Тест-полоска для определения содержания этилового спирта в крови электрохимическим способом с помощью портативной амперометрической ячейки

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложена тест-полоска для определения содержания этилового спирта в крови электрохимическим способом с помощью амперометрической ячейки. Тест-полоска включает планарный графитовый электрод с модифицированной гидрозолем диоксида марганца поверхностью и нанесенной ферментативной смесью. Причём ферментативная смесь содержит алкогольоксидазу Pichia pastoris или Hansenula polymorpha, детергент и высокомолекулярный спирт. Изобретение обеспечивает определение содержания этилового спирта в крови электрохимическим методом в диапазоне концентраций от 1 до 32 мМ. 11 ил., 3 табл., 2 пр.

 

Изобретение относится к области химии, биосенсорики и обеспечению безопасности и здоровья человека и может быть использовано для количественного определения содержания этилового спирта в крови человека. Принципиальная схема производственного цикла изготовления тест-полоски для определения этанола в крови электрохимическим методом представлена на Фиг. 1.

Этиловый спирт (этанол) имеет существенную хозяйственную значимость: он используется как растворитель в фармацевтике, в быту и в промышленности, в качестве добавки к топливу, входит в состав антифризов, часто служит в качестве дезинфектанта. Этанол используется в качестве исходного материала в химическом синтезе. Он присутствует в составе различных пищевых продуктов и напитков, существенно влияя на их потребительские свойства.

Поскольку этанол является наиболее известным и доступным в быту психотропным веществом, его практическая значимость для населения во многом определяется юридическими нормами, регулирующими его содержание в крови водителей. В настоящее время порядок тестирования водителей на неалкогольные психотропные средства определяется Приказом Министерства здравоохранения РФ от 15.06.2015 года №344н «О проведении обязательного медицинского освидетельствования водителей транспортных средств», вступившим в силу 26 марта 2016 года. С 03.07.2018 г вступила в силу поправка в законодательство, согласно которой степень опьянения водителей определяется по анализу крови. С указанной даты вступил в силу Федеральный закон от 3 апреля 2018 года N 62-ФЗ, которым были внесены изменения в статью 12.8 КоАП РФ «Управление транспортным средством водителем, находящимся в состоянии опьянения, передача управления транспортным средством лицу, находящемуся в состоянии опьянения». Согласно этой поправке, «административная ответственность, предусмотренная настоящей статьей и частью 3 статьи 12.27 настоящего Кодекса, наступает в случае установленного факта употребления вызывающих алкогольное опьянение веществ, который определяется наличием абсолютного этилового спирта в концентрации, превышающей возможную суммарную погрешность измерений, а именно, наличием абсолютного этилового спирта в концентрации 0,3 и более грамма на один литр крови». С учетом молекулярной массы этанола равной 46 г/моль, это эквивалентно 6,52 мМ.

Процедура выявления водителей, не способных адекватно контролировать свои действия по управлению транспортным средством, разделена на два самостоятельных этапа. Первичное тестирование проводится сотрудниками полиции на месте остановки водителя на дороге с применением портативного алкотестера. Развернутое тестирование водителя представляет собой медицинское освидетельствование в медицинском учреждении. Такое освидетельствование проводится, в случае, если водитель отказался проходить проверку на алкотестере. Также проведение медицинского освидетельствования в медицинском учреждении необходимо для выявления присутствия в организме неалкогольных психотропных средств, которые не могут быть выявлены с помощью алкотестеров.

В настоящее время ни в России, ни в других странах мира не выпускаются доступные для применения в быту портативные устройства для определения этанола непосредственно в крови. Задача по самоконтролю содержания этанола в крови решается водителями путем определения содержания паров этанола в выдыхаемом воздухе с помощью портативных дыхательных алкостестеров. Популярными среди массовых потребителей являются такие модели приборов этого типа, как Ritmix rat 350, AT 6000, Динго Е010, Alcohunter professional, Carline Alco 200, Inspector at 200, Alcosafe KX-7000s. Однако, зависимость содержания этанола в крови и выдыхаемом воздухе не имеет строгого и однозначного характера: на нее влияют такие факторы, как пол и возраст человека, особенности его метаболизма, влажность и температура окружающего воздуха. За счет этого возникает риск недостоверного определения этанола в собственной крови на основании показателей дыхательных алкотестеров. Это может привести к наложению мер административной ответственности на водителя, обнаружившего, что содержание этанола в выдыхаемом им воздухе соответствует нормативам.

Таким образом, ужесточение законодательства РФ делает актуальным вопрос о разработке устройства, позволяющего проводить определение содержания этанола в крови прямым способом. Удобным решением для этой цели является принцип электрохимической детекции с использованием высокоспецифичного фермента, распознающей целевой аналит - этиловый спирт. Данный принцип успешно реализован в портативных глюкометрах, рутинно используемых в быту для определения в крови глюкозы. На рынке массово представлены такие марки портативных глюкометров, как OneTouch (США), Contour (Ascensia Diabetes Care, Германия), Диаконт (Россия), Accu-Chek Active (Roche, США) Сателлит экспресс (Элта, Россия). Основой одноразовый электродов для этих глюкометров - так называемых тест-полосок является фермент глюкозооксидаза, выделяемая из плесневых грибов (Aspergillus niger, Penicillium funiculosum и других).

