Планарный твердофазный оптический сенсор для определения белковых соединений методом спектроскопии гигантского комбинационного рассеяния и его применение для детектирования белковых соединений

Группа изобретений относится к области технологий материалов, материаловедческих и аналитических исследований. Планарный оптический ГКР-сенсор для детектирования белковых соединений включает последовательно расположенные на подложке на основе диэлектрического химически инертного материала наноструктурированное покрытие на основе наночастиц благородных металлов и прозрачный микропористый слой полиэлектролита, характеризующийся способностью/возможностью образовывать полиэлектролитный комплекс с белковыми соединениями, при этом наночастицы благородных металлов имеют размеры 20-90 нм, наноструктурированное покрытие из них выполнено толщиной 1-10 мкм, а слой полиэлектролита выполнен толщиной 50-100 мкм. Технический результат – детектирование анализируемых белковых соединений с низкими пределами обнаружения методом спектроскопии ГКР. 2 н. и 6 з.п. ф-лы, 7 ил., 2 табл.

 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к области технологий материалов, материаловедческих и аналитических исследований, и может быть использовано в медицинской диагностике и биохимических исследованиях для качественного и количественного обнаружения белковых соединений в биологических жидкостях с высокими чувствительностью, селективностью и экспрессностью.

Уровень техники

Из уровня техники известны решения, направленные на создание оптических планарных сенсорных устройств на основе наночастиц благородных металлов. Данные сенсорные устройства позволяют разрабатывать новые подходы к высокочувствительному, селективному и экспрессному определению набора химических соединений в различных диагностических целях. Создаваемые сенсоры представляют собой многослойные структуры на специальном субстрате-подложке, способные модулировать сигнал (усиливать интенсивность, изменять частоту и т.д.) - однозначно необходимы для перехода на современные технологии «lab-on-chip» («лаборатории на чипе»), что позволяет совершенствовать современные аналитические методы, применяемые как в, так и вне лаборатории. Известные решения находят применение в широком круге таких приложений, как диагностика здоровья человека, мониторинг экологического состояния окружающей среды, детектирование наркотических и взрывоопасных веществ. К особому классу оптических сенсоров относятся устройства, действие которых основано на принципах спектроскопии гигантского комбинационного рассеяния (ГКР, от англ. SERS - Surface Enhanced Raman Scattering). Известно, что наночастицы благородных металлов и нанокомпозиционные материалы на их основе способны усиливать сигнал комбинационного рассеяния в 106-1014 раз за счет их способности генерировать локальное электромагнитное поле, взаимодействующее с колебательными состояниями анализируемых органических молекул. Явление ГКР открывает новые возможности в создании сверхчувствительных диагностических методов анализа и понижении предела обнаружения по сравнению с известными методами. На сегодняшний день для ранней диагностики заболеваний и своевременного лечения требуется определение белковых соединений с высокой чувствительностью и точностью, поскольку даже небольшое изменение концентрации белков или активности ферментов могут быть вызваны началом некоторых серьезных заболеваний. Однако современные методы не в полной мере удовлетворяют требованиям к чувствительности, экспрессности, доступности используемого оборудования и стоимости анализа, что приводит к необходимости пересмотра существующих и разработке новых, более чувствительных, селективных и менее ресурсозатратных экспресс-способов определения белковых соединений в таких биологических жидкостях, как кровь, моча, спинномозговая жидкость, слюна и др. Сложность анализа белковых соединений методом спектроскопии ГКР заключается в низкой воспроизводимости коэффициентов усиления сигнала, вызванной различной ориентацией макромолекул белка относительно металлической поверхности, а также возможным изменением конформации глобулы. В связи с этим необходим поиск приемов для лучшего удерживания макромолекулы белка и, как следствие, улучшения метрологических характеристик определения с использованием сенсора.

Из уровня техники известно решение, представленное в заявке RU 2014144947 «Ультрачувствителъный сенсор», описывающей сенсорное устройство - подложку с множеством столбиков, некоторые из которых содержат диск наверху и металлическую точечную структуру на боковой стенке столбика. По меньшей мере, часть указанной металлической структуры покрыта слоем молекулярной адгезии толщиной 0.5-50 нм, рядом с внешней поверхностью которого наносенсор усиливает световой сигнал. В зависимости от выбора молекулярного адгезионного слоя сенсор способен связывать амины, тиосоединения или гидроксильные органические вещества. В качестве адгезионного слоя были предложены алкантиол, тиополи(этилен)гликоль, стрептавидин/биотин. Разработанный сенсор позволяет удерживать различные органические соединения, обладающие такими функциональными группами как амино-, тио- или гидроксильная группа, в том числе в качестве аналитов могут выступать белки.

Однако сенсор обладает достаточно сложной конструкцией, что отрицательно влияет на воспроизводимость методики определения целевых аналитов и сужает круг определяемых соединений. Анализ с использованием известного сенсора требует больших трудозатрат. Производство данного сенсора сложно осуществлять в больших масштабах. Кроме того, применение для удерживания аналитов специфических взаимодействий «антитело - антиген» накладывает строгие ограничения на условия хранения и транспортировки известного устройства, а также резко повышает стоимость анализа.

Из уровня техники известно решение, представленное в патенте RU 2356033 «Способ измерения поверхностного плазменного резонанса (варианты) и соединение благородного металла, используемое для данного способа», описывающем способ анализа и соединение благородного металла, позволяющее установить состояние молекулы белка: фосфорилированное или дефосфорилированное. Согласно изобретению способ измерения поверхностного плазмонного резонанса включает помещение соединения благородного металла на нижнюю грань призмы, облучение призмы светом для обнаружения отраженного света. Соединение благородного металла содержит заместители на стороне, противоположной стороне, контактирующей с призмой, при этом исследуемый образец добавляют к стороне, имеющей заместители в соединении благородного металла. Изобретение позволяет обнаружить существование фосфорилированного пептида (белка) и, следовательно, определить, является ли пептид в биологических материалах фосфорилированным или нет. В качестве «распознающих» заместителей на поверхности используется сложное металлоорганическое соединение.

Однако известное решение не обеспечивает количественного определения белковых соединений. Кроме того, описанный способ позволяет адсорбировать только белок в фосфорилированном состоянии, а, следовательно, не решает проблему удерживания белковых соединений и их анализа не зависимо от их состояния. В качестве захватывающего соединения предложено труднодоступное металлоорганическое соединение, что усложняет методику получения сенсора из-за возможных синтетических сложностей и стоимости препарата, также ухудшает воспроизводимость анализа.

