Способ дифференциальной диагностики жировой болезни печени алкогольного и неалкогольного генеза

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для дифференциальной диагностики жировой болезни печени алкогольного и неалкогольного генеза. Для этого на суспензию эритроцитов пациента воздействуют неоднородным переменным электрическим полем. Проводят видеорегистрацию изменения размера каждого эритроцита в период воздействия электрического поля и после его отключения. На основе компьютерного анализа полученных видеокадров производят программное вычисление значения средней амплитуды деформации в выборке эритроцитов (M1). Затем в эту же суспензию вносят раствор этанола. После чего проводят видеорегистрацию изменения размера каждого обработанного этанолом эритроцита в период воздействия электрического поля и после его отключения. На основе компьютерного анализа вычисляют значение средней амплитуды деформации в выборке эритроцитов после экспозиции в растворе этанола (М2). Определяют разность M1 - М2. При положительной и статистически значимой разности M1 и М2 делают вывод о наличии неалкогольной жировой болезни печени. При отрицательной и значимой разности M1 и М2 делают вывод о наличии алкогольной жировой болезни печени. Изобретение позволяет проводить дифференциальную диагностику жировой болезни печени. 2 ил., 1 табл., 2 пр.

 

Изобретение относится к медицине и может быть использовано в медицине, а именно: гепатологии и гастроэнтерологии в качестве способа дифференциальной диагностики жировой болезни печени алкогольного и неалкогольного генеза.

Важным критерием, позволяющим отличить неалкогольную жировую болезнь печени (НАЖБП) от алкогольной жировой болезни печени (АЖБП), служит употребление пациентами алкоголя в гепатотоксичных дозах. У большинства больных НАЖБП ассоциирована с метаболическим синдромом (МС) [5]. В патогенезе алкогольной (АЖБП) и неалкогольной (НАЖБП) жировой болезни печени, возникшей на фоне метаболического синдрома, наблюдается совпадение большей части метаболических путей, что создает сложности в диагностике [4, 6]. Кроме того отмечаются изменения эластичности, вязкоупругих характеристик (ВУХ) эритроцитов, способности их к деформации [1, 2].

Предшествующий уровень техники. При диагностике жировой болезни широко используют ряд методов это:

- биопсия печени;

- ультразвуковое исследование;

- лабораторные показатели эритроцитов;

- биохимические тесты.

Биопсия печени, будучи «золотым стандартом» для определения степени фиброза и цирроза, оказывается малоприемлемой для дифференциальной диагностики жировой болезни печени вследствие целого ряда недостатков, главные из которых: инвазивность, ошибки биоптата, влияние «человеческого фактора» (различная интерпретация результатов одного образца биопсии), зависимость результата от качества биоптата, а также ошибка, заложенная в самой процедуре биопсии (фрагментарность вследствие различной степени изменений в различных участках ткани печени). Рекомендовать биопсию для уточнения или постановки окончательного диагноза зачастую невозможно из-за сложности выполнения процедуры, необходимости госпитализации, высокого риска осложнений, а также высокой стоимости самой процедуры. Кроме того, морфологическая картина при алкогольном и неалкогольном жировом поражении печени бывает сходной, тельца Мэллори, считавшиеся ранее специфичными для алкогольного гепатита, обнаруживают и при неалкогольном стеатогепатите. В связи с инвазивностью, большой погрешностью гистологического исследования, связанной с «ошибками попадания» иглы при пункционной биопсии печени, различием в интерпретации результатов, для ранней диагностики патологических процессов в настоящее время уделяют большее внимание более точным и достоверным методам диагностики [3, 4].

Ультразвуковое исследование (УЗИ) печени помимо размеров, структуры, характера паренхимы, с применением специальной аппаратуры позволяет определить степень жировой инфильтрации и фиброза. Однако УЗИ не позволяет дифференцировать алкогольную и неалкогольную жировую болезнь печени. Кроме того, интерпретация данных УЗИ на практике вызывает сложности из-за получения трудновоспроизводимых данных с большими различиями в интерпретации. Метод ультразвуковой эластометрии с помощью аппарата FibroScan позволяет также оценить Controlled Attenuation Parameter (CAP™) - контролируемый параметр затухания, который используется для неинвазивной оценки и количественного определения стеатоза. САР™ является величиной затухания ультразвука, которая соответствует уменьшению амплитуды ультразвуковых волн при их распространении через ткань печени. Использование данного параметра расширяет спектр неинвазивных методов обследования и последующего наблюдения за пациентами с заболеваниями печени, однако дискриминировать алкогольное и неалкогольное поражение печени не позволяет.

