Способы повышения специфического захвата ботулиновых нейротоксинов клетками

Группа изобретений относится к медицине и касается способа повышения специфического захвата нейротоксического полипептида клетками, включающего инкубацию с нейротоксическим полипептидом клеток, восприимчивых к интоксикации нейротоксином, в течение времени и в условиях, которые позволяют нейротоксическому полипептиду проявить свою биологическую активность, причем инкубация включает по меньшей мере два из следующих этапов: (i) K⁺-опосредованную деполяризацию клеток, (ii) уменьшенное время воздействия нейротоксического полипептида, составляющее по меньшей мере 24 часа и меньше 96 часов, и/или (iii) встряхивание клеток во время воздействия нейротоксического полипептида, что приводит к повышению специфического захвата нейротоксического полипептида указанными клетками, причем специфический захват нейротоксического полипептида в клетку повышен по меньшей мере в 1,5 раза по сравнению со способом с применением условий культивирования клеток, которые не включают (i), (ii) и/или (iii). Группа изобретений также касается способа прямого определения биологической активности нейротоксического полипептида в клетках. Группа изобретений обеспечивает повышение специфического захвата нейротоксического пептида в клетки. 2 н. и 13 з.п. ф-лы, 2 пр., 1 ил.

 

В настоящем изобретении предложен способ повышения специфического захвата нейротоксического полипептида клетками, включающий инкубацию с нейротоксическим полипептидом клеток, восприимчивых к интоксикации нейротоксином, в течение времени и в условиях, которые позволяют нейротоксическому полипептиду проявить свою биологическую активность, причем инкубация включает по меньшей мере один из следующих этапов: (i) K⁺-опосредованную деполяризацию клеток, (ii) уменьшение времени воздействия нейротоксического полипептида и/или (iii) встряхивание клеток во время воздействия нейротоксического полипептида, что приводит к повышению специфического захвата нейротоксического полипептида указанными клетками. Кроме того, в настоящем изобретении предложен способ прямого определения биологической активности нейротоксического полипептида в клетках, включающий: а) инкубацию с нейротоксическим полипептидом клеток, восприимчивых к интоксикации нейротоксином, в течение времени и в условиях, которые позволяют нейротоксическому полипептиду проявить свою биологическую активность, причем инкубация включает по меньшей мере один из следующих этапов: (i) K⁺-опосредованную деполяризацию клеток, (ii) уменьшение времени воздействия нейротоксического полипептида и/или (iii) встряхивание клеток во время воздействия нейротоксического полипептида; b) фиксацию клеток и необязательно увеличение проницаемости мембраны клеток детергентом; с) контактирование клеток по меньшей мере с первым захватывающим антителом, специфически связывающимся с нерасщепленным и расщепленным нейротоксином субстратом, и по меньшей мере со вторым захватывающим антителом, специфически связывающимся с участком расщепления субстрата, расщепленного нейротоксином, в условиях, которые делают возможным связывание указанных захватывающих антител с указанными субстратами; d) контактирование клеток по меньшей мере с первым детекторным антителом, специфически связывающимся с первым захватывающим антителом, в условиях, которые делают возможным связывание указанного первого детекторного антитела с указанным первым захватывающим антителом, с образованием первых детекторных комплексов, и по меньшей мере со вторым детекторным антителом, специфически связывающимся со вторым захватывающим антителом, в условиях, которые делают возможным связывание указанного второго детекторного антитела с указанным вторым захватывающим антителом, с образованием вторых детекторных комплексов; е) определение количества первых и вторых детекторных комплексов этапа d); и f) расчет количества субстрата, расщепленного указанным нейротоксическим полипептидом в указанных клетках, с использованием вторых детекторных комплексов для определения биологической активности указанного нейротоксического полипептида в указанных клетках.

Clostridium botulinum и Clostridium tetani продуцируют высокоактивные нейротоксины, а именно ботулиновые токсины (BoNT) и столбнячный токсин (TeNT) соответственно. Эти клостридиальные нейротоксины (CNT) специфически связываются с нейронными клетками и нарушают высвобождение нейромедиатора. Каждый токсин синтезируется в виде неактивного непроцессированного одноцепочечного белка массой около 150 кДа. Посттрансляционный процессинг включает образование дисульфидных мостиков и ограниченный протеолиз (одноцепочечный разрыв) бактериальной(-ыми) протеазой(-ами). Активный нейротоксин состоит из двух цепей: N-концевой легкой цепи массой около 50 кДа и тяжелой цепи массой около 100 кДа, которые связаны дисульфидной связью. CNT структурно и функционально состоят из трех доменов, а именно каталитической легкой цепи, тяжелой цепи, включающей домен транслокации (N-концевая половина) и рецептор-связывающий домен (С-концевая половина); см., например, Krieglstein 1990, Eur. J. Biochem. 188, 39; Krieglstein 1991, Eur. J. Biochem. 202, 41; Krieglstein 1994, J. Protein Chem. 13, 49. Ботулиновые нейротоксины синтезируются в виде молекулярных комплексов, содержащих нейротоксический белок массой 150 кДа и связанные нетоксические белки. Размеры комплексов различаются в зависимости от штамма клостридий и определенных серотипов нейротоксина и находятся в диапазоне от 300 кДа, более 500 кДа и 900 кДа. Нетоксические белки в этих комплексах стабилизируют нейротоксин и защищают его от разрушения; см. Silberstein 2004, Pain Practice 4, S19-S26.

Clostridium botulinum секретирует семь серотипов ботулинового нейротоксина с определенными антигенными свойствами, обозначаемых буквами от А до G (BoNT/A-BoNT/G). Все серотипы вместе с родственным столбнячным нейротоксином (TeNT), секретируемым Clostridium tetani, представляют собой Zn2+-эндопротеазы, которые блокируют синаптический экзоцитоз посредством расщепления белков SNARE; см. Couesnon, 2006, Microbiology, 152, 759. CNT вызывают вялый мышечный паралич, наблюдаемый при ботулизме и столбняке; см. Fischer 2007, PNAS 104, 10447. Недавно был выявлен новый тип ботулинового токсина, а именно BoNT/H; см. Barash and Arnon, J. Infect. Dis. (2014), 209 (2): 183-191 и Dover, Barash, Hill, Xie and Arnon, J. Infect. Dis. (2014), 209 (2): 192-202.

Несмотря на токсические эффекты, комплекс ботулинового токсина используется в качестве терапевтического агента при множестве заболеваний. Серотип А ботулинового токсина был одобрен для применения у человека в США в 1989 г. при лечении косоглазия, блефароспазма и других расстройств. На рынке он присутствует в виде белкового препарата ботулинового токсина A (BoNT/A), например, под торговым названием BOTOX (Allergan, Inc.) или DYSPORT/RELOXIN (Ipsen, Ltd). Улучшенный, не содержащий комплекс препарат ботулинового токсина А присутствует на рынке под торговым названием XEOMIN (Merz Pharma GmbH & Co. KGaA). Для терапевтического применения препарат вводят непосредственно в интересующую мышцу. При физиологическом рН токсин высвобождается из белкового комплекса и оказывает нужный фармакологический эффект. Действие ботулинового токсина только временное, поэтому для поддержания терапевтического эффекта может потребоваться повторное введение ботулинового токсина.

Клостридиальные нейротоксины ослабляют произвольную мышечную силу и представляют собой эффективное терапевтическое средство при косоглазии, фокальной дистонии, включая цервикальную дистонию, и доброкачественном эссенциальном блефароспазме. Известно, что они также уменьшают гемифациальный спазм и фокальную мышечную спастичность и, кроме того, эффективны при широком диапазоне других показаний, таких как желудочно-кишечные расстройства, гипергидроз и косметическая коррекция морщин; см. Jost 2007, Drugs 67, 669.

В процессе производства клостридиальных нейротоксинов особое значение имеет качественное и количественное определение указанных нейротоксинов, а также контроль качества биологически активных нейротоксических полипептидов. Кроме того, государственные органы учитывают только простые, надежные и прошедшие валидацию анализы активности ботулинового токсина. В настоящее время мышиный биологический анализ LD₅₀ (тест на летальность) остается «золотым стандартом», применяемым производителями фармацевтических средств для анализа активности получаемых составов; см. Arnon et al. (2001), JAMA 285, 1059-1070. Однако в последние годы были приложены значительные усилия по поиску альтернативных подходов для того, чтобы снизить потребность в проведении испытаний на животных и устранить все недостатки, уменьшить затраты и решить этические вопросы, связанные с этим типом анализов на животных. Кроме того, регулирующие органы обязывают фармацевтические компании применять принцип трех «R» в отношении тестирования активности ботулиновых нейротоксинов: «Reduce, Refine, Replace» («снижение, очищение, замещение»); см. Straughan, Altern. Lab. Anim. (2006), 34, 305-313. В результате были разработаны клеточные тест-системы в качестве приемлемой альтернативы способам, в которых используются живые животные. Однако в настоящее время доступны только три клеточные тест-системы, позволяющие определять биологическую активность нейротоксина, которые являются достаточно чувствительными к нейротоксическим полипептидам. Эти клеточные тест-системы включают применение первичных нейронов, выделенных из эмбрионов грызуна, которые подвергают дифференцированию in vitro (Pellett et al. (2011), Biochem. Biophys. Res. Commun. 404, 388-392), нейронально-дифференцированных индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (Whitemarsh et al. (2012), Toxicol. Sci. 126, 426-35) и субклона клеточной линии SiMa (WO 2010/105234 Al).

Однако выделение первичных нейронов требует умерщвления животных, а также является трудоемким и затратным. Кроме того, тест-системы, в которых используются различные первичные нейроны, демонстрируют выраженную вариабельность. Аналогично, создание нейронально-дифференцированных индуцированных плюрипотентных стволовых клеток является сложным и занимает много времени. Кроме того, хранение таких клеток представляет собой очень трудную задачу. Анализы, в которых используются опухолевые клеточные линии, часто имеют недостаточную чувствительность к BoNT. Более того, для указанных опухолевых клеточных линий необходимы сложные протоколы дифференцирования, что приводит к выраженной вариабельности и/или высокой вероятности ошибки при выполнении анализов с использованием указанных клеточных линий.

С учетом вышеизложенного существует значительная потребность в дополнительных тест-системах для определения активности нейротоксического полипептида.

Таким образом, техническую проблему, лежащую в основе настоящего изобретения, можно обозначить как обеспечение средств и способов, удовлетворяющих вышеупомянутым потребностям. Техническая проблема решается посредством вариантов осуществления, описанных в формуле изобретения и ниже в настоящем документе.

В первом аспекте настоящее изобретение относится к способу повышения специфического захвата нейротоксического полипептида клетками, включающему: инкубацию с нейротоксическим полипептидом клеток, восприимчивых к интоксикации нейротоксином, в течение времени и в условиях, которые позволяют нейротоксическому полипептиду проявить свою биологическую активность, причем инкубация включает по меньшей мере один из следующих этапов: (i) K⁺-опосредованную деполяризацию клеток,

(ii) уменьшение времени воздействия нейротоксического полипептида и/или

(iii) встряхивание клеток во время воздействия нейротоксического полипептида, что приводит к повышению специфического захвата нейротоксического полипептида указанными клетками. Предпочтительно данный способ представляет собой способ in vitro.

Клостридиальные нейротоксические полипептиды действуют внутри синаптического окончания, блокируя высвобождение нейромедиатора. Нейротоксин попадает в нейрон путем связывания с мембранными рецепторами нейрона, поглощаясь эндосомоподобным компартментом и проникая через мембрану эндосомы посредством рН-зависимого процесса транслокации. Оказавшись внутри синаптической цитоплазмы, клостридиальные нейротоксины расщепляют соответствующие субстраты белков SNARE, необходимые для слияния синаптической везикулы.