Важной предпосылкой успешного решения поставленной задачи изобретения по созданию тест-полоски для определения этанола в крови является наличие источника фермента, способного с высокой избирательностью распознавать целевой аналит в составе крови и генерировать электрохимический сигнал (катодный или анодный ток). Таким ферментом могут служить алкогольоксидазы различных видов дрожжей, плесневых грибов и бактерий. Среди них особое место занимают метилотрофные дрожжи, которые благодаря наличию исключительно мощного промотора ген алкогольоксидазы (АОХ1) часто используются в качестве основы для создания рекомбинантных продуцентов практически важных белков. Метилотрофные дрожжи - это эукариотические организмы, которые способны усваивать метиловый спирт как единый источник углерода и энергии. Большинство этих организмов принадлежат к родам: Pichia, Candida, Hansenula и Torulopsis [Kurtzman C.P. Synonymy of the yeast genera Hansenula and Pichia demonstrated through comparisons of deoxyribonucleic acid relatedness // Antonie Van Leeuwenhoek. 1984. v. 50. p. 209-217]. Путь обмена метанола сравнительно простой и охватывает три последовательные стадии окисления метанола до углекислоты. Первую стадию этого процесса катализирует алкогольоксидаза (ЕС. 1.1.3.13).

СН₃ОН+O₂→CH₂O+H₂O₂

В этой реакции участвует молекулярный кислород, и образуются два токсичных продукта - формальдегид и пероксид водорода. Это обуславливает особую клеточную локализацию (компартментализацию) фермента в специальных органеллах, называемых микротельцами, или пероксисомами [Suiter G., Harder W., Veenhuis M. Structural and functional aspects of peroxisomal membranes in yeasts // FEMS Microbiol. Rev. 1993. v. 11. p. 285-296]. Органеллы диаметром 0,2-1,5 мкм отделены от цитозоля одинарной мембраной и часто содержат кристалловидную сердцевину, уложенную молекулами АО. Кроме АО в пероксисомах содержится каталаза, которая разрушает токсичный пероксид водорода. Формальдегид, образующийся в ходе ферментативной реакции под действием АО, диффундирует из пероксисом в цитозоль, где окисляется до углекислого газа в процессе двух дегидрогеназных реакций.

Алкогольоксидаза - ключевой фермент для метилотрофного обмена метилотрофных дрожжей. Этот фермент является флавопротеином, который содержит флавинадениндинуклеотид (ФАД) как простетическую группу, связанную с апоферментом нековалентными связями. Активный белок является октамером (Рис. 1), который складывается из восьми идентичных ФАД-содержащих субъединиц с общей молекулярной массой 600 кДа.

Ферментативную активность проявляет октамер АО, что подтверждается отсутствием каталитической активности после диссоциации фермента в 80% глицерине на ФАД-зависимые мономеры. Реактивация наблюдается при разведении раствора и связана с реассоциацией октамера. Также было отмечено, что если перед диссоциацией АО заранее исключить ФАД из холофермента, то в случае дальнейшего его внесения ни реактивация, ни реассоциация не происходят [Evers М., Harder W., Veenhuis М. In vitro dissociation and reassembly of peroxisomal alcohol oxidase of Hansenula polymorpha and Pichia pastoris // FEBS Lett. 1995. v. 368. p. 293-296].

Белок имеет достаточно низкую изоэлектрическую точку: например, pI АО из Candida pastoris составляет 5,7. Алкогольоксидазу выделяют в высокоочищенном состоянии из нескольких видов метилотрофных дрожжей. Как обычно, процедура очистки фермента включает несколько стадий: механическое разрушение клетки, фракционное осаждение сульфатом аммония, ионообменная хроматография на анионитах и гель-фильтрация на сефадексах. Искомая активность очищенного фермента изменяется в широких пределах - от 5 до 30 и даже 50 мкмоль/(мин×мг) в зависимости от вида дрожжей и схемы очистки. В окисленном состоянии флавопротеин имеет максимумы поглощения при 212, 274, 375 и 460 нм с острым пиком при 396 нм для алкогольоксидаз из Н. polymorpha и P. pastoris. Восстановление АО субстратом (простейшим алифатическим спиртом) приводит к частичному понижению пиков при 375, 396 и 460 нм. Разница при поглощении при 460 нм между окисленной и восстановленной субстратом формами фермента служит для определения содержания окисленного флавина в АО (Δε_мМ=11,3мМ^-1×см^-1). В обычных препаратах фермента наряду с каталитически активной окисленной формой фермента обнаружена стабильная «красная» семихинонная форма АО (до 35%), которая не восстанавливается дальше ни метанолом, ни сульфитом или дитионитом натрия. Кроме того, до 30-35% может достигать содержание так называемой некомпетентной ФАД-зависимой формой АО, также не способной восстанавливаться при наличии метанола [Geissler J., Ghisla S., Kroneck P. Flavin-dependent alcohol oxidase from yeast. Studies on the catalytic mechanism and inactivation during turnover // Eur. J. Biochem. 1986. v. 160. p. 93-100]. Генерацией этих неактивных форм АО объясняется значительная вариабельность в искомых активностях хроматографически чистых препаратах фермента.

Алкогольоксидазы из разных видов дрожжей имеют сходную первичную структуру и близкие спектры кругового дихроизма, что свидетельствует о подобии вторичной структуры белков. Кинетические характеристики ферментов разного происхождения также схожи, хотя некоторые отличия в кинетических параметрах есть, особенно в Км относительно субстратов [Pavlishko Н., Gayda Н., Gonchar М. Alcohol oxidase and its bioanalytical application // Visnyk of L'viv Univ. Biology series. 2004. v. 35, p. 3-22] (Таблица 1).