Лабораторными показателями эритроцитов в диагностике хронического потребления алкоголя являются: увеличение среднего корпускулярного объема, повышенный уровень триангулоцитов, появление в мембранах клеток красной крови аномального фосфолипида - фосфатидилэтанола, однако изменение этих параметров не является специфичным для жировой болезни печени алкогольного генеза. [7-9].

Биохимические тесты для диагностики алкогольного и неалкогольного поражение печени основаны на методах, которые отличаются между собой в зависимости от этиологии процесса:

- метод диагностики, основанный на наличии сопутствующих биохимических нарушений, в частности, липидного, углеводного обмена. К ним относятся FibroTest, FibroMaxTest, Fibrometer. Так, в составе ФиброМакс имеется ряд неинвазивных тестов, позволяющих выявить наличие стеатоге-патита (СтеатоТест), неалкогольную (НешТест) и алкогольную (АшТест) форму стеатогепатита [10];

- метод СтеатоСкрин, позволяющий подтвердить или опровергнуть стеатоз печени, установленный по результатам УЗИ, а также выявить признаки стеатоза печени у лиц группы высокого риска. Для данного метода исследована корреляция с гистологическими признаками стеатоза печени, что позволяет использовать его с высокой степенью достоверности и неинвазивно определять наличие стеатоза печени у пациентов. [11, 12].

Недостатками всех выше указанных методов являются высокая трудоемкость и стоимость, малая доступность оборудования, необходимость специального обучения персонала, осуществляющего способы, и необходимость применения широкой номенклатуры различных реагентов. Эти факторы определяют невозможность применения данных методов для массовой диагностики, в целях скрининга. Диагностическая точность заболевания зачастую зависит от выраженности синдромов гемолиза, цитолиза, холестаза, наличия у пациента сопутствующей инфекции, что может сказаться на уровне исследуемых биохимических показателей и затруднить интерпретацию результата, тем более, в свете дифференциальной диагностики жировой болезни печени алкогольного и неалкогольного генеза. Приведенные методы не предусматривают измерение амплитуды деформации эритроцитов, их вязкоупругих характеристик, после внесения алкоголя в клеточную суспензию и экспозиции в ней клеток до проведения измерений.

Наиболее близкими аналогами (прототипом) является способ определения и исследования способности эритроцитов к деформации. Измерения осуществляется с помощью цитодифрактометров, реоскопов, эктацитометра [13-17]. Принцип их измерения состоит в помещение эритроцитов в суспензии между двумя прозрачными поверхностями и создание встречного сдвигового течения в сечении потока, имитирующее условия в кровеносных сосудах. Течение формируется путем вращения поверхностей во встречном направлении. Деформация эритроцитов измеряется оптическими средствами, например, с помощью фоточувствительной матрицы.

Следующий способ определения ВУХ клетки основан на использовании атомно-силовой микроскопии. Он проводится путем давления зонда микроскопа (кантиливира) на мембрану [18].

Вышеперечисленные способы имеют общее и существенное ограничение, которое сдерживает их применение в широкой практической медицине: низкую точность и высокую трудоемкость.

