5-метил-7-(3-нитро-[1,2,4]триазол-1-ил)-[1,2,4]триазоло[1,5-а]пиримидина, обладающий противотуберкулезной активностью в отношении возбудителя с множественной лекарственной устойчивостью, и способ его получения

Изобретение относится к применению 5-метил-7-(3-нитро-[1,2,4]триазол-1-ил)-[1,2,4]триазоло[1,5-а]пиримидина формулы 1 в качестве противотуберкулёзного вещества с активностью в отношении возбудителя с множественной лекарственной устойчивостью. Технический результат: предложено применение 5-метил-7-(3-нитро-[1,2,4]триазол-1-ил)-[1,2,4]триазоло[1,5-а]пиримидина для лечения туберкулёза с множественной лекарственной устойчивостью. 5 ил., 4 табл., 4 пр.

.

 

5-метил-7-(3-нитро-[1,2,4]триазол-1-ил)-[1,2,4]триазоло[1,5-а]пиримидина, обладающий противотуберкулезной активностью в отношении возбудителя с множественной лекарственной устойчивостью, и способ его получения.

Изобретение относится к области органической химии и медицины, а именно к индивидуальному триазоловому производному пиримидина - 5-метил-7-(3-нитро-[1,2,4]триазол-1-ил)-[1,2,4]триазоло[1,5-а]пиримидину формулы 1, обладающему противотуберкулезной активностью в отношении возбудителя с множественной лекарственной устойчивостью, и способу его получения.

Туберкулез является одной из ключевых проблем всемирного здравоохранения. Согласно оценкам Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), в 2015 г.туберкулезом заболели 10,4 млн. человек, в т.ч. 5,9 млн. (56,0%) мужчин, 3,5 млн. (34,0%) женщин и 1,0 млн. (10,0%) детей. На Индию, Китай и Российскую Федерацию пришлось 45,0% от совокупного общего числа в 580000 случаев заболевания. Темпы снижения заболеваемости ТБ с 2014 по 2015 годы составили во всем мире лишь 1,5%. Численность умерших от ТБ в период с 2000 по 2015 гг. сократилась на 22,0%, однако и до настоящего времени во всем мире туберкулезная инфекция остается одной из 10 ведущих причин смерти.

В 2015 году туберкулезом со множественной лекарственной устойчивостью (ТБ с МЛУ) микобактерий заболело 480000 человек. На глобальном уровне туберкулез со множественной лекарственной устойчивостью (ТБ с МЛУ) возбудителя, по оценкам, имеет место у 3,3% новых случаев туберкулеза и у 20,0% случаев, в которых больные ранее проходили соответствующее лечение. При развитии туберкулеза с множественной лекарственной устойчивостью (ТБ-МЛУ) выявляется резистентность микобактерий туберкулеза (МБТ) одновременно к двум наиболее эффективным лекарственным средствам - изониазиду и рифампицину. Эффективность лечения ТБ-МЛУ в России составляет 36,9%, в то время как по рекомендациям ВОЗ должна быть не менее 75%. Используемые для лечения туберкулеза схемы составляют комбинацию из пяти - восьми препаратов и включают разнородные химические соединения - антибиотики и химиотерапевтические средства. Применение таких схем терапии в течение длительного периода времени (до 18-24 месяцев) создает высокую медикаментозную нагрузку на больного и нередко осложняется возникновением побочных реакций, что в значительной мере затрудняет выздоровление таких пациентов. По мнению экспертов ВОЗ, без разработки и применения в клинике новых препаратов глобальная эпидемия туберкулеза с МЛУ МБТ продолжить нарастать.

До последнего времени изыскания в области терапии туберкулеза шли по направлению поиска новых действующих веществ и их комбинаций с известными лекарственными средствами (WO 1995/13807, публ. 26.05.1995; ЕР 0650728 А1, публ. 03.05.1995; ЕР 0398165 А1, публ. 22.11.1990; US 5399558, публ. 21.03.1995), либо создания новых лекарственных форм для таких известных лекарственных средств, как изониазид, рифампицин, этамбутол (WO 88/006038, публ. 25.08.1988; US 5811088, публ. 22.091998; RU 2143900 С1, публ. 10.01.2000; RU 2087146 С1, публ. 20.081997; RU2125451C1, публ. 27.01.1999).

