Препарат цистеиновой протеиназы пшеницы тритикаина-альфа, полученной в растворимой форме, и способ получения препарата



Препарат цистеиновой протеиназы пшеницы тритикаина-альфа, полученной в растворимой форме, и способ получения препарата
Препарат цистеиновой протеиназы пшеницы тритикаина-альфа, полученной в растворимой форме, и способ получения препарата
Препарат цистеиновой протеиназы пшеницы тритикаина-альфа, полученной в растворимой форме, и способ получения препарата
Препарат цистеиновой протеиназы пшеницы тритикаина-альфа, полученной в растворимой форме, и способ получения препарата
Препарат цистеиновой протеиназы пшеницы тритикаина-альфа, полученной в растворимой форме, и способ получения препарата
Препарат цистеиновой протеиназы пшеницы тритикаина-альфа, полученной в растворимой форме, и способ получения препарата
Препарат цистеиновой протеиназы пшеницы тритикаина-альфа, полученной в растворимой форме, и способ получения препарата
Препарат цистеиновой протеиназы пшеницы тритикаина-альфа, полученной в растворимой форме, и способ получения препарата
C12N15/00 - Получение мутаций или генная инженерия; ДНК или РНК, связанные с генной инженерией, векторы, например плазмиды или их выделение, получение или очистка; использование их хозяев (мутанты или микроорганизмы, полученные генной инженерией C12N 1/00,C12N 5/00,C12N 7/00; новые виды растений A01H; разведение растений из тканевых культур A01H 4/00; новые виды животных A01K 67/00; использование лекарственных препаратов, содержащих генетический материал, который включен в клетки живого организма, для лечения генетических заболеваний, для генной терапии A61K 48/00 пептиды вообще C07K)

Владельцы патента RU 2676322:

федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Министерства здравоохранения Российской Федерации (Сеченовский университет) (RU)

Изобретение относится к области молекулярной биологии и биотехнологии и представляет собой биологически активный белковый препарат, обладающий специфической активностью папаин-подобных цистеиновых протеиназ, характеризующийся тем, что представляет собой аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO:2-4, экспрессирующийся в растворимой форме. Изобретение относится также к способу получения биологически активного белкового препарата, где способ включает трансформацию клеток плазмидами, содержащими ДНК, кодирующую белок с аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO: 2-4, культивирование и выделение биологически активного препарата. Изобретение обеспечивает возможность получения препарата тритикаина-альфа с высоким и стабильным выходом, высоким уровнем очистки и функциональной активности. 5 н. и 4 з.п. ф-лы, 8 ил., 7 пр.

 

Изобретение относится к области молекулярной биологии, препаративной биохимии, биотехнологии, биофармакологии, а именно к созданию способов получения рекомбинантных белков семейства цистеиновых протеиназ пшеницы (Triticum aestivum) в растворимой форме и препараты белка тритикаина-альфа, состоящие из фрагмента тритикаина-альфа пшеницы. Изобретение может быть использовано в исследовательских целях для изучения функционирования папаин-подобных цистеиновых протеиназ, а также в медицине для разработки ферментных терапевтических препаратов.

Тритикаины (triticain-α, -β, -γ) - высококонсервативные папаин-подобные цистеиновые эндопротеазы пшеницы, состоящие из сигнального (лидерного) пептида, удаляющегося при активации про-пептидного домена, гранулин-подобного домена [GenBank АВ267407] и каталитического домена с каталитической триадой Cys-His-Asn [1]. Цистеиновые протеиназы распространены в растениях и экспрессируются в их различных органах [2, 3]. Предполагается, что эти ферменты участвуют в стадиеспецифическом расщеплении и пост-трансляционных модификациях запасающих белков [4, 5]. Среди папаин-подобных цистеиновых протеиназ растений наиболее широко изучены ферменты риса и ячменя - оризаины (oryzain-α, -β, -γ) и эндопептидазы ЕРВ (barley cysteine proteinase B-1, -2) [6, 7], однако протеазы пшеницы начали изучать относительно недавно [1, 8].

Основным преимуществом папаин-подобных цистеиновых протеиназ из семян растений на данный момент является их эндопептидазная активность, в частности, глютеназная активность - способность эффективно гидролизовать пептиды глютена (запасного белка пшеницы, состоящего из смеси мономерных глиадинов и полимерных глютенинов) или родственных запасных белков ржи и ячменя. Это свойство растительных ферментов позволяет считать их перспективными объектами при разработке лекарственных средств для борьбы с целиакией. Целиакия (глютеновая энтеропатия) представляет собой комплексное воспалительное заболевание человека, которое развивается при наличии соответствующей генетической предрасположенности в ответ на обогащенные остатками пролина и глутамина пептиды, являющиеся продуктами происходящего в пищеварительном тракте частичного протеолиза глютена [9, 10]. Распространенность глютеновой энтеропатии во взрослой популяции большинства стран мира оценена как 1:100 - 1:250 или 0.5-1% от общей популяции [11]. Доказанной эффективной терапией целиакии является пожизненная строгая безглютеновая диета, позволяющая предотвратить развитие осложнений и исключить клинические симптомы заболевания [12]. Однако главным недостатком безглютеновой диеты является сложность ее соблюдения из-за ее ограничительного характера, обусловленного как высокой стоимостью, так и сложностью подбора глютен-несодержащих продуктов питания.

В связи с этим, исследование и разработка способов получения высокоспецифичных протеиназ, стабильных и активных в присутствии эндогенных ферментов желудочно-кишечного тракта человека (т.е. в месте предполагаемого действия лекарственного препарата на их основе) имеет большое значение в терапевтических целях [13].

Из литературы известен метод получения проэнзимной формы цистеиновой протеиназы ячменя ЕР-В2 (proЕР-В2) в E.coli. [14, 15].

В рамках данного изобретения была выбрана протеиназа пшеницы Triticum aestivum - тритикаин-альфа, т.к. пшеница играет существенную роль как источник питания в России, а значит, наиболее подходящая для разработки отечественных терапевтических препаратов для лечения целиакии.