Наиболее близким аналогом (прототипом) является способ дифференциальной диагностики заболеваний печени (патент РФ №2296327, МПК G01N 27/00, опубл. 27.03.2007 г.), включающий отбор проб эритроцитов, разведение их изотоническим раствором, поддерживающим жизнедеятельность клеток эритроцитов, с заданным коэффициентом k, определение динамической вязкости η_w суспензии эритроцитов в указанном изотоническом растворе и перенос смеси исследуемых эритроцитов с заданной концентрацией клеток в измерительную кювету, отличающийся тем, что в кювете формируют неоднородное переменное электрическое поле с частотой f от 10 кГц до 5 МГц и средней напряженностью Е₀ электрического поля в зазоре между электродами в пределах от 10⁴ до 10⁶ В/м, измеряют средние скорости движения каждой клетки в суспензии и их минимальный радиус R_мин, средний радиус R и максимальный радиус R_мax через определенные интервалы времени в период воздействия электрического поля и после его отключения по истечении времени t путем видеозаписи изображения движения клеток и изменения их размера, полученные данные в цифровом виде вводят и обрабатывают в компьютере, имеющем вычислительную программу накопления и обработки данных, в результате чего определяют средние значения характеристик x_j эритроцитов для данного образца (где j - порядковый номер характеристики от 1 до 8). Причем вышеописанный процесс измерения средних скоростей движения каждой клетки в суспензии, их минимальный R_мин, средний R_cp, максимальный R_мax радиусы и определения характеристик x_j эритроцитов проводят многократно для проб эритроцитов здоровых пациентов (в норме) и пациентов с различными видами патологий, диагноз (состояние здоровья) которых определен заранее другими методами, например иммуноферментным методом, с определением характеристик эритроцитов (где i - порядковый номер диагноза от 1 до 7, в том числе норма и различные виды патологий: i=1 - норма, i=2 вирусный гепатит, i=3 - алкогольный гепатит, i=4 - смешанный гепатит, i=5 - вирусный цирроз, i=6 - алкогольный цирроз, i=7 - смешанный цирроз) и формируют из характеристик клеток статистически достоверный массив данных для последующего использования его в дифференциальной диагностике заболеваний печени, а затем проводят аналогичные измерения образцов проб эритроцитов пациентов с различными видами патологий с определением лением характеристик эритроцитов x_i,j в реальном масштабе времени с последующим сравнением этих характеристик с соответствующими значениями находящимися в базе данных компьютера, и определением показателя Δ_i близости измеряемых характеристик эритроцитов к каждому из представленных семи видов диагноза. Минимальное значение Δ_i измеряемых параметров эритроцитов человека x_j,i соответствует i-му диагнозу, который и принимают как окончательно поставленный диагноз.

Однако способ-прототип является сложным и трудоемким в воспроизведении, требует наличия базы данных характеристик эритроцитов здоровых и больных пациентов для сравнительного анализа, а также высокую квалификацию специалистов, проводящих анализ.

Техническим результатом заявляемого изобретения является создание более простого и менее трудоемкого способа дифференциальной диагностики жировой болезни печени алкогольного и неалкогольного генеза, а также увеличение объективности оценки показателей исследования вне зависимости от квалификации и опыта специалиста, производящего исследования.

Указанный технический результат достигается тем, что в способе дифференциальной диагностики жировой болезни печени алкогольного и неалкогольного генеза, включающем отбор проб эритроцитов, разведение их раствором, поддерживающим жизнедеятельность клеток эритроцитов, перенос суспензии исследуемых эритроцитов в измерительную кювету, в которой формируют под действием переменного напряжения в зазоре между двумя электродами неоднородное переменное электрическое поле с частотой около 1 МГц, измеряют параметры каждой клетки в суспензии в период воздействия на эритроциты электрического поля и после его отключения по истечении времени путем видеозаписи изображения движения клеток и изменения их размера, полученные данные в цифровом виде вводят и обрабатывают в компьютере, имеющем вычислительную программу накопления и обработки данных, в результате чего определяют средние значения изменения размеров эритроцитов для данного образца, согласно изобретения, видеорегистрацию изменения размера каждого эритроцита при его перемещении от одного электрода к другому в период воздействия электрического поля и после его отключения проводят с получением нескольких кадров видеоизображения; на основе компьютерного анализа полученных видеокадров производят программное вычисление:

- радиусов (d_i) для каждого в отдельности наблюдаемого эритроцита и находят его среднее арифметическое значение (D_1,2) до и после выключения электрического поля, среднее арифметическое значение n измерений радиуса каждого эритроцита до выключения электрического поля из уравнения (1):

где: - сумма результатов измерений радиусов

i - (от 1 до n) номер эритроцита в выборке, среднее арифметическое значение n измерений для радиусов каждого эритроцита после выключения электрического поля (2):

где: сумма результатов измерений радиусов

для j-го эритроцита.

- средний радиус (An) амплитуды деформации для каждого наблюдаемого эритроцита (3):

где: - средний радиус эритроцита под действием поля [м];

- средний радиус эритроцита после выключения поля [м].

- среднюю амплитуду деформации (М), среднеквадратическое отклонение (δ) и среднюю ошибку амплитуды деформации (m) эритроцитов находятся, согласно известных уравнений для нормального распределения (4):

полученное значение средней амплитуды деформации (М) в выборке эритроцитов является начальным - M1; затем в эту же измерительную камеру со взвесью эритроцитов вносят от 9,95 до 10,05 мкл 0,0195-0,0205% раствора этанола и осуществляют экспозицию смеси в течение около 300 сек, а затем проводят видеорегистрацию изменения размера каждого обработанного этанолом эритроцита при его перемещении от одного электрода к другому в период воздействия электрического поля и после его отключения с получением нескольких кадров видеоизображения; на основе анализа полученных видеокадров производят программное вычисление:

- радиусов (d_i) для каждого в отдельности наблюдаемого эритроцита и находят его среднее арифметическое значение (D_1,2) до и после выключения электрического поля, среднее арифметическое значение n измерений радиуса каждого эритроцита до выключения электрического поля из уравнения (1);

- среднее арифметическое значение n измерений для радиусов каждого эритроцита после выключения электрического поля (2);

- средний радиус (An) амплитуды деформации для каждого наблюдаемого эритроцита (3);

- среднюю амплитуду деформации (М), среднеквадратическое отклонение (δ) и среднюю ошибку амплитуды деформации (m) эритроцитов находятся, согласно известных уравнений для нормального распределения (4); причем, средняя амплитуда деформации (М) в выборке эритроцитов после экспозиции в растворе этанола является (М2), далее определяют разность М1 - М2 и если эта разность статистически значима [20] и положительная, то средние М1 и М2 относятся к разным генеральным совокупностям, и делается вывод о наличии - неалкогольной жировой болезни печени, а если эта разность значима и отрицательная, то средние М1 и М2 относятся к разным генеральным совокупностям, и делается вывод о наличии - алкогольной жировой болезни печени.

Способ иллюстрируется следующими графическими материалами. На фиг. 1 представлена схема измерительного вычислительного комплекса (ИВК). На фиг. 2 изображена схема измерительной ячейки.

Описание устройства для измерения амплитуды деформации эритроцитов.

Измерение амплитуды деформации эритроцитов осуществляют с помощью измерительного вычислительного комплекса (ИВК). ИВК включает следующие приборы и устройства (фиг. 1):

- компьютер (1) для регистрации потока видеоизображения и обработки потока информации от видеокамеры, расчета характеристик электрического поля в измерительной камере, расчета параметров клетки, хранения видеофайлов и результатов расчета параметров клетки, управления работой (включение/выключение) видеозаписи по заданной программе;

- осциллограф (2) Актаком ADS2111MV для регистрации переменного напряжения на электродах измерительной ячейки;

- ртутный термометр (3) 0-50°С для измерения температуры клеточной суспензии;

- генератор (4) переменного напряжения Г3-112/1;

- микроскоп (5) Микмед-6 для наблюдения за клеткой и ее реакцией в измерительной камере в ответ на действие НПЭП;

- объект микрометры (6) ОМ-О, ОМ-П для калибровки ИВК и измерения линейных размеров клетки, расстояния между электродами измерительной камеры;

- усилитель (7) переменного напряжения Г3 112/1;

- измерительную ячейку (8);

- комплекс визуализации (9) МС-14 для трансляции потока видеоизображения клетки через микроскоп в компьютер о динамике ее движения в измерительной камере;

Измерительная ячейка (8) содержит (фиг. 2) : основание, выполненное в виде стеклянной пластины (10), на которой имеются металлические электроды (11) с зазором относительно друг друга для образования измерительной камеры (12). Электроды (11) с измерительной камерой (12) накрыты покровным стеклом (13).

Описание способа дифференциальной диагностики жировой

болезни печени алкогольного и неалкогольного генеза Для разработки метода дифференциальной диагностики жировой болезни печени алкогольного и неалкогольного генеза использовалась кровь волонтеров с одобрения Этического Комитета Федерального государственного бюджетного научного учреждения «Научно-исследовательского института терапии и профилактической медицины» (протокол заседания №122 от 29.11.2016). Все волонтеры дали информированное согласие на участие в работе в соответствии с Хельсинской декларацией Всемирной ассоциации «Этические принципы проведения научных медицинских исследований с участием человека» с поправками 2000 г. и «Правилами клинической практики в Российской Федерации», утвержденными Приказом Минздрава РФ от 19.06.2003 г. №266.

Для проведения измерений у обследуемого натощак кровь объемом от 1,95 до 2,05 мл забирают вакутейнерами в 3,65-3,85% цитратный буфер в соотношении 9:1, и через от 5 до 20 минут пробу объемом от 9 до 11 мкл вносят в 0,3 М раствор сахарозы с объемом от 285 до 295 мкл и перемешивают.