В период 2012-2014 во фтизиатрической практике появились всего лишь два новых препарата, рекомендованных к использованию в режимах лечения больных МЛУ туберкулезом - это Бедаквилин (bedaquiline) (зарегистрированный в 2012 году в США)

и новый препарат японской компании Отсука Фармацевтикалс (Otsuka Pharmaceuticals) - Деламанид (delamanid), торговое название Делтиба (Deltyba).

Деламанид является производным нитро дигидро имидазоло оксазола, ингибирующим новую мишень в синтезе миколевой кислоты в клеточной стенке МБТ {Mycobacterium tuberculosis). Деламанид ингибирует синтез микобактериальной клеточной стенки посредством нарушения биосинтеза метокси-миколевой и кето-миколевой кислот. Препарат очень эффективен против внутриклеточной МБТ в макрофагах человека. Деламанид оказывает сильное бактерицидное действие против МБТ. Кроме того, один из продуктов метаболизма Деламанида - оксид азота, тоже обладает цитотоксическим действием против микобактерий.

Добавление Деламанида к 5-компонентной схеме терапии у пациентов со множественной лекарственной устойчивостью микобактерий, способствует повышению эффективности лечения по основным показателям: прекращению бактериовыделения (97,7%) и закрытию полостей распада.

Однако, процесс синтеза Деламанида является достаточно сложным, что приводит к удорожанию препарата. Известно, что туберкулез - это преимущественно заболевание бедных, развивающихся стран. Финансовые возможности их правительств, страховой медицины и пациентов недостаточны для использования дорогостоящих лекарственных средств. Препарат Deltyba™ (действующее вещество Деламанид) из за его высокой стоимости продают только в двух европейских странах - Великобритании и Германии. Для бедных стран такое лечение недоступно.

Таким образом, поиск новых более эффективных и дешевых в производстве препаратов, для лечения туберкулеза с множественной лекарственной устойчивостью возбудителя является актуальным в настоящее время.

Известно соединение 5-метил-7-(3-нитро-[1,2,4]триазол-1-ил)-[1,2,4]триазоло[1,5-a]пиримидин (Russian Journal of Organic Chemistry, Vol. 36, №6, p.866-872. Translated from Zhurnal Organicheskoi Khimii, Vol. 36, №6, p.899-905), authors: Kofman, T.P.; Kartseva). Однако фармакологические свойства этого соединения в литературе не описаны.

Авторы настоящего изобретения поставили перед собой задачу изучить антимико-бактериальную активность соединения 5-метил-7-(3-нитро-[1,2,4]триазол-1-ил)-[1,2,4]триазоло[1,5-а]пиримидина формулы 1, что позволит расширить ассортимент потенциальных противотуберкулезных препаратов.

Техническими результатами является разработка простого способа синтеза соединения формулы 1, которое может быть использовано в медицине в качестве лекарственного средства; выявленная противотуберкулезная активность in vitro в отношении стандартного и клинических лекарственно устойчивых штаммов M. tuberculosis, подтвержденная исследованиями in vivo на модели экспериментального туберкулеза мышей.

Задача решается тем, что способ получения соединения 5-метил-7-(3-нитро-[1,2,4]триазол-1-ил)-[1,2,4]триазоло[1,5-a]пиримидина формулы 1, осуществляется путем взаимодействия соединений формулы 1.1 и формулы 2 в присутствии раствора катализа-тора, ацетата палладия(II).

Задача решается также тем, что соединение формулы 1 обладает противотуберкулезной активностью, проявляемой в отношении чувствительного стандартного штамма H₃₇RV и лекарственно устойчивых клинических изолятов M.tuberculosis, а также на модели экс-периментального туберкулеза мышей.

Изобретение поясняется чертежами, где:

Фиг 1. МИК 5-метил-7-(3-нитро-[1,2,4]триазол-1-ил)-[1,2,4]триазоло[1,5-а]пиримидин (ОТ-В-021) формулы 1 в отношении штамма H₃₇RV. По оси абсцисс - кон-центрация соединения (1), по оси ординат - интенсивность флуоресценции резазурина (индикатора роста МБТ) в усл. ед. График построен по флуоресценции резазурина (индикатора роста МБТ) в усл. ед. средним значениям ± доверительный интервал (М±1, при α=0,05). Значение МИК=12,5 мкг/мл.