Молекула полноразмерного тритикаина-альфа состоит из 461 аминокислотного остатка с молекулярным весом 50,4 кДа. Впервые фермент был клонирован и экспрессирован в зародыше и алейроновом слое пшеницы для выяснения его роли в процессе созревания семян [1]. Однако непосредственно белок тритикаин-альфа выделен не был.

Биосинтез рекомбинантного тритикаина-альфа для исследования его протеолитических функций был осуществлен нами ранее [16, 17]. В описанном способе рекомбинантный тритикаин-альфа (фрагмент полноразмерного белка) синтезировался в бактериальных клетках в нерастворимой форме, что требовало включения дополнительной, трудно валидируемой, стадии рефолдинга в процессе выделения целевого белка. Также, полученные препараты обладали меньшей активностью, чем полученные препараты в настоящей заявке, а также обладали меньшим выходом при выделении и меньшей чистотой.

Задачей, решаемой в рамках настоящей заявки, является расширение ассортимента ферментативных препаратов, с потенциалом использования в качестве лекарственного средства, а также разработка эффективного способа получения высокоочищенного и высокоактивного препарата белка с последующим потенциальным применением в промышленных условиях. Существует необходимость разработки усовершенствованных экономически целесообразных технологий получения таких белков с сохранением высокого качества (степень чистоты, выход и активность) препаратов для исследовательских и прикладных целей.

Техническим результатом настоящего изобретения является получение высокоочищенного и высокоактивного препарата фрагмента протеазы пшеницы тритикаина-альфа, состоящего из пропептидного (продомена) и каталитического доменов полноразмерного тритикаина-альфа пшеницы (т.е. без лидерного пептида и гранулин-подобного домена), в растворимой форме с высоким выходом при выделении, для фундаментальных и прикладных исследований (в частности, для использования в составе ферментных терапевтических средств).

Поставленная задача решается следующим образом:

Пример 1. Клонирование усеченных фрагментов гена тритикаина-альфа для бактериальной экспрессии белков в растворимой форме.

На основе известной последовательности мРНК пшеницы (Triticum aestivum), кодирующей полноразмерный ген тритикаина-альфа (GenBank АВ267407), синтезируют комплементарную ДНК (кДНК) с использованием обратной транскриптазы мышиного вируса лейкемии Молони и праймера на 3'-нетранслируемую область мРНК 5'-gggggatccttacgcgctacttttcttgccg. Амплификацию кодирующей транслируемую область гена полноразмерного тритикаина-альфа ДНК, фланкированную сайтами рестрикции NdeI и BamHI (TRIT-α, фиг. 1, SEQ ID NO: 1), проводят с использованием следующих прямого и обратного праймеров: 5'-ccccatatgcatcatcatcatcatcatgccatgaggagctccatggccctc и 5'-gggggatccttacgcgctacttttcttgccg (сайты рестрикции NdeI и BamHI выделены подчеркиванием). Продукт амплификации и плазмидную ДНК рЕТ-42а(+) обрабатывают рестриктазами NdeI и BamHI, соединяют при помощи лигазной реакции, после чего реакционную смесь трансфицируют в компетентные клетки E.coli BL21-CodonPlus(DE3)-RIL. Трансформированные клетки высевают на агаризованную среду LB, содержащую антибиотик (канамицин). Из отобранных методом ПЦР (с помощью универсальных праймеров для рЕТ-векторов) клонов выделяют целевую плазмидную ДНК (pET_TRIT-α). Нуклеотидную последовательность встроенного фрагмента подтверждают секвенированием по Сенгеру. Отобранные клоны наращивают для оценки продуктивности, устойчивости к антибиотикам и стабильности трансформации.

Конструирование новой последовательности ДНК, кодирующей усеченный фрагмент гена тритикаина-альфа (6HIS-Triticain-α-GM, без лидерного пептида и гранулин-подобного домена, с N-концевой полигистидиновой последовательностью, фиг. 2, SEQ ID NO:2) для экспрессии в бактериальной системе, осуществляют на основе плазмидной ДНК pET_TRIT-α в качестве матрицы и праймеров: 5'-tatacatatgtcgatcgtgtcgtacgg (сайт рестрикции NdeI выделен подчеркиванием) и 5'-ttctcgagttagcccgtcttcgtcgg (сайт рестрикции XhoI выделен подчеркиванием). Продукт амплификации клонируют в экспрессионную плазмиду рЕТ-15b (Novagen, Germany) по сайтам рестрикции NdeI и XhoI, используя штамм E.coli Rosetta gami В (DE3). Скрининг колоний проводят методом рестрикционного анализа и последующего секвенирования.

Аналогичным образом осуществляют конструирование новой последовательности ДНК, кодирующей усеченный фрагмент гена тритикаина-альфа (Triticain-α-GM-6HIS), без лидерного пептида и гранулин-подобного домена, с С-концевой полигистидиновой последовательностью, фиг. 3, SEQ ID NO:3), используя следующую пару праймеров: 5'-ataccatggcgctgccggagaccgtcg и 5'-attctcgagtcagtggtggtggtggtggtggcccgtcttcgtcgggt и сайты рестрикции NcoI и XhoI соответственно (выделены подчеркиванием).

Пример 2. Клонирование фрагмента гена тритикаина-альфа для дрожжевой экспрессии белка в растворимой форме.

Конструирование новой последовательности ДНК, кодирующей усеченный фрагмент гена тритикаина-альфа (y-Triticain-α-GM, фиг. 4, SEQ ID NO:4) для экспрессии в дрожжевой системе, осуществляют на основе плазмидной ДНК pET_TRIT-α в качестве матрицы и праймеров: 5'-tgaattctccatcgtgtcgtacggg (сайт рестрикции EcoRI выделен подчеркиванием) и 5'-attgcggccgcttagcccgtcttcgtcgg (сайт рестрикции NotI выделен подчеркиванием). Продукт амплификации клонируют в экспрессионный вектор Pichia pastoris рРIС9 по указанным сайтам, который позволяет получать целевой белок в секретируемом виде за счет сигнальной последовательности (α-фактора, фиг. 4).

