Усовершенствованный способ очистки лактоферрина молока и его продукты

Авторы патента:


Усовершенствованный способ очистки лактоферрина молока и его продукты
Усовершенствованный способ очистки лактоферрина молока и его продукты
Усовершенствованный способ очистки лактоферрина молока и его продукты
Усовершенствованный способ очистки лактоферрина молока и его продукты
Усовершенствованный способ очистки лактоферрина молока и его продукты
Усовершенствованный способ очистки лактоферрина молока и его продукты
Усовершенствованный способ очистки лактоферрина молока и его продукты
C07K1/34 - Пептиды (пептиды в пищевых составах A23, например получение белковых композиций для пищевых составов A23J, препараты для медицинских целей A61K; пептиды, содержащие бета-лактамовые кольца, C07D; циклические дипептиды, не содержащие в молекуле любого другого пептидного звена, кроме образующего их кольцо, например пиперазин-2,5-дионы, C07D; алкалоиды спорыньи циклического пептидного типа C07D519/02; высокомолекулярные соединения, содержащие статистически распределенные аминокислотные единицы в молекулах, т.е. при получении предусматривается не специфическая, а случайная последовательность аминокислотных единиц, гомополиамиды и блоксополиамиды, полученные из аминокислот, C08G 69/00; высокомолекулярные продукты, полученные из протеинов, C08H 1/00; получение

Владельцы патента RU 2683228:

МУРРЕЙ ГОУЛБЁРН КО-ОПЕРАТИВ КО. ЛИМИТЕД (AU)

Изобретение относится к биотехнологии. Способ осуществляют следующим образом. Фильтруют молоко через фильтр с НОММ от 30 кДа до 50 кДа для разделения его на фракцию ультраконцентрата, содержащую лактоферрин, и фракцию фильтрата, содержащую факторы роста и/или РНКазы с молекулярной массой менее чем 30 кДа. Во время фильтрации через фильтр с НОММ от 30 кДа до 50 кДа молоко подвергают обработке солью, по меньшей мере, в течение 4 ч, таким образом, что в фильтрат попадают факторы роста и/или РНКазы с молекулярной массой менее чем 30 кДа. При этом обработка солью включает поддержание молока или лактоферрина в течение фильтрации через фильтр с НОММ от 30 кДа до 50 кДа при концентрации соли, составляющей по меньшей мере 0,2 М NaCl или эквивалента, или проводимости по меньшей мере 20 мСм. Собирают указанную фракцию ультраконцентрата, содержащую лактоферрин. Изобретение обеспечивает получение продукта в промышленном масштабе со степенью очистки лактоферрина 98,0%. 4 з.п. ф-лы, 14 ил., 1 табл., 9 пр.

 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение в целом относится к способам очистки целевых белков молока.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

В течение многих лет молоко домашних животных использовалось в качестве источника белков и других продуктов для пищевой и фармацевтической отраслей промышленности. Известно множество методов выделения этих продуктов. Молоко –это коллоидная суспензия, состоящая в основном из жиров, лактозы и белков, распределенных в воде. Молоко жвачных и лабораторных животных содержит в среднем 30-140 грамм белка на литр, или около 4-17% массовой доли в зависимости от вида. Большую часть этих белков составляют казеины в комплексе с фосфатом кальция, образующие надмолекулярные структуры, известные как мицеллы. Другой важный класс белков молока – это белки сыворотки, состоящие преимущественно из бета-лактоглобулина и альфа-лактальбумина, но включающие также лактоферрин, иммуноглобулины и сывороточный альбумин.

Белки молока, как правило, выделяют с помощью сочетания способов, включая методы мембранной фильтрации и ионообменной адсорбции.

Лактоферрин – это железосвязывающий гликопротеин с молекулярной массой 80 кДа, содержащийся в биологических жидкостях, таких как слюна, желчь, бронхиальная слизь, желудочно-кишечные соки, шеечно-влагалищная слизь, семенная жидкость и молоко. Наиболее богатыми источниками лактоферрина являются молоко и молозиво млекопитающих. Концентрация лактоферрина в обезжиренном коровьем молоке обычно невелика, как правило, она находится в пределах 80-200 мг/мл в зависимости от условий предварительной обработки обезжиренного молока, в том числе пастеризации. После осаждения присутствующего в молоке казеина концентрация лактоферрина в сыворотке коровьего молока составляет, как правило, 10-100 мг/мл в зависимости от предварительной физической и химической обработки сыворотки.

Лактоферрин имеет множество предполагаемых биологических функций, включая регуляцию метаболизма железа, иммунную функцию и участие в эмбриональном развитии. Лактоферрин имеет антимикробную активность в отношении ряда патогенов, включая грамположительные и грамотрицательные бактерии и грибы, в том числе дрожжи. Антимикробный эффект лактоферрина основан на его способности связывать железо, необходимое для роста патогенных микроорганизмов. Лактоферрин также ингибирует репликацию некоторых вирусов и повышает чувствительность некоторых бактерий к антибиотикам и лизоциму путем связывания с липидом А - компонентом липополисахаридов на бактериальных мембранах.

Целью предпочтительного варианта реализации настоящего изобретения является обеспечение усовершенствованного способа очистки лактоферрина молока, в частности коровьего, для повышения степени очистки.

Все ссылки, в том числе патенты или патентные заявки, цитируемые в данном описании изобретения, включены в данный документ посредством ссылки. Очевидно, что хотя данное описание ссылается на определенное количество предшествующих публикаций, это не является признанием того, что любой из этих документов образует часть общего уровня знаний в данной области техники.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Первый аспект изобретения предлагает способ очистки лактоферрина молока, включающий фильтрацию молока с целью его разделения на фракцию ультраконцентрата, содержащую лактоферрин, и фракцию фильтрата, содержащую факторы роста и/или РНКазы, причем перед и/или во время фильтрации молоко подвергают обработке солью, вследствие чего в фильтрат попадают факторы роста и/или РНКазы.

При очистке лактоферрина молока с помощью мембранной фильтрации с отсечением от 30 кДа до 50 кДа, авторы изобретения обнаружили, что ультраконцентрат лактоферрина был загрязнен факторами роста и РНКазами. Поскольку молекулярная масса этих факторов роста и РНКаз составляет менее чем 30 кДа, они должны были пройти через мембрану и попасть в фильтрат, таким образом, они не должны были присутствовать в виде примесей во фракции ультраконцентрата лактоферрина. Поэтому обнаружение факторов роста и РНКаз в ультраконцентрате было неожиданным. В процессе дальнейшей очистки фракции лактоферрина авторы изобретения обнаружили, что добавление большого количества соли в молоко перед фильтрацией удаляет факторы роста и РНКазы из ультраконцентрата, таким образом, дополнительно очищая лактоферрин. В присутствии соли факторы роста и РНКазы обнаруживались в фильтрате.

Не желая быть связанными с какой-либо теорией, авторы изобретения предполагают, что при обычных условиях РНКазы и факторы роста, присутствующие в молоке, агрегируют или другим путем обретают массу, большую, чем их отдельно взятые молекулярные массы. Предполагается, что обработка солью приводит к дезагрегации или диссоциации РНКаз и факторов роста.

Исходя из этого, в альтернативном варианте способ по первому аспекту изобретения предлагает способ очистки лактоферрина молока, включающий фильтрацию молока с целью его разделения на фракцию ультраконцентрата, содержащую лактоферрин, и фракцию фильтрата, содержащую факторы роста и/или РНКазы, причем перед и/или во время фильтрации молоко подвергают обработке солью, способствующей дезагрегации или диссоциации любой массы РНКаз или факторов роста, вследствие чего факторы роста и/или РНКазы попадают в фильтрат.

Не желая быть связанными с какой-либо теорией, авторы изобретения предполагают, что при условиях низкой ионной силы белковые агрегаты могут ассоциироваться с мембраной, тем самым образуя слой с меньшим видимым размером пор, чем у мембраны, что предотвращает прохождение РНКазы и факторов роста через мембрану при фильтровании молока. Предполагается, что обработка солью предотвращает образование белкового слоя или удаляет его, что позволяет любым РНКазам и факторам роста проходить через мембрану и попадать в фильтрат.