Полученную клеточную суспензию объемом от 5 до 10 мкл вносят в измерительную камеру 12, образованную двумя металлическими электродами 11, накрывают покровным стеклом размером 18*18 мм и помещают в измерительную ячейку 8. Расстояние между электродами 100-150 мкм. На электроды 11 подают переменное напряжение амплитудой U=10 В и частотой f 10⁶ Гц и проводят регистрацию поведения эритроцитов в электрическом поле в автоматическом режиме с использованием ИВК. Под действием поля эритроциты оседают на грани электродов 11 и вытягиваются вдоль силовых линий поля (от электрода к электроду). На четвертой секунде после включения электрического поля производят видеорегистрацию эритроцитов, осевших на гранях электродов, в количестве от 1 до 30 видеокадров с использованием комплекса (9) визуализации. Затем, сразу после выключения, осуществляют повторную видеорегистрацию эритроцитов на гранях электродов, также в количестве от 1 до 30 видеокадров. За это время эритроциты возвращаются в исходное состояние и не меняют координат своего местоположения в измерительной камере. На основе анализа полученных, например, 60 видеокадров производят измерение радиусов (di) для каждого в отдельности наблюдаемого эритроцита и находят его среднее арифметическое значение (D1,2) до и после выключения электрического поля. Среднее арифметическое значение n измерений радиуса каждого эритроцита до выключения электрического поля находится из уравнения (1):

где: - сумма результатов измерений радиусов

i - (от 1 до n) номер эритроцита в выборке. Аналогично находится среднее арифметическое значение n измерений для радиусов каждого эритроцита после выключения электрического поля (2):

где: сумма результатов измерений радиусов

для j-го эритроцита.

Такой подход позволяет на основании представительной выборки (n=30) определить средний радиус амплитуды деформации для каждого наблюдаемого эритроцита (3):

где: - средний радиус эритроцита под действием поля [м];

- средний радиус эритроцита после выключения поля [м].

Средняя амплитуда деформации (М), среднеквадратическое отклонение (δ) и средняя ошибка амплитуды деформации (т) эритроцитов находятся, согласно известных уравнений для нормального распределения (4):

Полученное значение средней амплитуды деформации (М) в выборке эритроцитов соответствует начальным - M1.

Затем в эту же кювету со взвесью эритроцитов вносили от 9,95 до 10,05 мкл 0,0195-0,0205% р-ра этанола и осуществляли ее экспозицию в течение от 295 до 305 сек. По окончания времени экспозиции осуществляют включение электрического поля, видеорегистрацию эритроцитов, осевших на гранях электродов, в количестве от 1 до 30 видеокадров. Затем, сразу после выключения, осуществляют повторную видеорегистрацию эритроцитов на гранях электродов, также в количестве от 1 до 30 кадров. За это время эритроциты возвращаются в исходное состояние и не меняют координат своего местоположения в измерительной камере. На основе анализа полученных, например, 60 видеокадров производят измерение программными средствами радиусов (di) для каждого в отдельности наблюдаемого эритроцита и находят его среднее арифметическое значение (D1,2) до и после выключения электрического поля. Среднее арифметическое значение n измерений радиуса каждого эритроцита до выключения электрического поля находится из уравнения (1). Аналогично находится среднее арифметическое значение n измерений для радиусов каждого эритроцита после выключения электрического поля по формуле (2). Далее на основании представительной выборки (n=30) определяют средний радиус амплитуды деформации для каждого наблюдаемого эритроцита по формуле (3). Средняя амплитуда деформации (М), сред-неквадратическое отклонение (δ) и средняя ошибка амплитуды деформации (m) эритроцитов находятся, согласно известных уравнений для нормального распределения по формулам (4).

Средняя амплитуда деформации (М) в выборке эритроцитов после экспозиции в растворе этанола соответствует (М2). В процессе проведения диагностики сравнивают результаты средней амплитуды деформации выборок1 с тем, чтобы оценить достоверность разности M1 - М2.

Если эта разность статистически значима [20] и положительная, то средние М1 и М2 относятся к разным генеральным совокупностям, и делается вывод о наличии - неалкогольной жировой болезни печени.

Если эта разность статистически значима [20] и отрицательная, то средние М1 и М2 относятся к разным генеральным совокупностям, и делается вывод о наличии - алкогольной жировой болезни печени.

Достоверность разности средних М1 - М2 и постановка диагноза печени принимается, согласно выражению (5) и статистическим показателям параметров эритроцитов, см. таблицу:

У пациента с жировой алкогольной болезнью печени происходит увеличение амплитуды деформации клеток. У пациента с неалкогольной жировой болезни печени - снижение амплитуды деформации.

