подтверждается чрезвычайно слабой окраской полос или ее отсутствием (Фиг. 4, линии 1, 2 и 4). В это же время, электрофореграмма (Фиг. 4, линия 5) указывает на значительное (не менее 1 мкг) количество белка G в линиях.

Пример 7. Дот-блот.

Для подготовки различных вариантов рабочей нитроцеллюлозной мембраны готовят ряд последовательных двукратных разведений белков «первого слоя», в качестве которых выступают белок G, или иммуноглобулины G нормальной сыворотки крови различных животных, в частности кролика и мыши. Растворы белков переносят в объеме 1 мкл каждого разведения рядами на поверхность размеченной мембраны. Мембрану сушат в течение 1 час при 23°С, после чего погружают в блокирующий раствор, содержащий 1% бычий сывороточный альбумин или 5% обезжиренное молоко в ФСБТ. Блокировку проводят на качалке в течение 2 час при 37°С. Для промывок мембран и разведения белков на каждом промежуточном этапе используют ФСБТ. Перечисленные этапы являются общими для всех проводок. На последующих этапах, в зависимости от схемы эксперимента, применяют различные последовательности инкубации мембран в растворах нормальных сывороток животных, белка G, конъюгатов различных антивидовых антител с пероксидазой хрена, как правило, в течение 2 час при 37°С с необходимыми промежуточными промывками ФСБТ. При длительных экспериментах, выходящих за пределы одного рабочего дня, этапы инкубации проводят в течение ночного времени, но при 6°С. Этап обработки субстратом является общим и завершающим для всех схем проводки: промытую мембрану помещают в раствор субстрата, содержащего 3,3'-диаминобензидин (0,5 мг/мл), хлорид никеля (0,1 мг/мл), 0,03% Н2О2, 0,05 М Трис-HCl (рН 7,6). После добавления перекиси водорода субстрат используют немедленно, реакцию останавливают, промывая мембрану дистиллированной водой. Описания всех использованных схем дот-блотов приведены на Фиг. 5. Числами в верхней части фигуры обозначены секторы нитроцеллюлозной мембраны с сорбированными белками в последовательных двукратных разведениях, начиная с наибольшей концентрации, составляющей 1000 мкг/мл (секторы 1 всех полос). Полосы с сорбированным белком G обозначены слева надписью «Белок G», полосы с сорбированным бычьим сывороточным альбумином обозначены слева надписью «Альбумин». Полосы, обозначенные справа как «А» и «В» вместе с прилегающими полосами «Альбумин», отличаются проводкой мембран.

Проводка А: этап 1 - сорбция белка G и альбумина, 1 час, 24°С; этап 2 - промывка ФСБТ; этап 3 - инкубация с блокирующим агентом, 2 час, 37°С; этап 4 - промывка ФСБТ; этап 5 - инкубация с раствором IgG мыши, 1 мкг/мл, 2 час, 37°С; этап 6 - промывка ФСБТ; этап 7 - инкубация с конъюгатами антимышиных антител с пероксидазой хрена, 2 час, 37°С; этап 8 - промывка ФСБТ; этап 9 - хромогенный субстрат.

Проводка В: этап 1 - сорбция белка G и альбумина, 1 час, 24°С; этап 2 - промывка ФСБТ; этап 3 - инкубация с блокирующим агентом, 2 час, 37°С; этап 4 - промывка ФСБТ; этап 5 - инкубация с раствором IgG кролика, 1 мкг/мл, 2 час, 37°С; этап 6 - промывка ФСБТ; этап 7 - инкубация с конъюгатами антикроличьих антител с пероксидазой хрена, 2 час, 37°С; этап 8 - промывка ФСБТ; этап 9 - хромогенный субстрат. Числами в верхней части фигуры обозначены участки нитроцеллюлозной мембраны с сорбированными иммуноглобулинами G (IgG) в последовательных двукратных разведениях, начиная с наибольшей концентрации IgG, составляющей 1000 мкг/мл (участки 1). Виды сорбированных на нитроцеллюлозную мембрану IgG обозначены в левой части фигуры.