Исходя из этого, в альтернативном варианте способ по первому аспекту изобретения предлагает способ очистки лактоферрина молока, включающий фильтрацию молока с целью его разделения на фракцию ультраконцентрата, содержащую лактоферрин, и фракцию фильтрата, содержащую факторы роста и/или РНКазы, причем перед и/или во время фильтрации молоко подвергают обработке солью, способствующей прохождению РНКазы или факторов роста через мембрану, вследствие чего факторы роста и/или РНКазы попадают в фильтрат.

Второй аспект изобретения предлагает лактоферрин, полученный с помощью способа по первому аспекту изобретения.

В одном варианте реализации изобретения лактоферрин подвергают дальнейшей очистке.

Третий аспект изобретения предлагает применение лактоферрина по второму аспекту изобретения в качестве противоракового, противовирусного, антимикробного или противовоспалительного агента, для лечения пролиферативных расстройств, таких как рак, особенно включающих твердые опухоли, для лечения злокачественных новообразований и гиперпролиферативных заболеваний, для лечения костных заболеваний путем стимуляции остеогенеза, для лечения вирусных или микробных инфекций, для лечения ран роговицы, для повышения иммунитета, для лечения В-клеточной неходжкинской лимфомы, для лечения септического шока, для улучшения здоровья кишечника путем повышения числа бифидобактерий при снижении количества E.coli, Streptococcus и Clostridium, для лечения воспалительных заболеваний кишечника (ВЗК), для стимулирования иммунитета и сопротивляемости к болезням, для управления системными воспалениями, чтобы предотвратить отторжение трансплантата органа и реакцию "трансплантат против хозяина", для улучшения здоровья матери и плода, для улучшения здоровья нейронов и развития кишечника новорожденного, чтобы уменьшить вероятность ассоциированных с беременностью осложнений, таких как преэклампсия, преждевременные роды, гестационный диабет, выкидыш, внутриутробная гибель плода, невынашивание, низкий вес при рождении, отслойка плаценты и внутриутробная задержка роста, особенно у женщин с гипоферремией или железодефицитной анемией, для лечения дефицита железа и анемии, особенно у беременных женщин, для профилактики неонатального сепсиса у недоношенных новорожденных, для заживления ран, для облегчения формирования биопленки, для лечения инфекций полости рта, включая периодонтит, для лечения диабетических язв, при лечении муковисцидоза, для уменьшения боли, для лечения протеинурии, для стимуляции роста клеток кожи, в качестве радиопротекторного агента, при лечении инфекций мочевыводящих путей, при лечении дегенеративных заболеваний суставов, при лечении диабета, при лечении респираторных расстройств, для сокращения циркулирующего холестерина, при сосудистом воспалении, атеросклерозе и сердечно-сосудистых заболеваниях, а также все другие применения лактоферрина, известные специалистам в данной области техники.

В альтернативном варианте третий аспект изобретения предлагает лактоферрин, полученный с помощью способа по первому аспекту изобретения, для применения как предлагается в третьем аспекте изобретения или для использования при производстве лекарственных средств, предназначенных для применения как предлагается в третьем аспекте изобретения.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

Фигура 1 иллюстрирует, как с увеличением проводимости повышается интенсивность потока фильтрата через мембрану с отсечением 50 кДа.

Фигура 2 иллюстрирует, как при ультрафильтрации в условиях возрастающей концентрации хлорида натрия повышается степень очистки удерживаемого лактоферрина благодаря лучшему проникновению низкомолекулярных загрязняющих веществ через мембрану (на примере РНКаз).

Фигура 3 иллюстрирует концентрацию лактоферрина (●), низкомолекулярных белков (на примере РНКаз, ♦) и белка (▲) в фильтрате, полученном с использованием УФ-мембраны с отсечением 50 кДа.

Фигуры 4 А, В, С и D иллюстрируют анализ лактоферрина методом эксклюзионной ВЭЖХ при возрастающих концентрациях хлорида натрия, указывающий на то, что увеличение концентрации соли приводит к дезагрегации крупных частиц. Концентрация хлорида натрия в течение первых 50 минут показывает важное различие между четырьмя хроматограммами: A, 0 М NaCl; В, 0,16 М NaCl; С, 0,32 М NaCl и D, 0,48 М NaCl.

Фигуры 5А и В иллюстрируют ультрафильтрацию раствора лактоферрина через мембрану с отсечением 50 кДа, проведенную в аппарате Vivacell в присутствии хлорида натрия (0, 1,5, 3, 4, 5, или 6% NaCl), и указывают на то, что в присутствии хлорида натрия мембрана с отсечением 50 кДа избирательно пропускает РНКазы и другие факторы роста. A: образцы фильтрата; B, образцы фильтрата.

Фигуры 6A и 6B иллюстрируют ультрафильтрацию раствора лактоферрина через мембрану с отсечением 50 кДа, проведенную в аппарате Vivacell в присутствии хлорида натрия (0, 1,5, 3, 4, 5, or 6% NaCl), и указывают на то, что в присутствии хлорида натрия мембрана с отсечением 50 кДа избирательно пропускает РНКазы и другие факторы роста. A: образцы фильтрата; B, образцы фильтрата.

Фигура 7 иллюстрирует, как при ультрафильтрации в условиях возрастающей проводимости повышается степень очистки удерживаемого лактоферрина.

Фигура 8 иллюстрирует, что наблюдаемая повышенная степень очистки лактоферрина связана с увеличением интенсивности переноса загрязняющих факторов роста, таких как РНКазы. Интенсивность переноса факторов роста быстро увеличивается от 0 мСм до 20 мСм.

Фигура 9 иллюстрирует степень очистки лактоферрина в исходном материале лактоферрина, основной пик катионнообменной хроматографии и материал, дополнительно очищенный с помощью УФ-мембраны с отсечением 50 кДа. Целевая степень очистки лактоферрина составляет 98%.

Фигура 10 иллюстрирует повышение степени очистки лактоферрина в процессе прохождения через мембраны с отсечением 50 кДа. Образцы, проанализированные с помощью катионообменной ВЭЖХ в жидкой форме, изображены серым цветом, образцы, проанализированные с помощью катионообменной ВЭЖХ в форме порошка, изображены черным цветом.

Фигура 11 иллюстрирует, что при ультрафильтрации растворов лактоферрина, содержащих хлорид натрия, увеличение номинального отсечения по молекулярной массе приводит к повышению количества белка, переходящего в фильтрат ( _ ▲ _), и улучшает удержание белка ( ... ● ...) и лактоферрина ( _ ■ _). Результаты были получены при экспериментальном отделении 2 мг/мл раствора лактоферрина, содержащего 6% хлорида натрия, с помощью УФ-мембран Sartorius Stedium Vivacell 250 с указанной пористостью.

Фигура 12 иллюстрирует, что проницаемость мембраны повышается с увеличением номинального отсечения по молекулярной массе (данные получены при пропускании воды через фильтр Synder при 25°С и 3,4 бар), но существенно не отличается в диапазоне от 30 до 50 кДа.

Фигура 13 иллюстрирует, что при ультрафильтрации растворов лактоферрина, содержащих хлорид натрия, увеличение номинального отсечения по молекулярной массе приводит к повышению степени очистки, пока пористость мембраны не достигнет 50 кДа. Результаты были получены при экспериментальном отделении 2 мг/мл раствора лактоферрина, содержащего 6% хлорида натрия, с помощью УФ-мембран Sartorius Stedium Vivacell 250 с указанной пористостью.

Фигура 14 иллюстрирует степень очистки лактоферрина на установке UF7 при оснащении ее традиционной мембраной с отсечением 5 кДа или новой мембраной с отсечением 50 кДа. Нанесенные значения являются средними и вертикальная черта указывает 95% доверительный интервал.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение предлагает усовершенствованные способы очистки лактоферрина молока или обогащения молока лактоферрином.

Авторы изобретения признают необходимость способа, позволяющего эффективное получение обогащенного лактоферрина.

Термины "очищенный" или "обогащенный" в отношении лактоферрина, как используется в данном документе, означают, что соотношение белок лактоферрин:суммарный белок в ультраконцентрате больше, чем соотношение в молоке до этапа фильтрации. Фракция, которая может считаться обогащенной или очищенной, должна содержать по меньшей мере на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 22, 25, 27, 28 или 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98, 98, или 99% масс/масс больше лактоферрина, чем в молоке до этапа фильтрации.

Способ по первому варианту реализации изобретения нацелен на увеличение степени очистки ультраконцентрата лактоферрина до 100%.