Из уровня техники известно решение, представленное в заявке US 20110064886 «Способ улучшения оптического датчика», в котором в целях обеспечения необходимой адгезии аналита к металлической поверхности оптического датчика предложен специальный способ обработки сенсорного устройства. Методика предполагает несколько шагов: обработку поверхности сенсора кислотой; формирование тонкого металлического слоя на поверхности и модификацию металлического слоя плазмой, что повышает его адгезионную способность. В качестве аналитов были рассмотрены биомолекулы, в том числе белковой природы - бычий сывороточный альбумин.

Однако вышеописанный метод обладает рядом недостатков: например, обработка поверхности плазмой повышает стоимость анализа из-за дороговизны как оборудования, так и проведения самой обработки. Кроме того, адгезионные свойства металлической поверхности с учетом специальной обработки оказываются ниже, чем при использовании специального полимерного слоя.

Наиболее близким к заявляемому является решение, представленное в заявке на изобретение RU 201312364 «Способ анализа мембраносвязанного гемоглобина в эритроцитах с помощью спектроскопии гигантского комбинационного рассеяния на наноструктурированных покрытиях», раскрывающее способ анализа мембраносвязанного гемоглобина в эритроцитах с помощью спектроскопии ГКР на наноструктурированных покрытиях, характеризующийся тем, что для исследования эритроцитов используются наноструктурированные покрытия в виде кольцевых наноструктур серебра имеющих иерархическую структуру. Ободки серебряных колец состоят из сообщающихся друг с другом пористых агрегатов серебра микронного размера, на поверхности которых расположены и внедрены в матрицу округлые наночастицы серебра размером 2-100 нм. Преимущество данного изобретения заключается в его практической применимости в области медицинской диагностики и биоаналитических исследований: для обнаружения биологических молекул и маркеров в биологических жидкостях (крови, слюне и др.), исследований строения биомолекул, криминалистических целей. Использование наноструктурированных подложек с контролируемой морфологией не вызывает гемолиз эритроцитов и позволяет осуществлять их неинвазивную диагностику методом ГКР в результате более эффективного контакта наночастиц (НЧ) с живыми клетками плазмы крови, исключая стадию смешения эритроцитов с коллоидными растворами НЧ и сокращая время иммобилизации клеток.

Недостатком известного технического решения является невозможность предварительного концентрирования и связывания анализируемого соединения белковой природы на поверхности наноструктурированного металлического сенсорного устройства, что не позволяет повышать чувствительность анализа и понижать пределы обнаружения аналитов. Также в связи с отсутствием полимерного слоя невозможно расширять круг определяемых белковых соединений за счет их электростатического связывания в полиэлектролитные комплексы с поликатионами или полианионами. Более того, известный способ характеризуется низкой достоверностью получаемых результатов в случае нанесения пробы, содержащей белковые соединения вне клеточных структур, на металлическое сенсибилизированное покрытие из-за частичного изменения конформации структуры и деградации макромолекулы. Непредсказуемость распределения анализируемых соединений по поверхности затрудняет регистрацию воспроизводимых по интенсивности сигналов в различных областях сенсорного устройства.

Раскрытие изобретения

Задачей настоящего изобретения является получение планарных оптических сенсоров с биопротектирующим полимерным слоем, позволяющих использовать метод спектроскопии гигантского комбинационного рассеяния (ГКР) с высоким коэффициентом чувствительности и низким пределом обнаружения (ПО), высокой селективностью, широким диапазоном определяемых концентраций (ДОК), высокими воспроизводимостью и прецизионностью для качественного и количественного определения белковых соединений.

Техническим результатом изобретения является способность предконцентрировать и связывать анализируемое вещество, что позволяет детектировать анализирумые белковые соединения с низкими пределами обнаружения методом спектроскопии ГКР, за счет образования полиэлектролитных комплексов молекул белков со слоем полиэлектролита (полимера) на поверхности сенсорного устройства. Заявляемый оптический сенсор позволяет регистрировать усиленный сигнал комбинационного рассеяния за счет сохранения конформационной структуры молекул белков благодаря наличию полимерного биопротектирующего покрытия, предотвращающего токсическое действие наночастиц серебра. При этом полимерное покрытие, находящееся на наноструктурированной поверхности серебра, имеет толщину, при котором возможно резонансное взаимодействие наночастиц серебра и белковых соединений. Более того, представленный оптический сенсор удобен для работы с портативным, коммерчески доступным, серийным оборудованием вне лабораторных условий. Таким образом, с использованием заявляемого оптического планарного сенсора возможно высокочувствительное и селективное качественное и количественное определение присутствующих в образце белковых соединений (фиг. 5). Поставленная задача решается планарным оптическим ГКР (гигантское комбинационное рассеяние) - сенсором для детектирования белковых соединений, характеризующимся тем, что он включает в себя: последовательно расположенные подложку на основе диэлектрического химически инертного материала, наноструктурированное покрытие на основе наночастиц благородных металлов, и расположенный на наноструктурированном покрытии прозрачный микропористый слой полиэлектролита, образующий полиэлектролитный комплекс с белковыми соединениями, при этом наночастицы благородных металлов имеют размеры 20-90 нм, наноструктурированное покрытие из них составляет слой толщиной 1-10 мкм и слой полиэлектролита толщиной 50-100 мкм. При этом в качестве диэлектрического химически инертного материала использован материал, выбранный из ряда: оксид алюминия, оксид магния, диоксид кремния, диоксид циркония, силикатное стекло.

При этом в качестве благородного металла использовано серебро или золото. При этом качестве полиэлектролита использованы прозрачные в области длин волн 300-800 нм соединения: полиакриловая кислота, натриевая соль альгиновой кислоты, хитозан, натриевая соль сополимера 4-стиролсулфоновой и малеиновых кислот, полистиролсульфокислота, альбумин, полиаллиламин или полиакриламид.

При этом полиэлектролитный слой выполнен из расчета 10-20 мкл подсушенного раствора с концентрацией 0.1-2 масс. % нанесенного на 1 см2 нанострукурированной поверхности благородного металла.

