Способ приготовления питательной среды для выращивания пробиотических культур

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии. Способ приготовления питательной среды для выращивания пробиотических культур предусматривает получение соевого гидролизата из расчета 24-48 г сухого соевого молока на 1 л воды гидролизом с помощью пепсина в течение 48 ч с получением гидролизата. Полученный гидролизат подвергают фильтрации и стерилизации с последующим добавлением пептона, глюкозы и воды в заданном соотношении компонентов с получением питательной среды. Питательную среду нагревают, охлаждают, фильтруют, устанавливают рН среды в пределах 6,8-7,0 и стерилизуют при заданных параметрах. Изобретение позволяет упростить способ приготовления питательной среды. 4 пр.

 

Предлагаемое изобретение относится к ветеринарной микробиологии, в частности к способам получения ростовой среды для молочнокислых бактерий, и может быть использовано в производстве лечебно-профилактических и лечебных препаратов.

В настоящее время в России идет активная разработка и внедрение безопасных, эффективных пробиотических препаратов при выращивании сельскохозяйственных животных и получении продукции животноводства. Пробиотики назначают для восстановления облигатной микрофлоры после длительного лечения антибиотиками и сульфаниламидными препаратами, терапии при гастритах, энтеритах, колитах. Пробиотики, нормализуя микрофлору кишечника животных, подавляют развитие кишечной палочки и гнилостных бактерий. Продукты жизнедеятельности молочнокислых бактерий благотворно влияют на секреторную деятельность желудочно-кишечного тракта, возбуждают аппетит, повышают усвояемость корма. Важное значение имеет также среда, на которой культивируют бактерии.

На данном этапе питательная среда должна быть достаточно бюджетной для производства, иметь низкую стоимость, включать все основные компоненты, соответствующие потребностям бактерий. Культивирование в такой среде должно способствовать, как минимум, сохранению пробиотических свойств микроорганизмов, обеспечивать достаточно длительное хранение при поддержании определенной массы жизнеспособных микроорганизмов, не требовать особенных условий хранения.

Известен способ получения питательной среды на основе печеночного настоя. Для ее приготовления к 1000 мл дистиллированной воды добавляют пептон, хлористый натрий, глюкозу, дрожжевой экстракт и печеночный настой. Смесь нагревают до кипения. После охлаждения фильтруют через ватно-марлевый фильтр и устанавливают рН-6,8. Среду стерилизуют автоклавированием при 1 атм. 30 минут. Среда имеет соломенный цвет с серо-белым осадком, легко разбивающимся при встряхивании. Количество жизнеспособных микробных клеток не менее 1⋅107(КОЕ), млн/см3.

Известен способ приготовления гидролизатной среды на основе гидролизата белкового компонента, включающий ферментативный гидролиз, смешивание с уксусной кислотой, кипячение, фильтрацию, разведение, введение в гидролизат стабилизирующих добавок, стерилизацию полученной гидролизатной среды, введение суточной культуры микроорганизмов, их культивирование. При этом ферментативный гидролиз проводят в два этапа, один в кислой среде с использованием пепсина, другой - в щелочной среде с использованием панкреатина с концентрацией 5-10 г/л. Выход гидролизата, из которого готовят гидролизатную среду, составляет не менее 82 об. %, а содержание аминокислот 2,2-2,5 г/л. В качестве стабилизирующих добавок, количество которых составляет не менее 0,59 об.%, используют агар-агар в количестве 0,8-2,0 г/л, NaCl - 2,0-5,0 г/л, лактулозу или лактозу - 0,15-15,0 г/л, пептон - 2,5-15,0 г/л, цистин или цистеин солянокислый - 0,15-0,5 г/л, аскорбиновую кислоту - 0,3-0,5 г/л. В качестве белкового компонента для приготовления гидролизатной среды может быть использована смесь компонентов животного и растительного происхождения (1).

За прототип мы взяли наиболее близкий к заявляемому техническому решению по совокупности существенных признаков и достигаемому результату способ, предусматривающий приготовление питательной среды на основе ферментативного гидролизата белкового компонента с использованием соевоевого молока, а в качестве фермента для гидролиза - пепсин(2).