AO не является высокоспецифичным ферментом и, кроме метанола способна окислять другие первичные спирты - от этанола до гексанола, практически не действуя на их вторичные и третичные изомеры. Каталитическая активность фермента понижается с увеличением длины углеродной цепи субстрата. Например, если эффективность окисления метанола для АО из Н. polymorpha принять за 100%, то этанол окисляется с относительной скоростью 35-50%, пропанол-1 - 25-60%, бутанол-1 - 13-53%. В таблице приведены значения Км для разных спиртов для АО из разных видов дрожжей.

Молекулярный кислород является вторым субстратом для АО, и его концентрация влияет на каталитическую активность фермента и кинетические параметры АО относительно спиртов. Например, Км по метанолу, определенная в насыщенных кислородом растворах, втрое выше по сравнению со значением Км, полученным в условиях насыщения воздухом. Кроме молекулярного кислорода для алкогольоксидазной реакции акцепторами электронов могут являться: никатинамидадениндинуклеотид (НАД+), ферроцианид калия, 2,6-дихлорфенолидофенол, метил фиолетовый, цитохром С, метиленовый синий.

Температурный оптимум для АО разного происхождения немного отличается. Больше всего температурный оптимум сдвинут в область высоких температур для фермента из Н. polymorpha (до 45°С). При повышении температуры прослеживается сильное уменьшение значений Км для всех субстратов, кроме метанола, для которого Км постоянна до 55°С [Pavlishko Н., Gayda Н., Gonchar М. Alcohol oxidase and its bioanalytical application // Visnyk of L'viv Univ. Biology series. 2004. v. 35, p. 3-22].

Алкогольоксидаза из H. polymorpha существенно отличается от аналогичных ферментов из других метилотрофных дрожжей и рН-оптимумом. Этот фермент имеет широкий диапазон оптимума рН - от 7 до 11, тогда как для других АО характерны острые пики максимумов активности при рН~8. Кроме того, АО из Н. polymorpha устойчива к ингибировнию хлоридами, а АО из P. pastoris очень чувствительна к действию этого аниона.

Продукт алкогольоксидазной реакции - пероксид водорода - негативно влияет на каталитические свойства АО, инактивирует фермент. АО большинства видов дрожжей теряют половину активности при концентрации Н₂О₂ в диапазоне от 1 до 10 мМ, тогда как фермент из P. pastoris устойчив к инактивирующему действию пероксида водорода, сохраняя активность в 1 М Н₂О₂ на протяжении 20 мин при 30°С. Пероксид водорода, возможно, окисляет определенную функциональную группу активного центра фермента, поскольку глутатион реактивирует фермент. Наличие каталазы уменьшает инактивацию, однако не полностью. Другой продукт ферментативной реакции под действием АО - альдегид - в больших концентрациях инактивирует фермент. Вероятно, это связано со способностью карбонильных групп реагировать с функциональными группами белка, богатыми лизином. Алкогольоксидаза полностью инактивируется реагентами на сульфогидрильную группу (1 мМ п-хлормеркурибензоат ионом и 10 мМ йодацетамидом), ионами тяжелых металлов (1 мМ Cd²⁺, Cu²⁺, Hg²⁺, Ag⁺), азидом натрия, цианидом калия. Цианид калия при концентрации 6 мМ является причиной отщепления ФАД от холофермента при инкубации как цельных клеток, так и клеточных экстрактов на протяжении 2 часов при 37С [5]. Также отмечено, что фермент ингибируется хелатирующими агентами, кроме ЭДТА (этилдиаминтетраацетатом).

Механизм каталитического действия АО мало изучен. Если сравнивать с субстратами других флавинооксидаз, например, оксидаз аминокислот или лактатоксидаз, то, С-Н-связи в молекуле спирта, которые подвергаются окислению, намного меньше поляризованы с соседними функциональными группами. В случае окисления аминокислот или лактата реакцию инициирует образование α-карбоаниона путем отщепления Н⁺ от С-Н связи через возможное образование ковалентного аддукта между заданным карбоанионом и N₅-атомом окисленного флавина (Fl_ox). Завершается реакция формированием восстановленного флавина (Fl_red) и продукта реакции. Цикл завершается реокислением Fl_red кислородом. Описанный путь маловероятен для С-Н группы спиртов, поскольку нет механизма стабилизации карбоаниона, поэтому для АО предложен радикальный механизм. Предполагаются два одноэлектронных перехода от субстрата к Fl_ox. Эта гипотеза подтверждается фактом инактивации фермента под действием «суицидных» субстратов - циклопропанола и циклопропангидрата, которые дают промежуточный комплекс между флавинсемихиноном и β-пропионатрадикалом [Sherry B., Abeles R. Mechanism of action of methanol oxidase, reconstitution of methanol oxidase with 5-deazoflavin, and inactivation of methanol oxidase by cyclopropanol // Biochemistry. 1985. v. 24. p. 2594-2605]. Кинетическая схема всего каталитического процесса под действием АО (Фиг. 2) включает четыре этапа: 1) формирование комплекса Михаэлиса между ферментом и субстратом; 2) восстановительный этап, включающий скорость-лимитирующий процесс разрыва С-Н связи субстрата; 3) реакция комплекса восстановленного фермента и альдегида с молекулярным кислородом; 4) медленное отщепление продукта из комплекса окисленного фермента и продукта.