Клинические примеры использования данного способа дифференциальной диагностики этиологии жировой болезни печени, демонстрирующие возможность эффективного применения амплитуды деформации эритроцитов в клинической практике для определения алкогольного или неалкогольного генеза жировой болезни печени у пациентов с неясной этиологией заболевания.

Ниже приведены конкретные примеры способа диагностики.

Пример 1. У больного А., 52 лет, обратившегося в поликлинику в связи обследованием по поводу приема на работу, обнаружены гепатомегалия, единичные сосудистые звездочки, наличие избыточной массы тела (ИМТ 26,5 кг/м). При осмотре печень увеличена, выступает на 1,5-2 см из-под реберной дуги, мягкоэластической консистенции, безболезненная при пальпации, селезенка не пальпируется. Со слов больного, употребляет алкоголь редко (не более 1-2 раз в месяц, преимущественно некрепкие алкогольные напитки).

Состав крови больного на момент обращения (количество эритроцитов - 4,5⋅10¹²/л, содержание гемоглобина - 147 г/л, цветовой показатель - 0,96, количество лейкоцитов - 6,2⋅10⁹/л, формула не изменена, количество тромбоцитов - 241⋅10⁹/л, СОЭ - 8 мм/ч., гликемия натощак - 5,9 ммоль/л, общий билирубин - 15,2 мкмоль/л, связанный (прямой) - 4,2 мкмоль/л, свободный (непрямой) - 11,0 мкмоль/л, щелочная фосфатаза (ЩФ) - 210 U/1 (норма до 290 U/1), гамма-глутамилтранспептидаза (ГГТП) - 41,7 U/1 (норма до 49 U/1), АЛТ - 31 U/1 (норма до 40 U/1), ACT - 36 U/1 (норма до 37 U/1), тимоловая проба - 2,4 ед., общий холестерин - 211 мг/дл, триглицериды - 220 мг/дл, холестерин ЛПВП - 43 мг/дл, общий белок - 72,0 г/л, мочевина - 5,7 мг/дл, фибриноген - 2,8 г/л, СРБ +, протромбиновый индекс - 81,7%). Исследование методами иммуноферментного анализа (ИФА) и полимеразноцепной реакции (ПЦР) позволило исключить вирусную этиологию процесса. По данным УЗИ выявлены: умеренная гепатоспленомегалия, диффузные изменения в паренхиме печени по типу стеатоза, косвенные признаки хронического панкреатита.

Пациенту проведено исследование электрических и вязкоупругих параметров эритроцитов - определена амплитуда деформации эритроцитов начально и через 5 мин экспозиции с раствором этанола. Результаты исследований показали, что изначально амплитуда деформации эритроцитов была снижена, при частоте ƒ равной 1 МГц и напряжении U=10 В, она составляла 6,3⋅10^-6 м. Через 5 мин экспозиции с раствором этанола амплитуда деформации эритроцитов была измерена повторно и составила 8,8⋅10^-6 м, показав прирост в динамике ~на 30%, что позволяет сделать вывод об алкогольном генезе жировой болезни печени у пациента. В данном случае сложности в диагностике определялись, с одной стороны, нежеланием пациента сообщить истинную информацию о стиле потребления алкоголя в связи с опасениями, связанными с передачей сведений на место будущего трудоустройства. С другой стороны, данные общеклинических исследований не позволяли сделать вывод о систематическом приеме алкоголя (все показатели находились в пределах референтных значений или были несколько выше, что неудивительно при наличии алкогольной болезни печени на стадии жирового гепатоза). Использование предложенного способа дифференциальной диагностики позволило установить истинный генез жировой болезни печени.

Пример 2. Обследуемый К., 60 лет обратился к эндокринологу в связи с наличием абдоминально-висцерального ожирения (ИМТ 32 кг/м²). При обследовании были выявлены проявления метаболического синдрома: артериальная гипертензия 2 ст., инсулинорезистентность, атерогенная гиперлипидемия 2 Б типа, гиперурикемия. При УЗИ исследовании органов брюшной полости описана «большая белая печень». Данные исследования биохимии не выявили изменения уровня трансаминаз, ГГПТ, уровня билирубина, установлены изменения липидного профиля (общий холестерин - 228 мг/дл, триглицериды - 330 мг/дл, холестерин ЛПВП - 37 мг/дл), повышение уровня мочевой кислоты - 0,41 ммоль/л (N до 0,35 ммоль/л), глюкозы крови - 6,4 ммоль/л (N до 5,9 ммоль/л). При опросе пациент сообщил, что употребляет алкоголь, но не часто, затрудняясь детализовать дозы и частоту.