Соевое молоко готовят путем разведения сухого соевого порошка в воде согласно рецептуре, обычная концентрация составляет 7,5% (75 грамм на 1 литр воды) с последующим отстаиванием, процеживанием и кипячением. После охлаждения до 38-40°C доводят pH молока до 1,3-4,5, после вышеуказанной коррекции pH в соевое молоко вносят пепсин, проводят термостатирование молока при 37 град. С в течение 4 часов, при этом в процессе гидролиза происходит сдвиг pH в щелочную сторону на 0,2. При проведении гидролиза при pH ниже 4,5 после его окончания pH корректируют раствором NaOH (20%) до 4,5. Получаемый гидролизат представляет собой однородную мутную жидкость с небольшим количеством осаждающихся на дне белесоватых хлопьев и со специфическим запахом и вкусом соевого молока. Отстоявшийся гидролизат сливают с осадка, разводят дистиллированной водой 1:1, добавляют агар-агар, расплавляют, вносят хлористый натрий, пептон, нагревают до 80 град. С. Далее устанавливают pH питательной среды 7,5-7,6, кипятят в течение 15 мин, отстаивают, сливают с осадка, доводят горячей дистиллированной водой до исходного объема, добавляют лактозу, аскорбиновую кислоту в количестве 0,5 г/л. В среду вносят 5% маточной культуры бифидобактерий, и/или лактобактерий, и/или молочнокислых стрептококков и проводят культивирование бактерий путем термостатирования в течение 18 час. Исследования проб полученной маточной бактериальной культуры показали полное отсутствие посторонней микрофлоры как сразу после окончания культивирования, так и спустя 30 суток, при этом титр на гидролизатно-соевоей среде составил до 10×107 микробных клеток в 1 мл среды и не менялся в течение всего периода хранения закваски (30 суток). Не менялась также и морфология клеток.

Недостатком данного способа является сложность приготовления, длительность приготовления, ограниченный срок хранения.

В задачу наших исследований входило открытие нового способа создания питательной среды для выращивания пробиотических культур, обеспечивающей длительное сохранение микробной массы в жизнеспособном состоянии, дешевой в производстве.

Наша задача решается тем, что количество сухого соевого порошка вносимого сокращается до 24,0-28,0 грамм против обычной концентрации 75 грамм на 1 литр воды. Термостатирование под воздействием фермента пепсина длится в течении 48 часов, обеспечивая более полный гидролиз белков.

Через 48 часов гидролизат фильтруют через ватно-марлевый фильтр и автоклавируют при 1 атмосфере в течение часа. Готовый гидролизат используют для приготовления ростовой среды. Для ее приготовления к фильтрованной воде добавляют пептон, глюкозу и соевый гидролизат. Смесь нагревают до кипения. После охлаждения фильтруют через бумажный фильтр и устанавливают pH-метром 6,8-7,0. Среду стерилизуют автоклавированием при 1 атм. 30 минут. Культуры пробиотических микроорганизмов высевают в ростовую среду из расчета соотношения культуры и ростовой среды 1:20. Культивируют 24 часа. КОЕ/г после культивирования составляет не менее 1×109ед. Данный способ обеспечивает более полный гидролиз белков, срок хранения среды увеличивается до 6 месяцев в закрытом флаконе.

Изобретение иллюстрируют следующие примеры.

Пример 1: приготовление питательной среды в оптимальных параметрах.

Сухое соевое молоко 24 г разводят в 1 литре фильтрованной воды. Воду подогревают до 45-50°C и постоянно помешивают, до получения однородной жидкости. После охлаждения смеси до 37°C в нее вносят пепсин и помещают в термостат. Через 48 часов полученный гидролизат фильтруют через ватно-марлевый фильтр и автоклавируют при 1 атмосфере в течение часа. Далее готовят гидролизно-соевую среду. Для этого к 1000 мл фильтрованной воды добавляют 1 г пептона, 10 г глюкозы и 120,0 мл соевого гидролизата. Смесь нагревают до кипячения. После охлаждения фильтруют через бумажный фильтр и устанавливают pH 6,8-7,0. Среду стерилизуют при 1 атм. 30 мин. Среда готова для использования.

Пример 2: приготовление питательной среды в оптимальных параметрах.

Сухое соевое молоко 28 г разводят в 1 литре фильтрованной воды. Воду подогревают до 45-50°C и постоянно помешивают, до получения однородной жидкости. Охлаждают смесь до 37°C, вносят пепсин и термостатируют. Через 48 часов полученный гидролизат фильтруют и автоклавируют при 1 атмосфере в течение часа. Готовят гидролизно-соевую среду. Для этого к 1000 мл фильтрованной воды добавляют 1 г пептона, 10 г глюкозы и 120,0 мл соевого гидролизата. Смесь доводят до кипения. После охлаждения фильтруют через бумажный фильтр и устанавливают pH 6,8-7,0. Среду стерилизуют при 1 атм. 30 мин. Среда готова для использования.

