Продуцирующий imp микроорганизм и способ получения imp с его использованием

Авторы патента:

ЧО Джин Ман (KR)

БЭК Мин Чжи (KR)

КИМ Чжу Чжон (KR)

ЛИ Джи Хе (KR)

КВОН Нара (KR)

ЛИ Бэк Сок (KR)

C12P19/32 - имеющие конденсированную циклическую систему, содержащую шестичленное кольцо, например пуриновые нуклеотиды, никотинамидадениндинуклеотиды

C12N15/77 - для Corynebacterium; для Brevibacterium

C12N1/21 - модифицированные введением чужеродного генетического материала

C07K14/34 - из дифтерийной палочки (G)

Владельцы патента RU 2723038:

СИДЖЕЙ ЧЕИЛДЖЕДАНГ КОРПОРЕЙШН (KR)

Изобретение относится к микроорганизму рода Corynebacterium, продуцирующему инозин-5'-монофосфат (IMP), к способу получения IMP с его использованием, а также к увеличению экспорта IMP в микроорганизме рода Corynebacterium. Предложен модифицированный микроорганизм рода Corynebacterium, продуцирующий IMP, имеющий усиленную активность белка, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 или 2, и повышенную продуктивность в отношении IMP по сравнению с родительским штаммом. Способ получения IMP предусматривает культивирование указанного микроорганизма рода Corynebacterium, продуцирующего IMP, в среде и выделение IMP из микроорганизма или среды. Предложено также применение белка, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 или 2, для увеличения экспорта IMP в микроорганизме рода Corynebacterium. Изобретение позволяет получить IMP с высоким выходом. 3 н. и 2 з.п. ф-лы, 9 табл., 4 пр.

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к микроорганизму рода Corynebacterium, продуцирующему инозин-5’-монофосфат, обладающему усиленной активностью белка экспорта IMP; к способу получения инозин-5’-монофосфата с его использованием; к композиции для продуцирования инозин-5’-монофосфата; и способу увеличения экспорта инозин-5’-монофосфата.

Предшествующий уровень техники

Инозин-5’-монофосфат (далее называемый IMP), являющийся веществом на основе нуклеиновой кислоты, представляет собой промежуточное соединение в пути метаболизма нуклеиновой кислоты и используется во множестве областей, таких как продукты питания, лекарственные средства и различные медицинские применения. В частности, IMP широко используется в качестве добавки для пищевых приправ или пищевых продуктов наряду с гуанин-5′-монофосфатом (далее называемым GMP). Хотя известно, что IMP сам по себе обеспечивает вкус мяса, также известно, что он усиливает аромат мононатриевой соли глутаминовой кислоты (MSG); таким образом, IMP привлекает значительное внимание в качестве приправы со вкусом чабера на основе нуклеиновой кислоты.

Примеры способов получения IMP включают способ ферментативного разрушения рибонуклеиновой кислоты, экстрагированной из клеток дрожжей (публикация японской заявки на патент № 1614/1957), способ химического фосфорилирования инозина, продуцируемого путем ферментации (Agri. Biol. Chem., 36,

1511 и т.п.) и способ культивирования микроорганизма, который непосредственно продуцирует IMP и выделяет IMP в культуральный бульон. Среди этих способов наиболее часто используемый способ представляет собой способ с использованием микроорганизма, способного непосредственно продуцировать IMP.

Раскрытие изобретения

Техническая задача

Для продуцирования IMP с высоким выходом с использованием способа непосредственного продуцирования IMP путем микробной ферментации IMP должен беспрепятственно экспортироваться. Д Для выполнения этой задачи авторы настоящего

изобретения провели обширное исследование и изучили экспортирующие белки, вовлеченные в экспорт IMP; в результате они идентифицировали ImpE1 и ImpE2, которые представляют собой белки, вовлеченные в экспорт IMP. Обнаружили, что когда усиливаются активности ImpE1 и ImpE2, которые представляют собой белки, вовлеченные в экспорт IMP, тогда увеличивается концентрация IMP, завершив тем самым настоящее изобретение.

Техническое решение

Задача настоящего изобретения заключается в том, чтобы предложить микроорганизм рода Corynebacterium, продуцирующий IMP, с усиленной активностью белка экспорта IMP.

