Способ прогнозирования эффективности лечения тимололом первичной открытоугольной глаукомы

Изобретение относится к области медицины, а именно к офтальмологии, и предназначено для прогнозирования эффективности лечения тимололом первичной открытоугольной глаукомы (ПОУГ). Способ включает забор образцов буккальных соскобов, выделение геномной ДНК, аллель-специфическую полимеразную цепную реакцию с целью генотипирования по полиморфному локусу GSTP1^Ilel05Val (rs1695) гена глутатион-8-трансферазы-P1 GSTP1 пациентов с диагнозом «первичная открытоугольная глаукома» русской национальности. У носителей генотипа GSTP1^Ilel05Ile прогнозируют офтальмогипотензивный ответ на лечение тимололом, равный и более 20%, с 5,63-кратной вероятностью, а у носителей генотипа GSTP1^Ilel05Val - офтальмогипотензивный ответ на лечение тимололом менее 20% с 9,50-кратной вероятностью. Использование изобретения позволяет прогнозировать эффективность лечения тимололом ПОУГ и определять персонализированную тактику лечения пациентов, способствующую получению максимального терапевтического офтальмогипотензивного эффекта. 1 ил., 2 табл., 2 пр.

 

Изобретение относится к медицине, а именно, к офтальмологии, и может быть использовано для прогнозирования эффективности лечения тимололом первичной открытоугольной глаукомы.

Глаукома - прогрессирующее нейродегенеративное заболевание с повреждением структуры зрительного нерва и слоя ганглиозных клеток сетчатки, приводящее к необратимой слепоте и инвалидизации. В структуре глаукомы первое место занимает первичная открытоугольная глаукома (ПОУГ). На ее долю приходится от 72,3% до 96,1% всех форм глауком (Национальное руководство по глаукоме: для практикующих врачей. Под ред. проф. А.Е. Егорова, проф. Ю.С. Астахова, проф. Е.П. Еричева. М.: издательство ГЭОТАР-Медиа; 2015). Ключевым моментом в лечении ПОУГ является нормализация (снижение) повышенного уровня внутриглазного давления (ВГД). С этой целью применяются различные группы офтальмогипотензивных препаратов. Однако фармакологический ответ пациентов широко варьирует, что связано с генетическими отличиями. Определение вариантов генов, детерминирующих эффективность лечебного эффекта, позволит прогнозировать фармакологический ответ на лекарственное средство и выбирать тактику лечения в соответствии с генетическим профилем пациента, что способствовало бы повышению эффективности и безопасности фармакотерапии (Сычев Д.А., Рожков А.В., Алексеев И.Б. Фармакогенетика при лечении глаукомы: настоящее и будущее. Фармакогенетика и фармакогеномика. 2016; 1:13-17).

При лечении глаукомы препаратами первого выбора наряду с аналогами простагландинов являются неселективные бета-блокаторы, оказывающие офтальмогипотензивное действие путем снижения продукции внутриглазной жидкости. Однако бета-блокаторы, к которым относится тимолол, снижают уровень ВГД в лучшем случае на 20-25%, что может быть связано с индивидуальным генотипом, и половина пациентов с худшими офтальмогипотензивными результатами к концу второго года монотерапии нуждается в ее коррекции и назначении комбинированного лечения.

Описания способа прогнозирования эффективности лечения тимололом первичной открытоугольной глаукомы в литературе не представлено.

Назначением настоящего изобретения является разработка способа прогнозирования эффективности лечения тимололом первичной открытоугольной глаукомы.

Назначение изобретения достигается способом прогнозирования эффективности лечения тимололом первичной открытоугольной глаукомы. Проводят забор образцов буккальных соскобов, выделение геномной ДНК, аллель-специфическую полимеразную цепную реакцию с целью генотипирования по полиморфному локусу GSTP1^Ile105Val (rs1695) гена глутатион-S-трансферазы-Р1 GSTP1 пациентов с диагнозом «первичная открытоугольная глаукома» русской национальности. У носителей генотипа GSTP1^Ile105Ile прогнозируют офтальмогипотензивный ответ на лечение тимололом, равный и более 20% с 5,63-кратной вероятностью, а у носителей генотипа GSTP1^Ile105Val - офтальмогипотензивный ответ на лечение тимололом менее 20% с 9,50-кратной вероятностью.