Как используется в данном документе, термин "фракция" относится к частично очищенной части молока.

Термином "эффективный" обозначается недорогой и быстрый способ по сравнению со способами обогащения белков, которые используются в настоящее время.

Ссылка на молоко в данном документе подразумевает цельное молоко, обезжиренное молоко, пахту, сыворотку (например, кислую или сырную/сычужную сыворотку) или производное сыворотки (например, концентрат белка сыворотки или отфильтрованный изолят белка сыворотки) и молозиво. Ссылка на молоко также подразумевает фракции молока, например, фракции, подвергнутые этапам очистки, таким как катионообменная хроматография. К таким фракциям относятся основной белок молока и фракции обогащенного лактоферрина.

Специалистам в данной области техники очевидно, что молоко может быть получено от любых животных, способных к лактации, например, жвачных животных, таких как коровы, овцы, буйволы, козы и олени, нежвачных животных, включая приматов, в частности, человека, и животных с однокамерным желудком, таких как свиньи. Предпочтительно, чтобы в способе по настоящему изобретению использовалось обезжиренное молоко, полученное из цельного коровьего молока.

Фильтрация, применяемая в способе по первому аспекту изобретения, представляет собой мембранную фильтрацию. В одном варианте реализации изобретения мембрана имеет отсечение по размеру 25 кДа, 30 кДа, 35 кДа, 40 кДа, 45 кДа, 50 кДа, 55 кДа, 60 кДа, 65 кДа, 70 кДа и 75 кДа. Предпочтительный диапазон отсечения составляет 30 кДа или более и 50 кДа или менее.

Под фильтрацией может подразумеваться ультрафильтрация или диафильтрация, или то и другое.

Обработка молока солью, используемая в способе по первому аспекту изобретения, происходит путем добавления количества соли, достаточного для того, чтобы ионная сила молока составила по меньшей мере 0,2 М (1,1%) NaCl или эквивалента. В одном варианте реализации изобретения ионная сила поддерживается по меньшей мере на таком уровне в течение периода, необходимого для требуемого повышения степени очистки лактоферрина. Этот период может составлять по меньшей мере 10 минут, 15 минут, 20 минут, 30 минут, 45 минут, 1 час, 2 часа, 3 часа, 4 часа, 5 часов, 6 часов, 7 часов, 8 часов, 9 часов, 10 часов, 11 часов, 12 часов или более в зависимости от исходного материала молока и желаемого повышения степени очистки.

В альтернативном варианте обработка солью, используемая в способе очистки по первому аспекту изобретения, происходит путем добавления количества соли, достаточного для того, чтобы проводимость молока составила по меньшей мере 20 мСм. В одном варианте реализации изобретения проводимость поддерживается по меньшей мере на таком уровне на протяжении всего этапа фильтрации.

Как правило, ионная сила молока значительно ниже, чем 0,2 М NaCl или эквивалента, или проводимость составляет менее 20 мСм, следовательно, обработка солью происходит путем добавления соли с целью увеличения ионной силы или проводимости молока до желаемого уровня. Тем не менее, в некоторых случаях, например, когда молоко является фракцией, которая была подвергнута катионному обмену, ионная сила молока составляет по меньшей мере 0,2 М NaCl или эквивалента или проводимость составляет 20 мСм или более. Обычно фракции после катионного обмена подвергают обработке для удаления соли (например, диафильтрации водой). Однако согласно способу по первому аспекту изобретения обработка солью производится таким образом, чтобы поддерживать ионную силу молока по меньшей мере на уровне 0,2 М (1,1%) NaCl или эквивалента или проводимость молока по меньшей мере на уровне 20 мСм во время этапа фильтрации.

Как используется в данном документе, термин "проводимость" обозначает способность материала проводить электрический ток. Проводимость обычно измеряется с помощью измерителя проводимости, такого как Hach Sension 5. Специалистам в данной области техники известны подходящие альтернативные средства измерения проводимости. Между концентрацией ионов натрия и проводимостью существует в целом линейная зависимость.

Для обработки солью могут использоваться соли помимо NaCl, альтернативы которому хорошо известны специалистам в данной области техники. Например, может использоваться любой растворимый нетоксичный буфер, такой как растворимые соли: хлорид, цитрат, фосфат, ацетат, сульфат, бикарбонат, гидроксид, имидазол или малеат натрия, калия, кальция, магния или лития. Также могут использоваться синтетические цвиттерионные буферы, такие как HEPES, Trizma или трицин.

Для отделения РНКазы и факторов роста от лактоферрина ионная сила молока перед этапом фильтрации должна быть больше или равна 0,2 М (1,1%) NaCl или эквивалента. В одном варианте реализации изобретения ионная сила молока увеличивается при добавлении 1,1% соли, 1,5% соли, 2% соли, 2,5% соли, 3% соли, 3,5% соли, 4% соли, 4,5% соли, 5% соли, 5,5% соли, 6% соли или более. В другом варианте реализации изобретения ионная сила молока увеличивается до 0,2М, 0,22M, 0,24М, 0,26М, 0,28М, 0,30М, 0,32М, 0,34M, 0,36M, 0,38М, 0,40M, 0,42M, 0,44M , 0,46M, 0,48M, 0,50М, 0,6М, 0,7М, 0,8М, 0,9М, 1,0М NaCl или эквивалента или более. В другом варианте реализации изобретения проводимость составляет 20 мСм, 30 мСм, 40 мСм, 50 мСм, 60 мСм, 70 мСм, 80 мСм, 90 мСм, 100 мСм, 110 мСм, 120 мСм или более.

В предпочтительном варианте реализации изобретения обработка солью происходит путем добавления 0,2-0,5 M NaCl или KCl в молоко перед этапом фильтрации.

В одном варианте реализации изобретения обработка солью проводится при 4-10 °С.

В одном варианте реализации изобретения обработка солью проводится при 10-30 °С.

В одном варианте реализации изобретения обработка солью проводится при 30-50 °С.

В одном варианте реализации изобретения обработка солью проводится при 50-70 °С.

В одном варианте реализации изобретения обработка солью проводится при менее чем 20 °С.

В другом варианте реализации изобретения обработка солью проводится при 50 °С или выше, так как при температурах выше 50 °С уменьшается интенсивность образования бактерий группы кишечной палочки. Однако, поскольку лактоферрин денатурирует примерно при 70 °С, проведение обработки солью при 60 °С и выше может привести к снижению выхода.

В одном варианте реализации изобретения этап фильтрации осуществляется при 4-10 °С.

В одном варианте реализации изобретения этап фильтрации осуществляется при 10-30 °С

В одном варианте реализации изобретения этап фильтрации осуществляется при 30-50 °С

В одном варианте реализации изобретения этап фильтрации осуществляется при 50-70 °С

В одном варианте реализации изобретения обработка солью осуществляется при атмосферном давлении.

В одном варианте реализации изобретения этап фильтрации осуществляется при трансмембранном давлении менее 2,5 бар на мембрану, более предпочтительно – менее 2,0 бар, еще более предпочтительно – менее 1,5 бар, но в идеальном варианте – 1,0-1,4 бар, хотя давление в 0,0-1,0 бар приемлемо, однако при нем снижается интенсивность трансмембранного потока.

"Лечение" или "терапия" относится как к терапевтическому лечению, так и к профилактическим или превентивным мерам, цель которых состоит в том, чтобы предотвратить, улучшить, уменьшить или замедлить (облегчить) или улучшить состояние, заболевание или расстройство.

"Лечение" или "терапия", как используется в данном документе, охватывает любое лечение или профилактику состояния у позвоночного животного, млекопитающего, в частности у человека.

"Предупреждение", "предотвращение", "превентивный" или "профилактический" относится к предотвращению возникновения или препятствованию или защите от возникновения состояния, заболевания, расстройства или фенотипа, включая аномалию или симптом. Субъект, нуждающийся в профилактике, может иметь склонность к развитию заболевания.

Термин "улучшить" или " улучшение" относится к уменьшению, снижению или устранению состояния, заболевания, расстройства или фенотипа, включая аномалию или симптом. Субъект, нуждающийся в лечении, может уже иметь состояние или может иметь склонность к развитию состояния или может быть тем, у кого необходимо предотвратить развитие состояния.