Фиг. 2. МИК 5-метил-7-(3-нитро-[1,2,4]триазол-1-ил)-[1,2,4]триазоло[1,5-а]пиримидин (ОТ-В-021) формулы 1 в отношении клинического штамма 2712 с множественной лекарственной устойчивостью, где МИК=25 мкг/мл

Фиг. 3. 5-метил-7-(3-нитро-[1,2,4]триазол-1-ил)-[1,2,4]триазоло[1,5-a]пиримидин (ОТ-В-021) формулы 1 в отношении клинического штамма 5227 с полирезистентностью, где МИК=25 мкг/мл

Фиг. 4. МИК 5-метил-7-(3-нитро-[1,2,4]триазол-1-ил)-[1,2,4]триазоло[1,5-а]пиримидин (ОТ-В-021) формулы! в отношении клинического штамма 5307 с полирезистентностью, где МИК=25 мкг/мл

Фиг. 5. МИК 5-метил-7-(3-нитро-[1,2,4]триазол-1-ил)-[1,2,4]триазоло[1,5-а]пиримидин (ОТ-В-021) формулы 1 в отношении клинического штамма 7106 с множественной лекарственной устойчивостью, где МИК=25 мкг/мл

Примеры практического осуществления.

Пример 1. Методика получения 5-метил-7-(3-нитро-[1,2,4]триазол-1-ил)-[1,2,4]триазоло[1,5-а]пиримидин формулы 1.

Раствор катализатора (полученный путем кратковременного перемешивания при t 110°С смеси Pd(OAc)₂ (12 мг, 0,05 ммоль) и BINAP (65 мг, 0,01 ммоль) в сухом толуоле (5 мл), выливали в сосуд с винтовой крышкой со смесью триазолопиримидина 1 (169 мг, 1 ммоль), нитротриазола 2 (125 мг, 1,1 ммоль), CS₂CO₃ (489 мг, 1,5 ммоль) и сухого толуола (10 мл), заполненного аргоном. Смесь перемешивали при 110°С в течение 10 часов. После охлаждения до комнатной температуры смесь разбавляли EtOAc (30 мл) и фильтровали через слой целита. Выпаривание растворителей давало соединение формулы 1 (156 мг, 63%) в виде бесцветных кристаллов (чистота ~ 94% по данным 1Н-ЯМР). Кристаллизацию из EtOAc использовали для дополнительной очистки. ¹Н-ЯМР (400 МГц, CDCl₃) δ 10,29 (с, 1H), 8,67 (с, 1Н), 7,85 (с, 1H), 2,90 (с, 3Н). ¹³С-ЯМР (100 МГц, CDCl₃) δ 167,4, 163,3, 156,7, 156,5, 148,9, 137,1, 101,1,25,7.

Способ получения соединения 5-метил-7-(3-нитро-[1,2,4]триазол-1-ил)-[1,2,4]триазоло[1,5-а]пиримидин формулы 1 изучен и проведен в лабораторных условиях. Преимущество данного способа получения заключается в том, что он позволяет напрямую вводить в реакцию нитротриазол и хлораромэтическое соединение, без предварительного образования натриевой соли нитроатризола, что сокращает число синтетических операций и упрощает синтез.

Пример 2. Противотуберкулезная активность соединения 5-метил-7-(3-нитро-[1,2,4]триазол-1-ил)-[1,2,4]триазоло[1,5-а]пиримидин формулы 1 (исследование in vitro).

Исследование антимикобактериальной активности проводили методом двукратных серийных микроразведений в жидкой синтетической среде Миддлбрука (Middlebrook 7Н9 BrothBase, Sigma-Aldrich, кат. №М0178) с 10% ростовой добавки OADC (BBL Middlebrook OADC Enrichment, Becton Dickinson, кат.№245116) в 96-луночном планшете с индикацией роста микобактерий с помощью 0,01% резазурина (Resazurinsodiumsalt, Sigma, кат.№R7017) (метод REMA - Resazurin Microdilution Assay; Palomino J.-C., Martin A., Camacho M., Guerra H., Swings J., Portaels F. ResazurinMicrotitre Assay Plate Simple and Inexpensive method for Detection of Dgug Resistance in Mycobacterium tuberculosis. // Antimicrob. Agents Chemotherap.- 2002. - Vol. 46. - №8. - P. 2720-2722) и регистрацией роста с помощью планшетного флуориметра FLUO Star Optima (длина волны возбуждения - 530 нм, излучения - 590 нм).

В качестве тест-штаммов использовали:

1) чувствительный к противотуберкулезным препаратам штамм Mycobacterium tuberculosis H37Rv (ТВС # 1/47, источник - Институт гигиены и эпидемиологии, Прага, 1976 г., получен из ФГБУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Минздрава России);

2) 4 клинических штамма из коллекции ФГБУ "Санкт-Петербургский НИИ фтизио-пульмонологии" Минздрава России с различным типом лекарственной устойчивости (полирезистентность, множественная лекарственная устойчивость) и различными сочетаниями мутаций в генах rpoB (резистентность к рифампицину), katG, inhA, ahpC (устойчивость к изониазиду).