Более конкретно, клостридиальные нейротоксины отличаются тем, что они специфически ингибируют секрецию нейромедиаторов из пресинаптических нервных окончаний. Селективность периферических нейронов опосредуется распознаванием различных рецепторов, таких как SV2 и GT1b. Например, специфический захват BoNT/A пресинаптическими нервными окончаниями представляет собой жестко контролируемый многоэтапный процесс, включающий комбинацию рецепторов с высокой и низкой аффинностью. Связывание с ганглиозидом GT1b опосредует этап первичного связывания и посредством этого концентрирует BoNT/A на клеточной поверхности. После закрепления в мембране боковые перемещения внутри плазматической мембраны инициируют межмолекулярные взаимодействия BoNT/A с дополнительными (белковыми) рецепторами, такими как SV2 или FGFR3. Рецептором для BoNT/A является ганглиозид GT1b со связывающим карманом в С-концевом участке рецептор-связывающего домена. В соответствии с рецепторной моделью APR множество пресинаптических рецепторов (APR), сгруппированных в микродомены на пресинаптической мембране, являются ответственными за специфический захват нейротоксинов, включая BoNT/A. Именно связывание с ганглиозидом GT1b опосредует этап первичного связывания и концентрирует BoNT/A на клеточной поверхности. После закрепления в мембране боковые перемещения внутри плазматической мембраны инициируют межмолекулярные взаимодействия BoNT/A с белковыми рецепторами, включая три изоформы гликопротеина синаптической везикулы (SV), гликопротеина 2, SV2A (ENSG00000159164), В (ENSG00000185518) и С (ENSG00000122012), которые после слияния синаптических везикул с пресинаптической мембраной оказываются на наружной поверхности плазматической мембраны. BoNT/A специфически распознает четвертый люминальный домен (LD4) SV2. Специфическая последовательность в связывающем домене BoNT/A, которая взаимодействует с SV2, до сих пор не идентифицирована. Кроме того, было выявлено, что гликозилированные SV2A, В и С представляют собой рецепторы для BoNT/F, а гликозилированные SV2A и В представляют собой рецепторы для BoNT/E. Было выявлено, что BoNT/D проникает в нейроны посредством двух участков связывания с ганглиозидом: один участок находится в положении, ранее выявленном в BoNT/A, В, E, F и G, а другой участок сходный со вторым ганглиозид-связывающим карманом TeNT. Недавно также было показано, что BoNT/D использует SV2 (все три изоформы) для попадания в нейроны гиппокампа, но BoNT/D связывается с SV2 посредством механизма, отличающегося от используемого BoNT/A и BoNT/E. Кроме того, было показано, что SV2A и SV2B опосредуют связывание и попадание TeNT в центральные нейроны; см. Jacky et al., PLoS Pathog. 2013 May; 9 (5): e1003369 и ссылки, приведенные там.

Физиологический эффект нейротоксинов основан на расщеплении белка комплекса SNARE после связывания с рецептором и транслокации легкой цепи нейротоксина. Определение биологической активности клостридиальных нейротоксинов представляет собой важный аспект в определении характеристик указанных нейротоксических белков и, среди прочего, является одним из требований регулирующих органов при регистрации продуктов, содержащих клостридиальный нейротоксин. Таким образом, надежный тест, позволяющий измерить биологическую активность клостридиальных нейротоксинов, представляет собой основу для исследования, разработки и сбыта продуктов, содержащих клостридиальные нейротоксины. Более того, по этическим причинам клеточные тест-системы должны заменить преобладающие в настоящее время испытания на животных. Для создания таких клеточных тест-систем необходимо, чтобы нейронные клетки или клеточные линии обладали достаточно высокой чувствительностью к клостридиальным нейротоксинам.

Авторы настоящего изобретения в качестве преимущества обнаружили, что специфический захват клостридиальных нейротоксических полипептидов клетками, восприимчивыми к интоксикации клостридиальным нейротоксином, можно увеличить посредством выполнения по меньшей мере одного из следующих этапов: (i) K⁺-опосредованной деполяризации клеток, (ii) уменьшения времени воздействия нейротоксического полипептида или (iii) встряхивания клеток во время воздействия нейротоксического полипептида. При этом неспецифический захват нейротоксического полипептида или продуктов его разложения может быть снижен посредством аналогичных мер. В частности, неспецифический клеточный захват упомянутого нейротоксина и продуктов его разложения снижается при уменьшении периода времени инкубации клеток с нейротоксином. K⁺-опосредованная деполяризация клеток стимулирует специфический захват нейротоксина. Кроме того, встряхивание клеток после интоксикации нейротоксином влияет на концентрацию биофазы вблизи мембраны нейрона и, следовательно, способно уменьшить неспецифический захват, а также увеличить специфический захват нейротоксина клетками. Соответствующие данные показаны в представленных ниже примерах. Кроме того, на Фиг. 1 показано сравнение трех примеров клеточных анализов, в которых образцы, подвергнутые стрессовому воздействию, демонстрируют схожую с контрольным анализом (мышиным биологическим анализом LD₅₀) кинетику распада.

Соответственно, в одном аспекте способа настоящего изобретения снижается неспецифический клеточный захват нейротоксического полипептида или продуктов его разложения.

Настоящее изобретение также предусматривает селективность к поврежденным молекулам, например, в результате разрушения ботулинового нейротоксина при хранении в рамках испытания стабильности. Так как высвобождение нейромедиатора индуцируется K⁺-опосредованной деполяризацией, последующее увеличение повторного захвата везикул включает специфический захват посредством связывания с такими рецепторами, как GT1b и/или представители семейства белков SV2. Поврежденная молекула может слабее связываться с рецептором или вообще не связываться с ним. То же самое справедливо и для физических воздействий, например встряхивания. Менее стабильное связывание поврежденной молекулы будет еще ниже после встряхивания.

Для повышения специфического захвата нейротоксического полипептида клетками, восприимчивыми к интоксикации нейротоксином, клетки инкубируют с нейротоксическим полипептидом в течение времени и в условиях, которые позволяют нейротоксическому полипептиду проявить биологическую активность. Такие периоды времени и условия клеточной культуры известны в данной области. В способах настоящего изобретения условия клеточной культуры включают по меньшей мере один из следующих этапов: (i) K⁺-опосредованную деполяризацию клеток, (ii) уменьшение времени воздействия нейротоксического полипептида или (iii) встряхивание клеток во время воздействия нейротоксического полипептида. Способ настоящего изобретения также может включать два из упомянутых этапов, например этапы (i) и (ii), этапы (i) и (iii), этапы (ii) и (iii), или все три этапа (i)-(iii). Предпочтительно, чтобы условия клеточной культуры включали каждый из представленных ниже этапов, т.е. (i) K⁺-опосредованную деполяризацию клеток, (ii) уменьшение времени воздействия нейротоксического полипептида и (iii) встряхивание клеток во время воздействия нейротоксического полипептида.

Как правило, среда клеточной культуры, используемая в анализах активности нейротоксина в данной области, содержит около 5 мМ K⁺. Нейроны, как правило, создают градиент ионов посредством активного транспорта ионов K⁺ из среды внутрь клетки и ионов Na⁺ из цитозоли через плазматическую мембрану за пределы клетки. В результате на мембране создается потенциал, который жестко регулируется клеткой и представляет собой основу нескольких различных клеточных процессов, включая обмен информацией между клетками. Внезапное изменение специфической ионной проницаемости плазматической мембраны или резкое нарушение ионной композиции с любой из стороны мембраны приводит к изменению мембранного потенциала, называемому деполяризацией. K⁺-опосредованную деполяризацию клеток можно выполнять при повышенной концентрации K⁺ в среде клеточной культуры, например дополнительной концентрации K⁺ около 10 мМ, 20 мМ, 30 мМ, 40 мМ, 50 мМ или 55 мМ. Конечная концентрация K⁺ в способах настоящего изобретения может составлять около 15 мМ, 25 мМ, 30 мМ, 35 мМ, 40 мМ, 45 мМ, 50 мМ, 55 мМ или 60 мМ K⁺. Длительность K⁺-опосредованной деполяризации составляет по меньшей мере около 30 минут, 1 часа, полутора часов, 2 часов, 2 с половиной часов, 3 часов или даже больше.

K⁺-опосредованная деполяризация клеток и/или воздействие нейротоксического полипептида может выполняться в присутствии ганглиозида GT1b. GT1b можно использовать в концентрации около 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 или 60 мкМ, предпочтительно от около 15 мкМ до около 50 мкМ, более предпочтительно около 20 мкМ.

Время воздействия нейротоксического полипептида, используемое в данной области, как правило, составляет от около 4 часов до около 96 часов, часто около 72 часов. Уменьшенное время воздействия нейротоксического полипептида представляет собой интоксикацию клеток нейротоксическим полипептидом в течение по меньшей мере 24 часов и менее 96 часов, предпочтительно в течение по меньшей мере 48 часов, по меньшей мере 60 часов и максимум 72 часов.

Встряхивание клеток в процессе воздействия нейротоксическим полипептидом можно выполнять с помощью средств и способов, известных в данной области, например магнитной мешалки, вращения роторных колб или встряхивания клеток шейкерами. Встряхивание клеток выполняют при соответствующей скорости потока среды клеточной культуры, которая позволяет избежать отсоединения клеток от колбы для тканей. Приемлемые средние скорости потока среды находятся, например, в диапазоне от около 25 см/мин до около 300 см/мин.

Вышеупомянутую K⁺-опосредованную деполяризацию клеток можно также выполнять в присутствии GT1b и нейротоксического полипептида с последующим воздействием нейротоксического полипептида в течение дополнительного периода времени, например около 24 часов, 36 часов, 48 часов, 60 часов или 72 часов, при встряхивании.

Кроме того, предполагается, что перед воздействием нейротоксического полипептида выполняется инкубация без нейротоксического полипептида. Например, время инкубации без нейротоксического полипептида может составлять около 6, 12, 18, 24, 30, 36, 42, 48, 54 или 60 часов, предпочтительно от около 16 до около 48 часов.

Дополнительные предпочтительные варианты осуществления способов настоящего изобретения могут быть разработаны на основании следующих примеров.

Термин «нейротоксический полипептид» или кратко «нейротоксин» или «токсин» в настоящем документе означает клостридиальные нейротоксины, т.е. нейротоксины Clostridium botulinum и Clostridium tetani, в частности ботулиновые нейротоксины (BoNT) и столбнячный нейротоксин (TeNT). Более конкретно, указанный термин охватывает BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C1, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F, BoNT/G, BoNT/H (Barash and Arnon, J. Infect. Dis. (2014), 209 (2): 183-191) и столбнячный нейротоксин (TeNT), а также их подтипы. Например, подтипы BoNT/A включают BoNT/A1, BoNT/A2, BoNT/А3, BoNT/A4 и BoNT/A5. Подтипы BoNT/B включают, например, BoNT/B1, BoNT/B2, BoNT/B3, BoNT/B4, BoNT/B5, BoNT/В6, BoNT/B7 и BoNT/B8. Подтипы BoNT/C включают, например, BoNT/C1-1 и BoNT/C1 2. Кроме того, включен подтип BoNT/D-C. Подтипы BoNT/E включают, например, BoNT/E1, BoNT/E2, BoNT/E3, BoNT/E4, BoNT/E5, BoNT/Е6, BoNT/E7, B0NT/E8 и BoNT/E9. Кроме того, подтипы BoNT/F включают, например, BoNT/F1, BoNT/F2, BoNT/F3, BoNT/F4, BoNT/F5, B0NT/F6 и BoNT/F7. Дополнительные подтипы описаны, например, в публикации Hill et al. (J Bacteriol. 2007 Feb; 189 (3): 818-32. Epub 2006 Nov 17.), которая включена в настоящий документ путем ссылки. Нейротоксический полипептид и, в частности, его легкую цепь и тяжелую цепь получают из одного из серотипов ботулиновых нейротоксинов с различными антигенными свойствами или указанных выше подтипов. В одном аспекте указанные легкая и тяжелая цепи нейротоксического полипептида представляют собой легкую и тяжелую цепи нейротоксина, выбранного из группы, состоящей из: BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C1, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F, BoNT/G, BoNT/H или TeNT. В другом аспекте полинуклеотид, кодирующий указанные нейротоксические полипептиды, содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1 (BoNT/A), SEQ ID NO: 3 (BoNT/B), SEQ ID NO: 5 (BoNT/C1), SEQ ID NO: 7 (BoNT/D), SEQ ID NO: 9 (BoNT/E), SEQ ID NO: 11 (BoNT/F), SEQ ID NO: 13 (BoNT/G) или SEQ ID NO: 15 (TeNT). Более того, один аспект включает полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность, представленную в любой одной из SEQ ID NO: 2 (BoNT/A), SEQ ID NO: 4 (BoNT/B), SEQ ID NO: 6 (BoNT/C1), SEQ ID NO: 8 (BoNT/D), SEQ ID NO: 10 (BoNT/E), SEQ ID NO: 12 (BoNT/F), SEQ ID NO: 14 (BoNT/G) или SEQ ID NO: 16 (TeNT). Кроме того, один аспект способов настоящего изобретения включает нейротоксический полипептид, содержащий или состоящий из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из: SEQ ID NO: 2 (BoNT/A), SEQ ID NO: 4 (BoNT/B), SEQ ID NO: 6 (BoNT/C1), SEQ ID NO: 8 (BoNT/D), SEQ ID NO: 10 (BoNT/E), SEQ ID NO: 12 (BoNT/F), SEQ ID NO: 14 (BoNT/G) и SEQ ID NO: 16 (TeNT). Кроме того, включена соответствующая нуклеотидная или аминокислотная последовательность недавно описанного BoNT/H, как показано, например, в публикации Dover, N. et al., (2014), J Infect Dis 209 (2): 192-202.