В литературе описано много примеров использования алкогольоксидаз для создания датчиков для определения этанола и других алифатических спиртов. Биосенсорные системы на основе этих ферментов обладают высокой чувствительностью анализа за счет эффекта усиления, вызванного способностью одной молекулы фермента катализировать реакции нескольких молекул субстрата. В биосенсорных системах для изготовления сенсоров для определения спиртов помимо алкогольоксидазы используется NAD + зависимая алкогольдегидрогеназа (АДГ). Алкогольдегидрогеназа обратимо окисляет простые алифатические и ароматические спирты (1):

Сенсоры на основе алкогольдегидрогеназы более специфичны и стабильны, чем биосенсоры на основе АО. Датчики на основе АДГ обладают хорошей операционной стабильностью RSD=3-5% (за 10 измерений) [Svensson K., Bulow L., Kriz D. Investigation and evaluation of a method for determination of ethanol with the SIRE Biosensor P100, using alcohol dehydrogenase as recognition element // Biosensors & Bioelectronics. 2005. v. 21. p. 705-711], пределы детекции таких датчиков достигают 10-13 мкМ [Tsai Y., Huang J., Chiu C. Amperometric ethanol biosensor based on poly(vinyl alcohol)-multiwalled carbon nanotube-alcohol dehydrogenase biocomposite // Biosensors & Bioelectronics. 2007. v. 22. p. 3051-3056]. Однако сенсоры на основе АДГ требуют постоянного пополнения выщелачиваемого кофактора NAD+, что усложняет конструкцию датчиков. Прямое электрохимическое восстановление кофактора достигается либо при включении в систему медиатора, способствующего подщелачиванию среды, либо при поддержании высокого потенциала, в результате чего наблюдается пассивация (загрязнение) поверхности электрода.

Алкогольоксидаза, продуцируемая метилотрофными дрожжами родов Hansenula, Pichia, Candida катализирует окисление низкомолекулярных алифатических спиртов до соответствующих альдегидов, используя молекулярный кислород как акцептор электронов. Благодаря сильному окисляющему действию О₂ реакция, катализируемая АО, необратима (2):

Биосенсоры на основе АО просты в аппаратурном оформлении, позволяют определять этанол в сложных образцах благодаря высокой специфичности фермента. Детекция спирта при использовании амперометрических сенсоров проводится либо по количеству потребляемого молекулярного кислорода, либо по количеству образующегося в ходе каталитической реакции пероксида водорода. При этом катодный ток восстановления молекулярного кислорода протекает при потенциале - 600 мВ, а анодный ток окисления пероксида - при потенциале +600 мВ относительно электрода сравнения (Ag/AgCl).

а) устройство амперометрических сенсоров на основе алкогольоксидазы, детектирующие потребляемый в ходе ферментативной реакции молекулярный кислород

Чаще всего используются кислородные датчики Кларк-типа для детекции молекулярного кислорода. Электрод Кларка состоит из платинового катода, на котором восстанавливается кислород, и электрода сравнения, обычно это Ag/AgCl. Платиновый катод покрывается полупроницаемой мембраной, через которую диффундирует O₂, и погружается в раствор электролита (обычно используется раствор хлорида калия). При подаче на катод потенциала -600 мВ относительно электрода сравнения молекулярный кислород восстанавливается (согласно схеме, иллюстрирующей реакции, протекающие на рабочем электроде и электроде сравнения), и генерируется ток пропорциональный количеству восстановленного кислорода:

Сенсоры спиртов, детектирующие потребляемый молекулярный кислород, различаются кислородчувствительными полупроницаемыми мембранами, на которые иммобилизуют фермент, а также способами иммобилизации АО на мембраны. Так, в работе [Wen G., Zhang Y., Shuang S. Application of a biosensor for monitoring of ethanol // Biosensors & Bioelectronics. 2007. v. 23, p. 121-129] в качестве полупроницаемой мембраны использовалась яичная скорлупа, на которой был иммобилизован фермент при помощи 0,3% раствора хитозана.

Разработанный таким образом биосенсор обладает достаточно низким пределом детекции - 30 мкМ и хорошей операционной стабильностью (RSD=3,2% за 11 измерений). Следует отметить очень хорошую стабильность при хранении такого датчика (86.4% первоначальной активности сенсора сохраняется при хранении 3 месяца).

Кислородчувствительную мембрану из тефлона [Akyilmaz E., Dinckaya Е. А mushroom (Agaricus bisporus) tissue homogenate based alcohol oxidase electrode for alcohol determination in serum // Talanta. 2000. v. 53. p. 505-509] также успешно использовали для создания биосенсора, основанного на гомогенате ткани плодовых тел шампиньона Agaricus bisporus, который обладает алкогольоксидазной (ЕС 1.1.3.13) активностью. Полученный датчик обладает хорошей операционной стабильностью (RSD=2,31% за 10 измерений) и позволяет определять спирт в больших концентрациях, область линейности такого биосенсора 0,2-20 мМ. Хотя датчик прост в изготовлении, однако обладает хорошей операционной стабильностью лишь при повышенной температуре (Т=35°С), что ограничивает возможности его применения.

б) амперометрические сенсоры на основе алкогольоксидазы, детектирующие пероксид водорода, образующийся в ходе ферментативной реакции

Электрохимически можно детектировать пероксид водорода с использованием амперометрических датчиков, измеряя анодный или катодный отклик, благодаря, соответственно, окислению или восстановлению пероксида водорода на поверхности рабочего электрода. Биосенсоры, полагающиеся на прямую детекцию пероксида водорода, составляют, так называемые, сенсоры первого поколения (Фиг. 3).