Скрининг исследуемого соединения вначале проводили с помощью музейного штамма MBTH₃₇Rv, затем исследовали его активность в отношении лекарственно устойчивых штаммов.

Расчет МИК (минимальной ингибирующей концентрации)

Вычисляли средние значения интенсивности свечения индикатора роста (резаруфина, в который превращается резазурин при воздействии комплекса редуктаз микроорганизмов) и доверительный интервал (при р=0,05) в 8 лунках планшета: 1) контроля роста рабочей суспензии, 2) 1% контроля (рабочая суспензия, разведенная в 100 раз), 3) каждой концентрации исследуемого вещества. По полученным данным строили график. Минимальной ингибирующей концентрацией считали концентрацию препарата, в которой среднее значение флуоресценции значимо не превышало среднего значения 1% контроля роста и/или точку выхода кривой на «плато». Для оценки различий использовали t-критерий. Вычисления проводили с помощью программы, составленной Заявителями в формате Excel специально для определения МИК.

МИК соединения формулы 1 для стандартного штамма M.tuberculosis H₃₇RV равна 12,5 мкг/мл. (Фиг. 1).

Результаты определения МИК соединения формулы 1 для лекарственно-устойчивых штаммов M.tuberculosis представлены в таблице 1 и Фиг. 2-5.

Примечания. ЛУ - лекарственная устойчивость; ПОЛИ - полирезистентность; МЛУ - множественная лекарственная устойчивость; S - стрептомицин, Н - изониазид, R - рифампицин, Е - этамбутол, K - канамицин, Et - этионамид, Сар - капреомицин, А - амикацин, Z - пиразинамид.

Преимуществом соединения 5-метил-7-(3-нитро-1Н-1,2,4-триазол-1-ил) - [1,2,4] триазоло [1,5-а]пиримидина формулы 1 является то, что оно обладает антимикобактериальной активностью как в отношении чувствительного, так и лекарственно устойчивых штаммов.

Пример 3. Общетоксическое действие соединения 5-метил-7-(3-нитро-[1,2,4]триазол-1-ил)-[1,2,4]триазоло[1,5-a]пиримидин формулы 1 (исследование острой токсичности).

Опыты поставлены на 50 белых нелинейных мышах-самцах (массой 18-22 г) в соответствии с «Методическими указаниями по изучению общетоксического действия фармакологических веществ» (в книге «Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ», М., Медицина, 2005, с. 41-53). Для определения показателей острой токсичности вещество (в виде свежеприготовленной суспензии с использованием ТВИН-80) вводили белым мышам парентерально (внутрибрюшинно) однократно в возрастающих дозах. Диапазон исследуемых доз в опытах на мышах-самцах составил 100-1100 мг/кг, интервал между дозами - 150 мг/кг, каждую дозу исследовали на 5 животных. Контрольные животные получали аналогичные по объемам количества стерильной дистиллированной воды.

ЛД₅₀ рассчитывали по формуле Беренса

где А - доза, вызвавшая а% смертельных исходов; В (величина, не входящая в формулу) - доза, вызвавшая b% смертельных исходов; d - интервал между использованными дозами; А и В - соответствуют дозам, между которыми находятся ЛД₅₀.

Стандарт распределения (s)=ЛД₈₄-ЛД₁₆, определяли из графика характеристической кривой (Першин Г.Н., 1971).

Период наблюдения составил 14 дней. Регистрируемые показатели: летальность, время гибели животных, симптоматика отравления, ежедневное наблюдение общего состояния и поведения на протяжении 14 дней, вскрытие и макроскопическое описание погибших и всех выживших к концу исследования. У выживших животных при вскрытии извлекали внутренние органы (сердце, печень, легкие, селезенка, почка), взвешивали и вычисляли биометрические показатели (по отношению массы органа (г) к массе тела животного (г). Результаты определения ЛД₅₀ у мышей представлены в таблицах 2 и 3.