Термин "поддерживать", как используется в данном документе, относится к поддержанию состояния на уровне, предшествующем лечению.

Лактоферрин по второму варианту реализации изобретения может входить в состав фармацевтической, ветеринарной или нутрицевтической композиции, а также пищевых продуктов.

Фармацевтической называется композиция, подходящая для введения людям. Ветеринарной называется композиция, подходящая для введения животным. Как правило, в таких композициях содержится очищенный лактоферрин или по меньшей мере все компоненты композиции могут пройти проверку.

Фармацевтическая или ветеринарная композиция может содержать один или более носителей и, необязательно, другие терапевтические агенты. Каждый носитель, разбавитель, адъювант и/или вспомогательное вещество может быть "приемлемым".

Под "приемлемым" подразумевают материал, который не является биологически или в других отношениях непригодным, т.е. материал можно вводить индивидууму в сочетании с выбранным активным агентом, не вызывая каких-либо нежелательных биологических эффектов или вредных взаимодействий с любым из остальных компонентов в фармацевтической или ветеринарной композиции, в которой он содержится. Аналогично "приемлемая" соль или сложный эфир нового соединения, как используется в данном документе, – это соль или сложный эфир, которые не являются биологически или в других отношениях непригодными.

Как используется в данном документе, «носитель» подразумевает приемлемый растворитель, суспендирующее средство или основу для доставки агента субъекту. Носитель может быть жидким или твердым и выбирается в соответствии с предполагаемым способом введения. Каждый носитель должен быть "приемлемым" в том смысле, что он не является биологически или в других отношениях непригодным, т.е. носитель может вводиться субъекту в сочетании с агентом, не вызывая какой-либо существенной нежелательной реакции.

Фармацевтическая или ветеринарная композиция может применяться перорально, местно или парентерально в составах, содержащих обычные нетоксичные приемлемые носители, адъюванты и основы.

Как используется в данном документе, термин "парентеральный" включает внутривенную, внутриартериальную, внутрибрюшинную, внутримышечную, подкожную, субконъюнктивальную, внутриполостную, трансдермальную и подкожную инъекции, аэрозоль для введения в легкие или носовую полость или введение путем инфузии, например, с помощью осмотического насоса.

Фармацевтическая или ветеринарная композиция может вводиться перорально в форме таблеток, водных или масляных суспензий, таблеток для рассасывания, пастилок, порошков, гранул, эмульсий, капсул, сиропов или эликсиров. В целях получения фармацевтически первоклассных приятных на вкус препаратов композиция для перорального применения может содержать одно или более веществ, выбранных из группы, включающей подсластители, ароматизаторы, красители и консерванты. Подходящие подсластители включают сахарозу, лактозу, глюкозу, аспартам или сахарин. Подходящие разрыхлители включают кукурузный крахмал, метилцеллюлозу, поливинилпирролидон, ксантановую камедь, бентонит, альгиновую кислоту или агар. Подходящие ароматизаторы включают масла перечной мяты, грушанки и ароматизаторы вишни, апельсина или малины. Подходящие консерванты включают бензоат натрия, витамин Е, альфа-токоферол, аскорбиновую кислоту, метилпарабен, пропилпарабен или бисульфит натрия. Подходящие смазывающие вещества включают стеарат магния, стеариновую кислоту, олеат натрия, хлорид натрия или тальк. Подходящие вещества, замедляющие высвобождение активного агента, включают моностеарат или дистеарат глицерина. Таблетки могут содержать агент в смеси с нетоксичными фармацевтически приемлемыми вспомогательными веществами, пригодными для изготовления таблеток.

Такими вспомогательными веществами могут быть, например, (1) инертные разбавители, такие как карбонат кальция, лактоза, фосфат кальция или фосфат натрия; (2) гранулирующие веществаи разрыхлители, такие как кукурузный крахмал или альгиновая кислота; (3) связывающие вещества, такие как крахмал, желатин или гуммиарабик; и (4) смазывающие вещества, такие как стеарат магния, стеариновая кислота или тальк. Эти таблетки могут не иметь оболочки или покрываться оболочкой известными способами с целью замедления распадания и абсорбции в желудочно-кишечном тракте, что обеспечивает пролонгированное действие препарата. Например, может быть использовано вещество, замедляющее высвобождение активного агента, такое как глицерил моностеарат или глицерил дистеарат.

Препараты для парентерального введения включают стерильные водные или неводные растворы, суспензии и эмульсии. Примеры неводных растворителей включают пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, растительные масла, такие как оливковое масло, и инъекционные органические сложные эфиры, такие как этилолеат. Водные носители включают воду, спиртовые/водные растворы, эмульсии или суспензии, в том числе солевые и буферные среды. Парентеральные основы включают раствор хлорида натрия, декстрозу Рингера, декстрозу и хлорид натрия, Рингер-лактатные внутривенные основы включают восполнители жидкости и питательных веществ, восполнители электролитов (например, на основе декстрозы Рингера) и т.п. Также могут присутствовать консерванты и другие добавки, такие как, например, противомикробные средства, антиоксиданты, хелатирующие вещества, факторы роста и инертные газы и т.п.

Фармацевтическая или ветеринарная композиция может также содержать другие активные соединения, обеспечивающие вспомогательные, дополнительные или усовершенствованные терапевтические функции. Также фармацевтическая или ветеринарная композиция может быть упакована в контейнер, пакет или дозатор вместе с инструкциями для введения.

Фармацевтическая или ветеринарная композиция может вводиться однократно или с периодичностью, такой как один раз в день, один раз в неделю и один раз в месяц.

Режим дозирования может корректироваться в зависимости от периода полувыведения активного агента или тяжести состояния пациента.

Как правило, фармацевтическую или ветеринарную композицию вводят в виде болюсной дозы, чтобы максимизировать уровни активного агента в крови в течение наибольшего периода времени после введения дозы. После болюсной дозы также может быть использована непрерывная инфузия.

Лактоферрин по второму аспекту изобретения может входить в состав нутрицевтических композиций или пищевых продуктов.

Термин "нутрицевтик", как используется в данном документе, относится к съедобному продукту, выделенному или очищенному из пищевого продукта, в данном случае из молочного продукта, который зарекомендовал себя как оказывающий благоприятное физиологическое действие или обеспечивающий защиту от острого или хронического заболевания или травмы или их облегчение при пероральном введении. Таким образом, нутрицевтик может быть представлен в форме биологически активной пищевой добавки или препарата, который применяется отдельно или в смеси с пищевыми продуктами или напитками.

Нутрицевтическая композиция может быть в форме растворимого порошка, жидкости или готового к употреблению препарата. Кроме того, биологически активная пищевая добавка может быть в твердой форме в виде пищевых продуктов; например, в виде готового к употреблению батончика или сухого завтрака. Также в ней могут присутствовать различные ароматизаторы, волокна, подсластители и другие добавки.

Предпочтительно, чтобы нутрицевтик имел приемлемые органолептические свойства (такие как приемлемые запах, вкус и вкусовые качества), также он может дополнительно содержать по меньшей мере один витамин и/или минерал, выбранный из ряда: А, В1, В2, В3, В5, В6, В11, В12, биотин, C, D, E, H и К и кальций, магний, калий, цинк и железо.

Нутрицевтические композиции могут производиться традиционными способами; например, композиция может быть произведена путем смешивания белка с другими добавками. Если используется эмульгатор, он также может войти в состав смеси. На этом этапе могут быть добавлены дополнительные витамины и минералы, однако обычно их добавляют позже во избежание термической деградации.

Если необходимо получить порошкообразную нутрицевтическую композицию, белок может быть смешан с дополнительными порошкообразными компонентами. Массовая доля влаги в порошке не должна превышать 5%. Для образования жидкой смеси порошок может быть смешан с водой, предпочтительно подвергнутой обратному осмосу.

Если готовая нутрицевтическая композиция должна быть представлена в жидкой форме, готовой к употреблению, ее можно нагреть, чтобы уменьшить бактериальную нагрузку. Если желательно произвести жидкую нутрицевтическую композицию, жидкой смесью предпочтительно заполняют подходящие контейнеры в асептических условиях. Заполнение контейнеров в асептических условиях может осуществляться с помощью методов, общедоступных в данной области техники. Подходящее устройство для осуществления асептического заполнения такого рода является коммерчески доступным.