Другая задача настоящего изобретения заключается в том, чтобы предложить способ получения IMP, включающий культивирование микроорганизма рода Corynebacterium по настоящему изобретению в среде.

Еще одна задача описания настоящего изобретения заключается в том, чтобы предложить композицию для продуцирования IMP, содержащую белок, в которой усилена активность белка экспорта IMP в соответствии с настоящим описанием.

Еще одна задача описания настоящего изобретения заключается в том, чтобы предложить способ увеличения экспорта IMP, включающий усиление активности белка, экспортирующего IMP, в соответствии с настоящим описанием в микроорганизме рода Corynebacterium.

Полезные эффекты изобретения

В настоящему изобретению IMP может быть получен с использованием микроорганизма рода Corynebacterium, продуцирующего IMP, с усиленной активностью белка экспорта IMP.

Лучший вариант осуществления изобретения

Настоящее изобретение будет подробно описано далее. В то же самое время, каждое пояснение и типичное воплощение может применяться в отношении других соответствующих пояснений и типичных воплощений. То есть, все комбинации раскрытых здесь разных факторов относятся к объему настоящего изобретения. Кроме того, объем настоящего изобретения не должен ограничиваться конкретным раскрытием, приведенным далее.

Для достижения вышеприведенных задач в аспекте настоящего изобретения предложен вариант белка, обладающий активностью экспорта IMP.

Используемый в настоящем описании термин “белок, который экспортирует инозин-5’-монофосфат (IMP)” относится к белку, вовлеченному во внеклеточный экспорт IMP. В описании настоящего изобретения этот термин может быть использован взаимозаменяемо с белком, обладающим активностью экспорта IMP, белком экспорта IMP, белком, обладающим активностью экспорта инозин-5’- монофосфата, экспортирующим инозин-5’-монофосфат белком, и т.п; в частности, белок может выражен как ImpE, и, более конкретно, может быть выражен как ImpE1 или ImpE2, но не ограничивается ими. Кроме того, белок может быть получен из микроорганизма рода Corynebacterium, и в частности Corynebacterium stationis, но микроорганизм не ограничивается ими.

Белок, например, может состоять из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2, но любая последовательность, обладающая той же самой активностью как белок, может быть включена без ограничения, и специалист в данной области техники может получить информацию о последовательности в GenBank NCBI (Национальный центр биотехнологической информации), представляющей собой хорошо известную базу данных. Кроме того, белок может включать аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2, или аминокислотную последовательность, имеющую гомологию или идентичность с последовательностью SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2 по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99%. Кроме того, очевидно, что любой белок, имеющий аминокислотную последовательность с делецией, модификацией, заменой или вставкой в часть последовательности, также может быть включен в объем настоящего изобретения, равно как и аминокислотная последовательность, имеющая описанную выше гомологию или идентичность и обладающая действием, соответствующим действию белка.

То есть, хотя в описании настоящего изобретения белок описан как “белок, имеющий аминокислотную последовательность конкретной SEQ ID NO” или “белок, состоящий из аминокислотной последовательности конкретной SEQ ID NO”, белок может обладать активностью, которая идентична или соответствует активности белка, состоящего из аминокислотной последовательности, соответствующей SEQ ID NO. В таком случае, очевидно, что любые белки, имеющие аминокислотную последовательность с делецией, модификацией, заменой, консервативной заменой или вставкой в часть последовательности, также могут быть использованы в настоящем изобретении. Например, в том случае, когда белок обладает активностью, которая является такой же или соответствует активности модифицированного белка, не исключается вставка последовательности выше или ниже относительно аминокислотной последовательности, которая не изменяет функцию белка, мутация, которая может возникать в природе, его молчащая мутация или консервативная замена, и даже тогда, когда присутствует вставка последовательности или мутация, они очевидно относятся к объему настоящего изобретения.

Используемый здесь термин “гомология” или “идентичность” относится к степени совпадения двух заданных аминокислотных последовательностей или нуклеотидных последовательностей, и может выражаться в процентах.

Термины “гомология” и “идентичность” часто могут использоваться взаимозаменяемо друг с другом.