Пример 3. Экспрессия фрагмента тритикаина-альфа пшеницы в растворимой форме в E.coli.

Штамм E.coli Rosetta gami В (DE3), трансформированный плазмидой pET15-6HIS-Triticain-α-GM выращивают в среде LB (10 г/л триптон, 5 г/л дрожжевой экстракт, 5 г/л NaCl) при 37°С в аэробных условиях с добавлением ампициллина (до конечной концентрации 50 мг/мл) в течение 12-14 ч (посевной материал), инокулируют новую порцию питательной среды в соотношении 1:50, растят культуру до достижения оптической плотности А600 0.6-0.8, охлаждают во льду в течение 15 мин и индуцируют изопропилтио-β-О-галактозидом (ИПТГ) до конечной концентрации 1 мМ, после чего клетки продолжают инкубировать 20 ч при 18°С. При индукции ИПТГ происходит биосинтез рекомбинантного 6HIS-Triticain-α-GM (SEQ ID NO:2), который накапливается в клетках как в растворимой форме, так и в тельцах включения (фиг. 5). Отбирают пробы клеточной суспензии до и после индукции в количестве, соответствующем 0.1 оптических единиц (о.е.), осаждают центрифугированием, суспендируют в лизирующем буфере (0.03 М Трис-HCl, рН 6.8, 10% глицерин, 1% додецилсульфат натрия, 3% меркаптоэтанол, 0.005% бромфеноловый синий), нагревают 5 мин при 95°С, и образцы объемом 20 мкл анализируют электрофорезом в 12% полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия. Гель прокрашивают кумасси R-250 по стандартной методике и сканируют для определения относительного количества белка в полосе целевого белка (фиг. 5). По данным сканирования содержание рекомбинантного 6HIS-Triticain-α-GM составляет 15-20% от всех клеточных белков.

Аналогичным образом осуществляют экспрессию фрагмента тритикаина-альфа Triticain-α-GM-6HIS (SEQ ID NO:3), используя трансформированные плазмидой pET15-Triticain-α-GM-6HIS клетки штамма Rosetta gami В (DE3). Результат биосинтеза рекомбинантного белка анализируют электрофорезом в 12% полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (фиг. 6). По данным сканирования геля содержание рекомбинантного Triticain-α-GM-6HIS составляет 15-20% от всех клеточных белков, причем целевой белок синтезируется в бактериальных клетках исключительно в растворимой форме.

Пример 4. Получение высокоочищенного препарата рекомбинантного фрагмента тритикаина-альфа из E.coli.

Очистку целевых белков 6HIS-Triticain-α-GM (SEQ ID NO:2) и Triticain-α-GM-6HIS (SEQ ID NO:3) проводят методом аффинной (металл-хелатной) хроматографии. Получение рекомбинантного 6HIS-Triticain-α-GM и Triticain-α-GM-6HIS из клеток штаммов-продуцентов Rosetta gami В (DE3)/pET15-6HIS-Triticain-α-GM и Rosetta gami В (DE3)/pET15-Triticain-α-GM-6HIS соответственно, включает несколько стадий. Осажденную центрифугированием клеточную биомассу экспрессионной культуры ресуспендируют в 0.02 М фосфатном буфере, рН 8.0, содержащем 0.5 М NaCl и 0.01 М имидазол (буфер А), и гомогенизируют на ультразвуковом дезинтеграторе в течение 1 мин (12×5 с) при 4°С. Полученную после центрифугирования лизата (10000×g, 4°С, 15 мин) надосадочную жидкость наносят на колонку с активированной ионами никеля иминодиацетат-сефарозой, уравновешенную буфером А. Процесс хроматографии проводят на системе BioLogic (BioRad) с детекцией при 280 нм. Сорбент последовательно промывают уравновешивающим буфером А. Связавшийся с сорбентом белок элюируют буфером А с содержанием 0.3 М имидазола. Раствор диализуют против 0.02 М фосфатного буфера, рН 8.0 при 4°С в течение 24 ч, трижды производя замену буфера на свежий. Концентрацию целевого белка определяют с помощью ВСА-реагента (бицинхониновой кислоты), аликвотируют по стеклянным флаконам, замораживают и лиофилизуют.

Выход полученных таким способом рекомбинантных вариантов усеченного тритикаина-альфа в растворимой форме составляет не менее 15 мг (15-24 мг) с 1 л для бактериальной культуры Rosetta gami В (DE3)/pET15-6HIS-Triticain-α-GM и не менее 5 мг с 1 л - для Rosetta gami В (DE3)/pET15-Triticain-α-GM-6HIS. Чистота полученных препаратов по данным электрофоретического анализа составляет не менее 85% (фиг. 5, 6; следует отметить, что целевые белки 6HIS-Triticain-α-GM (SEQ ID NO:2) и Triticain-α-GM-6HIS (SEQ ID NO:3), проявляющие протеолитическую активность, подвергаются автопротеолизу в процессе выделения).

Пример 5. Экспрессия фрагмента тритикаина-альфа пшеницы в растворимой форме в P.pastoris.