Новизна изобретения:

1. Предлагаемый способ позволяет прогнозировать эффективность лечения тимололом по результатам генотипирования по полиморфному локусу GSTP1^Ile105Val (rs1695) гена глутатион-S-трансферазы-Р1 GSTP1 русских пациентов с диагнозом «первичная открытоугольная глаукома».

2. У носителей генотипа GSTP1^Ile105Ile прогнозируют офтальмогипотензивный ответ на лечение тимололом, равный и более 20% с 5,63-кратной вероятностью, а у носителей генотипа GSTP1^Ile105Val - офтальмогипотензивный ответ на лечение тимололом менее 20% с 9,50-кратной вероятностью.

Новый технический результат изобретения позволяет:

1. Выявить лиц русской национальности с диагнозом «первичная открытоугольная глаукома», генетически предрасположенных к эффективному фармакологическому ответу на лечение тимололом, определенных по носительству гомозиготного варианта GSTP1^Ile105Ile локуса GSTP1^Ile105Val (rs1695) гена глутатион-S-трансферазы-Р1 GSTP1.

2. Прогнозировать эффективность лечения тимололом ПОУГ и определять персонализированную тактику лечения пациентов, способствующую получению максимального терапевтического офтальмогипотензивного эффекта.

Суперсемейство глутатион-S-трансфераз (GST) объединяет мультифункциональные антиоксидантные ферменты фазы II системы детоксикации ксенобиотиков (СДК), одной из наиболее известных функций которых является катализ конъюгации глутатиона с различными субстратами, в том числе мутагенами и канцерогенами и их электрофильными метаболитами, генерируемыми в процессах окисления I фазы детоксикации. GST могут играть важную роль в детоксикации электрофильных α- и β-ненасыщенных карбонильных соединений, продуцируемых в реакциях окисления липидов, при воздействии ионизирующей радиации и при метаболизме лекарств (Berhane K., Widersten M., Engstrom A. et al. Detoxication of base propenals and other alpha, beta-unsaturated aldehyde products of radical reactions and lipid peroxidation by human glutathione transferases. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994; 91(4):1480-1484. DOI:10.1073/pnas.91.4.1480). Глаз, постоянно подвергаясь воздействию света и кислорода, особенно уязвим к повреждению механизмами фотосенсибилизированного свободнорадикального окисления, поскольку в сетчатке глаза содержатся легко окисляемые ненасыщенные жирные кислоты. Они определяют большую чувствительность глаза, по сравнению с другими органами, к оксидативным процессам, и являются одним из факторов, способствующих развитию окулярной ишемии, ишемии или гипоксии сетчатки, диабетической ретинопатии и глаукомы (Augustin AJ. Oxidative Tissue Damage. Klin. Monbl. Augenheilkd. 2010; 227(2):90-98. DOI: 10.1055/s-0029-1245125.).