Гомология или идентичность последовательности консервативных полинуклеотидных или полипептидных последовательностей может быть определена при помощи стандартных алгоритмов выравнивания и могут быть использованы с штрафом за пропуск, устанавливаемым по умолчанию в используемой программе. В общем, ожидается, что по существу гомологичные или идентичные последовательности гибридизуются в условиях умеренной или высокой жесткости вдоль всей длины или по меньшей мере приблизитель но 50%, приблизительно 60%, приблизительно 70%, приблизительно 80% или приблизительно 90% от всей длины последовательностей. Также рассматриваются полинуклеотиды, которые содержат вырожденные кодоны вместо кодонов в гибридизующихся полипептидах.

Обладают ли любые две полинуклеотидные или полипептидные последовательности гомологией, сходством или идентичностью, может быть определено с использованием известного компьютерного алгоритма, такого как программа “FASTA” (Pearson et al., (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85]: 2444: с использованием параметров по умолчанию в 2444). Альтернативно, они могут быть определены с использованием алгоритма Нидлмана-Вунша (Needleman and Wunsch,

1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453), который реализован в программе Needleman в пакете

EMBOSS ((EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al.,

2000, Trends Genet. 16: 276-277) (версия 5.0.0 или более позние версии) (пакет программ GCG (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12: 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, [S.] [F.,] [ET AL, J MOLEC BIOL 215]: 403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, [ED.,] Academic Press, San Diego, 1994, и [CARILLO ETA/.] (1988) SIAM J Applied Math 48: 1073). Например, гомология, сходство или идентичность могут быть определены с использованием BLAST или ClustalW от National Center for Biotechnology Information (NCBI).

Гомология, сходство или идентичность полинуклеотидных или полипептидных последовательностей могут быть определены путем сравнения информации о последовательностях с использованием, например компьютерной программы GAP (например, Needleman et al., (1970), J Mol Biol.48: 443), как опубликовано (например, Smith and Waterman, Adv. Appl. Math (1981) 2:482). В общем, программа GAP определяет гомологию, сходство или идентичность в виде значения, получаемого путем деления количества одинаково выравненных символов (т.е. нуклеотидов или аминокислот) на общее количество символов в более короткой из двух последовательностей. Параметры по умолчанию для программы GAP могут включать (1) однокомпонентную матрицу сравнения (содержащую значение 1 для идентичности и 0 для отсутствия идентичности) и взвешенную матрицу сравнения в соответствии с Gribskov et al. (1986), Nucl. Acids Res. 14:6745, как раскрыто в Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, pp.

353-358, 1979; (2) штраф 3,0 для каждого пропуска и дополнительно штраф 0,10 для каждого символа в каждом пропуске (или штраф за внесение пропуска в выравнивание

10 и штраф за удлинение пропуска 0,5); и (3) отсутствие штрафа за концевые пропуски. Соответственно, используемый здесь термин “гомология” или “идентичность” относится к соответствию между последовательностями.

Используемый в настоящем описании термин “усиление активности” обозначает, что активность белка включается или что активность улучшается по сравнению с эндогенной активностью или активностью до модификации микроорганизма. Термин “внедрение активности” означает, что появляется активность конкретного белка, которая в естественных условиях или искусственно не присуща микроорганизму. Термин “эндогенная активность” относится к активности конкретного белка, которой исходно обладает родительский штамм до трансформации, когда микроорганизм трансформируется путем генетической вариации, вызванной природными или искусственными факторами.

Например, усиление активности может включать как усиление активности путем внедрения в клетку-хозяина чужеродного белка, экспортирующего IMP, или увеличение активности эндогенного белка, экспортирующего IMP.

В частности, в описании настоящего изобретения усиление активности может быть осуществлено при помощи следующих способов:

1) увеличение числа копий полинуклеотида, который содержит код белка (то есть кодирует белок);

2) модификация регулирующей экспрессию последовательности для увеличения экспрессии полинуклеотида;

3) модификация полинуклеотидной последовательности на хромосоме для усиления активности белка; или

4) их комбинация, при этом способы не ограничены ими.