Пример 3: приготовление питательной среды с экспозицией гидролиза сои менее 48 часов.

Сухое соевое молоко 25 г разводят в 1 литре фильтрованной воды. Воду подогревают до 45-50°C и постоянно помешивают, до получения однородной жидкости. После охлаждения смеси до 37 в нее вносят пепсин и помещают в термостат. Через 40 часов полученный гидролизат фильтруют через ватно-марлевый фильтр и автоклавируют при 1 атмосфере в течение часа. Далее готовят гидролизно-соевую среду. Для этого к 1000 мл фильтрованной воды добавляют 1 г пептона, 10 г глюкозы и 120,0 мл соевого гидролизата. Смесь нагревают до кипячения. После охлаждения фильтруют через бумажный фильтр и устанавливают pH 6,8-7,0. Среду стерилизуют при 1 атм. 30 мин. В среду, готовую для использования, засевают посевной материал, состоящий из производственных штаммов: Bifidobacterium thermophilum тп-87, Lactobacillus acidofilus, Lactobacillus plantarum, Lactococcus lactissubsp.diacetilactis, Bacillus subtillus из расчета 1:20 (посевной материал \ гидролизно-соевая среда). Получена конечная концентрация: 0,4×109 м.клеток в мл, меньшая, чем с оптимальными параметрами.

Пример 4: приготовление питательной среды со снижением pH до 6,7.

Сухое соевое молоко 25 г разводят в 1 литре фильтрованной воды. Воду подогревают до 45-50°C и постоянно помешивают, до получения однородной жидкости. После охлаждения смеси до 37°C в нее вносят пепсин и помещают в термостат. Через 48 часов полученный гидролизат фильтруют через ватно-марлевый фильтр и автоклавируют при 1 атмосфере в течение часа. Далее готовят гидролизно-соевую среду. Для этого к 1000 мл фильтрованной воды добавляют 1 г пептона, 10 г глюкозы и 120,0 мл соевого гидролизата. Смесь нагревают до кипячения. После охлаждения фильтруют через бумажный фильтр и устанавливают pH 6,7. Среду стерилизуют при 1 атм. 30 мин. В среду, готовую для использования засевают посевной материал, состоящий из производственных штаммов: Bifidobacterium thermophilum тп-87, Lactobacillus acidofilus, Lactobacillus plantarum, Lactococcus lactissubsp.diacetilactis, Bacillus subtillus из расчета 1:20 (посевной материал \ гидролизно-соевая среда). В серии посевов получены конечные концентрации: от 1×106 до 1,4×107 м.клеток в мл, меньшие, чем при использовании оптимальных параметров.

Для проверки количества жизнеспособных микробных клеток после 7 месяцев хранения культуры были высеяны на элективные питательные среды методом серийных разведений. Рост отмечен до 9 разведений:

Bifidobacterium thermophilum тп-87 - 7×109 КОЕ/г

Lactobacillus acidofilus - 1×109 КОЕ/г

Lactobacillus plantarum - 4×109 КОЕ/г

Lactococcus lactis subsp.diacetilactis - 2×109 КОЕ/г

Bacillussubtillus - 1×108 КОЕ/г

Через 12 месяцев хранения образцы были повторно высеяны на элективные питательные среды, методом серийных разведений, количество их снизилось:

Bifidobacterium thermophilum тп-87 - 4×107 КОЕ/г

Lactobacillus acidofilus - 1×105 КОЕ/г

Lactobacillus plantarum - 1×109 КОЕ/г

Lactococcuslactissubsp.diacetilactis - 1×107 КОЕ/г

Bacillussubtillus - 1×105 КОЕ/г

При определении pH установлено значительное его снижение и превышение допустимой нормы - до 4,2. В результате проведенных исследований было принято решение установить срок годности среды 6 месяцев со дня изготовления.

Список литературы

1. Патент РФ №2207019. «Биологически активная добавка к пище и способ ее приготовления», МПК A23L 1/30, A23J 3/04, A23J 3/14, A23J 3/34, C12N 1/20, A23C 9/12, опубл. 27.06.2003 г.

2. Патент РФ №2087532 «Питательная среда для накопления биомассы бифидобактерий», МПК C12N 1/20, A61K 35/74, A23C 9/12 опубл. 20.08.97 г.