В глазу существует множество ферментных систем, защищающих глаз от окислительного повреждения, включая суперсемейство глутатион-S-трансфераз. GST Alpha, Mu и Pi-классов дифференциально экспрессируются в различных структурах и тканях глаза: Mu и Pi - в хрусталике, Alpha и Pi - в роговой оболочке, Mu и Pi - в сетчатке и макуле (Ahmad Н., Singh S.V., Medh R.D. et al. Differential expression of alpha, mu and pi classes of isozymes of glutathione S-transferase in bovine lens, cornea, and retina. Arch Biochem Biophys. 1988; 266(2): 416-426. DOI:10.1016/0003-9861(88)90273-1; Huang Q.L., Lou M.F., Straatsma BR, Horwitz J. Distribution and activity of glutathione-S-transferase in normal human lenses and in cataractous human epithelia. Curr. Eye Res. 1993; 5:433-437, DOI:10.3109/02713689309024625; Bhosale P., Larson A.J., Frederick J.M. et al. Identification and Characterization of a Pi Isoform of Glutathione S-Transferase (GSTP1) as a Zeaxanthin-binding Protein in the Macula of the Human Eye. J. Biol. Chem. 2004; 279(47):49447-49454. DOI:10.1074/jbc.M405334200) и играют важную роль в антиоксидации, детоксикации и ликвидации ксенобиотиков, включая канцерогены, окислители, токсины и метаболиты лекарств (Eaton D.L., Bammler Т.K. Concise review of the glutathione S-transferases and their significance to toxicology. Toxicol Sci. 1999; 49:156-164. DOI:10.1093/toxsci/49.2.156). Полагают, что присутствие GST Alpha, Mu и Pi в радужной оболочке и цилиарном теле необходимо для детоксикации и предотвращения инфильтрации в глазную жидкость эндогенных оксидантов, генерируемых при перекисном окислении липидов (Ahmad Н., Singh S.V., Srivastava S.K., Awasthi Y.C. Glutathione S-transferase of bovine iris and ciliary body: characterization of isoenzymes. Curr. EyeRes. 1989; 2:175-184. DOI:10.3109/02713688908995189).

Pi класс - наиболее распространенный член суперсемейства GST, найденный во многих нормальных и неопластических тканях, причем у человека, в отличие от других видов, обнаружена только одна Pi изоформа, глутатион-S-трансфераза-Р1 (GSTP1), кодируемая отдельным геном. Ген GSTP1 человека выделен и охарактеризован (Lo H.-W. and Ali-Osman F. Genomic Cloning of hGSTP1*C, an Allelic Human Pi Class Glutathione S-Transferase Gene Variant and Functional Characterization of Its Retinoic Acid Response Elements. J. Biol. Chem. 1997; 272(52):32743-327491. DOI: 10.1074/jbc.272.52.32743). Он локализуется в хромосомном локусе 11q13, состоит из 7 экзонов и 6 интронов, содержащих 3116 п.н., и может иметь несколько нуклеотидных транзиций (однонуклеотидные полиморфизмы), в том числе наиболее изученные A1404G и С2294Т в экзонах 5 и 6, которые меняют кодоны 105Ile на 105Val и 114Ala на 114Val, соответственно. Полиморфизмы GSTP1 снижают активность и аффинитет кодируемого фермента по отношению к различным электрофильным субстратам (Zimniak P., Nanduri В., Pikuta S. et al. Naturally occurring human glutathione S-transferase GSTP1-1 isoforms with isoleucine and valine in position 104 differ in enzymic properties. Eur. J. Biochem. 1994; 224(3):893-899. DOI:10.1111/j.l432-1033.1994.00893.x; Watson M.A., Stewart R.K., Smith G.B. et al. Human glutathione-S-transferase polymorphisms: relationship to lung tissue enzyme activity and population frequency distribution. Carcinogenesis. 1998; 19(2):275-280. DOI:10.1093/carcin/19.2.275) и могут определять чувствительность индивида к множеству заболеваний. Ранее нами было показано, что минорные аллели 105Val и 114Val гена GSTP1 значительно связаны с развитием воспалительной (хронический блефарит, хронический конъюнктивит, хронический блефароконъюнктивит) и дистрофической (пингвекула, птеригиум) офтальмопатологии у металлургов (Мельниченко М.А., Мальцева Н.В, Лыкова О.Ф., Конышева Т.В., Забелин В.И., Онищенко А.Л. Ассоциация генетических полиморфизмов глутатион-S-трансферазы-π1 с офтальмопатологией у работников металлургического производства. Молекулярная медицина. 2011; 1:22-27). По данным других авторов, полиморфизм GSTP1^Ile105Val в рецессивной модели наследования (Val/Val против Ile/Ile+Ile/Val) положительно коррелирует с повышенным риском развития первичной открытоугольной глаукомы (Yu Y., Weng Y., Guo J., Chen G., Yao K. Association of glutathione S transferases polymorphisms with glaucoma: a metaanalysis. PLoS One. 2013; 8(1):e54037. DOI:10.1371/journal.pone.0054037). Возможное влияние данного полиморфизма на эффективность лечения глаукомы ранее не изучалось. Выявление вариантов генов, способствующих либо препятствующих фармакотерапии глаукомы, будет весомым вкладом геномики в разработку тактики ее персонализированного лечения.