Для трансформации клеток Pichia pastoris дрожжевой экспрессионной плазмидой pPIC9-Triticain-α-GM был использован ауксотрофный по гистидину штамм Pichia pastoris GS115 (His-, Mut+). Плазмиду pPIC9-Triticain-α-GM линеаризуют по сайту BglII. Трансформацию клеток Pichia pastoris проводят методом электропорации. Клетки штамма GS115 высевают на чашку с агаризованной средой YPD (1% дрожжевой экстракт, 2% пептон, 2% глюкоза) и инкубируют при 30°С 2 дня до появления отдельных колоний. Одной колонией инокулируют 5 мл среды YPD в колбе объемом 50 мл и наращивают клетки в течение ночи при 30°С в шейкер-инкубаторе при 300 об/мин. Далее 200 мл свежей среды YPD засевают 0.2 мл ночной культуры и снова наращивают клетки в течение ночи при 30°С в шейкер-инкубаторе до достижения оптической плотности клеточной суспензии А600 1.5. Клетки осаждают центрифугированием (1500×g, 5 мин, 4°С), осадок дважды промывают 200 мл и 100 мл охлажденной во льду стерильной воды соответственно, после чего клетки снова осаждают и ресуспендируют в 8 мл холодного 1 М сорбита. Затем клетки снова осаждают и ресуспендируют в 0.6 мл ледяного 1 М сорбита. 40 мкл клеточной суспензии смешивают с 5 мкг линеаризованной плазмиды в 10 мкл буфера ТЕ (0.01 М Трис-HCl, 0.001 М ЭДТА, рН 8.0). Смесь помещают в охлажденную 2 мм кювету и охлаждают во льду 5 мин. Затем кювету помещают в отсек шоковой камеры электропоратора и генерируют единичный импульс. Кювету извлекают из камеры и быстро добавляют 1 мл ледяного 1 М сорбита. Содержимое кюветы переносят в стерильные микропробирки. По 100, 300 и 600 мкл клеточной суспензии, трансформированной линеаризованной плазмидой рРIС9-Triticain-α-GM, растирают на чашке Петри с минимальной безгистидиновой агаризованной средой. Для контроля выживаемости по 10 мкл клеточных суспензий после электропорации суспендируют в 100 мкл 1 М сорбита и по 10 мкл растирают на чашках Петри с агаризованной YPD средой. Чашки инкубируют при 30°С до появления колоний (2-4 дня).

В зависимости от способа рекомбинации и локуса встраивания линеаризованной плазмиды трансформированные клетки Pichia pastoris GS115 (Mut+) могут приобретать MutS фенотип. Для подтверждения Mut+ и MutS фенотипов трансформантов колонии высевают на чашки с минимальной агаризованной средой, содержащей метанол и глюкозу (ММ и MD соответственно), подразумевая, что дрожжевые клетки фенотипа MutS делятся в ММ среде медленнее, чем в MD среде (что визуально определяется сравнением размеров колоний на ММ и MD чашках через 2-3 суток инкубации при 30°С). Точную принадлежность дрожжевых трансформантов к Mut+ или MutS фенотипу подтверждают методом полимеразной цепной реакции. Для этого из выбранных клонов с ММ и MD чашек выделяют ДНК и анализируют методом ПЦР с использованием прямого 5'АОХ1 (gactggttccaattgacaagc) и обратного 3'АОХ1 (gcaaatggcattctgacatcc) праймеров при условиях амплификации: 95°С 3 мин, денатурация 95°С 30 с, 30 циклов, отжиг 54°С 30 с, элонгация 72°С 2 мин, затем 72°С 5 мин. Пробы анализируют методом горизонтального электрофореза в 1% агарозном геле с окрашиванием бромистым этидием. По размерам ампликонов ДНК клонов Mut+ и MutS фенотипа (2140 п.н. и 1476 п.н. соответственно) выявляют преобладающий фенотип (Mut+). Полученные трансформанты Pichia pastoris GS115/pPIC9-Triticain-α-GM содержат как минимум одну копию фрагмента гена тритикаина-альфа. По результатам анализа отбирают несколько клонов Mut+ и MutS фенотипов для экспрессии целевого рекомбинантного белка.

Для получения двойных трансформантов линеализированную по сайту рестрикции SalI плазмиду pPIC9K-Triticain-α-GM трансформировали в полученные ранее клетки Pichia pastoris GS 115/pPIC9-Triticain-α-GM (Mut+и MutS). Отбор двойных трансформантов проводили на генетицин-содержащей среде (0,15 мг/мл).

Для исследования способности трансформантов P.pastoris Mut+ и MutS фенотипов секретировать y-Triticain-α-GM (SEQ ID NO:4) одной колонией каждого клона трансформанта и контрольных штаммов со свежих чашек инокулируют 4 мл среды BMGY (1% дрожжевой экстракт, 2% пептон, 1.34% YNB, 4×10-5% биотин, 1% глицерин, 0.1 М фосфат калия, рН 6.0). Клеточную массу наращивают при 30°С в шейкер-инкубаторе при 300 об/мин до достижения А600 1 о.е. (для Mut+) и А600 5 о.е. (для MutS). Для АОХ-контролируемой индуции экспрессии клеточные суспензии в объеме, содержащем 5 о.е. (Mut+) или 25 о.е. (MutS), осаждают центрифугированием и осадки ресуспендируют в 5 мл среды BMMY (1% дрожжевой экстракт, 2% пептон, 1.34%) YNB, 4×10-5% биотин, 0.5% метанол, 0.1 М фосфат калия, рН 6.0). Клетки инкубируют в течение 96 ч при 30°С и 300 об/мин. Каждые 24 ч добавляют метанол до конечной концентрации 0.7%. После окончания инкубации клетки осаждают центрифугированием (4000×g, 5 мин, 4°С). Супернатанты отбирают, замораживают в жидком азоте и хранят при -70°С до последующего анализа. Наличие рекомбинантного y-Triticain-α-GM в супернатантах клеточной культуры P. pastoris определяют методом электрофореза в 14% полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия.

Пример 6. Получение высокоочищенного рекомбинантного y-Triticain-α-GM из Pichia pastoris.

Надосадочную культуральную жидкость Pichia pastoris GS115/pPIC9-Triticain-α-GM фильтруют (0.45 мкм) и диализуют против 0.02 М раствора фосфата натрия, рН 8.0 при 4°С в течение 24 ч, трижды производя замену буфера на свежий. Диализат концентрируют ультрафильтрацией на ячейке Amicon с мембраной RC-10 (Millipore) и наносят на колонку с сорбентом Sephacryl S-200HR, уравновешенную 0.02 М фосфатным буфером, рН 8.0, содержащем 130 мМ NaCl. Процесс гель-фильтрации проводят со скоростью 0,5 мл/мин, фракции по 6 мл собирают и анализируют на присутствие целевого белка методами электрофоретического анализа и определения протеолитической активности. Очищенный белок концентрируют на ячейке Amicon с мембраной RC-10 (Millipore), определяют концентрацию с помощью ВСА-реагента (бицинхониновой кислоты), аликвотируют по стеклянным флаконам, замораживают и лиофилизуют.