В указанном выше способе 1) увеличение числа копий полинуклеотида, кодирующего ферменты, может быть достигнуто путем функционального связывания полинуклеотида с вектором или путем внедрения его в хромосому клетки-хозяина, но, в частности, не ограничивается ими. Кроме того, в одном из воплощений увеличение числа копий могут быть осуществлено путем внедрения экзогенного полинуклеотида, проявляющего активность белка или варианта формы полинуклеотида, в котором кодон оптимизирован для вышеуказанного полинуклеотида, в клетку-хозяина. Экзогенный полинуклеотид может быть использован без ограничения по своему происхождению или последовательности, если только он демонстрирует такие же /схожие активности белка. Специалист в данной области техники сможет осуществить внедрение путем подходящего выбора известного способа трансформации, и белок может быть продуцирован путем экспрессии внедренного полинуклеотида в клетку-хозяина с целью увеличения его активности. Увеличение числа копий может быть таким, чтобы полинуклеотид был представлен непрерывно в тандемной форме. В этом случае полинуклеотидные последовательности, кодирующие другие белки экспорта IMP, могут быть представлены перекрестным, последовательным и повторяющимся образом. Когда полинуклеотид непрерывно представлен в тандемной форме, тогда может появляться перекрывающаяся часть, но она не ограничивается ей. Более конкретно, согласно настоящему изобретению число копий полинуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 3, 4 или 5 может быть увеличено.

Кроме того, 2) модификация регулирующей экспрессию последовательности для увеличения экспрессии полинуклеотида может быть осуществлена путем индуцирования модификации на регулирующей экспрессию последовательности путем делеции, вставки, неконсервативной или консервативной замены нуклеотидной последовательности, или их комбинации; или путем замены регулирующей экспрессию последовательности на нуклеотидную последовательность, обладающую более сильной активностью, но не ограничивается ими. Регулирующая экспрессию последовательность включает промотор, операторную последовательность, последовательность, кодирующую сайт связывания рибосомы, и последовательность, регулирующую прекращение транскрипции и трансляции, но, в частности, не ограничивается ими. Более конкретно, сильный гетерологический промотор вместо исходного промотора может быть связан выше фрагмента экспрессии полинуклеотида, и примеры сильного промотора могут включать промотор CJ7, промотор lysCP1, промотор EF-Tu, промотор groEL, промотор aceA или aceB и т.п. Скорость экспрессии полинуклеотида, кодирующего белок, может быть улучшена путем функционального связывания промотора с полинуклеотидом, но не ограничивается ими.

Кроме того, 3) модификация полинуклеотидной последовательности на хромосоме, хотя, в частности, не ограничивается этим, может быть осуществлена путем индуцирования вариации на регулирующей экспрессию последовательности путем делеции, вставки, неконсервативной или консервативной замены полинуклеотидной последовательности, или их комбинации для того, чтобы дополнительно усилить активность полинуклеотидной последовательности, или путем замены

последовательности на полинуклеотидную последовательность, которая модифицированная таким образом, чтобы обладать более сильной активностью.

Наконец, 4) способ модификации для усиления путем комбинации 1)-3) может быть осуществлен путем применения одного или более чем одного способа, выбранных из способа увеличения количества копий полинуклеотида, кодирующего белок, способа модификации полинуклеотидной последовательности для усиления экспрессии полинуклеотида, и способа модификации полинуклеотидной последовательности на хромосоме, а также модификации экзогенного полинуклеотида, проявляющего активность белка, или варианта формы полинуклеотида, в котором оптимизирован кодон.

Кроме того, понятно, что также может быть включен полинуклеотид, который может быть транслирован за счет вырожденности кодона в белок, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 или 2, или в белок, обладающий гомологией с ним. Например, белок может быть получен из полинуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 3, 4 или 5. Кроме того, последовательность, которая кодирует белок, обладающий активностью белка, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 или 2, путем гибридизации в жестких условиях с зондом, который может быть получен из известной последовательности гена, например последовательности, комплементарной всей или части нуклеотидной последовательности, может быть включена без ограничений.

Термин “жесткие условия” относится к условиям, которые обеспечивают возможность для специфической гибридизации между полинуклеотидами. Эти условия в частности описаны в литературе (например J. Sambrook et al., Sangdong). Например жесткие условия могут включать условия, при которых гены, обладающие высокой гомологией (например 40% или выше, в частности 90% или выше, конкретнее 95% или выше, еще конкретнее 97% или выше, и, в особенности, 99% или выше), смогут гибридизоваться друг с другом, тогда как гены, обладающие меньшей гомологией между собой, не смогут гибридизоваться друг с другом; или условия для обычной Саузерн гибридизации (т.е. условия для отмывания один раз, и, в особенности, два или три раза, при концентрации соли и температуре, которые составляют 60°C, 1× SSC (раствор хлорида и цитрата натрия) и 0,1% SDS (додецилсульфат натрия); в частности при 60°C, 0,1× SSC и 0,1% SDS, и конкретней при 68°C, 0,1× SSC и 0,1% SDS).