В исследуемой выборке нами были учтены критерии исключения лиц из исследования, к которым отнесли онкологические, генетические заболевания, использование нестероидных противовоспалительных препаратов, предварительное в течение последних 7 дней до начала исследования и одновременное системное лечение антибиотиками, декомпенсация соматических заболеваний, а также какие-либо операции на глазах, проведенные в прошлом. Провели обследование 39 русских пациентов (29 женщин и 10 мужчин) в возрасте от 53 до 89 лет, проживающих на территории Кемеровской области и находившихся на обследовании и лечении в офтальмологических клиниках г. Новокузнецка с диагнозом «первичная открытоугольная глаукома» (ПОУГ), выставленным в соответствии с Национальным руководством по глаукоме (Национальное руководство по глаукоме: для практикующих врачей / под ред. проф. Е.А. Егорова, проф. Ю.С. Астахова, проф. В.П. Еричева. - М: «ГЭОТАР-Медиа», 2015. - 456 с.). Для обследования всех пациентов использовали следующие клинические офтальмологические методы - визометрию, определение рефракции субъективным и объективным методами, определение цветового зрения, тонометрию, периметрию, биомикроскопию, офтальмоскопию, проведение диагностических проб Ширмера и Норна. ВГД измерялось тонометром Маклакова 10 гр по стандартной методике.

Используемый препарат для лечения ПОУГ - неселективный бета-адреноблокатор тимолол (0,5% раствор) - от разных производителей, чаще использовали препараты Тимолол-АКОС Россия, Окумед® (Ocumed) Индия, Timolol Rompharm Company S.R.L. (Румыния). Назначали инсталляции 2 раза в день. ВГД измеряли до старта терапии (Д1) и на фоне лечения через 2 недели после старта (Д2). Вычисляли коэффициент снижения ВГД в процентах от его первоначального уровня (ΔД) на лучшем глазу по формуле

Лучшим считали глаз пациента с ПОУГ, на котором выявляли I или II стадию заболевания с относительно невысоким уровнем ВГД. Худшим считали парный глаз пациента, на котором выявляли III или IV стадию процесса с более высоким уровнем ВГД. Полагаем, что «ответ» на назначение офтальмогипотензивных капель в виде снижения ВГД более информативен и генетически предопределен в ранних стадиях глаукомы («лучшие» глаза), чем в более развитых стадиях болезни («худшие» глаза), при которых наряду с генетическими факторами нарастают «местные» прессорные механизмы на уровне корнеосклеральной трабекулы.

Для оценки влияния тестируемого полиморфизма на эффективность лечения тимололом пациентов разделили на группы: 1 группа (малоэффективное лечение) - коэффициент снижения ВГД был меньше 10% (ΔД<10%), 2 группа (среднеэффективное лечение) - коэффициент снижения ВГД варьировал от 10 до 20% (т.е. находился в диапазоне 10%≤ΔД<20%), 3 группа (высокоэффективное лечение) - коэффициент снижения ВГД был равен или превышал 20% (ΔД≥20%).