В другом аспекте указанный полинуклеотид представляет собой вариант вышеупомянутых полинуклеотидов или полипептидов. Этот вариант может представлять собой нейротоксический полинуклеотид или полипептид природного происхождения, например вышеупомянутые изоформы или подтипы клостридиального нейротоксина. Например, специалистам в данной области будет понятно, что в пределах каждого серотипа ботулинового нейротоксина присутствуют варианты ботулинового нейротоксина природного происхождения, для которых характерны некоторые отличия в аминокислотной последовательности, а также в нуклеиновых кислотах, кодирующих эти белки.

Этот вариант может также представлять собой нейротоксический полипептид неприродного происхождения. В настоящем документе термин «вариант неприродного происхождения» клостридиального нейротоксина означает клостридиальный нейротоксин, продуцированный при содействии человека, включая, без ограничений, клостридиальный нейротоксин, продуцированный с помощью генной инженерии или рекомбинантных способов, например случайного мутагенеза или разумного проектирования, ферментативно-модифицированные варианты клостридиальных нейротоксинов, которые модифицированы воздействием ферментов, таких как эндо- и экзопротеолитические ферменты, или клостридиальные нейротоксины, продуцированные химическим синтезом. Термин «генетическая манипуляция» относится к способам, известным в данной области, используемым для модификации нативного клостридиального нейротоксина любого серотипа/подтипа посредством модификации гена, кодирующего клостридиальный нейротоксин, или соответствующих нуклеиновых кислот, таких как ДНК или мРНК. Рекомбинантные способы генной инженерии полинуклеотида, кодирующего нейротоксический полипептид, или нейротоксического полипептида хорошо известны в данной области; см., например, Sambrook, J. & Russell, D. (2001). Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 3rd edn. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory.

Более того, вариант полинуклеотида природного или неприродного происхождения в настоящем документе в другом аспекте содержит вариант нуклеотидной последовательности, идентичный по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% нуклеотидной последовательности, представленной в любой одной из SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 или 15, или нуклеотидной последовательности BoNT/H, представленной в публикации Dover, N. et al., (2014), J Infect Dis 209 (2): 192-202, или вариант нуклеотидной последовательности, который кодирует аминокислотную последовательность, идентичную по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% аминокислотной последовательности, представленной в любой одной из SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 или 16, или аминокислотной последовательности BoNT/H, представленной в публикации Dover, N. et al., (2014), J Infect Dis 209 (2): 192-202. Термин «идентичный» в настоящем документе относится к идентичности последовательности, оцененной посредством определения числа идентичных аминокислот между двумя нуклеотидными последовательностями или двумя аминокислотными последовательностями, причем последовательности выровнены таким образом, чтобы достичь наибольшего возможного соответствия. Ее можно рассчитывать с помощью опубликованных методик или способов, реализованных в виде компьютерных программ, таких как, например, BLASTP, BLASTN или FASTA (Altschul 1990, J Mol Biol 215, 403). Значения идентичности в процентах в одном аспекте рассчитывают для всей аминокислотной последовательности, например для легкой цепи или тяжелой цепи нейротоксического полипептида или для обеих. Специалист в данной области может использовать ряд программ, основанных на разнообразных алгоритмах, для сравнения различных последовательностей. В данном контексте алгоритмы Нидлмана-Вунша или Смита-Ватермана позволяют получить наиболее надежные результаты. Для выполнения выравнивания последовательностей можно использовать программу PileUp (Higgins 1989, CABIOS 5,151) или программы Gap и BestFit (Needleman 1970, J Mol Biol 48; 443; Smith 1981, Adv Appl Math 2, 482), входящие в программный пакет GCG (Genetics Computer Group 1991, 575 Science Drive, г. Мадисон, штат Висконсин, США 53711). Значения идентичности последовательностей в процентах (%), как описано выше, в другом аспекте настоящего изобретения определяют с использованием программы GAP для всей области последовательности со следующими настройками: штраф за делецию: 50, штраф за продолжение делеции: 3, среднее совпадение: 10,000 и среднее несовпадение: 0,000, которые при отсутствии иных указаний следует использовать в качестве стандартных настроек для выравнивания последовательностей. В одном аспекте каждый из вышеупомянутых вариантов полинуклеотидов кодирует полипептид, обладающий одним или более, а в другом аспекте всеми указанными в настоящем документе биологическими свойствами соответствующего нейротоксического полипептида, т.е. BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C1, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F, BoNT/G, BoNT/H или столбнячного нейротоксина (TeNT). Специалистам в данной области будет понятно, что полная биологическая активность развивается только после протеолитической активации, хотя не исключено, что непроцессированный предшественник может выполнять некоторые биологические функции или быть частично активным. Анализы in vivo по оценке биологической активности клостридиального нейротоксина включают мышиный анализ LD50 и мышиный гемидиафрагмальный анализ ex vivo, как описано в Pearce et al. (Pearce 1994, Toxicol. Appl. Pharmacol. 128: 69-77) и Dressler et al. (Dressler 2005, Mov. Disord. 20: 1617-1619, Keller 2006, Neuroscience 139: 629-637). Биологическая активность обычно выражается в мышиных единицах (MU). При использовании в настоящем документе 1 MU представляет собой такое количество нейротоксического компонента, которое убивает 50% указанной популяции мышей после внутрибрюшинной инъекции, т.е. мышиная внутрибрюшинная доза LD50. В дополнительном аспекте варианты полинуклеотидов могут кодировать нейротоксины, имеющие улучшенные или измененные биологические свойства, например, они могут содержать участки расщепления, которые лучше распознаются ферментом, и/или могут быть улучшены в отношении связывания с рецептором, интернализации, транслокации через эндосомальную мембрану в цитозоль или эндопротеолитического расщепления соответствующего субстрата из семейства белков SNARE.

Не имеющие ограничительного характера примеры вариантов клостридиального нейротоксина неприродного происхождения включают, например, консервативные варианты клостридиального нейротоксина. В настоящем документе термин «консервативный вариант клостридиального нейротоксина» означает клостридиальный нейротоксин, в котором по меньшей мере одна аминокислота замещена другой аминокислотой или аминокислотным аналогом, который обладает по меньшей мере одним свойством, аналогичным такому свойству исходной аминокислоты из эталонной последовательности клостридиального нейротоксина, как определено в настоящем документе, например аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO. 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 или 16, или аминокислотной последовательности BoNT/H, представленной в публикации Dover, N. et al., (2014), J Infect Dis 209 (2): 192-202. Вариант может иметь одну, две, три, четыре, пять или даже больше консервативных аминокислотных замен по сравнению с эталонной последовательностью. Вариант должен иметь сравнимые или даже улучшенные свойства по сравнению с эталонной последовательностью клостридиального нейротоксина. Примеры свойств включают, без ограничений, аналогичный размер, топографию, заряд, гидрофобность, гидрофильность, липофильность, способность образовывать ковалентные связи, способность образовывать водородные связи, физико-химическое свойство и т.п. или любую их комбинацию. Предпочтительно свойство представляет собой биологическое свойство, как определено в настоящем документе, т.е. (а) связывание с рецептором, (b) интернализацию, (с) транслокацию через эндосомальную мембрану в цитозоль и/или (d) эндопротеолитическое расщепление белков, участвующих в слиянии с мембраной синаптической везикулы. Консервативный вариант клостридиального нейротоксина способен функционировать по существу так же, как эталонный клостридиальный нейротоксин, на основе которого он создан, и может быть замещен эталонным клостридиальным нейротоксином в любом аспекте настоящего изобретения. Клостридиальный нейротоксин, описанный в настоящем документе, будет, как правило, содержать аминокислотные остатки природного происхождения, но в некоторых случаях также могут присутствовать аминокислотные остатки неприродного происхождения. Таким образом, в контексте настоящего изобретения также можно использовать так называемые «пептидомиметики» и «пептидные аналоги», которые могут включать неаминокислотные химические структуры, имитирующие структуру конкретной аминокислоты или пептида. Такие миметики или аналоги, как правило, обладают аналогичными физическими характеристиками, такими как размер, заряд или гидрофобность, а также надлежащая пространственная ориентация, которые обнаруживаются в соответствующем естественном пептиде. Конкретным примером пептидомиметика является соединение, в котором амидная связь между одной или более аминокислотами заменена, например, углеродной связью или другой неамидной связью, как известно в данной области; см., например, Sawyer, Peptide Based Drug Design, pp. 378-422, ACS, Washington D.C. 1995.

В настоящем документе вариант нейротоксического полипептида дополнительно включает химически модифицированные нейротоксические полипептиды. В настоящем документе термин «химическая модификация» по существу относится к способам, известным в данной области, используемым для модификации нативного или рекомбинантного клостридиального нейротоксина любого серотипа или подтипа посредством химических реакций или т.п.; особенно он относится к заменам, делециям, вставкам, добавлениям или посттрансляционным модификациям аминокислот клостридиального нейротоксина. Химически модифицированный нейротоксический полипептид можно модифицировать путем присоединения пирувильных групп, фосфорилирования, сульфатации, липидизации, пегилирования, гликозилирования и/или химического присоединения аминокислоты или полипептида, содержащего, например, от около двух до около 500 аминокислот. Например, клостридиальный нейротоксин или токсин, который получен из клостридиального токсина посредством химической модификации или генетической манипуляции, можно стабилизировать путем включения в нейротоксический полипептид гиалуроновой кислоты, или поливинилпирролидона, или полиэтиленгликоля, или их смесей.

Другой вариант клостридиального нейротоксина неприродного происхождения, который можно использовать в способах настоящего изобретения, представляет собой гибридный клостридиальный нейротоксин. В одном аспекте гибридный клостридиальный нейротоксин содержит комбинацию тяжелой цепи и легкой цепи клостридиального нейротоксина, причем легкая цепь и тяжелая цепь имеют разный серотип или подтип.

Способы получения таких химически, ферментативно или генетически модифицированных вариантов клостридиальных нейротоксинов и способы определения того, обладают ли такие варианты биологическими свойствами, описанными в настоящем документе, такими как (а) связывание с рецептором, (b) интернализация, (с) транслокация через эндосомальную мембрану в цитозоль и/или (а) эндопротеолитическое расщепление белков, участвующих в слиянии мембраны синаптической везикулы, хорошо известны любому среднему специалисту в данной области; см., например, Sambrook, там же.

Термин «биологическая активность нейротоксического полипептида» в настоящем документе означает биологические свойства, присущие нейротоксическому полипептиду, а именно: (а) связывание с рецептором, (b) интернализацию, (с) транслокацию через эндосомальную мембрану в цитозоль; и/или (d) эндопротеолитическое расщепление белков, участвующих в слиянии мембраны синаптической везикулы. Предполагается, что нейротоксический полипептид в настоящем документе обладает по меньшей мере одним из упомянутых выше свойств a)-d), предпочтительно способностью к эндопротеолитическому расщеплению белков, участвующих в слиянии мембраны синаптической везикулы, или двумя или тремя из всех четырех биологических свойств, перечисленных в a)-d). Анализы для определения биологической активности нейротоксических полипептидов хорошо известны в данной области и также описаны в настоящем документе; см., например, Pellett et al. (2011), Biochem. Biophys. Res. Commun. 404, 388-392; Whitemarsh et al. (2012), Toxicol. Sci. 126, 426-35.