Предпочтительно, чтобы нутрицевтическая композиция также содержала один или более фармацевтически приемлемых носителей, разбавителей или вспомогательных веществ. Нутрицевтические композиции могут содержать буферы, такие как нейтральный забуференный физиологический раствор, забуференный фосфатом физиологический раствор и т.п.; углеводы, такие как глюкоза, манноза, сахароза или декстраны; маннит; белки; полипептиды или аминокислоты, такие как глицин; антиоксиданты; хелатирующие вещества, такие как ЭДТА; адъюванты и консерванты.

Нутрицевтической может быть молочная смесь, в частности адаптированная для человека молочная смесь, предназначенная для новорожденных.

Лактоферрин по второму аспекту изобретения, представленный в виде продукта питания, может принимать форму биологически активной пищевой добавки, спортивной биологически активной пищевой добавки или молочной смеси. В одном варианте реализации изобретения продукт питания представляет собой корм для животных.

В данном описании слово "содержать" или его вариации, такие как "содержит" или "содержащий", подразумевает включение определенного элемента или целого или группы элементов или целых, но не исключение любого другого элемента или целого или группы элементов или целых, если контекст не подразумевает иного.

Следует также отметить, что используемые в описании изобретения слова в единственном числе подразумевают также и множественное число, если из контекста явно не следует иное.

Специалисту в данной области техники должно быть очевидно, что хотя изобретение было описано довольно подробно в целях ясности и понимания, различные модификации и изменения в вариантах реализации изобретения и методах, приведенных в данном документе, могут быть сделаны без выхода за пределы раскрытого в данном описании изобретательского замысла.

Примеры:

Ниже приведено более подробное описание изобретения с использованием следующих примеров. Примеры приведены исключительно в иллюстративных целях и не предназначены для ограничения, если не указано иное. Таким образом, данное изобретение охватывает любые и все варианты, которые очевидны, исходя из идеи настоящего изобретения.

Пример 1: Ультрафильтрация лактоферрина для удаления малых молекул и повышения степени очистки лактоферрина

Экспериментальная установка для ультрафильтрации APV была оснащена одной 6-дюймовой мембраной с отсечением 50 кДа (Synder), а затем стабилизирована таким образом, что базовое давление составило 3,2-3,4 бар, а трансмембранное давление составило 1,2-1,4 бар. Раствор лактоферрина (2 мг/мл) был разделен на шесть частей по 2 л. В шести экспериментах, которые отличались между собой только проводимостью (0, 20, 40, 60, 80 или 100 мСм), по 2 л раствора лактоферрина помещали в расходный резервуар установки для ультрафильтрации, доводили водой до 170 л и добавляли раствор хлорида натрия до достижения необходимой проводимости. Ультраконцентрат возвращали в расходный резервуар установки для ультрафильтрации, и собирали фильтрат. Удаленный фильтрат заменялся диафильтрационным раствором той же проводимости. Степень очистки оценивали с помощью катионообменной ВЭЖХ.

Было обнаружено, что увеличение концентрации соли повышает интенсивность потока фильтрата через мембрану (Фигура 1). При этом степень очистки лактоферрина увеличилась с 95% (0 мСм) до 98,4% (100 мСм) (Фигура 2). На Фигуре 3 представлены концентрации компонентов фильтрата, причем при 100 мСм количество лактоферрина и суммарного белка возрастает. Повышение степени очистки и увеличение интенсивности потока доказывают, что дополнительный хлорид натрия улучшает способ и для оптимального осуществления способа необходимая проводимость имеет значение по меньшей мере 40 мСм. Раствор элюированного из хроматографической установки лактоферрина и собранный в UF4 должен иметь 96 мСм. Поскольку оптимальное повышение степени очистки лактоферрина происходит в диапазоне между 80 мСм и 100 мСм, такой прибор совместим с существующим способом и не требует дополнительной обработки.

Пример 2: Соль приводит к дезагрегации лактоферрина

Лактоферрин (лактоферрин составляет 95% суммарного белка) был растворен в воде до концентрации 10 мг/мл. ВЭЖХ снабдили колонкой Superdex 200 10/300 GL (GE Healthcare) и уравновесили буфером А (Трис-HCl (рН 7,1 г/л)) при скорости потока 0,5 мл/мин. Буфер В – это Трис-HCl (1 г/л), содержащий 1М хлорида натрия (рН 7), и объем инъецированного образца был 100 мкл. Количество буфера В составляло 0% от 0 мин до 50 мин, возросло до 100% буфера В от 50 мин до 90 мин, а затем возросло до 16% буфера В от 90 мин до 150 мин. Во время каждого из последующих запусков соль от 0 мин до 50 мин и от 90 мин до 150 мин увеличилась на 16% В.

Как показано на Фигуре 4, элюции лактоферрина соответствует один основной пик приблизительно на 28 минуте, за которым следуют несколько меньших пиков, включающих фрагменты лактоферрина и белки кроме лактоферрина. На хроматограмме D показан типичный профиль лактоферрина в 0,48M растворе NaCl. На хроматограмме А, полученной при отсутствии NaCl, показан меньший пик лактоферрина и больший его пик на 94 минуте. Пик на 94 минуте соответствует лактоферрину, который находился в нерастворимой форме до тех пор, пока на 50 минуте повышенный уровень соли не начал диссоциировать агрегированный лактоферрин, обеспечивая его прохождение через слой содержащейся в колонке смолы.

Результаты, показанные на Фигуре 4, подтверждают, что соль диссоциирует белки, присутствующие в 95% порошке лактоферрина, при этом диссоциированными белками не обязательно являются только молекулы лактоферрина, и приводит к тому, что отдельные белки проходят через мембрану с отсечением 50 кДа. Результаты показывают, что для возникновения эффекта диссоциации требуется более 0,32 М NaCl.

При повторении описанного выше эксперимента с жидкими пробами наблюдались аналогичные результаты.

Пример 3: Ультрафильтрация лактоферрина с целью удаления малых молекул и повышения степени очистки лактоферрина

Шесть устройств Vivacell 250 (Sartorius) были оснащены мембранами с отсечением 50 кДа. Каждое устройство было заполнено раствором лактоферрина с концентрацией 1 мг/мл до отметки 250 мл, при этом концентрация хлорида натрия в каждом растворе различалась и составляла 0, 1,5, 3, 4, 5 или 6% NaCl. Давление в ячейках достигало 3 бар. Образцы ультраконцентрата и фильтрата были собраны и проанализированы с помощью катионообменной ВЭЖХ.

Было установлено, что повышение концентрации соли увеличивает интенсивность переноса факторов роста (представленных РНКазами), а также повышает степень очистки лактоферрина в ультраконцентрате (Фигуры 5 и 6).

Пример 4: Ультрафильтрация лактоферрина с целью удаления малых молекул и повышения степени очистки лактоферрина

Установка для ультрафильтрации была оснащена одной 6-дюймовой мембраной с отсечением 50 кДа (Synder), а затем стабилизирована таким образом, что базовое давление составило 3,2-3,4 бар, а трансмембранное давление составило 1,2-1,4 бар. Раствор лактоферрина (2 мг/мл) был разделен на шесть частей по 2 л. В шести экспериментах, которые отличались между собой только проводимостью (0, 20, 40 или 60 мСм), по 2 л раствора лактоферрина помещали в расходный резервуар установки для ультрафильтрации и доводили водой до 170 л и добавляли раствор хлорида натрия до достижения необходимой проводимости. Ультраконцентрат возвращали в расходный резервуар установки для ультрафильтрации, и собирали фильтрат. Удаленный фильтрат заменялся диафильтрационным раствором той же проводимости. Степень очистки оценивали с помощью катионообменной ВЭЖХ.

Степень очистки лактоферрина увеличилась с 90,9% (0 мСм) до 93,5% (60 мСм) (Фигура 7), в целом на 2,5%. Повышение степени очистки лактоферрина было достигнуто за счет селективного удаления факторов роста (на примере РНКаз, Фигура 8).

Пример 5: Использование вторичной катионообменной хроматографии с ультрафильтрацией или без нее с целью повышения степени очистки лактоферрина

Порошок лактоферрина (40 г, 95,2% лактоферрина) был растворен в воде (200 мл) с помощью Stomacher. Образец отбирали и анализировали с помощью катионообменной ВЭЖХ. Раствор лактоферрина наносили на колонку (50 ммД × 1000 ммл), заполненную смолой Fast Flow SP (GE Healthcare). Связанный лактоферрин элюировал из смолы по длине колонки в линейном градиенте 3 л, в пределах от 0% до 5,8% (1 М) хлорида натрия. Основной пик лактоферрина был обнаружен и проанализирован при помощи катионообменной ВЭЖХ.