К сенсорам первого поколения можно отнести и датчики на основе графитовой пасты. A. Morales и F. Cespedes в 1997 году описали амперометрический сенсор на основе полимерного композита, состоящего из эпоксидной смолы, графитового порошка и АО [Morales A., Cespedes F., Martinez-Fabregas Е. Ethanol amperometric biosensor based on an alcohol oxidase-graphite-polymer biocomposite // Electrochimica Acta. 1998. v. 43. N. 23. p. 3575-3579], который был помещен в специальную трубку, связанную с электрохимической цепью. Активность фермента в такой пасте сохраняется в течение трех месяцев. Однако следует отметить, что полученный датчик позволяет определять спирт лишь в высоких концентрациях (область линейности 0,01-0,63 М), что сужает область его применения. Также стали изготавливаться датчики с использованием трафаретной печати (screen-printed), которые напрямую детектируют пероксид водорода. Например, «screen-printed» сенсор описан в работе [Patel N.G., Meier S., Cammann K. Screen-printed biosensors using different alcohol oxidases // Sensors snd Actuators. 2001. v. В 75. p. 101-110]. Фермент иммобилизовали на поверхности рабочего платинового электрода при помощи поликарбомаил сульфонатного гидрогеля (ПКС) (Фиг. 4).

Преимущества сенсоров, изготовленных с использованием трафаретной печати, в легкости их производства и возможности изготовления сенсоров малых размеров, к тому же они обладают широкой областью линейности по этиловому спирту (0,01-3 мМ), хорошей операционной стабильностью (RSD=1,9% за 8 измерений) [Liden Н., Vijayakumar A., Gorton L. Rapid alcohol determination in plasma and urine by column liquid chromatography with biosensor detection // J. of Pharm. & Biomed. Anal. 1998. v. 17. p. 1111-1128].

Однако высокий потенциал (+600 мВ [Patel N.G., Meier S., Cammann K. Screen-printed biosensors using different alcohol oxidases // Sensors snd Actuators. 2001. v. В 75. p. 101-110], +1100 мВ [Morales A., Cespedes F., Martinez-Fabregas E. Ethanol amperometric biosensor based on an alcohol oxidase-graphite-polymer biocomposite // Electrochimica Acta. 1998. v. 43. N. 23. p. 3575-3579]), необходимый для окисления пероксида водорода, может вызывать ряд проблем, связанных с окислением при этом потенциале некоторых веществ (аскорбиновая и мочевая кислоты), присутствующих в реальных исследуемых образцах. Чтобы избавиться от этого недостатка поверхность электрода часто модифицируют электрокатализаторами (медиаторами), способствующими снижению необходимого потенциала. Медиаторы осуществляют перенос электронов между пероксидом водорода и электродом. Такие датчики называются биосенсорами второго поколения. В качестве электрокатализатора часто используются комплексы кобальта, осмия, ферроцен, Берлинская лазурь. Например, разработан датчик [Karyakin A., Karyakina Е., Gorton L. Prussian-Blue-based amperometric biosensors in flow-injection analysis // Talanta. 1996. v. 43. p. 1597-1606], который состоит из стеклоуглеродного рабочего электрода, модифицированного Берлинской лазурью путем электрохимического осаждения, на поверхности которого образована тонкая пленка из АО и перфторполиэлектролита (ПФП). Применение Берлинской лазури позволяет снизить рабочий потенциал до 0 В по сравнению с Ag/AgCl. Полученный датчик имеет предел детекции 0,05 мМ, относительно стабилен при использовании (величина ответа падает менее чем на 10% за 6 часов измерений).

Также в качестве электрокатализатора для окисления пероксида водорода может использоваться кобальт. Модификацию комплексом кобальта с органическим лигандом использовали М. Boujtita и J. Hart при создании «screen-printed» сенсора для определения спирта в пиве (от 5.19% об.) [Boujtita М., Hart J., Pittson R. Development of a disposable ethanol biosensor based on a chemically modified screen-printed electrode coated with alcohol // Biosensors & Bioelectronics. 2000. v. 15. p. 257-263] (Фиг. 5):

Альтернативный подход для решения проблем, связанных с высоким рабочим потенциалом, это использование другого акцептора электронов для регенерации окисленной формы кофактора ФАД. Идеальный метод заключается в прямом переносе электронов между активным центром, обычно расположенным внутри молекулы фермента, и поверхностью электрода. Пока это еще малоразработанные методики (биосенсоры третьего поколения), поскольку АО не может непосредственно соприкасаться с поверхностью электрода, что объясняется стерическими затруднениями и высоким реакционным барьером.

Другим подходом решения этой проблемы является использование двух ферментов для создания сенсоров (Фиг. 6). Например, разработан пастовый графитовый электрод на основе двух ферментов - алкогольоксидазы и перокидазы хрена [Liden Н., Vijayakumar А., Gorton L. Rapid alcohol determination in plasma and urine by column liquid chromatography with biosensor detection // J. of Pharm. & Biomed. Anal. 1998. v. 17. p. 1111-1128]. При этом рабочий потенциал составил -50 мВ по сравнению с электродом сравнения (Ag/AgCl), благодаря чему было исключено влияние электрохимически мешающих соединений. Такой датчик позволяет определять спирт в достаточно широком диапазоне (область линейности 0.02-2 мМ), однако процесс изготовления длителен (более 20 часов) и датчик нестабилен (активность падает на 71% при измерениях в течение недели).

Биферментные электроды могут быть как с прямым переносом электронов, так и с медиаторным. Наиболее часто в качестве медиаторов при изготовлении биферментных сенсоров используются ферроцен, ферроцианид калия, комплексы осмия. В последнее время создаются сенсоры, сочетающие сразу несколько альтернативных способов снижения рабочего потенциала и повышения чувствительности датчика. Так был разработан сенсор второго поколения на основе биокомпозита, включающего два фермента - АО и пероксидазу хрена (ПХ), в виде спрессованных таблеток-электродов (диаметр до 1,3 см) [Guzman-Vazquez de Prada А., Pena N., Mena М. Graphite-Teflon composite bienzyme amperometric biosensors for monitoring of alcohols // Biosensors & Bioelectronics. 2003. v. 18. p. 1279-1288.] (Фиг. 7). Наряду с низким пределом детекции (5,3 мкМ) такой биосенсор способен «самообновляться» за счет полирования поверхности, что делает данный способ изготовления датчика экономически выгодным. Разработанный таким образом достаточно стабильный датчик (за 3 месяца хранения при 0°С нет значительных потерь ферментативной активности) обладает удовлетворительной операционной стабильностью (RSD=6,1% за 10 измерений).