SNAP-25 представляет собой известный субстрат BoNT/A, BoNT/C1 и BoNTVE и расщепляется ими. VAMP/синаптобревин представляет собой субстрат BoNT/B, BoNT/D, BoNT/F, BoNT/G и TeNT и расщепляется ими, а синтаксин представляет собой субстрат BoNT/C1 и расщепляется им. Упомянутые субстраты и соответствующие нуклеотидные и аминокислотные последовательности хорошо известны в данной области; см., например, WO 2014/207109.

В настоящем документе термин «клетка» относится к любой эукариотической клетке, восприимчивой к интоксикации нейротоксином, таким как, например, BoNT/A, или любой эукариотической клетке, которая способна захватывать нейротоксин. Аспекты настоящего описания частично включают клетку из устойчивой клеточной линии. Термин «клетка» включает клетки из различных организмов, такие как, например, клетки мыши, крысы, свиньи, коровы, лошади, макака-резуса, примата и человека; из различных типов клеток, такие как, например, нейронные и другие клетки, которые могут быть выделены из или представлять собой часть гетерогенной популяции клеток, ткани или организма. В настоящем документе термин «устойчивая клеточная линия» является синонимом термина «иммортализованная клеточная линия» или «трансформированная клеточная линия» и означает культуру клеток, выбранных для бесконечного размножения из популяции клеток, полученной из организма, ткани или органа. По определению устойчивая клеточная линия исключает клеточную культуру первичных клеток. В настоящем документе термин «первичные клетки» означает клетки, собранные непосредственно из свежих тканей или органов и не имеющие потенциала к бесконечному размножению. Например, в способах изобретения можно использовать первичные нейронные клетки. Устойчивая клеточная линия может содержать гетерогенную популяцию клеток или однородную популяцию клеток. Устойчивая клеточная линия, полученная из одной клетки, называется клональной клеточной линией. Устойчивая клеточная линия может представлять собой линию, клетки которой эндогенно экспрессируют все компоненты, необходимые для срабатывания в них полного клеточного механизма, посредством которого нейротоксин, такой как BoNT/A, протеолитически расщепляет субстрат, такой как SNAP-25, и который включает связывание нейротоксина с рецептором нейротоксина, например BoNT/A с рецептором BoNT/A, интернализацию комплекса нейротоксин/рецептор, транслокацию легкой цепи нейротоксина из внутриклеточной везикулы в цитоплазму и протеолитическое расщепление субстрата нейротоксина. В альтернативном варианте осуществления устойчивая клеточная линия может представлять собой линию, в клетки которой из экзогенного источника был внедрен по меньшей мере один компонент, необходимый для срабатывания в них полного клеточного механизма, посредством которого нейротоксин, такой как BoNT/A, протеолитически расщепляет субстрат, такой как SNAP-25, и который включает связывание нейротоксина с рецептором, например BoNT/A с рецептором BoNT/A, интернализацию комплекса нейротоксин/рецептор, транслокацию легкой цепи нейротоксина из внутриклеточной везикулы в цитоплазму и протеолитическое расщепление субстрата нейротоксина. Также устойчивая клеточная линия может представлять собой клеточную линию, созданную методами генной инженерии, клетки которой могут, например, экспрессировать экзогенный FGFR2, экзогенный FGFR3, экзогенный SV2, экзогенный субстрат нейротоксина, такой как SNAP-25, или любую их комбинацию.

Термин «клеточная культура» в настоящем документе означает в самом широком смысле взятие клеток от животного или человека и их последующее выращивание в благоприятной искусственной среде. Клетки можно брать из ткани напрямую и разъединять перед культивацией ферментативными или механическими средствами, или их можно получать из клеточной линии или клеточного штамма, который уже является устойчивым. Первичная культура обозначает стадию культуры после выделения клеток из ткани и пролиферации в соответствующих условиях до тех пор, пока они не займут весь доступный субстрат, т.е. не достигнут конфлюентности. На этой стадии клетки необходимо пересеять, т.е. пассировать путем переноса их в новый резервуар со свежей ростовой средой, чтобы предоставить больше места для непрерывного роста. Обычные клетки, как правило, делятся только определенное число раз, после чего теряют способность к пролиферации, и это представляет собой генетически детерминированное событие, известное как старение; эти клеточные линии являются ограниченными. Однако некоторые клеточные линии становятся бессмертными при прохождении через процесс, называемый трансформацией, который может начинаться спонтанно или может быть индуцирован химическими веществами или вирусами. При прохождении ограниченной клеточной линией трансформации и приобретении способности к бесконечному делению она становится неограниченной клеточной линией. Условия культивирования значительно варьируются в зависимости от типа клетки, но искусственная среда, в которой выращивают клетки, всегда состоит из приемлемого резервуара, содержащего следующее: субстрат или среду, которая является источником необходимых питательных веществ (аминокислот, углеводов, витаминов, минералов), ростовые факторы, гормоны, газы (О₂, СО₂), регулируемую физико-химическую среду (рН, осмотическое давление, температура) и т.п. Большинство клеток требуют фиксации, и их необходимо культивировать, закрепив на твердом или полутвердом субстрате (адгезивная или монослойная культура), тогда как другие клетки могут расти, плавая в питательной среде (суспензионная культура).

Термин «клетка(-и), восприимчивая(-ые) к интоксикации нейротоксином» в настоящем документе означает клетку, в которой могут срабатывать полные клеточные механизмы, посредством которых нейротоксический полипептид (например, BoNT/A) расщепляет субстрат нейротоксина (например, субстрат BoNT/A SNAP 25) и которые включают связывание нейротоксического полипептида с соответствующим рецептором (например, связывание BoNT/A с рецептором BoNT/A), интернализацию комплекса нейротоксин/рецептор, транслокацию легкой цепи нейротоксина из внутриклеточной везикулы в цитоплазму и протеолитическое расщепление субстрата нейротоксина. Соответственно, термин «клетка, восприимчивая к интоксикации нейротоксином» в настоящем документе означает чувствительную к нейротоксину клетку. Упомянутый термин включает клетку или клеточную линию, например выделенную, первичную клетку или ее клеточную линию, или клетку из устойчивой клеточной линии или устойчивую клеточную линию, например опухолевые клетки или опухолевые клеточные линии, которые способны дифференцироваться в нейронные клетки, такие как нейробластомные клетки или нейробластомные клеточные линии, как определено в настоящем документе. Например, указанная нейробластомная клеточная линия может представлять собой клеточную линию SiMa, которую можно приобрести в DSMZ (АСС 164). Конкретные клоны клеточной линии SiMa дополнительно описаны в WO 2010/105234. Другие нейробластомные клеточные линии, которые можно использовать в способе настоящего изобретения, могут быть получены в АТСС или DSMZ под следующими номерами АТСС или DSMZ: клеточная линия N1E-115 под номером CRL-2263, клеточная линия Neuro2a под номером CCL-131, клеточная линия SH-SY5Y под номером CRL-2266, клеточная линия PC 12 под номером CRL-1721, клеточная линия MHH-NB-11 под номером АСС 157 (DSMZ) и клеточная линия SK-N-BE(2) под номером CRL-2271. Другими опухолевыми клетками, которые восприимчивы к интоксикации нейротоксином, являются клетки Р-19 (клеточная линия мышиной эмбриональной карциномы) (№ DSMZ: АСС 316). В некоторых аспектах, например для анализов активности, может быть необходимо дифференцировать указанные клетки в нейронные клетки. Такие способы дифференцировки подробно описаны в литературе. Кроме того, клетки, восприимчивые к интоксикации нейротоксином, включают нейроны, полученные из индуцированной плюрипотентной стволовой клетки (иПСК), предпочтительно нейроны, полученные из человеческой индуцированной плюрипотентной стволовой клетки (иПСК); см., например, Whitemarsh et al. (2012), там же. Такие полученные из человеческой иПСК нейроны также можно приобрести, например, в компании Cellular Dynamics. Способы создания иПСК описаны, например, в публикации Yu et al. (Science 2009 May 8; 324 (5928): 797-801. Epub 2009), WO 2011/056971 и WO 2011/025852. В некоторых аспектах иПСК дифференцируют в нейроны с помощью приемлемых способов, например описанных в WO 2012/135621 и заявках на патент США US 2010/0279403 и US 2010/0216181.

Термины «дифференцировка», «дифференцирование» или «дифференцированный» в настоящем документе означают процесс, посредством которого неспециализированная или относительно менее специализированная клетка становится относительно более специализированной. В контексте клеточного онтогенеза прилагательное «дифференцированный» представляет собой относительное понятие. Таким образом, «дифференцированная клетка» представляет собой клетку, которая продвинулась дальше по определенному пути развития, чем клетка, с которой проводят сравнение. Дифференцированная клетка может, например, представлять собой окончательно дифференцированную клетку, т.е. полностью специализированную клетку, которая выполняет специальные функции в различных тканях и органах организма, и при этом она может быть, но необязательно является постмитотической. Например, нейроны iCell^® окончательно дифференцированы из человеческих иПСК, обладают характеристиками и выполняют функции нейрона. В другом примере дифференцированная клетка также может представлять собой клетку-предшественник в пределах линии дифференцировки, которая может дополнительно пролиферировать и/или дифференцироваться. Аналогично, клетка является «относительно более специализированной», если она продвинулась дальше по определенному пути развития, чем клетка, с которой проводят сравнение, причем последняя, следовательно, считается «неспециализированной» или «относительно менее специализированной». Относительно более специализированная клетка может отличаться от неспециализированной или относительно менее специализированной клетки по одной или более наглядным фенотипическим характеристикам, таким как, например, наличие, отсутствие или степень экспрессии конкретных клеточных компонентов или продуктов, например РНК, белков, специфических клеточных маркеров или других веществ, активность определенных биохимических путей, морфологические признаки, способность к пролиферации и/или кинетика, способность к дифференцировке и/или реакция на дифференцировочные сигналы и т.п., причем такие характеристики указывают на продвижение относительно более специализированной клетки дальше по указанному пути развития. Условия культивирования при дифференцировке клеток в нейронные клетки хорошо известны в данной области, что очевидно из литературных данных, приведенных в настоящем документе.

Кроме того, условия культивирования при инкубации клеток, восприимчивых к интоксикации нейротоксином, с нейротоксическим полипептидом в течение времени и в условиях, которые позволяют нейротоксическому полипептиду проявить биологическую активность, подробно описаны в данной области и также могут быть обнаружены в публикациях, приведенных в настоящем документе.