Поставленная задача решается способом анализа белковых соединений в пробе, характеризующимся тем, что на заявляемый планарный твердофазный оптический сенсор наносят пробу с исследуемым соединением и детектирование полученного полэлектролитного комплекса белкового соединения в полиэлектролитном слое, методом спектроскопии гигантского комбинационного рассеяния и о качественном и количественном содержании белковых соединений судят по положению и интенсивности полос на регистрируемых спектрах.

При этом для качественного и количественного анализа используют жидкие пробы объемом 15-30 мкл путем их накалывания на поверхность сенсора.

При этом при проведении анализа используют лазерное излучение с длиной волны 514, или 532, или 633, или 785 нм, или 1064 нм и мощностью, не превышающей 10% от номинальной величины, при облучении сенсора с нанесенной пробой не более 10 секунд.

Также поставленная задача решается способом анализа белковых соединений, включающим нанесение на предлагаемый планарный твердофазный оптический сенсор жидкой пробы с исследуемым соединением с образованием полиэлектролитного межмолекулярного комплекса полимерного слоя с белковым соединением, и о качественном и количественном содержании белковых соединений судят по результатам анализа, проведенного методом спектроскопии гигантского комбинационного рассеяния. При этом на поверхность сенсора предпочтительно накапывать жидкие пробы объемом 10-50 мкл для качественного и количественного определения анализируемых веществ с концентрациями 10-9-10-2 М.

Предпочтительно при проведении анализа использовать лазерное излучение с длиной волны 514 или 532, или 633, или 785 нм, или 1064 нм и мощностью, не превышающей 10% от номинальной величины излучения, при облучении сенсора с нанесенной пробой не более 10 секунд.

Заявляемое сенсорное устройство применимо для определения белковых соединений на фоне большого количества посторонних мешающих компонентов анализируемых реальных биологических жидкостей: крови, мочи, церебральной жидкости и др. Данный результат достигается за счет дополнительного селективного связывания белковых макромолекул в полиэлектролитный комплекс с полимером на поверхности сенсора. Кроме того, за счет равномерного распределения макромолекул белкового соединения по поверхности полимерного слоя регистрируется воспроизводимый на всей сенсорной поверхности усиленный сигнал ГКР. Усиление сигнала комбинационного рассеяния в 103-1014 раз достигается за счет дополнительного предконцентрирования и проникновения белков через полимерный слой к активному металлическому элементу сенсорного устройства благодаря полиэлектролитным взаимодействиям. Еще одним преимуществом предлагаемого изобретения является сохранение конформационной структуры белковых соединений и предотвращение деградации их структуры на металлической поверхности активного элемента сенсора, что подтверждается искажением характеристических сигналов на спектрах ГКР, полученных от образцов, нанесенных на металлическую поверхность без полимерного слоя, и присутствием таких сигналов на спектрах ГКР, полученных от образцов, нанесенных на металлическую поверхность с дополнительным полимерным слоем. Предлагаемый оптический сенсор с биопротектирующим полимерным слоем имеет незначительный фоновый сигнал на спектрах гигантского комбинационного рассеяния, что позволяет количественно определять белковые соединения на уровне 10-5 M, предел обнаружения белковых соединений составляет порядка 10-9 М.

Заявляемая группа изобретений позволяет эффективно предконцентрировать и селективно связывать анализируемое вещество, контролируемо подбирать полимерное покрытие для образования полиэлектролитного комплекса, обнаруживать аналит с коэффициентом усиления до 1014, в том числе за счет сохранения конформационной структуры определяемого белкового соединения. При этом также стоит отметить потенциальное устранение мешающего влияния посторонних компонентов различных биологических жидкостей.

Таким образом, использование предлагаемого оптического сенсора с полиэлектролитным слоем позволяет детектировать сигнал ГКР с высоким коэффициентом чувствительности, высокой селективностью, широким диапазоном определяемых концентраций, высокой воспроизводимостью и прецизионностью.

В настоящем изобретении приняты следующие обозначения и термины:

ГКР - гигантское комбинационное рассеяние,

Спектр ГКР - спектр комбинационного рассеяния с сигналами, усиленными по интенсивности в 103-1014 раз,

ДОК - диапазон определяемых концентраций,

РЭМ - растровая электронная микроскопия,

ПАК1 - полиакриловая кислота с м.м. 18 кДа,

ПАК2 - полиакриловая кислота с м.м. 450 кДа,

ПО - предел обнаружения,

ПССК - поли(4-стирол)сульфоновая кислота.

Химические символы / сокращения имеют свои обычные значения: °С (градус (градусы) Цельсия), нм (нанометр (нанометры)), мкм (микрометр (микрометры)), см (сантиметр (сантиметр)), мин (минута (минуты)), с (секунда (секунды)), мкл (микролитр (микролитры)), мкг (микрограмм (микрограммы)), М (моль (моли) в литре), л (литр (литры)), мл (миллилитр (миллилитры)), мкл (микролитр (микролитры)), г(грамм (граммы)), мг (миллиграмм (миллиграммы)), моль (моли), ммоль (миллимоль (миллимоли)), масс. % (массовый процент (массовые проценты)), м.м. (молекулярная масса).

Краткое описание чертежей

Изобретение поясняется чертежами.

На фиг. 1 представлена схема оптического планарного ГКР - сенсора и детектирования белковых соединений с его помощью. Позициями на фигурах обозначены: 1 - подложку из химически инертного диэлектрического материала, 2 - нанесенный на нее слой наночастиц благородного металла, 3 - нанесенный на наноструктурированное покрытие слой полиэлектролита, 4 - образование электростатического (полиэлектролитного) комплекса детектируемого белкового соединения в слое полиэлектролита.

На фиг. 2 представлены оптические изображения образцов (а, 6, в), полученных методом термического разложения капель аэрозоля аммиачного комплекса серебра в мягких условиях. Позициями на фигурах обозначены различные моменты времени: а - 1.5 мин, 6-5 мин, в - 20 мин; РЭМ-изображения образцов (г, д, е), полученных методом термического разложения капель аэрозоля аммиачного комплекса серебра в мягких условиях, позициями на фигурах обозначены различные моменты времени: г - 1.5 мин, д - 5 мин, е - 20 мин.