Математическую обработку результатов исследований проводили с помощью пакетов лицензионных статистических программ InStatII, Microsoft Excel, SPSS22. Критический уровень значимости при проверке статистических гипотез принимался равным 0,05 (Р). Соответствие распределения частот генотипов равновесию Харди-Вайнберга определяли стандартно при помощи программы http://www.oege.org/software/hwe-mr-calc.htm1. Достоверность различий в распределении частот аллелей и генотипов между группами обследованных лиц оценивали двусторонним точным критерием Фишера. Определяли непараметрический коэффициент корреляции Спирмена (r), относительный риск (вероятность) заболевания по искомому аллелю/генотипу вычисляли как соотношение шансов (OR-odds ratio), n - количество пациентов (генотипов).

РЕЗУЛЬТАТЫ

Результаты представлены в таблице 1. В обследованной выборке носителями гомозиготного варианта GSTP1^Ile105Ile оказались 17 человек из 39 всех пациентов (44%), гетерозиготами GSTP1^Ile105Val - 21 человек (54%), и 1 человек был гомозиготой по мутантному аллелю GSTP1^Ile105Val (2%), т.е. распределение частот генотипов полиморфизма GSTP1^Ile105Val подчинялось равновесию Харди-Вайнберга (χ²=3,39; p>0,05).

Примечание: * - число вариантов генотипов/аллелей в абсолютном значении и в круглых скобках в процентах - частота встречаемости; OR - соотношение шансов (риск развития или вероятность); подстрочно указывается сравниваемый столбец/столбцы; в квадратных скобках - 95%-доверительный интервал; (Р) - показатель статистической достоверности разницы частот генотипов/аллелей.

Носительство нормального гомозиготного варианта GSTP1^Ile105Ile. Высокоэффективное лечение тимололом, т.е. фармакозависимое снижение ВГД на 20-26% (в среднем 21,7±0,8%) от достартового значения, наблюдалось почти у половины носителей данного генотипа (группа 3, 8 из 17 человек, т.е. 47%). Вероятность получения высокоэффективного офтальмогипотензивного эффекта (ΔД≥20%, группа 3) в сравнении с получением малоэффективного ответа ΔД<10% (группа 1) очень высока у нормальных гомозигот (OR=18,67; Р_3/1=0,0198). Напротив, вероятность малоэффективного ответа на тимолол таких пациентов (ΔД<10%) оказалась очень мала (OR=0,05; P_1/3=0,0198).

Среднеэффективный офтальмогипотензивный ответ на лечение тимололом (10%≤ΔД<20%, группа 2) выявлен у такого же количества пациентов-носителей данного генотипа (8 лиц). Только у 1 человека с носительством варианта GSTP1^Ile105Ile ВГД снизилось всего на 4,35%, т.е. было <10% (группа 1). Расчет показал, что при носительстве гомозиготного варианта GSTP1^Ile105Ile вероятность достичь офтальмогипотензивного ответа ΔД≥20% (группа 3) при лечении тимололом в 5,63 раз выше в сравнении с ΔД<20% (группы 1 + группа 2) - критический уровень значимости Р_3/1+2 равен 0,0329.

Носительство гетерозиготного варианта GSTP1^Ile105Val. У гетерозигот высокоэффективное лечение тимололом (ΔД≥20%) наблюдалось только у 2 человек, т.е. у десятой части гетерозиготных носителей (2 из 21 человека), среднеэффективное (10%≤ΔД<20%) - у 12 человек (почти половина гетерозигот) и малоэффективное (ΔД<10%) - у 7 человек (треть гетерозигот). Статистический анализ позволил выявить, что при гетерозиготном носительстве тестируемого локуса вероятность получения малоэффективного офтальмогипотензивного ответа пациентов (ΔД≤10%, группа 1) более чем 30-кратна в сравнении с ΔД≥20% (группа 3) - OR=31,50, P_1/3=0,0055. Вероятность получения среднеэффективного офтальмогипотензивного ответа (10%≤ΔД<20%, группа 2) оказалась более чем 6-кратна в сравнении с высокоэффективным ответом ΔД≥20% (группа 3) - OR=6,75, Р_2/3=0,0570, а вероятность получить эффект ΔД≥10% у гетерозигот (группа 2 + группа 3) в сравнении с ΔД<10% (группа 1) очень мала - OR=0,12; Р_2+3/1=0,0489. Вероятность получения высокого офтальмогипотензивного эффекта тимолола (ΔД≥20%, группа 3) также мала в сравнении с ΔД<20% (группа 1 + группа 2) у гетерозигот (OR=0,11, P_3/1+2=0,0107) и, наоборот, вероятность получения ΔД<20% - очень высока (OR=9,50, Р_1+2/3=0,0107). Таким образом, гетерозиготный генотип GSTP1^Ile105Val предрасполагает к получению худшего результата лечения тимололом ПОУГ в сравнении с гомозиготным генотипом GSTP1^Ile105Ile.