Проводку мембран осуществляли следующим образом: этап 1 - сорбция IgG мыши или кролика, 1 час, 24°С; этап 2 - промывка ФСБТ; этап 3 - инкубация с блокирующим агентом, 2 час, 37°С; этап 4 - инкубация с раствором ренатурированного белка G, 1 мкг/мл, 2 час, 37°С; этап 5 - промывка ФСБТ; этап 6 - инкубация с растворами IgG: верхний ряд - IgG кролика, нижний ряд - IgG мыши, 1 мкг/мл, 18 час, 6°С; этап 7 - промывка ФСБТ; этап 8 - инкубация с конъюгированными с пероксидазой хрена антивидовыми антителами против IgG, использованных на этапе 6, 2 час, 37°С; этап 9 - промывка ФСБТ; этап 10 - хромогенный субстрат. Числами в верхней части фигуры обозначены секторы нитроцеллюлозной мембраны с сорбированными белками в последовательных двукратных разведениях, начиная с наибольшей концентрации, составляющей 1000 мкг/мл (секторы 1 всех полос). Полосы с сорбированными IgG мыши в составе сыворотки крови мышей также обозначены надписью слева. Полосы, обозначенные справа как «А», используют в проводке белок G, очищенный из растворимой фракции лизатов клеток Е. coli аффинной хроматографией при помощи IgG Sepharose 6В. Полосы «В» используют в проводке белок G, ренатурированный и выделенный электроэлюцией в настоящем исследовании.

Проводка полос «А» и «В» с сорбированными IgG кролика: этап 1 - сорбция IgG кролика, 1 час, 24°С; этап 2 - промывка ФСБТ; этап 3 - инкубация с блокирующим агентом, 2 час, 37°С; этап 4 - промывка ФСБТ; этап 5 - инкубация с растворами белка G: линия «А» - очищенного аффинной хроматографией, линия «В» - ренатурированного и выделенного электроэлюцией, 1 мкг/мл, 2 час, 37°С; этап 6 - промывка ФСБТ; этап 7 - инкубация с раствором нормальной сыворотки мышей (1:100), 2 час, 37°С; этап 8 - промывка ФСБТ; этап 9 - инкубация с конъюгатами антимышиных антител с пероксидазой хрена, 2 час, 37°С; этап 10 - промывка ФСБТ; этап 11 - хромогенный субстрат.

Проводка полос «А» и «В» с сорбированной нормальной сывороткой мышей (1:30): этап 1 - сорбция белков сыворотки, включая IgG мыши, 1 час, 24°С; этап 2 - промывка ФСБТ; этап 3 - инкубация с блокирующим агентом, 2 час, 37°С; этап 4 - промывка ФСБТ; этап 5 - инкубация с растворами белка G: линия «А» - очищенного аффинной хроматографией, линия «В» - ренатурированного и выделенного электроэлюцией, 1 мкг/мл, 2 час, 37°С; этап 6 - промывка ФСБТ; этап 7 - инкубация с раствором IgG кролика (1 мкг/мл), 2 час, 37°С; этап 8 - промывка ФСБТ; этап 9 - инкубация с биотинилированными F(ab)2 фрагментами антикроличьих антител, 2 час, 37°С; этап 10 - промывка ФСБТ; этап 11 - стрептавидин-пероксидаза (1:3000), 2 час, 37°С; этап 12 - промывка ФСБТ; этап 13 - хромогенный субстрат.