На фиг. 3 представлена оптическая фотография поперечного среза оптического планарного ГКР-сенсора. Позициями на фигурах обозначены: 7 - поверхность слоя полиэлектролита, 6 - наноструктурированный слой серебра, 5 - поверхность стеклянной подложки.

На фиг. 4 представлены спектры ГКР фонового сигнала оптических планарных ГКР-сенсоров с микропористыми слоями из различных полиэлектролитов. Позициями на фигурах обозначены: 8 - без слоя полиэлектролита, и со слоем полиэлектролита: 9 - хитозана, 10 - альгината, 11 - поли(4-стирол)сульфоновой кислоты (ПССК), 12 - полиакриловой кислоты с м.м. 18 кДа (ПАК1), 13 - полиакриловой кислоты с м.м. 450 кДа (ПАК2), 14 - альбумин, с использованием 10% от номинальной величины лазерного излучения (облучении сенсора в течение 10 с) с длинами волн: а - 633 нм, 6-514 нм.

На фиг. 5 представлены спектры ГКР 5×10-6 М раствора цитохрома С на поверхности оптических планарных ГКР-сенсоров. Позициями на фигурах обозначены: а - без слоя полиэлектролита, б - со слоем ПАК2 (полученного из 0.25% раствора ПАК2), для растворов с различной ионной силой: 15 - 0, 16 - 0.025 М, 17 - 0.05 М, 18 - 0.1 М, 19 - 0.5 М.

На фиг. 6 представлены спектры ГКР 1×10-9 М раствора цитохрома С на поверхности оптических планарных ГКР-сенсоров. Позициями на фигурах обозначены слои различных полиэлектролитов: 13 - ПАК2, 9 - хитозан, 10 - альгинат (полученные из 0.1% раствора поэлектролитов), 8 - без слоя полиэлектролита.

На фиг. 7 представлены спектры ГКР 5×10-6 М раствора гемоглобина на поверхности оптических планарных ГКР-сенсоров. Позициями на фигурах обозначены используемые полиэлектролиты: 8 - без полиэлектролитного слоя, 13 - ПАК2, 10 - альгинат (полученные из 2.0% раствора поэлектролитов), 9 - хитозан.

Осуществление изобретения

Представленные ниже примеры конкретного осуществления изобретения приведены для предоставления специалистам в данной области техники полного описания проведения и применения анализа по изобретению, но не ограничивают предполагаемый авторами изобретения объем изобретения.

Все приведенные ниже реагенты являются коммерчески доступными. Все процедуры, если не оговорено особо, осуществляли при комнатной температуре или температуре окружающей среды, то есть в диапазоне от 18 до 25°С; в ходе всех экспериментов для приготовления водных растворов и промывки суспензий использовали деионизированную воду высокой чистоты, очищенную с использованием установки «Milli-Q», «Milliporе»; спектры ГКР зарегистрированы на КР-спектрометре «Renishaw inVia Reflex» с фокусным расстоянием 250 мм, размером пятна лазера 1 - 300 мкм, при этом все спектры ГКР сняты с использованием 20 × -ного объектива и с временем экстинкции 10 с, юстировку прибора проводили с использованием монокристаллических пластин кремния в качестве стандарта; оптические фотографии снимались на конфокальном микроскопе «Leica DMLM» с разрешением до 2.5 мкм; разделение неоднородных систем проводилось с помощью центрифуги «Centrifuge 5804», «Eppendorf»; для фильтрования использовали насосный фильтр «MillexLCR» («Millipore», с порами 450 мкм); взвешивание препаратов проводили с точностью ± 0.02 мг на аналитических весах «Discovery», «OHAUS»; точные объемы жидкостей отбирали с использованием автоматических дозаторов «Eppendorf» с диапазонами объемов: 2 - 20, 10 - 100, 20 - 200, 100 - 1000 и 500 - 5000 мкл; гомогенизацию неоднородных систем ультразвуковым облучением проводили в УЗ-ванне «Elmasonic Р», «Еlmа», механическую гомогенизацию неоднородных систем проводили с использованием или мини-ротатора «Bio RS-24», «BioSan», или планетарной мельницы «PULVERISETTE», «FRITSCH», или магнитной мешалки «RCT basic», «IKA» с возможностью подогрева.

Заявляемый сенсор состоит из трех ключевых компонентов: 1) подложки на основе диэлектрического химически инертного материала до образования поверхности с шероховатостью 1-10 мкм; 2) наноструктурированного покрытия на основе наночастиц благородного металла; 3) микропористого слоя полиэлектролита до толщины 50-100 мкм, способного удерживать анализируемое вещество и электростатически связываться с ним путем формирования полиэлектролитного комплекса (фиг. 1).

Пример 1. Планарный оптический ГКР-сенсор с биопротектирующим полиэлектролитным слоем для анализа белковых соединений.

Планарный оптический ГКР-сенсор представляет собой нанесенное на стеклянную подложку наноструктурированного покрытия на основе наночастиц серебра до толщины не более 10 мкм, что осуществляют следующим образом: 30 мл 0.1 М водного раствора гидроксида натрия («Aldrich», NaOH) добавляют по каплям в 30 мл свежеприготовленный 0.02 М водный раствор нитрата серебра («Sigma Aldrich», AgNO3) до полного осаждения коричневого осадка - оксида серебра (I). Полученный осадок трижды тщательно промывают водой. Далее надосадочный раствор отделяют декантацией, к полученному осадку добавляют 30 мл воды, механически гомогенизируют посредством многократных интенсивных встряхиваний, дают осесть в течение 30 мин. Раствор над осадком сливают и полученный осадок растворяют в 3 мл 10% водного раствора аммиака (полученного из 30% водного раствора гидроксида аммония, «Aldrich»). Затем прозрачный раствор аммиачного комплекса серебра фильтруют через сменный мембранный фильтр «Millex-LCR» («Millipore», размер пор 450 нм). Далее производят осаждение аэрозоля диаммиаката оксида серебра (I), при температуре 200-300°С и с помощью ультразвукового нейбулайзера распыляют полученный раствор аммиачного комплекса оксида серебра (I) (размер капели 1-5 мкм) на разогретые до 200-270°С чистые и сухие стеклянные пластинки в течение 5-30 мин с последующим контролем толщин металлического слоя с помощью оптической микроскопии (фиг. 2). Влияние толщины покрытия на основе наночастиц серебра на получение сенсора приведены в табл. 1 и подтверждают, что заявляемые пределы 1-10 мкм являются необходимым условием изготовления ГКР-сенсора.