Для гибридизации требуется, чтобы две нуклеиновые кислоты имели комплементарные последовательности, хотя ошибки спаривания между основаниями возможны в зависимости от жесткости гибридизации. Термин “комплементарный” используется для описания взаимосвязи между нуклеотидными основаниями, способными гибридизоваться друг с другом. Например, в отношении ДНК аденозин комплементарен тимину, а цитозин комплементарен гуанину. Таким образом, описание настоящего изобретения также может включать по существу похожие последовательности нуклеиновых кислот, а также выделенные фрагменты нуклеиновых кислот, комплементарные полноразмерной последовательности.

В частности, полинуклеотид, имеющий гомологию, может быть обнаружен с использованием условий гибридизации, включающих стадию гибридизации при величине Tm (температуры плавления) 55°C и с использованием описанных выше условий. Кроме того, величина Tm может составлять 60°C, 63°C или 65°C, но не граничивается ими, и может быть подходящим образом скорректирована специалистом в данной области техники в соответствии с задачей.

Жесткость, подходящая для гибридизации полинуклеотидов, зависит от длины и комплементарности полинуклеотидов и переменных, хорошо известных в области

техники (смотри Sambrook et al., выше, 9.50 - 9.51 и 11.7 - 11.8).

Используемый в описании настоящего изобретения термин “вектор” относится к конструкции ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность полинуклеотида, кодирующего целевой белок, который функционально связан с подходящей регуляторной последовательностью, таким образом, что желаемый белок экспрессируется в подходящей клетке-хозяина. Регуляторная последовательность может включать промотор, способный инициировать транскрипцию, любую операторную последовательность для регуляции транскрипции, последовательность, кодирующую подходящий сайт мРНК для связывания с рибосомой, и последовательность, регулирующую окончание транскрипции и трансляции. Этот вектор после трансформации в подходящую клетку-хозяина может реплицироваться или осуществлять свою фунцкию независимо от генома хозяина, или может быть интегрирован в сам геном хозяина.

Вектор, используемый в описании настоящего изобретения, может быть не ограничен конкретным образом, при условии, что он может экспрессироваться в клетке-хозяине, и может быть использован любой вектор, известный в области техники. Примеры обычно используемого вектора включают природную или рекомбинантную плазмиду, космиду, вирус и бактериофаг. Например, в качестве фагового вектора или космидного вектора может быть использован pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A и Charon21A; и в качестве плазмидного вектора может быть использован вектор, основанный на pBR, основанный на pUC, основанный на pBluescriptII, основанный на pGEM, основанный на pTZ, основанный на pCL, основанный на pET. В частности, могут быть использованы векторы pDZ, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118 и pCC1BAC, но вектор не ограничивается ими.

Вектор, который может быть использован в описании настоящего изобретения, не ограничен конкретным образом, и может быть использован известный вектор экспрессии. Кроме того, полинуклеотид, кодирующий желаемый белок, может быть встроен в хромосому при помощи вектора для внутриклеточного встраивания в хромосому. Встраивание полинуклеотида в хромосому может быть осуществлено с использованием любого из способов, например путем гомологичной рекомбинации, но не ограничивается ими. Вектор дополнительно может включать селективный маркер для указания на встраивание вектора в хромосому. Адаптированный для указания на клетку, трансформированную вектором, то есть на то, встроен ли целевой ген в геном клетки хозяина, селективный маркер может обеспечить клетку способностью демонстрировать устойчивость к лекарственным средствам, устойчивость к цитотоксическим агентам, к ауксотрофии или к экспрессии селективного фенотипа, такой как экспрессия поверхностного белка. В среде, когда производят обработку селективным агентом, только клетки, экспрессирующие селективный маркер, выживают или экспрессируют другой фенотип, и, таким образом могут быть отобраны трансформированные клетки.