Носительство мутантного гомозиготного варианта GSTP1^Val105Val. В исследованной выборке носителем данного генотипа явился всего лишь один человек, вошедший в группу 3 (ΔД=26%), и связи такого носительства с эффективностью лечения не обнаружили (Р>0,05).

Подтверждением ассоциации тестируемого полиморфизма GSTP1^Ile105Val с эффективностью лечения тимололом ПОУГ являются и выявленные корреляционные связи - во всей исследованной выборке носительство гомозиготного генотипа GSTP1^Ile105Ile положительно коррелировало с ΔД (r=0,415, Р=0,009, n=39), а гетерозиготного генотипа GSTP1^Ile105Val - отрицательно (r=-0,493, Р=0,001, n=39). Носительство нормального аллеля GSTP1^Ilel05 положительно коррелировало с ΔД (r=0,353, Р=0,027, n=39), а носительство мутантного аллеля GSTP1^l05Val - отрицательно (r=-0,353, Р=0,027, n=39).

Таким образом, гомозиготное носительство аллеля GSTP1^Ilel05 (генотип GSTP1^Ile105Ile) детерминирует получение лучшего терапевтического эффекта тимолола. Следовательно, гомозиготный вариант GSTP1^Ile105Ile может быть прогностическим маркером высокоэффективного офтальмогипотензивного лечения тимололом пациентов с ПОУГ.

В соответствии с рекомендациями Р. Флетчера и соавт. (Р. Флетчер, С. Флетчер, Э. Вагнер. Клиническая эпидемиология. Основы доказательной медицины. «Медиа Сфера», М., 1998, 352 с. - стр. 66) для оценки чувствительности, специфичности, распространенности и прогностической ценности предлагаемого нами способа прогнозирования офтальмогипотензивного эффекта тимолола полученные нами данные были проанализированы с помощью четырехпольной таблицы 2.

Примечание: * - число вариантов генотипов (пациентов с указанными генотипами)

Доля лиц с положительным результатом теста, т.е. доля пациентов-носителей генотипа GSTP1^Ile105Ile среди лиц с ΔД≥20% в выборке оказалась равной 8/(8+2)=0,80 (80%) (чувствительность предлагаемого теста). Доля лиц с отрицательным результатом теста, т.е. доля лиц-носителей генотипов GSTP1^Ile105Val среда лиц с ΔД<20% составила 19/(19+9)=0,68 (68%) (специфичность предлагаемого теста). Распространенность генотипа GSTP1^Ile105Ile среди всех обследованных лиц с ПОУГ составила (9+8)/(9+8+19+2)=0,45 (45%), среди лиц с ΔД≥20% - 8/(8+2)=0,80 (80%), среди лиц с ΔД<20% - 9/(9+19)=0,32 (32%). Прогностическая ценность положительного результата теста (вероятность достичь терапевтического эффекта, равного ΔД≥20% при носительстве генотипа GSTP1^Ile105Ile равна 8/(8+9)=0,47 (47%). Прогностическая ценность отрицательного результата теста (вероятность ΔД≤20% при носительстве генотипов GSTP1^Ile105Val равна 19/(19+2)=0,90 (90%).