ЛД₅₀=297,8±85,01 мг/кг; ЛД₈₄=480 мг/кг; ЛД₁₆=115 мг/кг

Проведенные экспериментальные исследования острой токсичности соединения формулы 1 показали, что ЛД₅₀ для белых нелинейных мышей составляет при внутрибрюшинном введении - 297,8±85,01 мг/кг. При наблюдении за животными в постинтоксикационном периоде не выявлено выраженных изменений общего состояния. При патоморфологическом исследовании внутренних органов животных, переживших интоксикацию, не обнаружено видимых изменений внутренних органов. Эти данные свидетельствуют об удовлетворительной переносимости соединения формулы 1.

Пример 4. Терапевтическая эффективность соединения формулы 1 на модели экспериментального туберкулеза у мышей.

Опыты поставлены на 64 мышах инбредной линии C57black/6 в соответствии с приложением 3 к приказу МЗ СССР №755 от 10.08.1977 и рекомендациями, содержащимися в директиве Европейского парламента и Совета Европейского Союза 2010/63/ЕС от 22 сентября 2010 г. о защите животных, использующихся для научных целей. Экспериментальный туберкулез моделировали путем инокуляции в латеральную хвостовую вену 10⁶ КОЕ (колониеобразующих единиц/мышь) суспензии трехнедельного (1×10⁶ КОЕ/0,2 мл) штамма М. tuberculosis H37Rv, чувствительного к противотуберкулезным препаратам (из коллекции ФГБУ «Научный Центр экспертизы средств медицинского применения Минздрава России»). Сформировано 4 группы: группа 1 (n=14) - зараженные нелеченные (контроль заражения); группа 2 (n=15) - мыши, получавшие этамбутол (противотуберкулезный препарат 1 линии) в стандартной терапевтической дозе 20 мг/кг; группа 3 (n=15) - мыши, получавшие PAS (противотуберкулезный препарат 2 линии) в стандартной терапевтической дозе 140 мг/кг; группа 4 (n=20) - мыши, получавшие соединение формулы 1 в дозе 20 мг/кг (1/10 ЛД₅₀). Лечение мышей в подопытных группах начинали на 10 день после инфицирования при обнаружении в легких очагов специфического воспаления. Исследуемые вещества вводили мышам внутрижелудочно (в/ж) через атравматичный металлический зонд в объеме 0,2 мл в виде свежеприготовленной взвеси в дистиллированной воде с использованием ТВИН-80. Дозирование противотуберкулезных препаратов (этамбутола и PAS) осуществляли на массу активного компонента таблеток. Животные группы 1 (контроль заражения) получали в аналогичном объеме дистиллированную воду. Мышей всех групп выводили из опыта через 4 недели терапии методом цервикальной дислокации. Эффективность лечения оценивалась по следующим критериям: летальность мышей; макроскопическая регистрация пораженности легких и их биометрия (в условных единицах), оценка массивности роста МБТ в дозированных посевах гомогенатов легких на плотную яичную среду Левенштейна-Йенсена (в пересчете на массу легких). Статистическую обработку данных проводили с использованием пакета прикладных программ Statistica 7.0. Метрические показатели представлялись в виде среднего и ошибки среднего (Х±m). Оценка достоверности различия метрических показателей проводилась с использованием непараметрического U-критерия Вилкоксона-Манна-Уитни. Оценка лечебного действия соединения формулы 1 в сравнении с фармакопейными противотуберкулезными препаратами по тестам пораженности органов представлена в таблице 4.

Соединение формулы 1 вызывало задержку развития генерализованного туберкулезного процесса у животных, что демонстрируется достоверным уменьшением коэффициентов массы легких в 1,2 раза(р<0,01) и числа КОЕ в посевах ткани легких в 2,4 раза (р<0,01) по сравнению с контролем заражения (табл. 5). По тестируемым показателям пораженности легких (коэффициенту массы легких и клиренсу легких от микобактерий туберкулеза) терапевтическая активность соединения формулы 1 была несколько выше эффекта ПАСК и близка к эффекту этамбутола.

Таким образом, соединение 5-метил-7-(3-нитро-[1,2,4]триазол-1-ил)-[1,2,4]триазоло[1,5-а]пиримидин формулы 1 обладает противотуберкулезной активностью in vitro в отношении стандартного и клинических лекарственно-устойчивых штаммов М. tuberculosis, умеренной токсичностью, проявляет терапевтическую эффективность в условиях монотерапии мышей с экспериментальным генерализованным туберкулезом и представляется перспективным для применения в медицинской практике.

Применение 5-метил-7-(3-нитро-[1,2,4]триазол-1-ил)-[1,2,4]триазоло[1,5-а]пиримидин формулы 1 в качестве противотуберкулёзного вещества с активностью в отношении возбудителя с множественной лекарственной устойчивостью

.