Техническая проблема, решение которой обеспечивается при осуществлении настоящего изобретения, состоит в разработке устройства сменного пластинчатого электрода, обеспечивающего возможность достоверного определения содержания этилового спирта в крови электрохимическим методом в диапазоне концентраций от 1 до 32 мМ с использованием коммерчески доступных амперометрических датчиков.

Техническая проблема решена путем создания тест-полоски, представляющей собой электрохимический сенсор с планарными углеродными электродами, покрытыми электрохимически активным медиаторным слоем, на поверхность которого наносится ферментативная смесь. Ферментативная смесь (биокомпозит) обеспечивает специфическое окисление этанола с образованием электроактивного компонента. Состав ферментативной смеси обеспечивает быстрое растворение компонентов при контакте с анализируемым образцом крови. Концентрация образовавшегося электроактивного компонента пропорциональна концентрации этанола в анализируемом образце крови. В состав биокомпозита входит фермент алкогольоксидаза, медиатор электронного переноса, детергент, высокомолекулярные спирты. Нанесение смеси проводится на рабочую поверхность электродов с помощью робота с перистальтическим дозатором.

В качестве альтернативного метода обеспечения электрохимического контакта между угольным электродом и оксидазой используют покрытие для электрохимических пероксид-чувствительных сенсоров, полученное с использованием гидрозоля диоксида марганца по способу, описанному в патенте РФ №2419785 «Гидрозоль для формирования покрытий электрохимических пероксид-чувствительных сенсоров и биосенсоров, способ его получения, электрохимический сенсор и биосенсор, способы их получения и применение» (патентообладатель ООО «Чипдетект», приоритет от 6 июля 2010 г).

Гидрозоль диоксида марганца получают, проводя реакцию сопропорционирования между ионами Mn²⁺ и MnO₄^- в водном растворе, подбирая противоионы и концентрации солей таким образом, чтобы в результате образовался стабильный золь MnO₂. Роль стабилизатора в этом случае выполняют отрицательно заряженные противоионы (например, ацетат-ионы), которые, адсорбируясь на поверхности образующихся частиц MnO₂, придают им одноименный заряд и препятствуют агломерации.

Принцип работы медиатора на поверхности полученного таким образом пероксид-чувствительного сенсора проиллюстрирован на Фиг. 8. Он состоит в том, что пероксид водорода, окисляясь на поверхности электрода, восстанавливает MnO₂ до оксидов Mn (II) и (III), которые при потенциале +250 - +500 мВ (относительно графитового или Ag/AgCl электрода сравнения) тут же электрохимически окисляются на электроде до MnO₂. На рисунке ниже представлена схема амперометрической детекции Н₂О₂ на электроде, модифицированном пероксид-чувствительным слоем MnO₂.

Для получения ферментативного пероксид-чувствительного биосенсора на поверхность пероксид-чувствительного сенсора наносят фермент алкогольоксидазу в составе ферментативной смеси, не содержащей феррицианид калия. На Фиг. 8 представлена схема электрохимической детекции этанола при помощи алкогольоксидазного биосенсора на основе медиатора MnO₂. Этанол окисляется кислородом воздуха при участии фермента алкогольоксидазы на поверхности электрода, при этом образуется пероксид водорода, который электрохимически регистрируется пероксид-чувствительным слоем сенсора.

Следующие фигуры чертежей поясняют сущность изобретения:

Фиг. 1. Схема производственного цикла изготовления тест-полоски для определения этанола в крови электрохимическим методом.

Фиг. 2. Схема реакции каталитического окисления этилового спирта с прямой детекцией пероксида водорода.

Фиг. 3. Схема реакции каталитического окисления этилового спирта с прямой детекцией пероксида водорода.

Фиг. 4. Схематическое изображение сенсора, изготовленного с использованием трафаретной печати.

Фиг. 5. Принцип действия «screen-printed» сенсора, модифицированного органическим комплексом кобальта.

Фиг. 6. Принцип действия биферментного сенсора на основе прямого переноса электронов.

Фиг. 7. Принцип действия биферментного сенсора с использованием медиатора (ферроцена).

Фиг. 8. Принцип работы покрытия для электрохимических пероксид-чувствительных сенсоров, полученного с использованием гидрозоля диоксида марганца пероксид-чувствительного сенсора.

Фиг. 9. Принцип послойного формирования тест-полоски и капиллярной ячейки

Фиг. 10. Схема расположения функциональных слоев в составе тест-полоски и капиллярной ячейки

Фиг. 11. Зависимость величины ответов сенсоров на основе алкогольоксидаз P. pastoris (А) и Н. polymorpha (Б) от числа измерений. Условия измерения: 4×10^-3 М этанола в составе крови человека, комнатная температура.

Осуществление изобретения иллюстрируется Примером 1 «Получение тест-полосок для электрохимического определения этанола в крови с использованием феррицианида железа в качестве медиатора в ферментативной смеси» и Примером 2 «Получение тест-полосок для электрохимического определения этанола в крови с использованием пероксид-чувствительного слоя на основе диоксида марганца».