Термин «специфический захват нейротоксического полипептида» в настоящем документе означает процесс, в ходе которого нейротоксический полипептид попадает в нейрон путем связывания со специфическим(-ими) мембранным(-ыми) рецептором(-ами) нейрона, например SV2, ганглиозидами, GD1a, синаптотагмином II для BoNT/B или синаптотагмином I для BoNT/D/-C, поглощения эндосомоподобным компартментом и проникновения через эндосомальную мембрану посредством рН-зависимого процесса транслокации. Соответственно, упомянутый термин включает а) связывание с рецептором нейротоксического полипептида, (b) интернализацию нейротоксического полипептида и (с) транслокацию нейротоксического полипептида через эндосомальную мембрану в цитозоль. Специалистам в данной области будет понятно, что чувствительная к нейротоксину клетка предпочтительно способна сначала захватывать нейротоксин, а затем реализовывать перечисленные выше полные клеточные механизмы. Выражение «неспецифический захват нейротоксического полипептида» в настоящем документе означает процесс, в ходе которого нейротоксический полипептид или продукт его разложения попадает в нейрон путем связывания с неспецифическим(-ими) мембранным(-ыми) рецептором(-ами) нейрона или путем попадания в клетку с помощью неспецифических механизмов, например при случайном котранспорте в случае пиноцитоза. Чувствительная к нейротоксину клетка в настоящем документе способна захватывать, например, около 100 наномоль (нМ), около 10 нМ, около 1 нМ, около 500 пикомоль (пМ), около 400 пМ, около 300 пМ, около 200 пМ, около 100 пМ, около 90 пМ, около 80 пМ, около 70 пМ, около 60 пМ, около 50 пМ, около 40 пМ, около 30 пМ, около 20 пМ, около 10 пМ, около 9 пМ, около 8 пМ, около 7 пМ, около 6 пМ, около 5 пМ, около 4 пМ, около 3 пМ, около 2 пМ, около 1 пМ, около 0,5 пМ или около 0,1 пМ нейротоксического полипептида или менее одного из указанных значений. В литературе встречаются значения ЕС50 выше 100 пМ. По определению клетка, восприимчивая к интоксикации нейротоксином, должна экспрессировать или быть создана с возможностью экспрессировать по меньшей мере один рецептор нейротоксина и по меньшей мере один субстрат нейротоксина. Рецепторы и субстраты нейротоксинов описаны в данной области и упомянуты в настоящем документе. Соответственно, указанная клетка является предпочтительно восприимчивой к биологически активному или зрелому нейротоксическому полипептиду, как определено в настоящем документе. Предпочтительно чувствительная к нейротоксину клетка в настоящем документе является восприимчивой к интоксикации нейротоксином в количестве, например, около 1 нМ или менее, 500 пМ или менее, около 400 мП или менее, около 300 пМ или менее, около 200 пМ или менее, около 100 пМ или менее, около 90 пМ или менее, около 80 пМ или менее, около 70 пМ или менее, около 60 пМ или менее, около 50 пМ или менее, около 40 пМ или менее, около 30 пМ или менее, около 20 пМ или менее, около 10 пМ или менее, около 9 пМ или менее, около 8 пМ или менее, около 7 пМ или менее, около 6 пМ или менее, около 5 пМ или менее, около 4 пМ или менее, около 3 пМ или менее, около 2 пМ или менее, около 1 пМ или менее, около 0,9 пМ или менее, около 0,8 пМ или менее, около 0,7 пМ или менее, около 0,6 пМ или менее, около 0,5 пМ или менее, около 0,4 пМ или менее, около 0,3 пМ или менее, около 0,2 пМ или менее или даже около 0,1 пМ или менее. Как известно в данной области, «полумаксимальная эффективная концентрация (ЕС50)» означает концентрацию лекарственного средства, антитела или токсического вещества, вызывающую реакцию, выраженность которой находится посередине между исходным и максимальным уровнями после некоторого установленного времени воздействия. Обычно этот параметр используют в качестве меры активности лекарственного средства. Таким образом, ЕС50 на ступенчатой кривой зависимости эффекта от дозы отражает концентрацию соединения, при которой наблюдается 50% от максимального эффекта. ЕС50 на дискретной кривой зависимости эффекта от дозы отражает концентрацию соединения, при которой у 50% популяции наблюдается реакция после определенной длительности воздействия. Способы выявления клеток или клеточных линий, восприимчивых к интоксикации нейротоксином и/или способных захватывать нейротоксин, т.е. чувствительных к нейротоксину клеток, как определено в настоящем документе, известны в данной области; см., например, US 2012/0122128 A1. Биологическая активность нейротоксических полипептидов в одном аспекте является результатом всех вышеупомянутых биологических свойств. Как указано в настоящем документе, до настоящего времени в данной области описано только несколько клеточных анализов с достаточно высокой чувствительностью к нейротоксинам, которые можно использовать для определения биологической активности нейротоксина.

Термин «повышение», используемый в настоящем документе, означает, что специфический захват нейротоксического полипептида клеткой улучшается или увеличивается по сравнению с интоксикацией клостридиальным нейротоксином без (i) K⁺-опосредованной деполяризации клеток, (ii) уменьшения времени воздействия нейротоксического полипептида и (iii) встряхивания клеток во время воздействия нейротоксического полипептида. Специфический захват нейротоксического полипептида клеткой предпочтительно возрастает по меньшей мере в 1,5 раза, по меньшей мере в 2 раза, по меньшей мере в 3 раза, по меньшей мере в 4 раза, по меньшей мере в 5 раз, по меньшей мере в 6 раз, по меньшей мере в 7 раз, по меньшей мере в 8 раз, по меньшей мере в 9 раз или даже по меньшей мере в 10 раз по сравнению со способами, в которых используют условия культивирования клеток, не включающие (i) K⁺-опосредованную деполяризацию клеток, (ii) уменьшение времени воздействия нейротоксического полипептида и (iii) встряхивание клеток во время воздействия нейротоксического полипептида. По существу в способах, описанных в данной области, конечная концентрация K+ составляет около 5 мМ, время воздействия нейротоксического полипептида составляет около 72 часов, и при этом не проводят встряхивание клеток. Авторы настоящего изобретения обнаружили, что вышеописанные меры (i), (ii) и/или (iii) не только улучшают специфический захват нейротоксина клетками, но также приводят к уменьшению неспецифического захвата упомянутого нейротоксина или продуктов разложения клетками. Неспецифический захват нейротоксического полипептида клеткой предпочтительно уменьшается по меньшей мере в 1,5 раза, по меньшей мере в 2 раза, по меньшей мере в 3 раза, по меньшей мере в 4 раза, по меньшей мере в 5 раз, по меньшей мере в 6 раз, по меньшей мере в 7 раз, по меньшей мере в 8 раз, по меньшей мере в 9 раз или даже по меньшей мере в 10 раз по сравнению со способами, в которых используют условия культивирования клеток, не включающие (i) K⁺-опосредованную деполяризацию клеток, (ii) уменьшение времени воздействия нейротоксического полипептида и/или (iii) встряхивание клеток во время воздействия нейротоксического полипептида. Средства и способы измерения специфического или неспецифического захвата нейротоксического полипептида клеткой подробно описаны в литературе и настоящем документе и дополнительно продемонстрированы в представленных ниже примерах. Например, влияние воздействия нейротоксина BoNT/A, BoNT/C и BoNT/E на протеолиз SNAP-25 в культурах нейронных клеток можно использовать в качестве индикатора транслокации нейротоксина. То же справедливо для воздействия нейротоксина BoNT/C на протеолиз синтаксина в нейронных клетках и воздействия нейротоксина BoNT/E, BoNT/D и BoNT/G на протеолиз VAMP.

В дополнительном аспекте способа настоящего изобретения в дополнение к вышеупомянутому способу настоящего изобретения используется способ определения биологической активности нейротоксического полипептида в клетках.

Как показано в представленных ниже примерах, клеточный анализ активности можно преимущественно улучшить посредством увеличения специфического захвата клостридиальных нейротоксических полипептидов клетками, посредством использования K⁺-опосредованной деполяризации клеток, снижения времени воздействия нейротоксического полипептида и/или встряхивания клеток во время воздействия нейротоксического полипептида. В то же время может наблюдаться уменьшение неспецифического захвата упомянутого нейротоксина или продуктов разложения клетками.

В данной области описан ряд анализов для определения биологической активности нейротоксических полипептидов, таких как анализы легкой цепи (ИФА), Endopep-MS, FRET, ВЭЖХ-СВЭЖХ, DARET или клеточные анализы, в которых используют, например, клетки SH-SY5Y или Neuro2a, эмбриональные нейроны цыпленка, первичные нейроны из спинного мозга или дорсальных корешковых ганглиев (Pellett et al. (2011), Biochem. Biophys. Res. Commun. 404, 388 392), нейроны, полученные из эмбриональной стволовой клетки (Whitemarsh et al. (2012), Toxicol. Sci. 126, 426-35), на основании результатов Вестерн-блоттинга, или дифференцированные человеческие нейробластомные клетки SiMa; см., например, , Е. et al., (2012). PLoS One 7 (11).

Во втором аспекте настоящего изобретения предложен способ прямого определения биологической активности нейротоксического полипептида в клетках, включающий:

a) инкубацию с нейротоксическим полипептидом клеток, восприимчивых к интоксикации нейротоксином, в течение времени и в условиях, которые позволяют нейротоксическому полипептиду проявить свою биологическую активность, причем инкубация включает по меньшей мере один из следующих этапов: (i) K⁺-опосредованную деполяризацию клеток, (ii) уменьшение времени воздействия нейротоксического полипептида и/или (iii) встряхивание клеток во время воздействия нейротоксического полипептида;

b) фиксацию клеток и необязательно увеличение проницаемости мембраны клеток детергентом;

c) контактирование клеток по меньшей мере с первым захватывающим антителом, специфически связывающимся с нерасщепленным и расщепленным нейротоксином субстратом, и по меньшей мере со вторым захватывающим антителом, специфически связывающимся с участком расщепления субстрата, расщепленного нейротоксином, в условиях, которые делают возможным связывание указанных захватывающих антител с указанными субстратами;

d) контактирование клеток по меньшей мере с первым детекторным антителом, специфически связывающимся с первым захватывающим антителом, в условиях, которые делают возможным связывание указанного первого детекторного антитела с указанным первым захватывающим антителом, с образованием первых детекторных комплексов, и по меньшей мере со вторым детекторным антителом, специфически связывающимся со вторым захватывающим антителом, в условиях, которые делают возможным связывание указанного второго детекторного антитела с указанным вторым захватывающим антителом, с образованием вторых детекторных комплексов;

e) определение количества первых и вторых детекторных комплексов этапа d); и

f) расчет количества субстрата, расщепленного указанным нейротоксическим полипептидом в указанных клетках, с использованием вторых детекторных комплексов для определения биологической активности указанного нейротоксического полипептида в указанных клетках.

Предпочтительно данный способ представляет собой способ in vitro. Данный способ настоящего изобретения позволяет напрямую определять биологическую активность нейротоксического полипептида в клетках. Это значит, что больше не нужно выполнять лизис клеток и выделение или концентрирование расщепленного субстрата нейротоксина из клеточных лизатов, как в способах, описанных в данной области. Например, в анализе, основанном на Вестерн-блоттинге, известном в данной области, субстрат нейротоксина концентрируют посредством разделения и концентрирования компонентов соответствующего образца в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (SDS). В ИФА сэндвич-типа с электрохемилюминесценцией, описанном в данной области, концентрирование субстрата нейротоксина выполняют посредством использования антител, которые специфически связываются с расщепленным субстратом нейротоксина на титрационном микропланшете, к которому добавляют клеточный лизат. Расщепленный субстрат нейротоксина выделяют из лизата посредством связывания с упомянутым антителом, что приводит к концентрированию указанного расщепленного субстрата клостридиального нейротоксина.