Выход полученного таким способом рекомбинантного y-Triticain-α-GM (SEQ ID NO:4) составляет 80-300 мг с 1 л дрожжевой культуры (с чистотой не менее 90% по данным электрофоретического анализа, фиг. 7; следует отметить, что целевой белок y-Triticain-α-GM (SEQ ID NO:4) в процессе секреции подвергается автопротеолизу).

Пример 7. Определение протеолитической активности вариантов рекомбинантных белков усеченного тритикаина-альфа (6HIS-Triticain-α-GM, Triticain-α-GM-6HIS и y-Triticain-α-GM).

Ферментативную (протеолитическую) активность рекомбинантного усеченного тритикаина-альфа определяют по способности гидролизовать синтетический модельный пептидный субстрат PLVQ-AMК, конъюгированный с 7-Амино-4-метилкумарином (АМК), с определением продуктов гидролиза по интенсивности флуоресценции свободного AMK. Последовательность и структура выбранного пептида PLVQ (пролин-лейцин-валин-глутамин), представляющего собой фрагмент глютена, являются оптимальными для связывания и гидролиза тритикаином-альфа [15].

Анализ проводят при 25°С в реакционной смеси, состоящей из 20 нМ целевого белка (рекомбинантного тритикаина-альфа) и 50 мкМ PLVQ-АМК в 200 мМ ацетатном буфере, рН 5.6, содержащем 100 мМ NaCl, 15 мМ 2-меркаптоэтанол, 0.6 мМ ЭДТА, 0.5% ДМСО. Количество гидролизованного субстрата PLVQ-AMK определяют по интенсивности флуоресценции свободного AMK с использованием многорежимного автоматического спектрофлуориметра при длине волны возбуждения флуоресценции, равной 360 нм, и длине волны испускания флуоресценции, равной 460 нм. Скорость реакции определяли по графику зависимости количества субстрата (моль) от времени гидролиза (с) с последующей обработкой полученных данных с применением метода линейной регрессиии. Для репрезентативности данные по специфической активности представлены в виде гистограммы (фиг. 8).

Сравнивали активность полученных препаратов усеченного тритикаина-альфа, полученного в растворимой форме, с препаратами усеченного тритикаина-альфа, полученного ранее в нашей лаборатории в нерастворимой форме и папаином.

Активность белковых препаратов усеченного тритикаина-альфа, полученного в растворимой форме 6HIS-Triticain-α-GM (SEQ ID NO:2) и Triticain-α-GM-6HIS (SEQ ID NO:3) значительно превысила активность препарата усеченного тритикаина-альфа 6HIS-Triticain-α-GM, полученного в нерастворимой форме, а также папаина, что является существенным преимуществом препаратов, полученных нами в рамках данной заявки. Активность препарата усеченного тритикаина-альфа y-Triticain-α-GM (SEQ ID NO:4), полученного в дрожжевой экспрессионной системе, оказалась ниже, чем активность препарата усеченного тритикаина-альфа 6HIS-Triticain-α-GM, полученного в нерастворимой форме, и папаина, однако, принимая во внимание высокое содержание в препарате и высокий выход при экспрессии белка y-Triticain-α-GM, такой результат также является промышленно применимым и технически значимым.

Преимуществами заявленного технического решения являются, во-первых, получение протеолитически активного препарата тритикаина-альфа, состоящего из пропептидного (продомена) и каталитического доменов полноразмерного тритикаина-альфа пшеницы, который может быть использован для создания новых более эффективных лекарственных энзиматических средств, а также в исследовательстких целях, в частности, для изучения функционирования папаин-подобных цистеиновых протеиназ; во-вторых, возможность получения вариантов протеолитически активного тритикаина-альфа в растворимой форме как в бактериальных, так и в дрожжевых клетках; в-третьих, упрощенная методика выделения вариантов рекомбинантного белка из E.coli за счет исключения стадии рефолдинга in vitro, т.е. времязатратной и сложно валидируемой процедуры, что в последствии послужит основой для создания ферментных лекарственных средств в терапии некоторых заболеваний (в частности, целиакии).

Источники информации, принятые во внимание

1. Т. Kiyosaki, Т. Asakura, I. Matsumoto, et al. J Plant Physiol, 2009, 1, 166(1), 101-6.

2. K. Muntz, M.A. Belozersky, Y.E. Dunaevsky, et al. J Exp Bot, 2001, 52, 1741-52.

3. J.Q. Ling, T. Kojima, M. Shiraiwa, et al. Biochim Biophys Acta, 2003, 1627, 129-39.

4. A. Capocchi, M. Cinollo, L. Galleschi, et al. JAgric Food Chem, 2000, 48, 6271-79.

5. T. Okamoto, T. Shimada, I. Hara-Nishimura, et al. Plant Physiol, 2003, 132, 1892-1900.

6. A. Mikkonen, I Porali, M. Cercos, et al. Plant Mol Biol, 1996, 31(2), 239-54.

7. H. Kondo, K. Abe, I. Nishimura, et al. J Biol Chem, 1990, 15, 265(26), 15832-37.

8. T. Kiyosaki, I. Matsumoto, T. Asakura, et al. FEBS J, 2007, 274, 1908-17.

9. N. McGough, J.H. Cummings. Proc Nutr Soc, 2005, 64(4), 434-50.

10. J.S. Leeds, A.D. Hopper, D.S. Sanders. Br Med Bull, 2008, 88(1), 157-70.

11. WGO - OMGE: Practice guidelines. World Gastroenterology News, 10 (2, 2), 2005, 1-8.

12. S. Rashtak, J.A. Murray. Aliment Pharmacol Ther, 2012, 35(7), 768-81.

13. L.V. Savvateeva, A.A. Zamyatnin. Curr Pharm Des, 2016, 22(16), 2439-49.

14. H. Vora, J. McIntire, P. Kumar, et al. Biotechnol Bioeng, 2007, 1, 98(1), 177-85.

15. Патент WO 2008115428 A2, 25.09.2008.