Следовательно, предлагаемый способ прогнозирования эффективности лечения тимололом первичной открытоугольной глаукомы, обладающий чувствительностью, равной 80% и специфичностью, равной 68%, может быть использован в качестве теста с прогностической ценностью положительного результата, равной 47% и прогностической ценностью отрицательного результата, равной 90%, позволяющего сделать персонализированный выбор офтальмогипотензивного фармпрепарата для лечения ПОУГ на первых этапах клинического обследования.

Изобретение иллюстрируется фотографией - Фиг. 1.

На Фиг. 1 представлены результаты проведения генотипирования 17 обследуемых пациентов с диагнозом «первичная открытоугольная глаукома», для лечения которых применяли препарат тимолола, по полиморфному локусу rs1695 (GSTP1^Ile105Val) гена глутатион-S-трансферазы-Р1 GSTP1 в виде электрофореграммы, на которой показаны продукты амплификации исследуемого локуса GSTP1^Ile105Val в виде светящихся полос.

K- - отрицательный контроль; дорожки 3, 5, 9, 10, 12, 14, 15 - гомозиготный нормальный генотип GSTP1^Ile105Ile; дорожки 1, 2, 4, 6, 7, 11, 13, 16, 17 - гетерозиготный генотип GSTP1^Ile105Val, дорожка 8 - гомозиготный мутантный генотип GSTP1^Val105Val.

Способ осуществляется следующим образом.

У пациентов с диагнозом «первичная открытоугольная глаукома» проводят забор образцов буккальных соскобов для выделения геномной ДНК и молекулярно-генетические исследования, которые осуществляют на основании информированного согласия обследованных лиц. Геномную ДНК выделяют с помощью коммерческого комплекта реагентов для экспресс-выделения ДНК из буккальных соскобов (НПФ «Литех», Москва).

Генотипирование осуществляют по полиморфному локусу rs1695 (GSTP1^Ile105Val) гена глутатион-S-трансферазы-Р1 GSTP1 с использованием комплекта реагентов «SNP-экспресс» для выявления мутации-1 глутатион-S-трансферазы Пи 1 (НПФ Литех, Москва) с помощью метода аллель-специфической полимеразной цепной реакции (ПЦР). Согласно инструкции, с образцом выделенной ДНК осуществляют одновременно две реакции амплификации - с двумя парами аллель-специфичных праймеров, на параллельное выявление аллелей GSTP1^105Ile (нормальный аллель) и GSTP1^105Val (мутантный аллель). Реакционная смесь для ПЦР состоит из 5 мкл исследуемого образца ДНК и 20 мкл рабочей амплификационной смеси, содержащей 0,2 мкл рабочего раствора Taq полимеразы. Амплификацию проводят в автоматическом термоциклере Терцик («ДНК-Технология», Москва). Программа амплификации, соответственно инструкции, включает следующий температурный режим - 1 цикл при 93°С в течение 1 мин, 35 циклов с этапами денатурации ДНК в течение 10 сек при 93°С, отжига праймеров в течение 10 сек при 64°С и синтеза цепей в течение 20 сек при 72°С, и 1 цикл при 72°С в течение 1 мин. Анализ ПЦР-продуктов проводят после их электрофоретического разделения в 50 мл 3%-агарозного геля на 50×ТАЕ-буфере, в который до застывания вносят 5 мкл 1% раствора бромистого этидия. В каждом геле вырезают два ряда лунок - для детекции аллеля нормального типа и мутантного аллеля. Фрагменты анализируемой ДНК проявлялись в виде светящихся полос. Гели анализируют в УФ-трансиллюминаторе ЕСХ-15М (Vilber Lourmat, Франция) с помощью гельдокументирующей видеосистемы GL-2 (Россия) в проходящем ультрафиолетовом свете с длиной волны 310 нм.

По результатам детекции продуктов ПЦР устанавливают носительство вариантов генотипов тестируемого полиморфизма. У носителей генотипа GSTP1^Ile105Ile прогнозируют офтальмогипотензивный ответ на лечение тимололом, равный и более 20% с 5,63-кратной вероятностью, а у носителей генотипа GSTP1^Ile105Val - офтальмогипотензивный ответ на лечение тимололом менее 20% с 9,50-кратной вероятностью.