На следующей стадии проводят процедуру покрытия наноструктурированной поверхности слоем полиэлектролита. При выборе полиэлектролита руководствуются зарядом исследуемого белка: выбирают поликатион в случае, если белок находится в анионной форме; или полианион в случае, если белок в катионной форме. Следовательно, в качестве полиэлектролита, выбирается соединение с изоэлектрической точкой больше 7.0 для детектирования белковых соединений с изоэлектрической точкой меньше 7.0, и наоборот. В качестве полианионного соединения используют соединение из ряда: полиакриловая кислота, натриевая соль альгиновой кислоты, натриевая соль сополимера 4-стиролсулфоновой и малеиновых кислот, полистиролсульфокислота или полиакриламид; в качестве поликатионного соединения - альбумин, полиаллиламин или хитозан. В качестве подходящего полимера может рассматриваться любой из ряда прозрачных в области 300-800 нм. Взаимодействие поликатион-полианион с образованием поилектролитного комплекса приводит к возможности количественного высокоточного определения белковых соединений, а в случае взаимодействий типа поликатион-поликатион или полианион-полианион сигнал также будет наблюдаться, но определение будет возможно лишь на качественном уровне для белковых соединений, присутствующих в больших концентрациях порядка 10-3-10-2 М.

Нанесение 50-100 мкм слоя полиэлектролита на поверхность стеклянных пластин проводят следующим образом: на металлическую поверхность наноструктурированного покрытия площадью 4×4 мм2 наносят водный раствор полиэлектролита в количестве 10-20 мкл с концентрацией 0.1-2.0%. Высушивание проводят на воздухе не менее двух часов, после чего полученные структуры используют в качестве планарных оптических сенсоров (фиг. 3). При этом предложенный микропористый слой полиэлектролита на наноструктурированной металлической поверхности не имеет фоновых мешающих сигналов на спектрах ГКР (фиг. 4). Выбор в качестве подложки любой другой на основе диэлектрического химически инертного материала, в частности наиболее распространенных для этой цели материалов, таких как оксид алюминия, оксид магния, диоксид кремния, диоксид циркония, существенно не изменит эффект.

Способ анализа белковых соединений с помощью оптического сенсора, описанного в заявляемом изобретении включает нанесение на планарный оптический сенсор водной пробы или белкового соединения, растворенного в органическом растворителе (например, ацетонитриле, диметилформамиде, диметилсульфоксиде и др.), с исследуемым соединением, детектирование образующегося полиэлектролитного комплекса с помощью спектроскопии гигантского комбинационного рассеяния (ГКР) с использованием стандартных лазеров, выбор которых должен соответствовать положению полос поглощения связей исследуемого белкового соединения, с последующей расшифровкой характеристических колебаний анализируемых соединений на спектрах ГКР.

Для детектирования анализируемых веществ с концентрациями 10-9-10-2 М используют жидкие пробы объемом 15-30 мкл путем их накалывания на поверхность сенсора. Для обеспечения высокой скорости анализа при большом отношении сигнал / шум и отсутствии появления ложной спектральной информации, мощность лазерного излучения не превышала 10% от номинальной величины при продолжительности набора спектров аналитов (белковых соединений) в составе межмолекулярного комплекса не более 10 с. Превышение данных параметров может привести к фотоповреждению образца.

Пример 2. Способ анализа цитохрома С (с изоэлектрической точкой 9.0), положительно заряженного в растворах с нейтральной кислотностью (рН 7.0), с концентрацией в интервале 10-9-10-5 М с использованием в качестве полимера полиакриловой кислоты для модификации металлической поверхности сенсора.

Для анализа цитохрома С, используют планарный оптический сенсор, содержащий в качестве полиэлектролита, способного удерживать анализируемое вещество и электростатически связываться с ним путем формирования полиэлектролитного комплекса, полиакриловую кислоту с молекулярной массой 450 кДа - полианион, поскольку цитохром С в нейтральной среде заряжен положительно (изоэлектрическая точка - 10.0). Рабочая площадь элемента сенсора составляет 4×4 мм2. Раствор, содержащий определяемое белковое соединение, объемом 30 мкл наносят путем накалывания на поверхность сенсора. Детектирование полученного комплекса методом спектроскопии ГКР проводят с использованием лазера с длиной волны 514 нм (фиг. 5). Мощность лазерного излучения составляет 10% от номинальной величины при продолжительности набора цитохрома С в составе межмолекулярного комплекса 10 с. В предлагаемом примере удается предконцентрировать и селективно связывать белковое соединение в слое полиэлектролита, а затем обнаруживать цитохром С с повышенным коэффициентом усиления за счет оптических явлений, поскольку молекула цитохрома С удерживается близко к поверхности металла. О количественном содержании цитохрома С судят по градуировочным зависимостям (табл. 2).

Градуировочный график строится в координатах концентрация белкового соединения - площадь характеристического пика. В диапазоне определяемых концентраций (ДОК) соблюдается линейная зависимость между площадью пика на спектрах и концентрацией белкового соединения. Прямолинейность графика сохраняется только в интервале ДОК, указанных в табл. 2. Нахождение значение концентраций белкового соединения в испытуемом растворе по градуировочным зависимостям ниже и выше ДОК возможно, но не рекомендуется из-за большой погрешности. В целях установления неизвестного содержания белкового соединения в растворе используют уравнение вида S=(а±Δа)×С+(b±Δb), в которое подставляется значение площади измеренного пика (S), и вычисляется концентрация определяемого соединения (С).

Таблица 2. Метрологические характеристики (с количеством параллельных измерений n=3 и доверительной вероятностью Р=0.95) количественного определения цитохрома С, гемоглобина, миоглобина и каталазы на серебряной наноструктурированной подложке и полимерной подложке методом спектроскопии ГКР по площадям характеристических сигналов 1580, 1373, 1456 и 1781 см-1, соответственно

Пример 3. Способ анализа цитохрома С (с изоэлектрической точкой 9.0), положительно заряженного в растворах с нейтральной кислотностью (рН 7.0), с концентрацией в интервале 10-9-10-5 М с использованием, в качестве полиэлектролита для микропористого слоя, альгината натрия на наноструктурированной металлической поверхности сенсора.