16. L.V. Savvateeva, N.V. Gorokhovets, V.A. Makarov, et al. Int J Biochem Cell Biol, 2015, 62, 115-24.

17. Патент RU 2603054 C2, 20.11.2016.

Подписи к фигурам:

Фиг. 1. Аминокислотная и нуклеотидная последовательности рекомбинантного полноразмерного тритикаина-альфа, экспрессирующегося в E.coli (SEQ ID NO:1, TRIT-α, курсивом выделена последовательность от экспрессионной плазмиды рЕТ-42а(+); курсивом и подчеркиванием выделены сайты узнавания рестриктазами; подчеркиванием выделен лидерный пептид; курсивом и цветом выделена каталитическая триада Cys-His-Asn, определяющая принадлежность белка к цистеиновым протеазам; цветом выделен гранулин-подобный домен; подчеркиванием выделены сайты узнавания рестриктазами);

Фиг. 2. Аминокислотная и нуклеотидная последовательности рекомбинантного усеченного тритикаина-альфа с N-концевой полигистидиновой последовательностью, экспрессирующегося в E.coli в растворимой форме (SEQ ID NO:2, 6HIS-Triticain-α-GM; курсивом выделена последовательность от экспрессионной плазмиды рЕТ-15b; подчеркиванием выделены сайты узнавания рестриктазами; курсивом и цветом выделена каталитическая триада Cys-His-Asn, определяющая принадлежность белка к цистеиновым протеазам);

Фиг. 3. Аминокислотная и нуклеотидная последовательности рекомбинантного усеченного тритикаина-альфа с С-концевой полигистидиновой последовательностью, экспрессирующегося в E.coli в растворимой форме (SEQ ID NO:3, Triticain-α-GM-6HIS; курсивом выделена последовательность от экспрессионной плазмиды рЕТ-15b; подчеркиванием выделены сайты узнавания рестриктазами; курсивом и цветом выделена каталитическая триада Cys-His-Asn, определяющая принадлежность белка к цистеиновым протеазам);

Фиг. 4. Аминокислотная и нуклеотидная последовательности рекомбинантного усеченного тритикаина-альфа, экспрессирующегося в P.pastoris (SEQ ID NO:4, y-Triticain-α-GM; курсивом выделена последовательность от экспрессионной плазмиды рPIС9; цветом выделен α-фактор; стрелкой выделен сигнал отщепления α-фактора; подчеркиванием выделены сайты узнавания рестриктазами);

Фиг. 5. Электрофореграмма в 12% полиакриламидном геле в присутствии SDS: лизатов клеток штамма-продуцента E.coli Rosetta gami B(DE3) / pET15-6HIS-Triticain-α-GM до индукции (дорожка 1), лизатов клеток штамма-продуцента E.coli Rosetta gami B(DE3) / pET15-6HIS-Triticain-α-GM после индукции изопропилтио-β-D-галактозидом (дорожка 2); растворимая клеточная фракция (дорожка 3), нерастворимая клеточная фракция (дорожка 4); рекомбинантный усеченный тритикаин-альфа (SEQ ID NO:2, 6HIS-Triticain-α-GM, дорожка 5) после хроматографического выделения; М - белковые маркеры молекулярной массы (кДа).

Фиг. 6. Электрофореграмма в 12% полиакриламидном геле в присутствии SDS: лизатов клеток штамма-продуцента E.coli Rosetta gami B(DE3) / Triticain-α-GM-6HIS до индукции (дорожка 1), лизатов клеток штамма-продуцента E.coli Rosetta gami B(DE3) / Triticain-α-GM-6HIS после индукции изопропилтио-β-D-галактозидом (дорожка 2); растворимая клеточная фракция (дорожка 3), нерастворимая клеточная фракция (дорожка 4); рекомбинантный усеченный тритикаин-альфа (SEQ ID NO:3, Triticain-α-GM-6HIS, дорожка 5) после хроматографического выделения; М - белковые маркеры молекулярной массы (кДа).

Фиг. 7. Рекомбинантный усеченный тритикаин-альфа (SEQ ID NO:4, y-Triticain-α-GM, экспрессированный в клетках P.pastoris) после хроматографического выделения в 14% полиакриламидном геле в присутствии SDS (М - белковые маркеры молекулярной массы, кДа); (М - белковые маркеры молекулярной массы, кДа);

Фиг. 8. Специфическая (протеолитическая) активность вариантов рекомбинантных белков усеченного тритикаина-альфа и папаина (как контроля цистеиновых папаин-подобных протеиназ): 1 - папаин; 2 - рекомбинантный фрагмент тритикаин-альфа из нерастворимой фракции; 3 - усеченный тритикаин-альфа, экспрессированный в клетках P.pastoris (SEQ ID NO:4, y-Triticain-α-GM); 4 - усеченный тритикаин-альфа с N-концевой полигистидиновой последовательностью (SEQ ID NO:2, 6HIS-Triticain-α-GM); 5 - усеченный тритикаин-альфа с С-концевой полигистидиновой последовательностью (SEQ ID NO:3, Triticain-α-GM-6HIS).

1. Биологически активный белковый препарат, обладающий специфической активностью папаин-подобных цистеиновых протеиназ, характеризующийся тем, что представляет собой аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO:2-4, экспрессирующийся в растворимой форме.

2. Способ получения биологически активного белкового препарата по п. 1, обладающего специфической активностью папаин-подобных цистеиновых протеиназ, характеризующийся тем, что включает трансформацию клеток плазмидами, содержащими ДНК, кодирующую белок с аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO: 2-4, культивирование и выделение биологически активного препарата.