Пациенту проведено исследование электрических и вязкоупругих параметров эритроцитов. Исследование показало, что начальные значения амплитуды деформации эритроцитов составляли 7,9⋅10^-6 м. После экспозиции с раствором этанола в течение 5 мин амплитуда деформации клеток снизилась на 46%, составив 5,4⋅10^-6 м. Наблюдаемая динамика позволила сделать вывод о наличии у пациента неалкогольной жировой болезни печени. Эпизодическое употребление алкоголя в нетоксических дозах не имело значимого влияния на развитие жировой болезни печени, которую следует считать проявлением метаболического синдрома. Таким образом, выше приведенный пример осуществления заявляемого метода подтверждает достижение заявляемого технического результата, а именно: диагностики жировой болезни печени.

Источники научно-технической и патентной информации

1. Kuntz Е., Kuntz H.-D. Hepatology. Principles and practice. - Springer-Verlag Berlin, Heidelberg. - 2002. - P. 56-59;

2. Кручинина M.B., Генералов B.M., Курилович C.A., Громов А.А. Ди-электрофорез эритроцитов в диагностике диффузных заболеваний печени различной этиологии // Архив внутренней медицины. - 2011. - №.2. - с. 58-63.)

3. Гастроэнтерология. Национальное руководство // Под ред Ивашкина В.Т., Лапиной Т.Л. М: изд. группа «ГЭОТАР-Медиа». 2008. 700 с.

4. Ивашкин Н.Т. Болезни печени и желчевыводящих путей. Руководство для врачей. / Н.Т. Ивашкин, М: Вести, 2002. - 451 с. Подымова С.Д. Болезни печени. // М.: Медицина. 1993. 544 с.

5. Бельков В. В. Неинвазивные биомаркеры фиброза. До свиданья, биопсия? // Клинико-лабораторный консилиум. 2009; 30: 34-44;

6. Ahn J.M., Paik Y.-H., Kim S. H., Lee J. H., Cho J. Y., Sohn W., Gwak G.-Y., Choi M. S., Lee J. H., Koh К. C, Paik S. W., Yoo В. C. Relationship of Liver Stiffness and Controlled Attenuation Parameter Measured by Transient Elastogra-phy with Diabetes Mellitus in Patients with Chronic Liver Disease // Korean Med Sci. 2014; 29: 1113-111

7. Тарасова О.И., Мазурчик H.B., Огурцов П.П. Современные лабораторные маркеры употребления алкоголя. // Клиническая фармакология и терапия. 2007. №1 С. 1-5;

8. Буеверов А.О., Маевская М.В., Ивашкин В.Т. Алкогольная болезнь печени // Бол. орг.пищевар. - 2001. - №. - С. 16-25;

9. Хомерики С.Г., Хомерики Н.М. Алкогольная болезнь печени: механизмы развития, морфологические проявления, дифференциальная диагностика и патогенетические подходы к терапии // Consilium medicum. Гастроэнтерология. 2012, 1, с. 27-34.

10. Ивашкин В.Т. Фиброз печени /В.Т. Ивашкин, Ч.С. Павлов. М.: ГЭОТАР-Медиа. 2011.- 168 с.

11. Ивашкин В.Т., Шульпекова Ю.О. Неалкогольный стеатогепатит // Бол. орг. пищевар. -2000. - №2 - С. 41-46.;

12. Шерлок Ш., Дули Дж. Заболевания печени и желчных путей: практическое рук. Пер. с англ. под ред. З.Т. Апросиной, Н.А. Мухина. М.: Гэотар-Мед. 2002. 859 с.

13. Васин Б.Л., Долгинов Я.Ш., Еремеев Б.В., Захаров С.Д., Симанов В.А., Косырев А.Б. Устройство для определения деформируемости эритроцитов (лазерный цитодифрактометр) АС №1697304, БИ №45 (1991).

14. Захаров Станислав Дмитриевич (RU) Устройство для определения деформируемости эритроцитов крови Патент РФ 2301617:Дата 20.03.20063.

15. Bessis М., Mohandas N., Feo С.Automated ektacytometry: a new method of measuring red cell deformability and red cell indices. In: Automation in hematology, what to measure and why? Ed. D.W.Ross, G.Brecher, M.Bessis. New York, 1981, p. 153-165.

16. Fisher T.M., Stohr-Liesen M., Schmid-Schonbein H. The red cell as a fluid droplet. Tank-tread-like motion of the human erythrocyte membrane in shear flow. Science, V. 202, 894-896 (1978).