Для подтверждения свойств ренатурированного белка используют различные схемы последовательных иммунохимических взаимодействий (различные проводки). При схеме прямого дот-блота, как и в иммуноблоте (Фиг. 4), на нитроцеллюлозную мембрану первым слоем сорбируют очищенный, функционально активный ренатурированный белок G и после блокировки проводят через растворы различных антител, соответствующих антивидовых антител, конъюгированных с пероксидазой хрена и субстрата (Фиг. 5). Появление окрашенных пятен в 11 секторе для кроличьих антител и в 12 секторе для антител мыши соответствуют количествам белка G 0,98 нг и 0,49 нг в 1 мкл раствора, сорбированного на мембраны. Альбумин, использованный в качестве контроля в проводках А и В, не показывает окраски пятен даже при сорбции на мембрану 1000 нг белка (Фиг. 5). По сравнению с иммуноблотом (Фиг. 4) ренатурированный белок G в прямом варианте дот-блота проявляет способность связывать IgG кролика и мыши в концентрациях на три порядка меньше, чем белок G, термоденатурированный перед ДСН-электрофорезом.

В отличие от прямого дот-блота, новый вариант использует белок G в качестве «мостика», связывающего иммуноглобулины различных видов животных (Фиг. 6). В этом случае макромолекула белка G должна нести по крайней мере два центра связывания константных областей IgG, и проявление такой способности доказывает наличие функциональной активности белка G, подвергнутого ренатурации. Для подтверждения, в эксперименте на нитроцеллюлозную мембрану сорбируют различные виды иммуноглобулинов G, соответственно, кролика и мыши в последовательных двукратных разведениях от нулевого до 1:2048, что соответствует в последней, 12-й ступени концентрации 0,488 мкг/мл. Далее, IgG первого слоя взаимодействуют с белком G, к которому перекрестно присоединяют IgG мыши и кролика. Обработка соответствующими конъюгированными антивидовыми антителами и субстратом приводит к появлению окрашенных пятен, отчетливо различимых в шестом и седьмом разведениях, что доказывает наличие у ренатурированного белка G способности связывать IgG мыши и кролика. Расчеты показывают, что для связывания белка G необходимо сорбировать на мембрану в одном пятне не менее 30 нг антител (Фиг. 6, участки 6 и 7). Однако в этой схеме мы не можем исключить вероятность прямого взаимодействия антивидовых конъюгатов с сорбированным белком G первого слоя за счет оставшихся свободных мест связывания. Схема дот-блота, исключающая такую возможность, и его результаты приведены на Фиг. 7. Проводка отличается от предыдущего варианта тем, что на завершающих этапах вместо конъюгатов антивидовых антител используют биотинилированные F(ab)2 фрагменты антител, утратившие способность к взаимодействию с белком G вследствие удаления константной Fc области молекулы IgG. Окраска пятен на полосах А и В с сорбированной сывороткой мыши доказывает отсутствие неспецифического связывания конъюгата с белком G.

Способ выделения ренатурированного белка G из маркированного полиакриламидного геля, включающий разделение субфракций бактериальной массы центрифугированием в течение 15 мин при 1500×g с последующим переосаждением полученного осадка при тех же условиях при 10°С, ресуспендированием в растворе 8 М мочевины, содержащем 10 мM Трис-HCl (рН 8,0) и 1,5 мM ЭДТА и длительным перемешиванием с финальным центрифугированием суспензии при 14000×g в течение 30 мин при 12°С для получения надосадочной фракции, отличающийся тем, что для денатурации и ренатурации используют белок G, иммобилизованный в составе полиакриламидного геля в редуцирующих условиях (ДСН-ПААГ) с маркированием положения белка G по завершении и отделением фрагмента маркированного геля, содержащего белок G с последующей последовательной обработкой фрагмента геля денатурирующим буферным раствором, содержащим 20 мМ Трис (рН 8.0), 100 мМ NaCl, 1% Тритон Х-100, 6 М мочевину, 2 М тиомочевину в течение 1 час и ренатурирующим буферным раствором, содержащим 20 мМ Трис (рН 8.0), 100 мМ NaCl, 2 мМ сульфобетаина, 1 мМ ЭДТА в течение 3 час при 20°С с трехкратной сменой буфера и завершающей электроэлюцией ренатурированного белка G из измельченного геля в буферном растворе, содержащем 10 мМ калий-фосфатный буфер (рН 7,5) в течение 2 час и силой тока 200 мА.