Небольшое количество лактоферрина (5 мл), соответствующего основному пику, разместили в ультрафильтрационном устройстве с отсечением 50 кДа (Sartorius Stedim) с центрифужным приводом, исходный объем разбавили в три раза (до 15 мл) водой, и отцентрифугировали (8000 g х 20 мин) до 1,5 мл остатка лактоферрина, после чего образец проанализировали с помощью катионообменной ВЭЖХ.

Сочетание катионообменной хроматографии с ультрафильтрацией при отсечении 50 кДа позволило достигнуть 98,9% степени очистки, что превышает 98% требуемой степени очистки белка, которую невозможно получить с помощью только хроматографии (97,8%) (Фигура 9). Катионообменная хроматография увеличивает степень очистки лактоферрина на 2,7%, а последующий этап ультрафильтрации при отсечении 50 кДа дополнительно увеличивает степень очистки на 0,9%. Примечательно, что ультрафильтрация при отсечении 50 кДа повышает степень очистки даже в очень чистом веществе. Следовательно, ультрафильтрация при отсечении 50 кДа сама по себе должна быть тщательно изучена.

Пример 6: Первоначальный эксперимент, определяющий, достаточно ли ультрафильтрация лактоферрина может повысить его степень очистки

Порошок лактоферрина (1 кг, степень очистки белка 96,3 %) был растворен в 100 л воды. Раствор лактоферрина был помещен в установку для ультрафильтрации APV, снабженную одной мембраной Synder 6,3" 50 кДа (BX-5XB-6338). Объединенный объем раствора лактоферрина и воды в установке для ультрафильтрации составил 180 л, также был добавлен хлорид натрия, при этом проводимость раствора составила 58 мСм. Фильтрат (100 л) удалили через 10 мин. После этого добавили воду (100 л) и соль для достижения проводимости 121 мСм. Фильтрат (100 л) удалили через 10 мин. Затем проводимость ультраконцентрата лактоферина уменьшили диафильтрацией с водой (400 л фильтрата) до 1300 мкСм. Затем ультраконцентрат лактоферрина лиофилизировали (48 ч, 1 мбар, 40 °С). Жидкие образцы были проанализированы на MGC катионообменной ВЭЖХ, образцы порошка также были проанализированы с помощью катионообменной ВЭЖХ по внешним стандартам (такие образцы требуют более точного анализа).

Степень очистки лактоферрина может быть увеличена приблизительно на 2% (белковая основа) при условии эффективной диафильтрации в установке для ультрафильтрации, снабженной мембранами с отсечением 50 кДа. Окончательная степень очистки достигает 98,1% (белковая основа) (Фигура 10), следовательно, данный метод вполне успешен и его дальнейшее развитие оправдано.

Пример 7: Влияние номинального отсечения по молекулярной массе на производительность мембраны

Номинальное отсечение по молекулярной массе (НОММ) оказывает наиболее важное влияние на производительность мембраны. С увеличением размера пор мембраны обеспечивается прохождение более крупных белков (Фигура 11) и интенсивность потока повышается (Фигура 12). Мембраны обладают способностью разделять компоненты в смесях, но только при условии, что один или несколько компонентов меньше, чем НОММ мембраны и один или несколько компонентов больше, чем НОММ мембраны. В итоге, для идеального разделения компонентов смеси необходима разница в молекулярной массе компонентов по меньшей мере на два порядка (т.е. вода массой 28 Да и хлорид натрия массой 58 Да могут почти полностью отделиться от лактоферрина массой 78 кДа), однако возможно также некоторое разделение при отсутствии значительной дифференциации по размеру. По-видимому, если целью является повышение степени очистки раствора лактоферрина, то использованиие мембраны с отсечением 50 кДа является лучшим существующим способом достижения данной цели (Фигура 13).

Пример 8: Ультрафильтрационные мембраны

UF4

Тип: Спиральная полиэфирсульфоновая (ПЭС) навивка НОММ: 30 кДa

Марка: Synder Модель: MK2B-6338

Установка для ультрафильтрации, известная как UF4, применялась для:

1. концентрирования лактоферрина, элюированного из катионообменной колонки, и

2. рецикла соли после элюирования лактоферрина, которую возвращают обратно в емкость с 6% солевым раствором для повторного использования в процессе хроматографии.

Обоснование способа в рамках более обширного производства лактоферрина:

- используемый в способе выделения лактоферрина хлорид натрия (2000 кг на партию) имеет существенную стоимость ($ 1200 за партию), и возможность его рецикла резко снижает стоимость производства.

- благодаря рециклу хлорида натрия снижается наносимый производством вред экологии. После доочистки на устройстве Leongatha с целью удаления органических твердых веществ жидкие отходы, содержащие хлорид натрия, сбрасывают в океан. Поэтому должны быть предприняты все необходимые меры для уменьшения количества отходов производства. Повторное использование после переработки экономит до 80% соли, следовательно, попадающая в окружающую среду масса хлорида натрия уменьшается на 8000 кг за партию (благодаря использованию UF4 остаются две трети массы соли).

Обоснование типа мембраны:

- использование спиральных мембран является сравнительно дешевым способом получения большой площади мембраны, что обеспечивает более интенсивные потоки в устройствах с небольшой установочной поверхностью.

- PES по своей сути является гидрофильной мембраной, которая смачивается быстро и полностью, что обеспечивает быструю фильтрацию со исключительной скоростью потока и высокой производительностью. PES-мембрана также очень слабо связывается с белками, сводя к минимуму вероятность забивания пор молекулами белков, что обеспечивает высокую производительность, устойчивые трансмембранные потоки и подходящую видимую пористость мембраны.

Обоснование НОММ:

- мембраны с отсечением 30 КДа успешно удерживают собранный лактоферрин (перенос через мембрану составляет 0,6% доли присутствующего белка), повышая степень очистки, при этом позволяя пройти через мембрану ключевым загрязняющим компонентам (в частности РНКазам).

Хлорид натрия (58 Да) не удерживается в мембране с отсечением 30 кДа, в отличие от лактоферрина (80 кДа), молекулы которого значительно больше. Поэтому лактоферрин, элюированный из колонки при низкой концентрации (0,1% белка), может быть сконцентрирован до 3% белка без соответствующего увеличения концентрации соли или потери белка.

UF5

Спиральная навивка из полиэфирсульфона (PES) НОММ: 5 кДа

Марка: Synder Модель: MT2B-6338

Установка для ультрафильтрации UF5 применялась для:

1. концентрирования белков кроме лактоферрина, элюированных из катионообменной колонки, и

2. рецикла 2,5% раствора соли, которую возвращают обратно в емкость с 2,5% солевым раствором для повторного использования в процессе хроматографии.

Обоснование способа в рамках более обширного производства лактоферрина:

- используемый в способе выделения лактоферрина хлорид натрия (2000 кг на партию) имеет существенную стоимость ($ 1200 за партию), и возможность его рецикла резко снижает стоимость производства.

- благодаря рециклу хлорида натрия снижается наносимый производством вред экологии. После доочистки на устройстве Leongatha с целью удаления органических твердых веществ жидкие отходы, содержащие хлорид натрия, сбрасывают в океан. Поэтому должны быть предприняты все необходимые меры для уменьшения количества отходов производства. Повторное использование соли после ее переработки экономит до 80% соли, следовательно, попадающая в окружающую среду масса хлорида натрия уменьшается на 8000 кг за партию (благодаря использованию UF5 остается одна треть массы соли).

Обоснование типа мембраны:

- использование спиральных мембран является сравнительно дешевым способом получения большой площади мембраны, что обеспечивает более интенсивные потоки в устройствах с небольшой установочной поверхностью.

- PES по своей сути является гидрофильной мембраной, которая смачивается быстро и полностью, что обеспечивает быструю фильтрацию со исключительной скоростью потока и высокой производительностью. PES-мембрана также очень слабо связывается с белками, сводя к минимуму вероятность забивания пор молекулами белков, что обеспечивает высокую производительность, устойчивые трансмембранные потоки и подходящую видимую пористость мембраны.