В противоположность, расщепленный субстрат нейротоксина, например SNAP 25, может быть напрямую обнаружен в клетке с помощью данного способа настоящего изобретения. Для этого клетки, восприимчивые к интоксикации нейротоксином, более подробное определение которых приведено в настоящем документе, инкубируют с нейротоксическим полипептидом в течение периода времени и в условиях, которые позволяют нейротоксическому полипептиду проявить биологическую активность. Инкубация включает K⁺-опосредованную деполяризацию клеток, уменьшение времени воздействия нейротоксического полипептида и/или встряхивание клеток во время воздействия нейротоксического полипептида, как определено в настоящем документе. Эти меры повышают специфический клеточный захват нейротоксина, при этом снижают неспецифический захват нейротоксина или продуктов разложения клетками. На следующем этапе клетки фиксируют, например, путем добавления фиксирующего агента, такого как метанол, этанол, ацетон, формальдегид, или смеси упомянутых фиксирующих агентов. Необязательно можно увеличить проницаемость мембраны клеток при использовании по меньшей мере одного детергента, такого как тритон Х-100, твин 20, сапонин, дигитонин или n-октил-β-глюкопиранозид. Детергент может быть включен в состав соответствующего буферного раствора, такого как фосфатно-солевой буфер (PBS). Таким образом, клетки контактируют по меньшей мере с первым захватывающим антителом, которое специфически связывается с нерасщепленным и расщепленным нейротоксином субстратом, и по меньшей мере со вторым захватывающим антителом, специфически связывающимся с участком расщепления субстрата, расщепленного нейротоксином, в условиях, которые делают возможным связывание указанных захватывающих антител с указанными субстратами. В настоящем документе первое захватывающее антитело способно определять общее содержание или количество субстрата нейротоксина в клетках посредством специфического связывания с соответствующим эпитопом, присутствующим как в нерасщепленном, так и в расщепленном нейротоксином субстрате нейротоксина. Второе захватывающее антитело распознает и специфически связывается с эпитопом, присутствующим только в расщепленном субстрате нейротоксина, например посредством специфического связывания с расщепленным нейротоксином участком в субстрате нейротоксина. В альтернативном варианте осуществления клетки могут контактировать со смесью указанных первого и второго захватывающих антител, т.е. клетки контактируют по меньшей мере с первым захватывающим антителом и по меньшей мере со вторым захватывающим антителом одновременно в упомянутых условиях. На следующем этапе клетки контактируют по меньшей мере с первым детекторным антителом, специфически связывающимся с первым захватывающим антителом, в условиях, которые делают возможным связывание указанного первого детекторного антитела с указанным первым захватывающим антителом, с образованием первых детекторных комплексов. На следующем этапе клетки контактируют по меньшей мере со вторым детекторным антителом, специфически связывающимся со вторым захватывающим антителом, в условиях, которые делают возможным связывание указанного второго детекторного антитела с указанным вторым захватывающим антителом, с образованием вторых детекторных комплексов. В альтернативном варианте осуществления клетки могут контактировать со смесью указанных первого и второго детекторных антител, т.е. клетки контактируют по меньшей мере с первым детекторным антителом и по меньшей мере со вторым детекторным антителом одновременно в упомянутых условиях. В альтернативном варианте осуществления после увеличения проницаемости мембраны клеток они могут контактировать со смесью указанных первого и второго захватывающих антител и указанных первого и второго детекторных антител одновременно в упомянутых условиях. На следующем этапе определяют количества первого и второго детекторных комплексов. В конце рассчитывают количество субстрата, расщепленного указанным нейротоксическим полипептидом в указанных клетках, используя вторые детекторные комплексы. Таким образом, биологическую активность указанного нейротоксического полипептида определяют напрямую в клетках.

Ниже представлено более подробное описание данного способа настоящего изобретения. Для получения клеточной культуры клетки, восприимчивые к интоксикации нейротоксином, как определено в настоящем документе, такие как нейронные клетки, клетки SiMa или полученные из иПСК нейроны, сначала засевают на 96-луночные титрационные микропланшеты. Клетки SiMa дифференцируют до нейронного фенотипа, например, в соответствии с процедурами, описанными в WO 2010/105234, а полученные из иПСК нейроны дифференцируют до нейронного фенотипа, например, в соответствии с анализами, описанными в WO 2012/135621. Затем клетки инкубируют с нейротоксическим полипептидом, таким как BoNT/A, в течение времени и в условиях, которые позволяют нейротоксическому полипептиду проявить биологическую активность. Инкубация включает K⁺-опосредованную деполяризацию клеток, уменьшение времени воздействия нейротоксического полипептида и/или встряхивание клеток во время воздействия нейротоксического полипептида, как описано в настоящем документе.

На следующем этапе клетки фиксируют на титрационном микропланшете, после чего проводят анализ ИФА. Для фиксации клеток к ним можно добавлять, например, ледяной метанол (-20°С) на 20 минут при -20°С.

Для выполнения анализа ИФА клетки сначала промывают. В качестве промывочного буфера можно использовать, например, тритон Х-100 0,1% в 10 мМ PBS (рН 7,4). Затем эндогенные протеазы инактивируют инактивирующим буфером, таким как Н₂О₂ 0,6% в 10 мМ PBS (рН 7,4), с последующим дополнительным этапом промывки. На следующем этапе свободные участки связывания на титрационном микропланшете блокируют подходящим блокирующим буфером, таким как, например, бычий сывороточный альбумин (BSA) 2% в 10 мМ PBS (рН 7,4) и тритон Х-100 0,05%. Затем увеличивают проницаемость мембраны клеток, используя подходящий детергент. В качестве буфера для увеличения проницаемости мембраны можно использовать, например, тритон Х-100 0,5% в 10 мМ PBS. Увеличение проницаемости мембраны позволяет антителам диффундировать через поры, образованные в клетках. Затем клетки промывают промывочным буфером, как указано выше.

На следующем этапе клетки с увеличенной проницаемостью мембраны инкубируют, например, со смесью двух различных антител. Смесь содержит первое захватывающее антитело, специфически связывающееся с нерасщепленным и расщепленным нейротоксином субстратом, и второе захватывающее антитело, специфически связывающееся с участком расщепления субстрата, расщепленного нейротоксином. Указанные первое и второе захватывающие антитела также можно применять последовательно. Например, первое захватывающее антитело может специфически связываться как с нерасщепленным, так и с расщепленным нейротоксином SNAP 25, что позволяет количественно оценить общее количество или содержание SNAP-25 в клетках. Кроме того, это первое захватывающее антитело можно использовать для нормализации количества расщепленного SNAP 25 в клетках при оценке. Второе захватывающее антитело специфически связывается с участком расщепления субстрата, расщепленного нейротоксином, и, следовательно, позволяет определять и обнаруживать субстрат, расщепленный нейротоксином, такой как SNAP 25, расщепленный BoNT/A.

Следующее обнаружение общего субстрата нейротоксина и субстрата нейротоксина, расщепленного нейротоксином, в способе настоящего изобретения можно выполнять напрямую на титрационном микропланшете или чашке для клеточной культуры, т.е. в клетках. Таким образом, преимущество заключается в том, что в способе настоящего изобретения не нужно получать клеточные экстракты и выделять и/или концентрировать субстрат нейротоксина из клеточного лизата по сравнению со способами, описанными в данной области. Затем клетки промывают для удаления избытка антител, не связанных с соответствующим антигеном. На следующем этапе клетки с увеличенной проницаемостью мембраны контактируют по меньшей мере с первым детекторным антителом и по меньшей мере со вторым детекторным антителом. Указанные антитела можно применять в виде смеси, т.е. одновременно, или последовательно. Первое детекторное антитело специфически связывается с первым захватывающим антителом. В результате этого образуются первые детекторные комплексы. Первое детекторное антитело может быть против видов, от которых было получено первое захватывающее антитело. Например, если в качестве первого захватывающего антитела, специфически связывающегося с нерасщепленным и расщепленным BoNT/A субстратом SNAP-25, используется кроличье поликлональное антитело против SNAP 25 S9684 (Sigma), то в качестве первого детекторного антитела можно использовать антикроличье антитело, конъюгированное со щелочной фосфатазой. Второе детекторное антитело специфически связывается со вторым захватывающим антителом. В результате этого образуются вторые детекторные комплексы. Второе детекторное антитело может быть против видов, от которых было получено второе захватывающее антитело. Например, если в качестве второго захватывающего антитела, специфически связывающегося с расщепленным BoNT/A субстратом SNAP-25, используется мышиное моноклональное антитело (mAb) 20-2-5, описанное в WO 2014/207109, то в качестве второго детекторного антитела можно использовать антимышиное антитело, конъюгированное с пероксидазой хрена (HRP). Специалистам в данной области будет понятно, что первое детекторное антитело и второе детекторное антитело конъюгированы с различными ферментами, чтобы обеспечить возможность специфического обнаружения соответствующих первого и второго захватывающих антител, используемых в способе настоящего изобретения. Например, обнаружение на основе HRP, как описано в настоящем документе, можно использовать для SNAP 25, расщепленного BoNT/A, а обнаружение на основе щелочной фосфатазы (ЩФ) - для общего (расщепленного BoNT/A и нерасщепленного) SNAP 25. Затем клетки снова промывают. На следующем этапе к клеткам добавляют флуорогенный субстрат HRP. В качестве субстрата HRP можно использовать, например, Amplex UltraRed (Invitrogen), который возбуждается при 540 нм и излучает при 600 нм. Инкубацию с субстратом HRP выполняют в течение периода времени, достаточного для достаточного преобразования субстрата пероксидазой хрена. После инкубации с субстратом HRP можно добавить, например, субстрат ЩФ DiFMUP (6,8-дифтор-4-метилумбеллиферилфосфат; возбуждение 360 нм; излучение 450 нм) к субстрату HRP, и клетки инкубируют со смесью указанных двух субстратов. Инкубацию с указанным субстратом ЩФ выполняют в течение периода времени, достаточного для достаточного преобразования субстрата щелочной фосфатазой. Как известно в данной области, субстрат необходимо преобразовать в количестве, достаточном для того, чтобы измеренный сигнал был по меньшей мере равным среднему значению холостой пробы плюс три стандартных отклонения от среднего, в соответствии с определением термина «предел обнаружения». Предел обнаружения может быть установлен, как описано в литературе; см., например, Armbruster and Pry, Clinical Biochem. Rev. 2008, 29 (Supplement 1): S49-S52. Так как оптимальный рН для щелочной фосфатазы находится в щелочной области, соответствующий буфер субстрата является сильно щелочным. При добавлении субстрата щелочной фосфатазы к субстрату HRP реакция, катализируемая пероксидазой хрена, останавливается щелочным рН, и щелочная фосфатаза преобразует DiFMUP. На преобразованный субстрат HRP щелочной рН не влияет. В конце измеряют флуоресценцию двух субстратов следующим образом:

Amplex UltraRed: возбуждение 540 нм; излучение 600 нм;

DiFMUP: возбуждение 360 нм; излучение 450 нм.

Специалистам в данной области будет понятно, что в способе настоящего изобретения для обнаружения первого и второго захватывающих антител можно использовать только такие флуорогенные субстраты, которые имеют различные длины волн возбуждения/излучения. Только в этом случае с их помощью можно обнаружить каждый антиген, т.е. общий субстрат нейротоксина (такой как нерасщепленный и расщепленный нейротоксином SNAP 25) и расщепленный субстрат нейротоксина (такой как расщепленный нейротоксином SNAP 25). Таким образом, можно количественно оценивать общее содержание субстрата нейротоксина и содержание расщепленного субстрата нейротоксина в каждой лунке или чашке с клеточной культурой одновременно. Таким образом, преимущество заключается в возможности автоматизации способа настоящего изобретения. Как описано в настоящем документе, флуорогенные субстраты, выбранные для реализации способа настоящего изобретения, должны иметь достаточный сдвиг между спектрами возбуждения/излучения, чтобы обеспечить возможность специфического обнаружения соответствующего субстрата. Данное требование выполняется, например, для субстрата HRP Amplex и его производных и для субстрата ЩФ DiFMUP. Хотя в оптимальном случае не должно быть наложения между спектрами возбуждения/излучения используемых флуорогенных субстратов, было показано, что наложение до 30% в области пика спектров возбуждения используемых флуорогенных субстратов является допустимым. Дополнительная информация об этом способе настоящего изобретения приведена, например, в WO 2014/207109.