Используемый здесь термин “трансформация” обозначает, что вектор, содержащий полинуклеотид кодирующий желаемый белок, внедрен в клетку хозяина, таким образом, что белок, кодируемый полинуклеотидом, способен экспрессироваться в клетке хозяине. Трансформированный полинуклеотид может представлять собой любой полинуклеотид независимо от позиции, а также полипептида, способного экспрессироваться в клетке хозяине, независимо от того, встроен ли полинуклеотид и расположен в хромосоме клетки хозяина или расположен во внешнем фрагменте хромосомы. Кроме того, полинуклеотид включает ДНК и РНК, которые кодируют требуемый белок. Полинуклеотид может быть внедрен в любой форме, а также полинуклеотид способен внедряться в клетку-хозяин для экспрессии. Например, полинуклеотид может быть внедрен в клетку хозяина в форме экспрессионной кассеты, которая представляет собой генетическую структуру, включающую все факторы, требующиеся для самоэкспрессии. Экспрессионная кассета может включать промотор, сигнал прекращения транскрипции, сайт связывания рибосомы и сигнал прекращения трансляции, которые могут быть функционально связаны с полинуклеотидом. Экспрессионная кассета может представлять собой вектор экспрессии, осуществляющий саморепликацию. Кроме того, полинуклеотид может быть внедрен в клетку хозяина сам по себе для того, чтобы быть функционально связанным с последовательностью, требующейся для экспрессии в клетке хозяине, но не ограничивается этим. Способ трансформации включает любой способ внедрения в клетку нуклеиновой кислоты, и может быть осуществлен путем выбора подходящего стандартного метода, известного из уровня техники. Например, примеры этого способа могут включать электропорацию, осаждение фосфатом кальция (CaPO4), осаждение, осаждение хлоридом кальция (CaCl2), микроинъекцию, способ с использованием полиэтиленгликоля (PEG), способ с использованием DEAE (диэтиламиноэтилцеллюлоза)-декстрана, способ с использованием катионной липосомы и способ с использованием ацетата лития-DMSO (диметилсульфоксид), но не ограничивается ими.

Кроме того, термин “функционально связанный” относится к функциональной связи между промоторной последовательностью, которая инициирует и опосредует транскрипцию полинуклеотида, кодирующего целевой белок в соответствии с настоящим описанием, и полинуклеотидной последовательностью. Функциональное связывание может быть осуществлено с помощью метода рекомбинации генов, известного из уровня техники, и сайт-специфического расщепления ДНК, и лигирование может быть осуществлено с использованием фермента рестрикции и лигазы, известных из уровня техники, но не ограничивается этим.

Используемый в настоящем описании термин “микроорганизм рода Corynebacterium, продуцирующий IMP” относится к микроорганизму рода Corynebacterium, обладающему способностями продуцировать IMP в его нативной форме или в форме варианта. В частности, в описании настоящего изобретения микроорганизм рода Corynebacterium, продуцирующий IMP, может представлять собой микроорганизм, который обладает улучшенными способностями продуцировать IMP путем внедрения гена, связанного с механизмом продукции самого нативного штамма или экзогенного IMP, или путем усиления или ослабления активности эндогенного гена. Более конкретно, микроорганизм рода Corynebacterium, продуцирующий IMP, может представлять собой микроорганизм, у которого способность продуцировать IMP улучшена по сравнению со способностью у родительского штамма перед трансформацией или у немодифицированного микроорганизма.

В описании настоящего изобретения “микроорганизм рода Corynebacterium” в частности может представлять собой Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium ammoniagenes, Brevibacterium lactofermentum, Brevibacterium flavum, Corynebacterium thermoaminogenes, Corynebacterium efficiens, Corynebacterium stationis и т.п, но не ограничивается ими. Более конкретно, в описании настоящего изобретения микроорганизм рода Corynebacterium может представлять собой Corynebacterium stationis. Конкретный пример микроорганизма рода Corynebacterium может представлять собой Corynebacterium stationis, у которого способность продуцировать IMP улучшена путем усиления активности белка, обладающего функцией экспорта IMP вне клетки, но не ограничивается им.

В еще одном аспекте настоящего изобретения предложен способ получения IMP, включающий культивирование микроорганизм рода Corynebacterium, обладающего усиленной активностью белка экспорта IMP, в среде.

В частности, способ в соответствии с настоящим изобретением дополнительно может включать стадию выделения IMP из микроорганизма или среды.