3. Способ по п. 2, характеризующийся тем, что для трансформации плазмидами, содержащими последовательности ДНК, кодирующие белки с аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO:2-3, используют клетки E.coli штамма Rosetta gami В (DE3), в качестве среды культивирования используют среду LB с добавлением ампициллина и инкубируют при 37°С в аэробных условиях в течение 12-14 ч, посевным материалом инокулируют питательную среду, растят культуру до достижения оптической плотности А600 0.6-0.8, индуцируют 1 мМ изопропилтио-β-D-галактозидом и растят еще 20 ч при 18°С с накоплением растворимой формы белка, а выделение биологически активного препарата осуществляют осаждением путем центрифугирования экспрессионной культуры, после чего осадок ресуспендируют в 0.02 М фосфатном буфере, рН 8.0, содержащем 0.5 М NaCl и 0.01 М имидазол (буфер А), и гомогенизируют на ультразвуковом дезинтеграторе в течение 1 мин при 4°С, полученный лизат центрифугируют, надосадочную жидкость наносят на колонку с активированной ионами никеля иминодиацетат-сефарозой, уравновешенную буфером А, сорбент последовательно промывают уравновешивающим буфером А, затем белок элюируют буфером А с содержанием G.3 М имидазола, далее раствор белка диализуют против 0.02 М фосфатного буфера, рН 8.0 и после определения концентрации и протеолитической активности белка в полученном препарате аликвотируют по стеклянным флаконам, замораживают и лиофилизуют.

4. Способ по п. 2, характеризующийся тем, что для трансформации плазмидой, содержащей последовательность ДНК, кодирующую белок с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:4, используют клетки P.pastoris штамма GS115, в качестве среды культивирования используют среду YPD и инкубируют при 30°С в шейкере-инкубаторе до достижения оптической плотности А600 1-5, клеточные суспензии растирают на чашке Петри с минимальной безгистидиновой агаризованной средой и инкубируют при 30°С до появления колоний, затем одной колонией полученных трансформантов Pichia pastoris GS115/pPIC9-Triticain-α-GM, содержащих одну или две копии фрагмента гена усеченного тритикаина-альфа, инокулируют питательную среду BMGY и наращивают клеточную массу при 30°С в шейкере-инкубаторе до оптической плотности 5 о.е. (Mut+) или 25 о.е. (MutS), выделение биологически активного препарата осуществляют осаждением путем центрифугирования, полученный осадок ресуспендируют в среде BMMY с последующим инкубированием в течение 96 ч при 30°С и 300 об/мин, добавляя каждые 24 ч в качестве индуктора экспрессии метанол до конечной концентрации 0.7%, затем клетки осаждают, отбирают супернатанты; далее надосадочную культуральную жидкость фильтруют (0.45 мкм) и диализуют против 0.02 М раствора фосфата натрия, рН 8.0 при 4°С в течение 24 ч, диализат концентрируют и наносят на колонку с сорбентом Sephacryl S-200HR, уравновешенную 0.02 М фосфатным буфером, рН 8.0, содержащим 130 мМ NaCl, далее собирают белковые фракции по 6 мл и анализируют на присутствие белка методами электрофоретического анализа и определяют концентрацию и протеолитическую активность, далее биологически активный белковый препарат аликвотируют по стеклянным флаконам, замораживают и лиофилизуют.

5. Нуклеиновая кислота, кодирующая биологически активный белковый препарат, обладающий специфической активностью папаин-подобных цистеиновых протеиназ, по п. 1, характеризующаяся тем, что предназначена для использования в способе по п. 2.

6. Вектор экспрессии, характеризующийся тем, что содержит нуклеиновую кислоту по п. 5 для использования в способе по п. 2.

7. Вектор экспрессии по п. 6, характеризующийся тем, что представляет собой вектор на основе pET15b или pPIC9.

8. Клетка-хозяин, характеризующаяся тем, что содержит нуклеиновую кислоту по п. 5, кодирующую биологически активный белковый препарат по п. 1, для использования в способе по п. 2.

9. Клетка-хозяин по п. 8, характеризующаяся тем, что представляет собой клетку E.coli штамма Rosetta gami В (DE3) или P.pastoris штамма GS115.



 

Похожие патенты:

Группа изобретений относится к области биотехнологии. Предложен способ получения L-метионина, путем ферментации микроорганизма семейства Enterobacteriaceae, в котором ослаблен ген proP таким образом, что активность или концентрация этого белка снижается на величину от 0 до 75% активности или концентрации соответствующего белка в нерекомбинантном микроорганизме.

Группа изобретений относится к микроорганизму для продуцирования диамина, а также способу получения диамина с использованием указанного микроорганизма. В предложенном микроорганизме активность белка, имеющего аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 22 и SEQ ID NO: 24, или белка, обладающего диамин-экспортирующей активностью и имеющего аминокислотную последовательность, имеющую гомологию последовательности с SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 22 или SEQ ID NO: 24, составляющую по меньшей мере 95%, введена или повышена по сравнению с эндогенной активностью.

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к рекомбинантной плазмиде pHlyA. Плазмида pHlyA экспрессирует клонированный ген hlyA (гемолизина) Vibrio cholerae, встроенный по сайтам BamHI-Pstl в полилинкер векторной плазмиды pQE30 под контролем Т5-промотора.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей первый полипептид, второй полипептид, сигнальную последовательность mBIP и либо белок оболочки, либо адаптерный белок.

Группа изобретений относится к рекомбинантной плазмиде, обеспечивающей синтез химерного белка прохимозина В Bos Taurus, и рекомбинантному штамму Е. coli - продуценту химерного белка прохимозина В Bos taurus в клетках E.

Изобретение относится к области биохимии, генной инженерии и биотехнологии, в частности к рекомбинантной плазмидной ДНК pET31b-pHLIP. Указанная плазмидная ДНК кодирует аминокислотную последовательность рекомбинантного рН-зависимого встраивающегося пептида и обеспечивает его синтез в составе белка-слияния с кетостероидизомеразой.

Изобретение относится к области генной инженерии, конкретно к рекомбинантному получению антиангиогенных белков, и может быть использовано в медицине. Сконструирована рекомбинантная плазмидная ДНК pERIG-PGS, обеспечивающая синтез в клетках Escherichia coli гибридного белка GyrA-PGS, содержащего модифицированный мини-интеин Мхе GyrA и антиангиогенный пептид Пигастин - производное фрагмента [44-77] фактора роста пигментного эпителия человека с присоединенной к С-концу последовательностью Pro-Gly-Pro.