Обоснование НОММ:

- мембраны с отсечением 5 кДа удерживают молекулы кроме лактоферрина, что предотвращает их возвращение в хроматографический процесс и загрязнение лактоферрина в ходе его последующего элюирования. Использование мембран с меньшей пористостью обусловлено наличием в смеси белков множества мелких молекул, многие из которых являются факторами роста.

Хлорид натрия (58 Да) не удерживается на мембране с отсечением 5 кДа, в отличие от лактопероксидазы (80 кДа), иммуноглобулинов (150 - 420 кДа) и факторов роста (5 - 17 кДа), и поэтому белки, элюированные из колонки при низкой концентрации (0,1% белка), могут быть сконцентрированы до 3% белка без соответствующего увеличения концентрации соли или потери белка.

MF6

Тип: Керамические трубки (оксид алюминия) НОММ: 0,8 мкм

Марка: Pall Модель: Membralox GP 19

Установка для микрофильтрации MF6 применялась для:

1. уменьшения количества микробов, присутствующих в растворе лактоферрина; и

2. удаления нерастворимого материала.

Обоснование типа мембраны:

- керамические мембраны имеют высокую устойчивость к агрессивным средам, поэтому их можно очищать химическими веществами с целью полного удаления микробов. Также они очень крепкие и не рвутся, поэтому загрязняющие компоненты не проходят через мембрану.

Обоснование НОММ:

- уменьшение количества нерастворимого вещества (повышенная прозрачность) и микробного загрязнения

- поры мембраны размером 0,8 мкм, в отличие от 0,22 мкм, позволяют белку проходить через мембрану при умеренном объеме и концентрации твердых веществ. Фильтр не предназначен для проведения полного этапа удаления микробов, так как основное сырье (обезжиренное молоко) подвергается предварительной пастеризации.

UF7

Тип: Спираль с навивкой из поливинилиденфторида (ПВДФ) MWCO: 50 кДа

Марка: Synder Модель: BN4B-6338

Установка для ультрафильтрации UF7 применялась для:

1. повышения степени очистки лактоферрина путем уменьшения количества белков кроме лактоферрина; и

2. увеличения доли отсутствия примесей в белке более чем до 95% путем удаления хлорида натрия и остатков лактозы.

Обоснование способа в рамках более обширного производства лактоферрина:

- лактоферрин может применяться для изготовления Ферритина ОВ, имеющего более высокую степень очистки лактоферрина, чем стандартный лактоферрин. Более высокую степень очистки получают путем замены обычно мембран с отсечением 5 кДа на мембраны с отсечением 50 кДа (Фигура 14).

Обоснование типа мембраны:

- использование спиральных мембран является сравнительно дешевым способом получения большой площади мембраны, что обеспечивает интенсивные потоки в устройствах с небольшой установочной поверхностью.

– гидрофильные поливинилиденфторидные (ПВДФ) мембраны имеют высокую проницаемость для трансмембранных потоков и низкое сродство к белкам. Поэтому загрязнение пор мембраны белками совсем незначительно и в течение всего процесса интенсивность потоков и производительность мембраны остаются высокими.

Обоснование НОММ:

- мембраны с отсечением 50 КДа более предпочтительны, чем мембраны с меньшим размером пор (обычные мембраны с отсечением 5 кДа), потому что они позволяют улучшенный перенос белков кроме лактоферрина (РНКаз, факторов роста), удерживая при этом лактоферрин. Повышение переноса молекул белка кроме лактоферрина приводит к повышению степени очистки лактоферрина (среднее увеличение степени очистки белка на 1,8%, P<0,001). Более подробное описание приводится в работе "Increasing Lactoferrin Purity by Diafiltration with Salt Solution in an Ultrafiltration Plant Fitted with 50 kDa Membranes" (JR0010).

Хлорид натрия (58 Да) не удерживается мембраной с отсечением 50 кДа в отличие от лактоферрина (80 кДа), поэтому лактоферрин, элюированный из колонки при низкой концентрации (3% белка) может быть сконцентрирован до > 20% белка, без соответствующего увеличения концентрации соли или потери белка.

- увеличение общего количества твердых веществ путем удаления воды приводит к максимальному увеличению пропускной способности твердых веществ после лиофилизации.

Пример 9: Испытание промышленного масштаба, подтверждающее, что степень очистки лактоферрина может быть повышена путем ультрафильтрации при отсечении 50 кДа

Чтобы обеспечить возможность сравнения эффективности изменений, партия материала для хроматографического процесса была разделена на две части. Первая половина материала была обработана на установке UF7, оснащенной мембранами с отсечением 5 кДа, без диафильтрации солью, другая половина материала была обработана на установке UF7, оснащенной мембранами с отсечением 50 кДа при диафильтрации солью.

Стандартное осуществление процесса в промышленном масштабе было изменено путем замены мембран с отсечением 5 кДа, установленных в UF7, на мембраны 50 кДа Synder, идентичные используемым в экспериментах 1 и 6. В промышленный процесс был также добавлен этап диафильтрации солью. Используемый в диафильтрации раствор соли был получен путем добавления 150 кг хлорида натрия в 3000 кг воды.

Результаты, представленные в Таблице 1, показывают, что ультрафильтрация через мембраны с отсечением 50 кДа и этап дополнительной диафильтрации хлоридом натрия могут увеличить степень очистки лактоферрина на 2,4% (белковая основа). Окончательная степень очистки лактоферрина достигает 97,8 % (белковая основа) и приближается к целевой степени очистки 98,0% (белковая основа). Состав белка в двух партиях был аналогичен, следовательно, можно предположить, что способ не имеет негативных эффектов.

Таблица 1. Сравнение состава лактоферрина, осуществленное на установке UF7 стандартным способом, и высокая степень очистки, выявленная на UF7, указывает на то, что порошки идентичны, за исключением повышения степени очистки лактоферрина.

Стандартный процесс Процесс высокой степени очистки
LLL17FEB12B6 LLL21FEB12B6
Влага (% масс/масс) 2,3 3,1
Жир (% масс/масс) 0.3 0,4
Лактоферрин (% белка) 95,4 97,8
Остатки примесей (% масс/масс) <0,1 <0,1
Белок (% масс/масс) >97,3 >96,4

Таким образом, при проведении испытания в промышленном масштабе был получен порошок со степенью очистки лактоферрина 98,0% (белковая основа), которая на 1,1% выше, чем степень очистки раствора UF4, из которого он был получен. Процесс был успешно проведен в промышленном масштабе.

Диафильтрация лактоферрина раствором соли в установке для ультрафильтрации, оснащенной мембранами с отсечением 50 кДа, успешно привела к повышению степени очистки лактоферрина в пределах от 1% до 2,4% (белковая основа) и поэтому может использоваться в производстве продукта со степенью очистки лактоферрина 98% (белковая основа). По-видимому, для оптимального осуществления процесса необходима концентрация хлорида натрия от 5% до 6% , что удобно, так как 6% раствор хлорида натрия используется для элюирования лактоферрина из катионообменной колонки.

1. Способ очистки лактоферрина молока, включающий фильтрацию молока через фильтр с НОММ от 30 кДа до 50 кДа с целью разделения его на фракцию ультраконцентрата, содержащую лактоферрин, и фракцию фильтрата, содержащую факторы роста и/или РНКазы с молекулярной массой менее чем 30 кДа, причем во время фильтрации через фильтр с НОММ от 30 кДа до 50 кДа молоко подвергают обработке солью таким образом, что в фильтрат попадают факторы роста и/или РНКазы с молекулярной массой менее чем 30 кДа, при этом обработка солью включает поддержание молока или лактоферрина в течение фильтрации через фильтр с НОММ от 30 кДа до 50 кДа при концентрации соли, составляющей по меньшей мере 0,2 М NaCl или эквивалента, или проводимости по меньшей мере 20 мСм, причем указанную фракцию ультраконцентрата, содержащую лактоферрин, собирают.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что обработка солью длится по меньшей мере 4 часа.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что фильтрацию через фильтр с НОММ от 30 кДа до 50 кДа осуществляют при 50-70°C.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что обработка солью дезагрегирует или диссоциирует любую массу РНКаз или факторов роста таким образом, что факторы роста и/или РНКазы с молекулярной массой менее чем 30 кДа попадают в фильтрат.