Анализ проводился аналогично примеру 2 с отличием в том, что в качестве полиэлектролита использовали альгинат натрия (фиг. 6).

Пример 4 . Способ анализа гемоглобина (с изоэлектрической точкой 6.8), отрицательно заряженного в растворах с нейтральной кислотностью (рН 7.0), с концентрацией в интервале 10-9-10-5 М с использованием, в качестве полиэлектролита для микропористого слоя, хитозана на наноструктурированной металлической поверхности сенсора.

Анализ проводился аналогично примеру 2 с отличием в том, что в качестве полиэлектролитного слоя использовали слой хитозана, а в качестве детектируемого белкового соединения исследовали гемоглобин (фиг. 7). О количественном содержании гемоглобина судят по градуировочным зависимостям (табл. 2) аналогично примеру 1.

Пример 5 . Способ анализа миоглобина (с изоэлектрической точкой 7.29), положительно заряженного в растворах с нейтральной кислотностью (рН 7.0), с концентрацией в интервале 10-9-10-5 М с использованием в качестве полиэлектролита натриевой соли сополимера 4-стиролсульфоновой и малеиновой кислот для модификации металлической поверхности сенсора.

Анализ проводился аналогично примеру 1 с отличием в том, что в качестве полиэлектролитного слоя использовали слой натриевой соли сополимера 4-стиролсульфоновой и малеиновой кислот, а в качестве детектируемого белкового соединения исследовали миоглобин. О количественном содержании миоглобина судят по градуировочным зависимостям (табл. 2) аналогично примеру 1.

Пример 6. Способ анализа каталаза (с изоэлектрической точкой 6.89), отрицательно заряженного в растворах с нейтральной кислотностью (рН 7.0), с концентрацией в интервале 10-9-10-5 М с использованием, в качестве полиэлектролита для микропористого слоя, полиаллиламина на наноструктурированной металлической поверхности сенсора.

Анализ проводился аналогично примеру 2 с отличием в том, что в качестве полиэлектролитного слоя использовали слой полиаллиламина, а в качестве детектируемого белкового соединения исследовали каталазу. О количественном содержании гемоглобина судят по градуировочным зависимостям (табл. 2) аналогично примеру 1.

Как видно из приведенных примеров, в то время как известные способы давали возможность невоспроизводимого определения лишь отдельных белковых соединений за достаточно продолжительное время анализа, составлявшее в ряде случаев до нескольких часов с использованием дорогостоящего и громоздкого оборудования, заявляемая нами группа изобретений позволяет предконцентрировать и селективно связывать анализируемое вещество, обнаруживать белковые соединения за счет оптических явлений. При этом также стоит отметить несущественный расход благородного металла за счет минимизации рабочей площади элемента сенсора до менее, чем 4×4 мм2, что приводит к уменьшению себестоимости сенсора.

Для детектирования белковых соединений, присутствующих в пробе на уровне концентраций 10-9-10-2 М, предпочтительно использовать жидкие пробы объемом 10-50 мкл путем их накалывания на поверхность сенсора для более эффективного предконцентрирования белковых соединений на рабочей поверхности оптического ГКР-сенсора.

Для обеспечения высокой эксперессности анализа при высоком отношении сигнал / шум и отсутствии появления ложной спектральной информации, мощность лазерного излучения не должна превышать 10% от номинальной величины при продолжительности набора спектров белковых соединений в составе полиэлектролитного комплекса не более 10 с. При этом для проведения анализа используют лазерное излучение с длиной волны 514, или 532, или 633, или 785 нм, или 1064 нм.

Для проведения анализа помимо стационарных КР-спектрометров возможно использование портативных приборов с вышеперечисленными длинами волн для регистрации спектров ГКР. Таким образом, предлагаемое техническое решение эффективно для использования в целях мобильного высокочувствительного и высокоточного входного контроля и идентификации белковых соединений, ускоренного контроля образцов биологических жидкостей, для окончательного контроля и диагностики как в лабораторных, так и в «полевых» условиях.

Анализ общеизвестных источников информации показал, что планарный оптический ГКР-сенсор на основе наночастиц благородных металлов с биопротектирующим микропористым слоем полиэлектролита, позволяющим предконцентрировать и связывать белковые соединения путем формирования полиэлектролитного комплекса, для детектирования и определения белковых соединений методом спектроскопии гигантского комбинационного рассеяния, не известен.

1. Планарный оптический ГКР-сенсор для детектирования белковых соединений, характеризующийся тем, что включает последовательно расположенные на подложке на основе диэлектрического химически инертного материала наноструктурированное покрытие на основе наночастиц благородных металлов и прозрачный микропористый слой полиэлектролита, характеризующийся способностью/возможностью образовывать полиэлектролитный комплекс с белковыми соединениями, при этом наночастицы благородных металлов имеют размеры 20-90 нм, наноструктурированное покрытие из них выполнено толщиной 1-10 мкм, а слой полиэлектролита выполнен толщиной 50-100 мкм.

2. Сенсор по п. 1, характеризующийся тем, что в качестве диэлектрического химически инертного материала используют материал, выбранный из ряда: оксид алюминия, оксид магния, диоксид кремния, диоксид циркония, силикатное стекло.

3. Сенсор по п. 1, характеризующийся тем, что в качестве благородного металла используют серебро или золото.

4. Сенсор по п. 1, характеризующийся тем, что в качестве полиэлектролита используют прозрачные в области длин волн 300-800 нм соединения: полиакриловая кислота, натриевая соль альгиновой кислоты, хитозан, натриевая соль сополимера 4-стиролсульфоновой и малеиновой кислот, полистиролсульфокислота, полиаллиламин или полиакриламид

5. Сенсор по п. 4, характеризующийся тем, что полиэлектролитный слой выполнен из водного раствора соединений по п. 4 с концентрацией 0.1-2 мас.%, нанесенного в количестве 10-20 мкл на 1 см2 нанострукурированной поверхности благородного металла, с последующей сушкой.

6. Способ анализа белковых соединений в пробе, характеризующийся тем, что на планарный твердофазный оптический сенсор по п. 1 наносят жидкую пробу с исследуемым соединением с последующим детектированием полученного полиэлектролитного комплекса белкового соединения в полиэлектролитном слое методом спектроскопии гигантского комбинационного рассеяния, при этом о качественном и количественном содержании белковых соединений судят по положению и интенсивности полос на регистрируемых спектрах.