Осуществление изобретения

Пример 1. Получение тест-полосок дли электрохимического определении этанола в крови с использованием феррицианида железа в качестве медиатора в ферментативной смеси.

Изготовление электродов (тест-полосок) выполняют методом трафаретной печати на пластиковой подложке.

Для приготовления растворов используют деионизированную воду с электропроводностью 17,5 МОм/см при 25°С, полученную при помощи установки для очистки воды Milli-Q (США).

Углеродную (графеновую) пасту с размером частиц 8-9 мкм и удельным сопротивлением 0,3 Ом/мкм² производства Gwent Electronic Materials Ltd (Великобритания), каталожный номер C2171023D1 наносят на пластиковую подложку толщиной 0,5 мм из аморфного полиэтилентерифталата (ПЭТ-А) плотностью 1,33 г/см³ (ООО «Техпластик», Россия) путем продавливания через трафарет с полимерной сеткой и эмульсией (толщина 13-15 мкм) из расчета 0,3 мл суспензии на см² подложки. Сушка пасты проводится при 130°С в течение 30 мин. Нанесение пасты на полимерную подложку производится с помощью полуавтоматического станка для трафаретной печати WSC-160A (WINON, Тайвань).

Принцип послойного формирования тест-полоски и капиллярной ячейки и схема расположения функциональных слоев в составе тест-полоски и капиллярной ячейки представлены на Фиг. 9 и 10, соответственно. Нанесение изолирующего слоя (резистивная паста) на полимерную подложку с графитовыми электродами производится с помощью полуавтоматического станка для трафаретной печати WSC-160A (WINON, Тайвань). Сушка пасты проводится при 130°С в течение 30 мин.

Далее проводится нанесение ферментативной смеси. В качестве источника алкогольоксидазы используют фермент из Hansenula polymorpha (ЕС 1.1.3.13) с активностью 7,7 ед на мг сухого вещества (22 ед/мг белка) по метанолу производства Sigma (Германия) или фермент из Pichia pastoris (ЕС 1.1.3.13) с активностью 28 ед/мг белка (37 мг/мл) по метанолу производства Sigma (Германия).

Ферментативную смесь объемом 3 мл готовят по следующему протоколу:

1. К 9 мг детергента Тритон Х-100 добавляют 1 мл воды, тщательно перемешивают;

2. Готовят раствор поливинилового спирта с концентрацией 6 мг/мл. Для этого навеску поливинилового спирта заливают водой и выдерживают в течение 24 часов при комнатной температуре для набухания полимера, а затем полученную вязкую массу нагревают в течение 10-30 мин до 90°С, добиваясь полного растворения;

3. К навеске феррицианида железа 65,4 мг добавляют 1 мл воды;

4. К навеске алкогольоксидазы массой 60 мг добавляют 1 мл раствора Тритона Х-100 (см. п. 1), перемешивают пипетированием до полного растворения;

5. К 1 мл раствора алкогольоксидазы с Тритоном Х-100 (см. п. 4) добавляют 1 мл раствора феррицианида железа (см. п. 3), перемешивают и добавляют 1 мл раствора поливинилового спирта(см. п. 2)

6. Смесь выдерживают 1 час при комнатной температуре в темноте, а затем осветляют центрифугированием в течение 5 мин при 16 тыс. g.

Конечные концентрации реагентов в смеси составляют:

- Алкогольоксидаза, 20 мг/мл

- Феррицианид железа, 21,8 мг/мл

- Тритон Х-100, 3 мг/мл

- Поливиниловый спирт, 2 мг/мл

Нанесение ферментной смеси на полимерную подложку с электродами из углеродной пасты, производится с помощью полуавтоматического станка для трафаретной печати WSC-160A (WINON, Тайвань). Сушка ферментной смеси на электродах осуществляется при 24°С и относительной влажности не более 20%. Расход смеси составляет 3 мл на 62 370 мм².

Область тест-полоски с ферментативным слоем подвергают ламинированию с помощью пленки 3М Anti-fog hydrophilic film (3М Science Applied for life, США, каталожный номер 9962) с целью формирования капиллярного канала.

Для проведения измерений используется 2-х электродная схема с приложенным потенциалом на рабочий электрод (графит) от -100 до 400 мВ относительно электрода сравнения (графитовый или Ag/AgCl). При попадании анализируемого вещества (этанола) вместе с образцом крови в капиллярную ячейку происходит каталитическое окисление этанола с выделением пероксида водорода или превращения медиатора

Для проведения расчетов используют модель убывающего во времени диффузионного тока при постоянном потенциале. Согласно этой модели, зависимость тока от времени подчиняется уравнению Котгрелла:

где электронов, участвующих в элементарном акте окисления/восстановления, F-постоянная Фарадея 96485 К/моль. рабочей поверхности (см²), С₀ - начальная концентрация электроактивного вещества (моль/см³), D-коэффициент диффузии (см²/с), t - время (с). Согласно данному уравнению ток, взятый в определенный момент времени после подачи потенциала на электрод, будет прямо пропорционален концентрации электроактивного вещества в растворе, которым является пероксид водорода.

Тестирование работоспособности тест-полосок, полученных с использованием алкогольоксидаз P. pastoris и Н. polymorpha, проводят с помощью потенциостата-гальваностата IPC-2000 (Хронас, Россия). В качестве стандартных образцов используют кровь человека, собранную в пробирки с антикоагулянтом BD Vacutainer (каталожный номер 368841). К крови добавляют этиловый спирт до конечной концентрации 0,1, 1. 2, 4, 8, 16 и 32 мМ (в качестве стокового используют водный этанол с концентрацией 10%, полученный из абсолютированного этанола производства ЗАО НПО Химсинтез).