Специалистам в данной области будет также понятно, что способ настоящего изобретения позволяет напрямую обнаруживать и количественно оценивать субстрат нейротоксина, расщепленный нейротоксическим полипептидом в клетках, для определения биологической активности указанного нейротоксического полипептида в указанных клетках. Преимуществом является то, что способ настоящего изобретения не требует получения клеточных лизатов или экстрактов и выделения или концентрирования расщепленного субстрата нейротоксина из клеточных лизатов/экстрактов, в отличие от способов, известных в данной области. Следовательно, можно сэкономить материал образца. Кроме того, при использовании способа настоящего изобретения можно уменьшить время получения образца и число образцов, так как количество общего субстрата нейротоксина и количество расщепленного субстрата нейротоксина в образце могут определяться одновременно. В анализах, описанных в данной области, образцы необходимо подразделять, чтобы обнаружить оба антигена, т.е. общий субстрат нейротоксина и расщепленный субстрат нейротоксина, отдельно друг от друга. Способ настоящего изобретения устраняет необходимость подразделения образца. Таким образом, можно избежать неоднородностей, связанных с подразделением образцов, и сэкономить материал образца. Более того, в анализах, описанных в данной области, могут быть разрушены антигены, что может привести к искажению результатов обнаружения расщепленного субстрата нейротоксина. Это связано с тем, что в анализах, описанных в данной области, клетки инкубируют с содержащими детергент лизирующими буферными растворами, которые, однако, не способны инактивировать нейротоксический полипептид или другие эндогенные протеазы, приводя к разрушению нейротоксического субстрата при более длительном хранении образцов. Более сильные лизирующие буферные растворы не могут быть использованы в ИФА сэндвич-типа с электрохемилюминесценцией, описанных в данной области, в связи с необходимостью использования клеточного лизата в указанном анализе. Это связано с тем, что агрегация вышеупомянутых антигенов может привести к неспецифической адсорбции антигенов к пластиковой поверхности чашек для клеточной культуры или титрационных микропланшетов, что, в свою очередь, нарушает обнаружение антигенов соответствующими антителами. Так как антитела для обнаружения антигенов также контактируют с лизатом, для этих антител также может быть характерна агрегация. В этом случае обнаружение антигена будет ненадежным и неточным. Авторы настоящего изобретения выявили такие реакции разрушения, используя анализы Вестерн-блоттинга для обнаружения биологической активности нейротоксина, описанные в данной области. При более длительном хранении лизатов при 20°С, по сравнению со свежими образцами лизата, сигнал обнаружения общего SNAP-25 оказался значительно сниженным, а отношение расщепленного субстрата SNAP-25 нейротоксина к нерасщепленному субстрату SNAP-25 нейротоксина изменилось из-за процессов разрушения при замораживании. Авторы настоящего изобретения обнаружили, что разрушения субстрата нейротоксина и/или нестабильности образцов можно избежать посредством прямой фиксации клеток на чашке для клеточной культуры, поскольку как субстрат нейротоксина, так и нейротоксин или другие эндогенные протеазы немедленно инактивируются при агрегации на чашке для клеточной культуры. Этого можно добиться, например, с помощью фиксации клеток метанолом или другими фиксаторами или фиксирующими агентами, известными в данной области, такими как этанол, ацетон, формальдегид или их смеси, или другими фиксирующими агентами, описанными в настоящем документе. В анализе стабильности, например, родительских клеток SiMa (человеческие нейробластомные клетки; № DSMZ: АСС 164) и нейронов, полученных из иПСК (Whitemarsh et al. (2012), Toxicol. Sci. 126, 426-35), с использованием данного способа фиксации не было выявлено каких-либо различий между свежими клетками и клетками в чашках для клеточной культуры, которые хранили в холодильнике в течение семи дней.

Приемлемые антитела, специфически связывающиеся с нерасщепленным и расщепленным нейротоксином субстратом, которые можно использовать в качестве первых захватывающих антител в способе настоящего изобретения, включают, например, кроличье поликлональное антитело против SNAP-25 S9684 (Sigma), кроличье поликлональное антитело против SNAP-25 РА5-19708 (Pierce Antibodies), кроличье поликлональное антитело против SNAP25 РА5-19701 (Pierce Antibodies) или кроличье моноклональное антитело против SNAP25 ab 108990 (Abcam).

Соответствующие антитела, специфически связывающиеся с участком расщепления субстрата, расщепленного нейротоксином, которые можно использовать в качестве вторых захватывающих антител в способе настоящего изобретения, включают, например, мышиное моноклональное антитело клона 20-2-5 (WO 2014/207109), мышиное моноклональное антитело, описанное в ЕР 14199282.6, мышиное моноклональное антитело МС-6053 (клон 4F3-2C1, R&D Systems), МАВ4733 (Abnova), orb26633 (Biorbyt) или GWB-T00279 (Genway).

Приемлемые детекторные антитела, которые можно использовать в качестве первых и вторых детекторных антител, известны в данной области. Например, первое детекторное антитело может представлять собой антитело, конъюгированное со щелочной фосфатазой (ЩФ), антитело, конъюгированное с пероксидазой хрена (HRP), или антитело, конъюгированное с флуоресцентным красителем. В качестве второго детекторного антитела можно использовать, например, антитело, конъюгированное со щелочной фосфатазой (ЩФ), антитело, конъюгированное с пероксидазой хрена (HRP), антитело, конъюгированное с глюкозооксидазой, антитело, конъюгированное с тирозиназой, или антитело, конъюгированное с β-галактозидазой. Предпочтительно первые и вторые детекторные антитела отличаются друг от друга при использовании в способе настоящего изобретения.

В настоящем документе применение терминов в единственном числе включает ссылку как на единственное число, так и на множественное число, если из контекста четко не следует иное. Например, «клетка» означает одну клетку или несколько клеток.

В настоящем документе термин «около» при количественной оценке величины указанного элемента, числа, процента или срока означает диапазон плюс или минус 10 процентов, 9 процентов, 8 процентов, 7 процентов, 6 процентов, 5 процентов, 4 процента, 3 процента, 2 процента, 1 процент или 0 процентов от величины указанного элемента, числа, процента или срока. Предпочтительным является диапазон плюс или минус 10 процентов.

Термины «включающий» и «включает» в данном документе являются синонимами терминов «содержащий» или «содержит» и являются включающими, или не имеющими ограничительного характера, и не исключают дополнительные неуказанные части, элементы или этапы способа. Очевидно, что термин «включающий» включает термин «состоящий из». Более конкретно, термин «включать» в настоящем документе означает, что пункт формулы изобретения включает все перечисленные элементы или этапы способа, но также может включать дополнительные, неназванные элементы или этапы способа. Например, способ, включающий этапы а), b) и с), включает, в наиболее узком смысле, способ, который состоит из этапов а), b) и с). Фраза «состоит из» означает, что композиция (или устройство, или способ) имеет указанные элементы (или этапы) и никаких других. Напротив, термин «содержит» может включать также способ, включающий дополнительные этапы, например этапы d) и е), в дополнение к этапам а), b) и с).

В случае использования в настоящем документе числовых диапазонов, таких как «в концентрации от 1 до 5 микромоль», диапазон включает не только 1 и 5 микромоль, но также любую числовую величину между 1 и 5 микромоль, например 2, 3 и 4 микромоль.

Термин in vitro в настоящем документе означает вне или за пределами тела животного или человека. Подразумевается, что термин in vitro в настоящем документе включает термин ex vivo. Термин ex vivo, как правило, означает ткани или клетки, удаленные из тела животного или человека и сохраненные или размножаемые за пределами тела, например в сосуде для культивирования. Термин in vivo в настоящем документе означает внутри тела животного или человека.

В дополнительном аспекте способов настоящего изобретения K⁺-опосредованную деполяризацию клеток выполняют при дополнительной концентрации K⁺ от около 20 мМ до около 55 мМ в течение по меньшей мере 2 часов.

Как правило, среда для клеточной культуры, используемая в данной области, содержит 5 мМ K⁺. Соответственно, конечная концентрация K⁺ в способах настоящего изобретения составляет предпочтительно от около 25 мМ до около 60 мМ K⁺.

В другом дополнительном аспекте способов настоящего изобретения K⁺-опосредованную деполяризацию клеток и/или воздействие нейротоксическим полипептидом выполняют в присутствии GT1b.

В другом аспекте способов настоящего изобретения GT1b используют в концентрации от 15 до 50 мкМ, предпочтительно 20 мкМ.

В дополнительном аспекте способов настоящего изобретения уменьшенное время воздействия нейротоксического полипептида представляет собой воздействие на клетки нейротоксическим полипептидом в течение по меньшей мере 24 часов и менее 96 часов, предпочтительно в течение по меньшей мере 48 часов и максимум 72 часов.

В дополнительном аспекте способов настоящего изобретения встряхивание клеток во время воздействия нейротоксического полипептида выполняют с помощью магнитной мешалки, или вращающихся роторных колб, или встряхивания клеток шейкером. Встряхивание клеток выполняют с подходящей скоростью потока среды для клеточной культуры, предпочтительно со средней скоростью потока среды от около 25 см/мин до около 300 см/мин, более предпочтительно от около 25 см/мин до около 150 см/мин.

В дополнительном аспекте способов настоящего изобретения K⁺-опосредованную деполяризацию клеток выполняют при дополнительной концентрации K⁺ по меньшей мере от около 20 мМ до около 55 мМ в течение по меньшей мере 2 часов в присутствии 20 мкМ GT1b и нейротоксического полипептида с последующим воздействием нейротоксическим полипептидом в течение еще 70 часов при встряхивании.

В дополнительном аспекте способов настоящего изобретения перед воздействием нейротоксического полипептида инкубацию некоторое время выполняют без нейротоксического полипептида.

В дополнительном аспекте способов настоящего изобретения время инкубации без нейротоксического полипептида составляет от 16 до 48 часов.

В дополнительном аспекте способов настоящего изобретения метод представляет собой метод флуоресценции.

В дополнительном аспекте способов настоящего изобретения нейротоксический полипептид представляет собой BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C1, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F, BoNT/G, BoNT/F, BoNT/G, BoNT/H или TeNT или их подтипы, как определено в настоящем документе.

В дополнительном аспекте способов настоящего изобретения субстрат представляет собой VAMP/синаптобревин, SNAP-25 или синтаксин.

В дополнительном аспекте способов настоящего изобретения клетки представляют собой нейронные клетки или нейронные дифференцированные клетки, выбранные из группы, состоящей из первичных нейронных клеток, опухолевых клеток, способных дифференцироваться до нейронных клеток, таких как нейробластомные клетки, клеток Р19 или нейронов, полученных из индуцированной плюрипотентной стволовой клетки (иПСК).

Дополнительные предпочтительные варианты осуществления способов настоящего изобретения могут быть разработаны на основании следующих примеров.

Описание фигуры

Фиг. 1. Кинетика уменьшения активности в образцах лекарственного продукта, подвергнутых стрессовому воздействию. Образцы лекарственного продукта, содержащие BoNT/А, хранили при 70°С до четырех недель. Через 0, 1, 2 и 4 недели образцы забирали и подвергали анализу в мышином биологическом анализе LD₅₀, а также в клеточном анализе (КА) с использованием различных протоколов. На оси x указано время хранения в неделях, а на оси y - относительная активность. Активность в начальной отметке приняли равной 100%, а последующие временные отметки теста выражали по отношению к начальной отметке. Результаты биологического анализа LD₅₀ показаны в виде ромбов. Результаты клеточных анализов, включающих K⁺-деполяризацию, показаны в виде квадратов, результаты анализов, включающих 8-часовую инкубацию с токсином с последующей 64-часовой инкубацией без токсина, показаны в виде треугольников, а результаты анализов, включающих встряхивание в течение 72-часовой инкубации, показаны в виде кружков. Результаты немодифицированного КА показаны в виде штрихов. Таким образом, на Фиг. 1 показано сравнение трех примеров клеточных анализов, в которых образцы, подвергнутые стрессовому воздействию, демонстрируют схожую с контрольным анализом (мышиный биологический анализ LD₅₀) кинетику распада.

Настоящее изобретение далее будет продемонстрировано с помощью представленных ниже примеров, которые, однако, не следует истолковывать как ограничивающие объем настоящего изобретения.

Примеры

Пример 1. Клеточный ИФА с двойной флуоресценцией для определения активности BoNT/A

Фиксация клеток

1. Удалите раствор среды/токсина. Добавьте 100 мкл/лунку ледяного метанола (-20°С) и инкубируйте в течение 20 мин при -20°С.

Примечание. Выполняйте все последующие этапы при комнатной температуре.

После фиксации клеток

1. Удалите раствор метанола и добавьте 100 мкл/лунку фосфатно-солевого буфера (PBS). Для более длительного хранения (>1 дня) следует добавить 300 мкл/лунку PBS и герметично закрыть планшеты парафильмом. Планшеты следует хранить в холодильном устройстве.

2. Удалите PBS и промойте клетки 3 раза фосфатно-солевым буфером по 200 мкл/лунку. Каждый этап следует выполнять в течение 1 минуты при осторожном встряхивании.

3. Удалите PBS и добавьте 100 мкл/лунку инактивирующего буфера и инкубируйте в течение 20 минут при осторожном встряхивании.

4. Удалите инактивирующий буфер и промойте клетки один раз фосфатно-солевым буфером по 300 мкл/лунку в течение 3 минут при осторожном встряхивании.