 

Похожие патенты:

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии и генетической инженерии, в частности к способу получения ранибизумаба с применением новых сигнальных последовательностей для лёгкой и тяжёлой цепи ранибизумаба, соответственно.

Представлены полинуклеотидная библиотека для получения спаренных последовательностей антител, способ получения представляющего интерес полинуклеотида и способ анализа и использования данных секвенирования.

Настоящее изобретение относится к хроматографическим матрицам, включающим лиганды на основе одного или нескольких доменов связывающихся с иммуноглобулином белков, таких как белок A (SpA) Staphylococcus aureus, а также способам их применения.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к иммуноцитокинам, и может быть использовано в медицине для лечения рака. Получают иммуноцитокин, содержащий: конъюгат интерлейкина 15 и домена sushi IL-15Rα, ковалентно связанный с антителом или его фрагмент, направленным против антигена, имеющего отношение к неоваскуляризации опухоли или к внеклеточному матриксу опухоли, или опухолевого антигена.

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен способ получения полипептида, рекомбинантно продуцируемого в периплазму прокариотическими клетками.

Группа изобретений относится к среде для культивирования клеток млекопитающих, способу ее получения и способу продуцирования рекомбинантного полипептида с использованием указанной среды.

Настоящее изобретение относится к иммунологии. Предложено антитело к молекуле отталкивающего направляющего сигнала а (RGMa).

Данное изобретение относится к области иммунологии. Предложено изолированное антитело, которое обладает способностью специфично связываться с амилоидом бета (Аβ), а также антигенные циклические пептиды, способные вызывать специфический иммунный ответ против олигомерного Аβ.

Изобретение относится к области биотехнологии и биохимии, а именно моноклональному антителу, селективно связывающему гликопротеин вируса Эбола с константой диссоциации комплекса 0,8×10-9 М, а также изолированному фрагменту ДНК, кодирующему участки легкой и тяжелой цепи указанного антитела, и антиген-связывающему фрагменту указанного моноклонального антитела.

Настоящее изобретение относится к иммунологии. Предложено антитело, которое связывается с фактором роста сосудистого эндотелия А (VEGF-А) человека и мыши, а также антигенсвязывающий фрагмент такого антитела.

Изобретение относится к биохимии. Предложен способ получения мультиспецифической связывающей молекулы, содержащей по меньшей мере две связывающих группировки, такой как антитело, где способ включает культивирование клетки, содержащей нуклеиновую кислоту, кодирующую растворимую сортазу А из S. aureus с С-концевым сигналом удерживания в эндоплазматическом ретикулуме, нуклеиновую кислоту, кодирующую первую связывающую группировку, содержащую на ее С-конце сортазный мотив, за которым следует сигнал удерживания в эндоплазматическом ретикулуме, и нуклеиновую кислоту, кодирующую вторую связывающую группировку, содержащую на ее N-конце по меньшей мере диглицин. Указанная клетка секретирует опосредованный сортазой А конъюгат первой связывающей группировки и второй связывающей группировки. Данное изобретение обеспечивает фермент-катализируемое получение мультиспецифической связывающей молекулы и может найти дальнейшее применение, в частности, для быстрого создания библиотек таких связывающих молекул. 6 з.п. ф-лы, 4 ил., 1 табл., 3 пр.