Способ приготовления питательной среды для выращивания пробиотических культур, предусматривающий получение соевого гидролизата из расчета 24-28 г сухого соевого молока на 1 л воды гидролизом с помощью пепсина в течение 48 часов, фильтрацию гидролизата, его стерилизацию в течение 1 часа при 1 атм и добавление его в количестве 120 мл к смеси 1г пептона, 10 г глюкозы и 1л воды, нагревание до кипения, охлаждение, фильтрацию и установление рН в пределах 6,8-7,0 с последующей стерилизацией готовой среды при 1 атм в течение 30 мин.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к микробиологии. Предложен штамм бактерий Pseudomonas fluorescens BS1506 для защиты растений от фитопатогенных грибов и бактерий и стимуляции роста растений.

Изобретение относится к биотехнологии и сельскому хозяйству. Предложен способ обработки семени растения.

Настоящее изобретение относится к биотехнологии и пищевой промышленности. Предложен способ производства консерванта продуктов питания.

Изобретение относится к медицинской микробиологии. Проводится идентификациия цитрат-ассимилирующих энтеробактерий, изолированных при микробиологической диагностике дисбиотических состояний кишечника (дисбактериозов) у детей и взрослых.

Группа изобретений относится к биотехнологии. Заявлена группа изобретений: Штамм микроорганизма L.

Изобретения касаются способа регуляции иммунной системы субъекта, включающего введение субъекту композиции, включающей бактериальный вид Roseburia hominis; способа лечения нарушения у субъекта, включающего введение субъекту композиции, включающей Roseburia hominis; фармацевтической композиции, включающей Roseburia hominis, и способа производства такой композиции.

Группа изобретений относится к области биотехнологии. Предложен способ получения 2,4-дигидроксибутирата (2,4-ДГБ) из гомосерина, включающий два этапа: 1) замещение первичной аминогруппы гомосерина карбонильной группой для получения 2-оксо-4-гидроксибутирата (ОГБ), и 2) восстановление полученного ОГБ до 2,4-ДГБ.
Изобретение относится к биотехнологии. Способ культивирования бифидобактерий предусматривает внесение бифидобактерий в питательную среду, содержащую гидролизат гороха с содержанием аминного азота 160-180 мг, отвар листьев и стеблей люцерны, кукурузный экстракт, Д(-)-лактозу, натрий фосфорнокислый однозамещенный, сульфат железа семиводный, цистеин и осветленную творожную сыворотку в заданном соотношении компонентов и проводят наращивание биомассы бифидобактерий в течение 24 часов.

Изобретение относится к биотехнологии. Универсальная питательная среда для культивирования коринебакетрий, нокардий и родококков содержит панкреатический гидролизат кильки, Д- глюкозу, KH2PO4, MgSO4, водный голубой, натрий углекислый, агар микробиологический, геотермальная вода, стерильная деффибринированная кровь животных и парафин в заданном соотношении компонентов.
Изобретение относится к медицинской микробиологии. Питательная среда для культивирования туляремийного микроба содержит настой мозга теленка, мясной настой из мяса крупного рогатого скота, питательный бульон для культивирования микроорганизмов сухой (СПБ), дрожжевой экстракт, глюкозу, L-цистеин, магний сернокислый, натрий сернистокислый, агар микробиологический, эмульсию желтка куриного яйца и дистиллированную воду при заданном соотношении компонентов.

Изобретения касаются способа регуляции иммунной системы субъекта, включающего введение субъекту композиции, включающей бактериальный вид Roseburia hominis; способа лечения нарушения у субъекта, включающего введение субъекту композиции, включающей Roseburia hominis; фармацевтической композиции, включающей Roseburia hominis, и способа производства такой композиции.

Изобретения касаются способа регуляции иммунной системы субъекта, включающего введение субъекту композиции, включающей бактериальный вид Roseburia hominis; способа лечения нарушения у субъекта, включающего введение субъекту композиции, включающей Roseburia hominis; фармацевтической композиции, включающей Roseburia hominis, и способа производства такой композиции.
Изобретение относится к биотехнологии. Способ культивирования бифидобактерий предусматривает внесение бифидобактерий в питательную среду, содержащую гидролизат гороха с содержанием аминного азота 160-180 мг, отвар листьев и стеблей люцерны, кукурузный экстракт, Д(-)-лактозу, натрий фосфорнокислый однозамещенный, сульфат железа семиводный, цистеин и осветленную творожную сыворотку в заданном соотношении компонентов и проводят наращивание биомассы бифидобактерий в течение 24 часов.