Клинические примеры.

Клинический пример №1. Больной К., 73 года с диагнозом: ПОУГ III с правого глаза; ПОУГ I с левого глаза. Сопутствующий диагноз: Артериальная гипертензия. Объективно: Острота зрения правого глаза = 0,8. Острота зрения левого глаза = 0,9. ВГД OD=35 мм. рт. ст.; ВГД OS=26 мм. рт. ст.

С помощью предложенного способа выявлено, что пациент - носитель генотипа GSTP1^Ile105Ile, следовательно, прогнозируют офтальмогипотензивный ответ на лечение тимололом, равный и более 20%.

Назначены инсталляции 0,5% раствора тимолола 2 раза в день в оба глаза. Повторный осмотр через 7 дней. При осмотре пациент переносит инсталляции глазных капель удовлетворительно. Острота зрения правого глаза = 0,8. Острота зрения левого глаза = 0,9. ВГД OD=23 мм. рт. ст.; ВГД OS=18 мм. рт. ст.

Таким образом, применение капель 0,5% раствора тимолола у больного К, 73 лет, носителя генотипа GSTP1^Ile105Ile, позволило снизить ВГД на «худшем» правом глазу на 34%, а на «лучшем» левом глазу на 30%. Прогноз подтвердился.

Клинический пример 2. Больная А., 78 лет с диагнозом: ПОУГ VI с правого глаза; ПОУГ II с левого глаза. Незрелая катаракта обоих глаз. Сопутствующий диагноз: Артериальная гипертензия. Дислипидемия. Объективно: острота зрения правого глаза = 0. Острота зрения левого глаза = 0,2. ВГД OD=36 мм. рт. ст.; ВГД OS=33 мм. рт. ст.

С помощью предложенного способа выявлено, что пациент - носитель генотипа GSTP1^Ile105Val, следовательно, прогнозируют офтальмогипотензивный ответ на лечение тимололом менее 20%.

Назначены инсталляции 0,5% раствора тимолола 2 раза в день в оба глаза. Повторный осмотр через 9 дней. При осмотре пациент переносит инсталляции глазных капель удовлетворительно. Острота зрения правого глаза = 0. Острота зрения левого глаза = 0,3. ВГД OD=29 мм. рт. ст.; ВГД OS=28 мм. рт. ст. Добавлены инсталляции латанопроста по 1 капле 1 раз в день вечером. Через 5 дней повторный осмотр. Острота зрения правого глаза = 0. Острота зрения левого глаза = 0,3. ВГД OD=22 мм рт ст; ВГД OS=20 мм рт ст.

Таким образом, применение капель 0,5% раствора тимолола у больной А., 78 лет, носителя генотипа GSTP1^Ile105Val, позволило снизить ВГД на «худшем» правом глазу на 19%, а на «лучшем» левом глазу на 12%. Прогноз подтвердился. Дополнительное назначение латанопроста больной А. позволило достичь целевого уровня ВГД.

Способ прогнозирования эффективности лечения тимололом первичной открытоугольной глаукомы, характеризующийся тем, что проводят забор образцов буккальных соскобов, выделение геномной ДНК, аллель-специфическую полимеразную цепную реакцию с целью генотипирования по полиморфному локусу GSTP1^Ile105Val (rs1695) гена глутатион-S-трансферазы-Р1 GSTP1 пациентов с диагнозом «первичная открытоугольная глаукома» русской национальности и у носителей генотипа GSTP1^Ile105Ile прогнозируют офтальмогипотензивный ответ на лечение тимололом, равный и более 20%, с 5,63-кратной вероятностью, а у носителей генотипа GSTP1^Ile105Val - офтальмогипотензивный ответ на лечение тимололом менее 20% с 9,50-кратной вероятностью.