7. Способ по п. 6, характеризующийся тем, что для качественного и количественного анализа используют пробы объемом 15-30 мкл.

8. Способ по п. 6, характеризующийся тем, что для детектирования пробу облучают лазерным излучением с длиной волны 514, или 532, или 633, или 785 нм, или 1064 нм и мощностью, не превышающей 10% от номинальной величины излучения, в течение до 10 секунд.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к способам анализа элементного состава веществ. Способ определения элементного состава капельных жидкостей включает: возбуждение плазменного разряда, доставку в зону разряда частиц анализируемой жидкости, регистрацию и обработку спектров излучения анализируемой жидкости, причем возбуждение плазменного разряда проводят при атмосферном давлении, основными носителями заряда в плазме являются электроны, генерируемые катодом плазменной горелки или каким-либо другим источником заряженных элементарных частиц.

Изобретение относится к области измерительной техники. Анализатор состава природного газа содержит непрерывный лазер, фокусирующую линзу, газовую кювету с входным и боковым окном, фотообъектив, голографический фильтр, спектральный прибор, сопряженный с ПЗС-матрицей, и блок управления, взаимодействующий с ПЗС-матрицей.

Изобретение относится к измерительной технике и может быть использовано для проведения качественного и количественного анализа газовых сред. Лазерный газоанализатор содержит непрерывный лазер, фокусирующую линзу, газовую кювету с входным окном для ввода лазерного излучения и окном для вывода рассеянного излучения под углом 90°, фотообъектив, голографический фильтр, спектральный прибор, сопряженный с ПЗС-матрицей, и блок управления.

Изобретение относится к медицине, а именно к терапии и кардиологии, и может быть использовано для диагностики ишемической болезни сердца. Ткань ногтевых пластин с пятых пальцев кистей правой и левой рук возбуждают линейно поляризованным лазерным излучением длиной волны 532 нм.

Изобретение относится к способу определения компонента в сепарационном блоке, расположенном ниже по потоку относительно реактора получения уксусной кислоты, включающему (i) подачу сырьевого потока в ректификационную колонну для перегонки низкокипящих фракций, где сырьевой поток содержит следующие компоненты: йодистый метил, воду, метанол, метилацетат, ацетальдегид, уксусную кислоту, алканы и пропионовую кислоту, (ii) разделение с помощью ректификационной колонны для перегонки низкокипящих фракций сырьевого потока на первый погон выходящего потока и выходящий поток кубового остатка, где первый погон выходящего потока содержит следующие компоненты: от 30% мас.

Изобретение относится к переносным устройствам для экспресс-оценки оптических характеристик растений на определенных волновых числах, закономерное изменение амплитуды которых является признаком влияния водорода, и может применяться для выявления зон эманации водорода за счет использования растений в качестве биоиндикаторов.

Изобретение относится к способу получения винилацетата, где указанный способ включает: (а) взаимодействие в реакторе (i) от 65 до 80 мол.% этилена, (ii) от 10 до 25 мол.% уксусной кислоты и (iii) от 5 до 15 мол.% кислородсодержащего газа в присутствии палладиево-золотого катализатора с получением винилацетата; (b) выведение из реактора газового потока, содержащего этилен, уксусную кислоту, винилацетат, воду и диоксид углерода; (c) разделение газового потока на поток этилена, включающий этилен и диоксид углерода, и первичный поток винилацетата, включающий винилацетат, воду и уксусную кислоту; (d) разделение потока этилена на поток регенерированного этилена и поток диоксида углерода; (e) разделение первичного потока винилацетата на поток винилацетата и поток регенерированной уксусной кислоты; (f) повторную подачу в реактор на стадию (а) потока регенерированного этилена со стадии (d) и потока регенерированной уксусной кислоты со стадии (е); (g) измерение концентрации компонентов, принимающих участие или связанных с одной или несколькими из перечисленных выше стадий, с помощью спектроскопии комбинационного рассеяния, где данная стадия измерения включает стадию идентификации сдвигов комбинационного рассеяния и интенсивностей сигналов компонентов, принимающих участие или связанных с одной или несколькими из перечисленных выше стадий; и (h) регулирование условий в реакторе или в любой из последующих стадий в соответствии с измеренными концентрациями компонентов для осуществления надлежащего управления реакцией или любой из последующих стадий.

Изобретение относится к области измерительной техники, а именно к спектроскопии комбинационного рассеяния света, и может быть использовано для проведения качественного и количественного анализа газовых сред.

Изобретение относится к области оптико-физических методов измерений и касается способа и устройства для обнаружения и идентификации химических веществ и объектов органического происхождения.

Изобретение относится к области исследования свойств вещества оптическими средствами и касается анализатора комбинационного рассеяния. Анализатор включает в себя расщепитель оптического пучка, фильтр на атомных парах, прерыватель и фотодетектор.

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности и представляет собой способ получения препарата для МРТ-диагностики опухолевых заболеваний, включающий приготовление раствора ацетилацетоната железа (III) в бензиловом спирте с концентрацией 75-200 г/л с последующим нагревом в токе инертного газа до температуры кипения бензилового спирта в течение 4-8 часов и кипячением раствора от 30 мин до 4 часов с получением суспензии, после чего суспензию охлаждают, промывают полярным органическим растворителем с получением наночастиц оксида железа Fe3O4, которые затем покрывают человеческим сывороточным альбумином и/или бычьим сывороточным альбумином, и полученное покрытие стабилизируют межмолекулярной сшивкой глутаровым альдегидом.
Изобретение относится к пищевой промышленности. Способ производства мороженого с экстрактом аралии маньчжурской включает введение в процессе производства в получаемый продукт наноструктурированной добавки, включающей экстракт аралии маньчжурской в альгинате натрия, или наноструктурированной добавки, включающей экстракт аралии маньчжурской в конжаковой камеди, или наноструктурированной добавки, включающей экстракт аралии маньчжурской в каррагинане, или наноструктурированной добавки, включающей экстракт аралии маньчжурской в натрий карбоксиметилцеллюлозе, или наноструктурированной добавки, включающей экстракт аралии маньчжурской в ксантановой камеди, или наноструктурированной добавки, включающей экстракт аралии маньчжурской в геллановой камеди, или наноструктурированной добавки, включающей экстракт аралии маньчжурской в агар-агаре, или наноструктурированной добавки, включающей экстракт аралии маньчжурской в высоко- или низкоэтерифицированном яблочном или цитрусовом пектине из расчета 1 г наноструктурированной добавки на 1000 г готового мороженого.
Изобретение относится к медицине, а именно к хирургии, и может быть использовано для предупреждения образования острых жидкостных скоплений при хирургическом лечении больших послеоперационных грыж передней брюшной стенки с использованием сетчатых имплантов.
Изобретение относится к пищевой промышленности. Способ производства шоколадного мороженого с сухим экстрактом шпината предусматривает внесение в процессе производства в получаемый продукт шоколада 72%-ного какао и наноструктурированной добавки, включающей сухой экстракт шпината в альгинате натрия, или наноструктурированного сухого экстракта шпината в натрий карбоксиметилцеллюлозе из расчета 1,5 г наноструктурированной добавки на 1000 г готового мороженого.