17. Захаров Станислав Дмитриевич (RU) Устройство для определения деформируемости эритроцитов крови Патент РФ 2301617 : Дата 20.03.2006.

18. Дрозд Е.С., Чижик С.А., Константинова Е.Э. // Атомно-силовая микроскопия структурно-механических свойств мембран эритроцитов/ Российский журнал биомеханики том 13, N4 (46). С 22-30.

19. Патент РФ №2296327, МПК G01N 27/00, опубл. 27.03.2007 г. (прототип).

20. Закс. Л. Статистическое оценивание. Пер. с нем. В.Н. Варигина. Под ред. Ю.П. Адлера, В.Г. Горского. М.: Статистика. 1976. стр. 72.

Способ дифференциальной диагностики жировой болезни печени алкогольного и неалкогольного генеза, включающий отбор проб эритроцитов, разведение их раствором, поддерживающим жизнедеятельность клеток эритроцитов, перенос суспензии исследуемых эритроцитов в измерительную кювету, в которой формируют под действием переменного напряжения в зазоре между двумя электродами неоднородное переменное электрическое поле с частотой около 1 МГц, измеряют параметры каждой клетки в суспензии в период воздействия на эритроциты электрического поля и после его отключения по истечении времени путем видеозаписи изображения движения клеток и изменения их размера, полученные данные в цифровом виде вводят и обрабатывают в компьютере, имеющем вычислительную программу накопления и обработки данных, в результате чего определяют средние значения изменения размеров эритроцитов для данного образца, отличающийся тем, что видеорегистрацию изменения размера каждого эритроцита при его перемещении от одного электрода к другому в период воздействия электрического поля и после его отключения проводят с получением нескольких кадров видеоизображения; на основе компьютерного анализа полученных видеокадров производят программное вычисление:

- радиусов (d_i) для каждого в отдельности наблюдаемого эритроцита и находят его среднее арифметическое значение (D_1,2) до и после выключения электрического поля, среднее арифметическое значение n измерений радиуса каждого эритроцита до выключения электрического поля из уравнения (1):

где: - сумма результатов измерений радиусов ,

i - (от 1 до n) номер эритроцита в выборке, среднее арифметическое значение n измерений для радиусов каждого эритроцита после выключения электрического поля (2):

где: - сумма результатов измерений радиусов

для j-го эритроцита,

- средний радиус (An) амплитуды деформации для каждого наблюдаемого эритроцита (3):

где: - средний радиус эритроцита под действием поля [м];

- средний радиус эритроцита после выключения поля [м],

- среднюю амплитуду деформации (М), среднеквадратическое отклонение (δ) и среднюю ошибку амплитуды деформации (m) эритроцитов находят согласно известным уравнениям для нормального распределения (4):

полученное значение средней амплитуды деформации (М) в выборке эритроцитов обозначают как (Ml); затем в эту же измерительную камеру со взвесью эритроцитов вносят от 9,95 до 10,05 мкл 0,0195-0,0205% раствора этанола и осуществляют экспозицию смеси в течение около 300 сек, а затем проводят видеорегистрацию изменения размера каждого обработанного этанолом эритроцита при его перемещении от одного электрода к другому в период воздействия электрического поля и после его отключения с получением нескольких кадров видеоизображения; на основе анализа полученных видеокадров производят программное вычисление:

- радиусов (d_i) для каждого в отдельности наблюдаемого эритроцита и находят его среднее арифметическое значение (D_1,2) до и после выключения электрического поля, среднее арифметическое значение n измерений радиуса каждого эритроцита до выключения электрического поля из уравнения (1);

- среднее арифметическое значение n измерений для радиусов каждого эритроцита после выключения электрического поля (2);

- средний радиус (An) амплитуды деформации для каждого наблюдаемого эритроцита (3);

- среднюю амплитуду деформации (М), среднеквадратическое отклонение (5) и среднюю ошибку амплитуды деформации (m) эритроцитов находят согласно известным уравнениям для нормального распределения (4); причем среднюю амплитуду деформации (М) в выборке эритроцитов после экспозиции в растворе этанола обозначают как (М2), далее определяют разность значений (M1 - М2) и если эта разность статистически значима и положительная, то средние значения (M1) и (М2) относятся к разным генеральным совокупностям, и делается вывод о наличии неалкогольной жировой болезни печени, а если эта разность значима и отрицательная, то средние значения (M1) и (М2) относятся к разным генеральным совокупностям, и делается вывод о наличии алкогольной жировой болезни печени.