Оценку эффективности измерения этанола с помощью тест-полосок, полученных с использованием алкогольоксидаз P. pastoris и Н. polymorpha, выполняют по следующим параметрам; область линейности (мМ), предел обнаружения этанола (мкМ), чувствительность, нА/(с мМ⋅см²), время ответа (сек), операционная стабильность (RSD, %,10 измерений). Результаты измерений представлены на Фиг. 11 и Таблице 2.

Испытания полученных тест-полосок, полученных с использованием феррицианида железа в качестве медиатора и алкогольоксидаз P. pastoris и Н. polymorpha при оптимальных условиях измерения спирта показывают, что несмотря на более высокую активность в выбранных оптимальных условиях сенсор на основе алкогольоксидазы P. pastoris менее стабилен, чем сенсор на основе алкогольоксидазы Н. polymorpha. Величина ответа сенсора падает с ростом числа измерений, разброс значений ответа сенсора составляет 18% при концентрации вводимого в ячейку спирта 32 мМ, и более 100% при добавлении спирта в концентрациях 4 и 8 мМ, наиболее значимых для потребителя.

Пример 2. Получение тест-полосок для электрохимического определения этанола в крови с использованием пероксид-чувствительного слоя на основе диоксида марганца.

Изготовление электродов (тест-полосок) выполняют методом трафаретной печати на пластиковой подложке, как описано в примере 1.

Углеродную (графеновую) пасту с размером частиц 8-9 мкм и удельным сопротивлением 0,3 Ом/мкм² производства Gwent Electronic Materials Ltd (Великобритания), каталожный номер C2171023D1 наносят на пластиковую подложку толщиной 0,5 мм из аморфного полиэтилентерифталата (ПЭТ-А) плотностью 1,33 г/см³ (ООО «Техпластик», Россия) путем продавливания через трафарет с полимерной сеткой и эмульсией (толщина 13-15 мкм) из расчета 0,3 мл суспензии на см² подложки. Сушка пасты проводится при 130°С в течение 30 мин. Нанесение пасты на полимерную подложку производится с помощью полуавтоматического станка для трафаретной печати WSC-160A (WINON, Тайвань).

Коллоидный раствор диоксида марганца получают, как описано в патенте РФ №2419785, по реакции сопропорционирования ацетата марганца (II) с перманганатом калия:

3(СН₃СОО)₂Mn⋅4H₂O+2KMnO₄→5MnO₂+2CH₃COOK+4СН₃СООН+2H₂O

Исходные растворы реагентов готовят па деионизованной воде в следующих концентрациях: ацетат марганца в концентрации 3,0×10^-4 М, перманганата калия в концентрации 2,2×10^-4 М. Концентрации реагентов в исходных растворах подбирают таким образом, чтобы они соответствовали стехиометрическим коэффициентам в приведенном выше уравнении реакции. Равные объемы растворов реагентов смешивают и интенсивно встряхивают в течение 5 минут. Полученные коллоидные растворы MnO₂ подлежат хранению не более 30 дней при комнатной температуре.

Пероксид-чувствительный электрод изготовляют, модифицируя полученным гидрозолем диоксида марганца поверхность пленарных графитовых электродов (см. описание в примере 1). На поверхность графитового планарного электрода наносят каплю гидрозоля диоксида марганца, электрод высушивают на воздухе при комнатной температуре, промывают водой, и прогревают электроды 1 час при 60°С в термостате и хранят при комнатной температуре.

Далее на электрод наносят ферментативную смесь, идентичную описанной в примере 1, с тем отличием, что она не содержит феррицианида железа в качестве медиатора.

Тестирование работоспособности тест-полосок, полученных с использованием алкогольоксидаз P. pastoris и Н. polymorpha и модифицированной гидрозолем диоксида марганца поверхности пленарных графитовых электродов, проводят с помощью потенциостата-гальваностата IPC-2000 (Хронас, Россия), как описано в примере 1. В качестве стандартных образцов используют кровь человека, собранную в пробирки с антикоагулянтом BD Vacutainer (каталожный номер 368841). К крови добавляют этиловый спирт до конечной концентрации 0,1, 1, 2, 4, 8, 16 и 32 мМ (в качестве стокового использовали водный этанол с концентрацией 10%, полученный из абсолютированного этанола производства ЗАО НПО Химсинтез).

Оценку эффективности измерения этанола с помощью тест-полосок, полученных с использованием алкогольоксидаз P. pastoris и Н. polymorpha, выполняют по тем же параметрам, что и в примере 1: область линейности (мМ), предел обнаружения этанола (мкМ), чувствительность, нА/(с мМ^⋅см²), время ответа (сек), операционная стабильность (RSD, %,10 измерений). Результаты измерений представлены в Таблице 3.

Испытания полученных тест-полосок, полученных с использованием с использованием модифицированной гидрозолем диоксида марганца поверхности планарных графитовых электродов при оптимальных условиях измерения этилового спирта показывают, что этот метод позволяет существенно улучшить все функциональные показатели тест-полоски. При этом наблюдается сглаживание отличий между сенсорами, полученными на основе алкогольоксидазы P. pastoris и Н. polymorpha. В этом варианте для получения биосенсоров с диапазоном чувствительности от 0,1 до 32 мМ могут быть использованы оба фермента.

Тест-полоска для определения содержания этилового спирта в крови электрохимическим способом с помощью амперометрической ячейки, включающая планарный графитовый электрод с модифицированной гидрозолем диоксида марганца поверхностью и нанесенной ферментативной смесью, содержащей алкогольоксидазу Pichia pastoris или Hansenula polymorpha, детергент и высокомолекулярный спирт.