Использование: для создания планарных структур. Сущность изобретения заключается в том, что способ формирования планарных серебряных структур на поверхности кремниевых пластин включает осаждение металлических частиц, которое происходит за счет локальной диссоциации соли серебра, индуцированной при приложении отрицательной разницы потенциалов между проводящей иглой атомно-силового микроскопа и поверхностью образца, на которой происходит формирование рельефа, для этого поверхность кремниевой пластины предварительно очищают и насыщают солями серебра, после чего размещают на электропроводящей подложке, игла АСМ двигается с частотой от 0,16 до 1,12 Гц при разности потенциалов от -7 до -12 В, при комнатной температуре и нормальной влажности, что позволяет формировать рельеф с топологией заданной траекторией движении иглы с шириной от 40 до 200 нм, высотой от 2 до 40 нм.
Изобретение относится к области нанотехнологий. Нанокомпозитный материал с биологической активностью включает подложку из политетрафторэтилена или полиэтилентерефталата, имеющую наноструктурированную поверхность в результате ее травления потоками ионов тетрафторметана.

Изобретение предназначено для производства гетероэпитаксиальных структур для изготовления светодиодов, фотоприемников, полупроводниковых лазеров, транзисторов и диодов.

Изобретение относится к сельскому хозяйству, а именно к способу повышения продуктивности цыплят-бройлеров при совместном применении внутримышечных инъекций наноформ железа и меди с электрохимически активированным католитом.

Использование: для использования при создании твердотельных лазеров, включая волоконные лазеры, и люминесцентных оптических материалов. Сущность изобретения заключается в том, что оптическая наностеклокерамика с ионами хрома относится к литий-калий-алюмоборатной системе с ионами трехвалентного хрома и имеет следующий состав (мол.%): Li2O 0-15,0; Al2O3 20,0-30,0; K2O 10,0-20,0; B2O3 40,0-60,0; Sb2O3 0-6,0; Cr2O3 0,05-0,2.
Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности и представляет собой способ получения системы для доставки противоопухолевого препарата в клетки опухоли, включающий смешение в присутствии воды модифицированных полимером наночастиц магнетита, эпитаксиально выращенных на наночастицах золота, с органическим соединением, химически связывающимся с наночастицами и обеспечивающим селективное проникновение наночастиц внутрь клеток опухоли, и водным раствором противоопухолевого препарата с последующим отделением полученных модифицированных наночастиц центрифугированием, отличающийся тем, что в качестве модифицированных полимером наночастиц используют наночастицы, полученные путем нагрева до 120°C в атмосфере инертного газа при перемешивании смеси дифенилового эфира, олеиновой кислоты, олеиламина и 1,2-гексадекандиола, введения в смесь пентакарбонила железа, выдерживания полученной смеси с последующим введением раствора, содержащего смесь тригидрата золотохлористоводородной кислоты и олеиламина в дифениловом эфире, предварительно выдержанного в атмосфере инертного газа, повторного нагрева смеси в атмосфере инертного газа от 120°C до 250°-260°C, выдерживания смеси при 250°-260°C в течение 25-30 мин и ее охлаждения до комнатной температуры, проводимыми в атмосфере инертного газа, выдерживания смеси при комнатной температуре в присутствии воздуха, добавления в смесь одноатомного спирта и отделения наночастиц магнетита центрифугированием, с последующей их обработкой раствором полимера, выбранного из группы, включающей триблок-сополимер, состоящий из центрального блока полипропиленгликоля со степенью полимеризации 56 и двух концевых блоков полиэтиленгликоля со степенью полимеризации 101 каждый, 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин-N-[карбокси(полиэтиленгликоль) - 2000] и триблок-сополимер, состоящий из центрального блока полипропиленгликоля со степенью полимеризации 30 и двух концевых блоков полиэтиленгликоля со степенью полимеризации 78 каждый, в органическом растворителе, затем ультразвуком, с последующим удалением растворителя, введением воды, повторной обработкой ультразвуком и отделением модифицированных наночастиц центрифугированием, в качестве противоопухолевого препарата используют доксорубицин, в качестве органического соединения, обеспечивающего селективное проникновение наночастиц внутрь клеток аденокарциномы предстательной железы человека, используют низкомолекулярный лиганд простатического специфического мембранного антигена, причем наночастицы вначале обрабатывают раствором доксорубицина, затем раствором низкомолекулярного лиганда простатического специфического мембранного антигена.

Группа изобретений относится к области технологий материалов, материаловедческих и аналитических исследований. Планарный оптический ГКР-сенсор для детектирования белковых соединений включает последовательно расположенные на подложке на основе диэлектрического химически инертного материала наноструктурированное покрытие на основе наночастиц благородных металлов и прозрачный микропористый слой полиэлектролита, характеризующийся способностьювозможностью образовывать полиэлектролитный комплекс с белковыми соединениями, при этом наночастицы благородных металлов имеют размеры 20-90 нм, наноструктурированное покрытие из них выполнено толщиной 1-10 мкм, а слой полиэлектролита выполнен толщиной 50-100 мкм. Технический результат – детектирование анализируемых белковых соединений с низкими пределами обнаружения методом спектроскопии ГКР. 2 н. и 6 з.п. ф-лы, 7 ил., 2 табл.

Наверх