В этом способе культивирование микроорганизма может быть осуществлено в периодической культуре, непрерывной культуре, периодической культуре с подпиткой, которые известны из уровня техники. Кроме того, что касается условий культивирования, подходящий pH (т.е. pH от 5 до 9, в частности pH от 6 до 8, и, в особенности, pH 6,8) может поддерживаться при использовании основного химического соединения (т.е. гидроксида натрия, гидроксида калия или аммиака) или кислотного химического соединения (т.е. фосфорной кислоты или серной кислоты). В дополнение, аэробное состояние может поддерживаться путем введения в культуру кислорода или содержащей кислород газовой смеси. Температура в культуре может поддерживаться в диапазоне от 20°C до 45°C, и, в частности, от 25°C до 40°C. Кроме того, время культивирования может составлять приблизительно от 10 до 160 часов. Тем не менее, условия культивирования не ограничены ими. IMP, продуцируемый при помощи вышеприведенного культивирования, может быть секретирован в культуру или может сохраняться внутри клетки.

Кроме того, среда для культивирования может содержать сахар и углевод (например, глюкозу, сахарозу, лактозу, фруктозу, мальтозу, мелассы, крахмал и целлюлозу), масло и жир (например, соевое масло, подсолнечное масло, арахисовое масло и кокосовое масло), жирную кислоту (например, пальмитиновую кислоту, стеариновую кислоту и линолевую кислоту), спирт (например, глицерин и этанол) и органическую кислоту (например, уксусную кислоту) по отдельности или в комбинации в качестве источника углерода, но среда не ограничивается ими. Кроме того, среда для культивирования может содержать азотсодержащее органическое соединение (например, пептон, дрожжевой экстракт, мясной сок, солодовый экстракт, кукурузный экстракт, соевую муку и мочевину) или неорганическое соединение (например, сульфат аммония, хлорид аммония, фосфат аммония, карбонат аммония и нитрат аммония) по отдельности или в комбинации в качестве источника азота, но среда не ограничивается ими. Кроме того, среда для культивирования может содержать дигидрофосфат калия, дикалия гидрофосфат, соответствующую им натрийсодержащую соль по отдельности или в комбинации в качестве источника фосфора, но среда не ограничена ими. Кроме того, среда может содержать другие важные вещества, стимулирующие рост, включающие соли металлов (например, сульфат магния или сульфат железа), аминокислоты и витамины.

Способ выделения IMP в соответствии с настоящим описанием, который продуцируется в вышеприведенном способе культивирования, может быть осуществлен путем сбора целевого IMP из культуральной среды с использованием подходящего способа, известного из уровня техники в соответствии со способом культивирования. Например, могут быть использованы центрифугирование, фильтрование, анионообменная хроматография, кристаллизация, HPLC (высокоэффективная жидкостная хроматография) и т.п., и требуемый IMP может быть выделен из среды или микроорганизма с использованием подходящего способа, известного из уровня техники.

Кроме того, вышеприведенный способ выделения может включать способ очистки и может быть осуществлен с использованием подходящего способа, известного из уровня техники. Таким образом, выделяемый IMP может быть представлен в очищенной форме или в форме микробного ферментативного бульона, содержащего IMP.

В еще одном аспекте настоящего изобретения предложена композиция для продуцирования IMP, содержащая белок в соответствии с настоящим описанием, который состоит из аминокислотной последовательности в соответствии с SEQ ID NO:

1 или 2, или кодирующий его полинуклеотид.

Композиция в соответствии с настоящим описанием дополнительно может включать без ограничения замену, способную делать полинуклеотид функциональным. Кроме того, в композиции в соответствии с настоящим описанием полинуклеотид может находиться в форме, включенной в вектор, таким образом, что ген, функционально связанный в клетке хозяине, может экспрессироваться.

Кроме того, композиция может дополнительно включать любые подходящие эксципиенты, обычно используемые в композиции для продукции IMP. Такие эксципиенты могут представлять собой, например, консерванты, увлажнители, суспендирующие агенты, буферы, стабилизирующие агенты или изотонические агенты, но не ограничены ими.

В еще одном аспекте настоящего изобретения предложено применение белка, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 или 2, для увеличения продукции IMP в микроорганизме рода Corynebacterium.

В еще одном аспекте описания изобретения предложен способ увеличения экспорта IMP, включающий усиление активности белка, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 или 2, в микроорганизме рода Corynebacterium.