5. Способ по п.1, отличающийся тем, что обработка солью отделяет любые РНКазы или факторы роста от фильтра, вследствие чего факторы роста и/или РНКазы с молекулярной массой менее чем 30 кДа попадают в фильтрат.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к новым пептидам на основе лактоферрина человека, и может быть использовано в медицине. Синтезируют пептиды, характеризующиеся последовательностью CFLWRRLMRKLR (SEQ ID NO: 74);CWLWRRAMRKVW (SEQ ID NO: 76); LRLWRRLMRKVW (SEQ ID NO: 77);RRLWRRWMRKVL (SEQ ID NO: 78); CRLWRRRMRKVW (SEQ ID NO: 79); LRLWRRSMRKVW (SEQ ID NO: 81); KKLWRRWWRKVL (SEQ ID NO: 90); RWCKLWRRLMRKVRRL (SEQ ID NO: 85);RWCFLWRRLMRKHRRL(SEQ ID NO: 86); WCKLWRRLMRKVRR(SEQ ID NO: 87); WRRWLRKSVKRL(SEQ ID NO: 93); WCRWLRKMVKAL(SEQ ID NO: 94) или WRRWLRKMVKRL(SEQ ID NO: 95).

Изобретение относится к новым пептидам, сконструированным на основании аминокислотной последовательности, соответствующей последовательности зрелого человеческого лактоферрина с 13 по 30 аминокислотный остаток, обладающим улучшенной противомикробной и/или противовоспалительной активностью, и их применению, в частности для лечения и/или предотвращения инфекций, воспалений, ран или рубцов.

Группа изобретений относится к биотехнологии. Предложены способ производства лактоферрина, фракция, содержащая лактоферрин, и ее применения.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к применению пептида, полученного из человеческого лактоферрина, в качестве маскирующего агента. Также раскрыт способ получения фармацевтической композиции.

Изобретение относится к новым производным гемина общей формулы (I) где R1 и R2 оба представляют собой ArgNH2, Arg(NO2)OMe, GlyNH2, SerNH2, SerOH, GlyOH, Glu(OH)OH, Glu(ArgNH2)ArgNH2, Glu(SerOMe)SerOMe, Glu(NHCH 2CH2OH)NHCH2CH2OH, Glu(SerNH 2)SerNH2, Glu(GlyNH2)GlyNH2 или Glu(GlyOMe)GlyOMe; Men+ представляет собой Fe 2+ или Fe3+; Hal- представляет собой F-, Cl-, Br- или I- , или его фармацевтически приемлемой соли.
Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для получения рекомбинантного лактоферрина человека. .

Изобретение относится к способам получения порфиринопептидов формулы I где R1 и R2 - заместители, которые могут представлять собой аминокислоты или пептиды, состоящие из 2-15 аминокислотных остатков, при этом -карбоксильные группы аминокислот или пептидов могут быть модифицированы С1-С8алкиловым эфиром, а боковые функции аминокислот или пептидов могут быть защищены, причем возможно, что R1=R2 или R1 R2, в частности R1=-ArgOMe, R2=-ОН (III); R1=-LeuHisOMe, R2 =-OH (IV); R1=-LeuLeuValPheOMe, R2=-OH (V); карбоксильная группа порфирина может быть модифицирована метиловым или другим C1-C8 эфиром или физиологически приемлемой солью; Y- представляет собой Cl- ; Me представляет собой Zn, Cu, Fe, Mn; путем активации карбоксильной группы порфирина действием N-окси-5-норборнен-2,3-дикарбоксиимидом при молярном соотношении исходных реагентов 1:1 и процесс ведут в присутствии N,N' – дициклогексилкарбодиимида, или действием дифенилфосфорилазида (DPPA) при эквимолярном соотношении порфирин:DPPA в присутствии основания, затем активированный по карбоксильной группе порфирин вводят в реакцию с аминокомпонентом - аминокислотой или пептидом, находящимся в виде соли с минеральной кислотой, которую нейтрализуют основанием; и к применению I в качестве нуклеолитических агентов.

Группа изобретений относится к области биотехнологии и предназначена для исследования ферментативной активности ботулинического нейротоксина. Предложена репортерная конструкция, которая содержит участок заякоривания в мембране, сайт расщепления и репортерную область, содержащую два идентичных репортерных пептида.

Настоящее изобретение относится к иммунологии. Предложено антитело к ROBO4 и его антигенсвязывающий фрагмент.

Настоящее изобретение относится к иммунологии. Предложено гуманизированное антитело или его функциональный фрагмент, которые специфически связываются с интегрином бета-1.

Изобретение относится к биотехнологии. Предложены клетка-хозяин E.coli для получения анти-VEGF антитела или антигенсвязывающего фрагмента анти-VEGF, свободных от ошибки включения норлейцина, клетка-хозяин E.coli для получения антитела против фактора D или антигенсвязывающего фрагмента против фактора D, свободных от ошибки включения норлейцина, и Клетка-хозяин E.coli для получения анти-МЕТ антитела или антигенсвязывающего фрагмента анти-МЕТ, свободных от ошибки включения норлейцина.

Настоящее изобретение относится к области иммунологии. Предложен способ получения биспецифического антитела, предусматривающий введение электрически взаимно отталкивающихся аминокислотных остатков в положения 147 тяжелой цепи и 180 легкой цепи, 147 тяжелой цепи и 131 легкой цепи или 175 тяжелой цепи и 160 легкой цепи (по нумерации ЕС), где тяжелая цепь представляет собой IgG1, а легкая цепь представляет собой IgK (Каппа).

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к антителам и их антиген-связывающим фрагментам, сконструированным для связывания трансформирующего фактора роста-β (TGFβ1, TGFβ2 и TGFβ3), что может быть использовано в медицине.

Изобретение относится к биохимии. Описан способ выделения и/или очистки гемоцианина, включающий a) обеспечение состава гемоцианина, полученного из морского моллюска, при этом указанный состав представляет собой сыворотку гемолимфы; b) уменьшение проводимости состава, который был обеспечен в п.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению иммуногенного полипептида, обеспечивающего формирование иммунного ответа против инфекции, вызываемой спирохетами комплекса Borrelia burgdorferi sensu lato, и может быть использовано для серодиагностики клещевого боррелиоза.
Изобретение относится к способу получения высокоочищенной смеси из 15 свободных аминокислот, полученной путем полного гидролиза коллагена. Способ получения полностью гидролизованного коллагена включает гидролиз в присутствии соляной кислоты при температуре +120-125°C; сорбцию аминокислот коллагена на среднесшитом катионите, например КУ-2-8; элюцию аминокислот и аммиака 2Н щелочью; отгонку аммиака из элюата под вакуумом; нейтрализацию и осветление раствора аминокислот на ионосорбенте ИА-4, согласно изобретению часть соляной кислоты, химически не связанную с аминокислотами, после окончания гидролиза удаляют в виде хлористого водорода путем вакуум-отгонки, пары хлористого водорода и воды поглощают в замкнутом цикле холодной водой и полученную соляную кислоту используют в процессе гидролиза коллагена.

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к терапевтическим химерным белкам, которые можно применять в медицине для лечения мукополисахаридоза IIIB типа (Синдром Санфилиппо В).

Изобретение относится к биотехнологии. Способ осуществляют следующим образом. Фильтруют молоко через фильтр с НОММ от 30 кДа до 50 кДа для разделения его на фракцию ультраконцентрата, содержащую лактоферрин, и фракцию фильтрата, содержащую факторы роста иили РНКазы с молекулярной массой менее чем 30 кДа. Во время фильтрации через фильтр с НОММ от 30 кДа до 50 кДа молоко подвергают обработке солью, по меньшей мере, в течение 4 ч, таким образом, что в фильтрат попадают факторы роста иили РНКазы с молекулярной массой менее чем 30 кДа. При этом обработка солью включает поддержание молока или лактоферрина в течение фильтрации через фильтр с НОММ от 30 кДа до 50 кДа при концентрации соли, составляющей по меньшей мере 0,2 М NaCl или эквивалента, или проводимости по меньшей мере 20 мСм. Собирают указанную фракцию ультраконцентрата, содержащую лактоферрин. Изобретение обеспечивает получение продукта в промышленном масштабе со степенью очистки лактоферрина 98,0. 4 з.п. ф-лы, 14 ил., 1 табл., 9 пр.

Наверх