Изобретение относится к биотехнологии, генной инженерии, биохимии, медицине, ветеринарии. Получают синтетическую последовательность ДНК, соответствующую гену, кодирующему белковую последовательность гепаринсвязывающего домена (HBD) из Danio rerio, слитую с последовательностью эритропоэтина (Еро) человека (белок HBD-Epo), спланированную таким образом, чтобы нуклеотидный состав кодонов был оптимизирован для гетерологичной экспрессии в непатогенном лабораторном штамме Е.

Изобретение относится к области биохимии, генной инженерии и биотехнологии, в частности к штамму бактерии Escherichia coli BL21(DE3) BpsOmpA - продуценту поверхностного протеина OmpA/MotB с молекулярной массой 36,9 кДа.

Изобретение относится к области биохимии, генной инженерии и биотехнологии, в частности к штамму бактерии Escherichia coli BL21(DE3) BpsOmp39 - продуценту поверхностного протеина Оmр39 с молекулярной массой 40,6 кДа.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к антителу для осуществления взаимодействия антиген-антитело с клаудином 6 (CLDN6), находящимся на поверхности клеток, экспрессирующих CLDN6, при этом по существу неспособному к взаимодействию антиген-антитело с другими высокогомологичными клаудинами, а также к иммуноконъюгату, фармацевтической композиции, содержащим вышеуказанное антитело.

Группа изобретений относится к области биотехнологии. Предложен способ получения L-валина путем ферментации микроорганизмов из рода Corynebacterium, содержащих в реплицируемой форме полинуклеотид с операторной активностью, последовательность которого по меньшей мере на 85% идентична последовательности от положения 1 до 121 согласно SEQ ID NO: 1, 2 или 3, с которым связывается активатор PrpR, и функционально ниже которого на 3’-конце находится второй полинуклеотид, характеризующийся промоторной активностью, а также гены ilvB и ilvN, и который регулирует транскрипцию генов ilvBN в зависимости от добавления активатора PrpR в среду, к которой после первой фазы (фазы роста), проходящей без индуктора, во второй фазе в качестве индуктора добавляют пропионат или 2-метилцитрат.

Данное изобретение относится к области биотехнологии и иммунологии. Предложена нуклеотидная композиция для получения гетеродимерной конструкции Fc, имеющей замены в CH3 доменах, обеспечивающие повышение температуры плавления.

Группа изобретений относится к биохимии. Предложена нуклеиновая кислота, кодирующая люциферазу или ее функциональный фрагмент и выбранная из группы, состоящей из нуклеиновой кислоты, кодирующей белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32 или 34, нуклеиновой кислоты, кодирующей белок, имеющий последовательность, которая по крайней мере на 65% идентична аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32 или 34, и нуклеиновой кислоты, кодирующей белок, в состав которого входит консенсусная последовательность SEQ ID NO: 35.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к терапевтическим пептидам из TLT-1 (Trem-подобный транскрипт-1), и может быть использовано в медицине. Полученные пептидные фрагменты TLT-1 эффективны в лечении сердечно-сосудистых заболеваний, выбранных из группы, включающей миокардиальный или церебральный инфаркт, острый инфаркт миокарда, болезни коронарных сосудов сердца, инсульт, аневризму, стабильную стенокардию или стенокардию напряжения, кардиомиопатию, гипертензивную кардиопатию, сердечную недостаточность (хроническую или острую), легочное сердце, сердечные аритмии, воспалительные заболевания сердца, такие как эндокардит, миокардит, заболевания периферических артерий, ССВО (синдром системного воспалительного ответа)-ассоциированную миокардиальную и сосудистую дисфункцию, атеросклероз.

Группа изобретений относится к биотехнологии. Предложены композиция вакцины и способ вакцинации домашней птицы.

Данное изобретение относится к иммунологии. Предложен выделенный пептид-эпитоп, полученный из ассоциированной с кинетохором молекулы 2 (KNTC2) и обладающий способностью к индукции цитотоксических T-лимфоцитов (CTL) в присутствии антигенпрезентирующей клетки (APC), несущей HLA-A*0201.

Настоящее изобретение относится к иммунологии. Предложен полипептид, способный связываться с поверхностным антигеном вируса гепатита B (HBV) и поверхностным антигеном, презентируемым иммунными эффекторными клетками.

Изобретение относится к области биотехнологии и биохимии, в частности к проникающему в клетки пептиду. Указанный пептид состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 и обладает способностью опосредовать внутриклеточную доставку легкой цепи ботулотоксина.

Предложены модифицированный белок орнитиндекарбоксилаза (ODC), обладающий улучшенной продуктивностью по путресцину, и его применение. Изолейцин в положении 163 от N-конца ODC, имеющей аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1, заменен на аминокислотный остаток, меньший, чем изолейцин, и/или глутаминовая кислота в положении 165 от N-конца ODC, имеющей аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1, заменена на аминокислотный остаток, меньший, чем глутаминовая кислота.

Данное изобретение относится к области биотехнологии и иммунологии. Предложена нуклеотидная композиция для получения гетеродимерной конструкции Fc, имеющей замены в CH3 доменах, обеспечивающие повышение температуры плавления.

Изобретение относится к области молекулярной биологии и биотехнологии и представляет собой биологически активный белковый препарат, обладающий специфической активностью папаин-подобных цистеиновых протеиназ, характеризующийся тем, что представляет собой аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO:2-4, экспрессирующийся в растворимой форме. Изобретение относится также к способу получения биологически активного белкового препарата, где способ включает трансформацию клеток плазмидами, содержащими ДНК, кодирующую белок с аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO: 2-4, культивирование и выделение биологически активного препарата. Изобретение обеспечивает возможность получения препарата тритикаина-альфа с высоким и стабильным выходом, высоким уровнем очистки и функциональной активности. 5 н. и 4 з.п. ф-лы, 8 ил., 7 пр.

Наверх