Изобретение относится к фармацевтической промышленности и представляет собой средство для стимуляции регенерации ткани печени при парентеральном введении в организм, характеризующееся тем, что оно содержит жидкую форму жизнеспособных клеток штамма бактерий Bacillus subtilis ВКПМ В-10641 в концентрации не менее 107 КОЕ/мл в изотоническом растворе натрия хлорида, а также способ стимуляции регенерации ткани печени, включающий парентеральное введение в организм средства для стимуляции регенерации ткани печени в течение периода, необходимого для достижения терапевтического эффекта, отличающийся тем, что в качестве средства для стимуляции регенерации ткани печени используют жидкую форму жизнеспособных клеток штамма бактерий Bacillus subtilis ВКПМ В-10641 в концентрации не менее 107 КОЕ/мл в изотоническом растворе натрия хлорида в виде суспензии, а введение указанного средства осуществляют инфузионно внутривенно капельно или внутривенно струйно однократно в количестве не более 250 мкл на 1 кг живой массы тела.

Группа изобретений относится к биотехнологии. Предложены способ отбора пробиотического штамма Bacillus, включающий оценку воздействия тестируемого штамма на экспрессию белка CFTR или белка NHE3; пробиотический штамм Bacillus subtilis, вызывающий уменьшение экспрессии белка CFTR и/или увеличение экспрессии белка NHE3, депонированный в CNCM под регистрационным номером I-2745; клетки, полученные путем культивирования пробиотического штамма Bacillus, и композиция, содержащая эффективное количество клеток, для применения при лечении и/или предотвращении диареи.

Изобретение относится к применению пробиотического бактериального штамма Lactobacillus reuteri DSM 17938 и/или Bifidobacterium longum АТСС BAA-999 в производстве питательной композиции для субъекта.

Изобретение относится к медицине и предназначено для лечения рассеянного склероза. Используют пробиотический штамм Enterococcus faecium L-3.

Группа изобретений относится к микробиологии и биотехнологии. Заявлены - штамм Lactobacillus gasseri ВКМ B-2918D, обладающий антагонистической активностью по отношению к штаммам Escherichia coli, и композиция, содержащая штамм Lactobacillus gasseri ВКМ B-2918D и лактоферрин.
Группа изобретений относится к фармацевтической промышленности, а именно к фармацевтическим лиофилизированным препаратам. Фармацевтический лиофилизированный препарат, включающий: ботулотоксин, полисорбат и метионин, и один или более компонентов, выбранных из группы, состоящей из сахара, сахароспирта и ионного соединения, взятых при определенном соотношении, причем ионное соединение выбрано из хлорида натрия, фосфата натрия, фосфата аммония, сульфата магния, ацетата натрия, сукцината натрия, пропионата натрия и фосфата калия, в котором препарат не содержит альбумин и в котором стабильность ботулотоксина поддерживается в течение по меньше мере 30 дней при 40°С и 70% относительной влажности (варианты).

Изобретение относится к биотехнологии. Штамм Bacillus megaterium 874, обладающий иммуномодулирующей способностью, депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под регистрационным номером ВКПМ В-12251 и может быть использован для снижения аллергии и добавлен в пищевые продукты.

Изобретение относится к фармацевтической промышленности и медицине и представляет собой композицию, способную образовывать специфический мукоадгезивный гелеобразующий комплекс по всему желудочно-кишечному тракту, содержащую бактерии, способные продуцировать экзополисахарид in situ в желудочно-кишечном тракте и принадлежащие к по меньшей мере одному из следующих штаммов: Streptococcus thermophilus DSM 16590 (YO2), Streptococcus thermophilus DSM 16592 (YO4), Streptococcus thermophilus DSM 17843 (YO8), Streptococcus thermophilus DSM 25246 (ST10), Streptococcus thermophilus DSM 25247 (ST11), Streptococcus thermophilus DSM 25282 (ST12) совместно с камедью тары, для применения в качестве лекарственного средства для предотвращения и лечения всех патологий, связанных с дефицитом барьерного эффекта в желудочно-кишечной области вследствие низкой выработки слизи. Изобретение обеспечивает сохранение в достаточном количестве и хорошей жизнеспособности бактериальных штаммов, а также сохранение кишечной слизистой. 4 з.п. ф-лы, 2 табл.

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии. Способ приготовления питательной среды для выращивания пробиотических культур предусматривает получение соевого гидролизата из расчета 24-48 г сухого соевого молока на 1 л воды гидролизом с помощью пепсина в течение 48 ч с получением гидролизата. Полученный гидролизат подвергают фильтрации и стерилизации с последующим добавлением пептона, глюкозы и воды в заданном соотношении компонентов с получением питательной среды. Питательную среду нагревают, охлаждают, фильтруют, устанавливают рН среды в пределах 6,8-7,0 и стерилизуют при заданных параметрах. Изобретение позволяет упростить способ приготовления питательной среды. 4 пр.

Наверх