Изобретение относится к области биохимии. Описано изобретение - способ выделения биспецифического антигенсвязывающего белка. Способ включает в себя стадии: контактирование разрушенной клетки или смеси антигенсвязывающих белков с аффинной подложкой с белком А, и, элюирование биспецифического антигенсвязывающего белка с использованием градиента рН в присутствии ионного модификатора. Способ включает в себя использование ионного модификатора, который является солью, выбранной из ацетата бериллия, лития, натрия или калия; бикарбоната натрия или калия; карбоната лития, натрия, калия или цезия; хлорида лития, натрия, калия, цезия или магния; фторида натрия или калия; нитрата натрия, калия или кальция; фосфата натрия или калия; или сульфата кальция или магния. Изобретение расширяет арсенал средств для выделения антигенсвязывающих биспецифических белков. 24 з.п. ф-лы, 11 ил., 3 табл., 12 пр.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению нового рекомбинантного фактора свертывания крови, представляющего собой химерный белок с увеличенным временем полужизни в плазме, состоящий из фактора III человека и мутантного Fc-фрагмента IgG человека, что может быть использовано в медицине. Полученные химерные белки используют в составе фармацевтической композиции для терапии гемостатических нарушений, в том числе для лечения гемофилии А. Изобретение позволяет осуществлять эффективную терапию гемофилии А за счет повышенного времени полужизни полученного фактора свертывания в плазме. 6 н. и 9 з.п. ф-лы, 4 ил., 5 табл., 8 пр.

Изобретения относятся к выделению экспрессированных бакуловирусами вирусоподобных частиц (VLP)безоболочечных вирусов из клеток насекомых и касаются способа выделения экспрессированных бакуловирусом VLP цирковируса свиней 2-го типа (PCV2) в клетках насекомых и способа получения экспрессированных бакуловирусами VLP PCV2. Представленный способ выделения экспрессированных бакуловирусом VLP PCV2 включает стадию смешивания клеток насекомых, выбранных из SF9 и SF21, с солью, где раствор соли в воде, полученный в результате смешивания, содержит от 300 мОсмоль/л до 600 мОсмоль/л соли, выбранной из группы, состоящей из NaCl, KCl, CaCl2 и MgCl2, и не включает стадий лизиса или разрушения клеток. Изобретения позволяют получать несекретируемые VLP в культуральную жидкость без необходимости выделения всей клеточной нуклеиновой кислоты и белкового содержимого. 2 н. и 4 з.п. ф-лы, 8 ил., 1 табл., 8 пр.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к композициям, содержащим рекомбинантные варианты человеческого фактора свертывания крови Ха, что может быть использовано в медицине. Рекомбинантным путем получают широкое разнообразие изоформ и посттрансляционных модификаций FXa. Изобретение позволяет осуществлять эффективную терапию гемостаза у нуждающихся в этом субъектов. 4 н. и 33 з.п. ф-лы, 7 ил., 4 табл., 7 пр.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к слитым белкам домена CD95, и может быть использовано для ингибирования сигнального пути CD95. Получен химерный белок, содержащий функциональный фрагмент укороченного по N-концу внеклеточного домена CD95, непосредственно сшитого с Fc-доменом, где функциональный фрагмент укороченного по N-концу внеклеточного домена CD95 расположен на N-конце Fc-домена или его функционального фрагмента, и где химерный белок лишен дополнительной N-концевой последовательности. Изобретение позволяет получить химерный белок CD95 в стабильной форме и эффективно ингибировать сигнальный путь CD95. 6 н. и 7 з.п. ф-лы, 8 ил., 4 табл., 2 пр.

Настоящее изобретение относится к биотехнологии и фармацевтике, в частности к фармацевтической композиции для применения в ингибировании роста опухоли, резистентной к анти-VEGF-средствам. Указанная композиция включает анти-ИЛ-6R антитело и антагонист VEGF. Настоящее изобретение раскрывает способы ингибирования роста опухоли, резистентной к анти-VEGF-средствам, у субъекта с использованием указанной композиции. Настоящее изобретение позволяет повысить эффективность лечения опухолей, резистентных к анти-VEGF-средствам, которые имеют более высокое ИЛ-6/STAT3 сигнализирование по сравнению с опухолью, чувствительной к антагонисту VEGF самому по себе. 4 н. и 20 з.п. ф-лы, 2 ил., 7 табл., 2 пр.