5. Удалите PBS и добавьте 200 мкл/лунку блокирующего буфера и инкубируйте в течение 1 часа при осторожном встряхивании.

6. Удалите блокирующий буфер и добавьте 100 мкл смеси первичных антител (антитела, разведенные в блокирующем буфере) в каждую лунку. Инкубируйте в течение ночи (16-18 ч) при осторожном встряхивании. Клетки одновременно инкубируют с двумя первичными антителами: мышиным антителом, специфичным к SNAP-25, расщепленному BoNT/A, и поликлональным кроличьим антителом, которое распознает SNAP-25 (антитело для определения общего количества SNAP-25 с целью нормализации).

7. Удалите смесь первичных антител и промойте клетки 4 раза фосфатно-солевым буфером по 200 мкл/лунку. Каждый этап следует выполнять в течение 3 минут при осторожном встряхивании.

8. Удалите PBS и добавьте 100 мкл смеси вторичных антител: антимышиных вторичных антител, конъюгированных с HRP, и антикроличьих вторичных антител, конъюгированных с ЩФ (антитела, разведенные в блокирующем буфере), в каждую лунку и инкубируйте в течение 2,5-3 часов при осторожном встряхивании.

9. Удалите смесь вторичных антител и промойте клетки 5 раз фосфатно-солевым буфером по 200 мкл/лунку с последующей 1 промывкой буфером HEPES по 300 мкл/лунку. Каждый этап промывки следует выполнять в течение 3 минут при осторожном встряхивании.

10. Удалите буфер HEPES из планшета и добавьте в каждую лунку 75 мкл флуорогенного субстрата для пероксидазы хрена (субстрат HRP). Инкубируйте в течение 50 минут при осторожном встряхивании. Защитите планшеты от попадания прямого света.

11. Добавьте 75 мкл флуорогенного субстрата для щелочной фосфатазы (субстрат ЩФ) в каждую лунку и инкубируйте в течение еще 50 минут при осторожном встряхивании. Защитите планшеты от попадания прямого света.

12. Выполните считывание планшетов с использованием флуоресцентного планшетного спектрофотометра:

возбуждение при 540 нм; излучение при 600 нм;

возбуждение при 360 нм; излучение при 450 нм.

13. Расчет

Для выполнения нормализации значение RFU (относительная единица флуоресценции) для расщепленного SNAP-25 (флуоресценция при 600 нм) нормализуют по RFU общего SNAP-25 (450 нм) в каждой лунке. Для лучшей иллюстрации RFU на схеме все значения умножают на коэффициент 1000 с использованием следующего уравнения:

Затем полученные значения RFU усредняют для каждого стандарта или образца.

Приготовление реагента

Фосфатно-солевой буфер (10 мМ):

фосфатно-буферный раствор (Sigma, № Р5368) (рН 7,4)

Инактивирующий буфер:

H₂O₂ 0,6% в 10 мМ PBS (рН 7,4)

Блокирующий буфер:

BSA 2% в 10 мМ PBS (рН 7,4) + тритон Х-100 0,05%

Буфер HEPES:

50 мМ HEPES (рН 7,4)

Субстрат HRP:

50 мМ HEPES (рН 7,4)

0,007% H2O2

150 пМ Amplex UltraRed

Субстрат ЩФ:

25 мМ диэтаноламина (рН 9,8)

2 мМ MgCl₂

100 мкл М DiFMUP

Пример 2. Повышение специфического захвата клостридиальных нейротоксических полипептидов клетками

a) Нейроны iCell® размораживали и высевали в соответствии с руководством пользователя Cellular Dynamics International (CDI) на 96-луночные планшеты из 4 различных партий клеток. Через 24 часа (ч) после высевания среду заменяли свежей средой для поддержания культуры, как описано в руководстве пользователя.

Еще через 72 ч инкубации среду удаляли и заменяли свежей средой, содержащей BoNT/A в различных концентрациях и ионы K⁺ в общей концентрации 30 мМ (т.е. дополнительные 25 мМ K⁺ по сравнению со стандартной средой). Через 2 часа среду с высоким содержанием K⁺ удаляли и к клеткам добавляли свежую среду, содержащую BoNT/A в различных концентрациях.

Еще через 70 ч среду аспирировали, клетки фиксировали и измеряли результаты ИФА, как описано в примере 1. Результаты данного протокола представлены на Фиг. 1 (квадраты).

b) Нейроны iCell® размораживали и высевали в соответствии с руководством пользователя Cellular Dynamics International (CDI) на 96-луночные планшеты из 4 различных партий клеток. Через 24 часа (ч) после высевания среду заменяли свежей средой для поддержания культуры, как описано в руководстве пользователя.

Еще через 72 ч инкубации среду удаляли и заменяли свежей средой, содержащей BoNT/A в различных концентрациях. Через 8 часов среду, содержащую BoNT/A, удаляли и к клеткам добавляли свежую среду без BoNT/A.

Еще через 64 ч среду аспирировали, клетки фиксировали и измеряли результаты ИФА, как описано в примере 1. Результаты данного протокола представлены на Фиг. 1 (треугольники).

c) Нейроны iCell® размораживали и высевали в соответствии с руководством пользователя Cellular Dynamics International (CDI) на 96-луночные планшеты из 4 различных партий клеток. Через 24 часа (ч) после высевания среду заменяли свежей средой для поддержания культуры, как описано в руководстве пользователя.

Еще через 72 ч инкубации среду удаляли и заменяли свежей средой, содержащей BoNT/A в различных концентрациях. Клетки помещали на планшетный шейкер в инкубатор и выполняли встряхивание со средней скоростью потока 300 см/мин в течение воздействия токсина.

Еще через 72 ч среду аспирировали, клетки фиксировали и измеряли результаты ИФА, как описано в примере 1. Результаты данного протокола представлены на Фиг. 1 (кружки).

d) Нейроны iCell® размораживали и высевали в соответствии с руководством пользователя Cellular Dynamics International (CDI) на 96-луночные планшеты из 4 различных партий клеток. Через 24 часа (ч) после высевания среду заменяли свежей средой для поддержания культуры, как описано в руководстве пользователя.

Еще через 72 ч инкубации среду удаляли и заменяли свежей средой, содержащей BoNT/A в различных концентрациях.

Еще через 72 ч среду аспирировали, клетки фиксировали и измеряли результаты ИФА, как описано в примере 1. Результаты данного протокола представлены на Фиг. 1 (штрихи).

Вывод

Таким образом, K⁺-опосредованная деполяризация клеток, уменьшение времени воздействия нейротоксического полипептида и встряхивание клеток во время воздействия нейротоксического полипептида обеспечивает схожую кинетику для оценки стабильности клеточного анализа из примера 1 при сравнении с мышиным биологическим анализом LD₅₀.

1. Способ повышения специфического захвата нейротоксического полипептида клетками, включающий:

инкубацию с нейротоксическим полипептидом клеток, восприимчивых к интоксикации нейротоксином, в течение времени и в условиях, которые позволяют нейротоксическому полипептиду проявить свою биологическую активность, причем инкубация включает по меньшей мере два из следующих этапов: (i) K⁺-опосредованную деполяризацию клеток, (ii) уменьшенное время воздействия нейротоксического полипептида, составляющее по меньшей мере 24 часа и меньше 96 часов, и/или (iii) встряхивание клеток во время воздействия нейротоксического полипептида, что приводит к повышению специфического захвата нейротоксического полипептида указанными клетками, причем специфический захват нейротоксического полипептида в клетку повышен по меньшей мере в 1,5 раза по сравнению со способами с применением условий культивирования клеток, которые не включают (i) K⁺-опосредованную деполяризацию клеток, (ii) уменьшенное время воздействия нейротоксического полипептида, составляющее по меньшей мере 24 часа и меньше 96 часов, и/или (iii) встряхивание клеток во время воздействия нейротоксического полипептида.

2. Способ по п. 1 с последующим определением биологической активности нейротоксического полипептида в клетках.

3. Способ прямого определения биологической активности нейротоксического полипептида в клетках, включающий:

a) инкубацию с нейротоксическим полипептидом клеток, восприимчивых к интоксикации нейротоксином, в течение времени и в условиях, которые позволяют нейротоксическому полипептиду проявить свою биологическую активность, причем инкубация включает по меньшей мере два из следующих этапов: (i) K⁺-опосредованную деполяризацию клеток, (ii) уменьшенное время воздействия нейротоксического полипептида, составляющее по меньшей мере 24 часа и меньше 96 часов, и/или (iii) встряхивание клеток во время воздействия нейротоксического полипептида;

b) фиксацию клеток;

c) контактирование клеток по меньшей мере с первым захватывающим антителом, специфически связывающимся с нерасщепленным и расщепленным нейротоксином субстратом, и по меньшей мере со вторым захватывающим антителом, специфически связывающимся с участком расщепления субстрата, расщепленного нейротоксином, в условиях, которые делают возможным связывание указанных захватывающих антител с указанными субстратами;

d) контактирование клеток по меньшей мере с первым детекторным антителом, специфически связывающимся с первым захватывающим антителом, в условиях, которые делают возможным связывание указанного первого детекторного антитела с указанным первым захватывающим антителом, с образованием первых детекторных комплексов, и по меньшей мере со вторым детекторным антителом, специфически связывающимся со вторым захватывающим антителом, в условиях, которые делают возможным связывание указанного второго детекторного антитела с указанным вторым захватывающим антителом, с образованием вторых детекторных комплексов;

e) определение количества первых и вторых детекторных комплексов этапа d); и

f) расчет количества субстрата, расщепленного указанным нейротоксическим полипептидом в указанных клетках, с использованием вторых детекторных комплексов для определения биологической активности указанного нейротоксического полипептида в указанных клетках.

4. Способ по п. 1 или 3, в котором K⁺-опосредованную деполяризацию клеток выполняют при дополнительной концентрации K⁺ от около 20 до около 55 мМ в течение по меньшей мере 2 часов.

5. Способ по п. 1 или 3, в котором K⁺-опосредованную деполяризацию клеток и/или воздействие нейротоксическим полипептидом выполняют в присутствии GT1b.

6. Способ по п. 1 или 3, в котором GT1b используют в концентрации от 15 до 50 мкМ, предпочтительно 20 мкМ.

7. Способ по п. 1 или 3, в котором уменьшенное время воздействия нейротоксического полипептида представляет собой воздействие на клетки нейротоксическим полипептидом в течение по меньшей мере 48 часов и максимум 72 часов.

8. Способ по п. 1 или 3, в котором встряхивание клеток во время воздействия нейротоксического полипептида выполняют с помощью магнитной мешалки, вращающихся роторных колб или встряхивания клеток шейкером, предпочтительно со средней скоростью потока среды от 25 до 300 см/мин.

9. Способ по п. 1 или 3, в котором K⁺-опосредованную деполяризацию клеток выполняют при дополнительной концентрации K⁺ по меньшей мере от 20 до 55 мМ в течение по меньшей мере 2 часов в присутствии 20 мкМ GT1b и нейротоксического полипептида с последующим воздействием нейротоксическим полипептидом в течение еще 70 часов при встряхивании.

10. Способ по п. 1 или 3, в котором перед воздействием нейротоксического полипептида инкубацию некоторое время выполняют без нейротоксического полипептида, причем время инкубации без нейротоксического полипептида составляет от 16 до 48 часов.

11. Способ по п. 1 или 3, в котором метод представляет собой метод флуоресценции.

12. Способ по п. 1 или 3, в котором нейротоксический полипептид представляет собой BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C1, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F, BoNT/G, BoNT/H или их подтипы.

13. Способ по п. 1 или 3, в котором субстрат представляет собой VAMP/синаптобревин, SNAP-25 или синтаксин.

14. Способ по п. 1 или 3, в котором клетки представляют собой нейронные клетки или нейронные дифференцированные клетки, выбранные из группы, состоящей из первичных нейронных клеток, опухолевых клеток, способных дифференцироваться до нейронных клеток, таких как нейробластомные клетки, клеток Р19 или нейронов, полученных из индуцированной плюрипотентной стволовой клетки (иПСК).

15. Способ по п. 3, включающий фиксацию клеток и увеличение проницаемости мембраны клеток детергентом на этапе b).