Изобретение относится к области биохимии. Описана группа изобретений, включающая антитело, направленное на две мишени, которое специфически связывается с VEGF и DLL4, полинуклеотид, кодирующий вышеуказанное антитело, экспрессионный вектор, включающий полинуклеотид, трансформированную клетку СНО для экспрессии вышеуказанного антитела, способ получения вышеуказанного антитела, фармацевтическую композицию для лечения рака, содержащую терапевтическое эффективное количество антитела, композицию для диагностики рака, способ диагностирования рака и способ лечения рака, включающий этап введения вышеуказанного антитела. В одном из представлений антитело специфически связывается с конформационным эпитопом DLL4, содержащим аминокислотные остатки с 58-го по 65-й и со 110-го по 115-й аминокислотной последовательности белка DLL4, представленного в SEQ ID NO: 21, и антитело специфически связывается с VEGF. Изобретение расширяет арсенал антител, связывающихся с VEGF и DLL4. 9 н. и 8 з.п. ф-лы, 12 ил., 5 табл., 10 пр.

Настоящее изобретение относится к биотехнологии и медицине, в частности к фармацевтической композиции, которая ингибирует сигнальный путь CD95, составу, который имеет величину pH в диапазоне 4-8, включающему указанную композицию, 20-100 мМ фосфата и 0,1-10 мас. % средства, повышающего вязкость, такого как сорбитол, а также способу получения указанной композиции. Композиция согласно изобретению включает смесь изоформ слитого белка APG101. Указанные изоформы отличаются от APG101 длиной белка, а именно могут быть укорочены с N-конца на 16, 20 или 25 аминокислот, имеют разную длину и дополнительно могут содержать замены и/или делеции аминокислот и имеют по меньшей мере 95% идентичности с APG101 и распределены в рамках pI-диапазона 4,0-8,5. Немодифицированный APG101 имеется в указанной смеси в количестве, не превышающем 1 мол. %. Настоящее изобретение позволяет повысить эффективность средств для ингибирования сигнального пути CD95. 3 н. и 7 з.п. ф-лы, 11 ил., 4 табл., 1 пр.

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к рекомбинантным экспрессионным неамплифицирующимся векторам, рекомбинантным вирусным амплифицирующимся векторам на основе Х-вируса картофеля и рекомбинантным вирусным амплифицирующимся векторам на основе вируса табачной мозаики крестоцветных, предназначенных для получения в клетках растения легкой и тяжелой цепи антитела, специфически связывающего домен димеризации экзоклеточной части онкобелка HER2/neu. Изобретение также предусматривает способ получения антитела, специфически связывающего домен димеризации экзоклеточной части онкобелка HER2/neu, в растении, антитело, специфически связывающее домен димеризации экзоклеточной части онкобелка HER2/neu, полученное предложенным способом, и его применение в качестве терапевтического агента для лечения HER2/neu-позитивного рака молочной железы. Заявленное изобретение позволяет получить антитело, специфически связывающее домен димеризации экзоклеточной части онкобелка HER2/neu, в растении наиболее эффективно. 8 н. и 20 з.п. ф-лы, 9 ил., 3 табл., 8 пр.

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен способ выделения ренатурированного белка G из маркированного полиакриламидного геля. Предложенный способ включает этапы маркирования положения белка G в составе полиакриламидного геля, отделения фрагмента маркированного геля, содержащего белок G, последовательной обработки фрагмента геля денатурирующим буферным раствором, содержащим 20 мМ Трис, 100 мМ NaCl, 1 Тритон Х-100, 6 М мочевину, 2 М тиомочевину, в течение 1 час и ренатурирующим буферным раствором, содержащим 20 мМ Трис, 100 мМ NaCl, 2 мМ сульфобетаина, 1 мМ ЭДТА, в течение 3 час при 20°С с трехкратной сменой буфера и завершающей электроэлюцией ренатурированного белка G из измельченного геля в буферном растворе, содержащем 10 мМ калий-фосфатный буфер, в течение 2 часов и силой тока 200 мА. Предложенный способ может быть использован для выделения белка G, имеющего сохраненные иммунобиологические свойства. 7 ил., 7 пр.

Наверх