В еще одном аспекте настоящего изобретения предложено применение белка, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 или 2 для увеличения экспорта IMP в микроорганизме рода Corynebacterium.

Термины “белок, состоящий из аминокислотной SEQ ID NO: 1 или 2”, “усиление” и “микроорганизм рода Corynebacterium” являются такими, как описано выше.

Подробное описание воплощений

Далее описание настоящего изобретения будет изложено подробно при помощи сопутствующих примеров воплощений. Тем не менее, примеры раскрытых здесь воплощений приведены исключительно для задачи иллюстрации и их не следует рассматривать как ограничивающие объем описания настоящего изобретения.

Пример 1: Получение библиотеки геномной ДНК

Библиотеку геномной ДНК Corynebacterium stationis ATCC6872 получали для того, чтобы идентифицировать мембранный белок Corynebacterium, который вовлечен в экспорт IMP.

Затем, поскольку штамм дикого типа Corynebacterium не может продуцировать IMP или продуцирует лишь небольшое количество IMP, получали штамм CJI0323, происходящий из штамма ATCC6872, обладающий способностью продуцировать IMP для подтверждения способности продуцировать IMP. Библиотеку геномной ДНК ATCC6872 трансформировали в полученный штамм CJI0323 и затем осуществляли скрининг для определения мембранного белка дикого типа, вовлеченного в экспорт IMP. Конкретные эксперименты являются следующими.

Пример 1-1: Отбор продуцирующего IMP штамма CJI0323

ATCC6872 (от 107 клеток/мл до 108 клеток/мл) суспендировали в фосфатном буфере (pH 7,0) или в цитратном буфере (pH 5,5) для того, чтобы получить продуцирующий IMP штамм, являющийся производным ATCC6872, и затем мутацию индуцировали при помощи УФ (ультрафиолетовой) обработки. Полученные в результате клетки дважды промывали 0,85% физиологическим раствором, а затем разбавляли и высевали на среду, которую готовили путем добавления подходящей концентрации обеспечивающего резистентность вещества в минимальную среду, содержащую 1,7% агар. После этого получали колонии. Каждую колонию культивировали в питательной среде и культивировали в среде для посева в течение 24 часов. После 3-4 суток культивирования колоний в ферментационной среде отбирали колонии, обладающие самым высоким количеством IMP, накопленного в культуральной среде. Для получения штамма, продуцирующего IMP в высокой концентрации, и для того, чтобы обеспечить ауксотрофию по аденинуутечку гуанина, восприимчивость к лизоциму, устойчивость к 3,4-дигидропролину, устойчивость к стрептомицину, устойчивость к азетидинкарбоновой кислоте, устойчивость к тиапролину, устойчивость к азасерину, устойчивость к сульфагуанидину, устойчивость к норвалину и устойчивость к триметоприму, вышеуказанные процедуры осуществляли последовательно для каждого вещества. Наконец, в результате отобрали CJI0323, который демонстрировал устойчивость к вышеприведенным веществам и превосходные способности продуцировать IMP. Степень устойчивости сравнивали между ATCC6872 и CJI0323, и результаты представлены в таблице 1 ниже.

[Таблица 1]

Характеристики	ATCC6872	CJI0323
Ауксотрофия по аденину	Отсутствие ауксотрофии	Ауксотрофия
Утечка гуанина	Отсутствие ауксотрофии	Допускающая утечку ауксотрофия
Восприимчивость к лизоциму	80 мкг/мл	8 мкг/мл
Устойчивость к 3,4-дигидропролину	1000 мкг/мл	3500 мкг/мл
Устойчивость к стрептомицину	500 мкг/мл	2000 мкг/мл

Устойчивость казетидинкарбоновой кислоте	5 мг/мл	30 мг/мл
Устойчивость к тиапролину	10 мкг/мл	100 мкг/мл
Устойчивость к азасерину	25 мкг/мл	100 мкг/мл
Устойчивость к сульфогуанидину	50 мкг/мл	200 мкг/мл
Устойчивость к норвалину	0.2 мг/мл	2 мг/мл
Устойчивость к триметоприму	20 мкг/мл	100 мкг/мл

Составы сред были следующими:

- Минимальная среда: 2% глюкоза, 0,3% сульфат натрия, 0,1% KH2SO4, 0,3% K2HPO4, 0,3% сульфат магния, хлорид кальция (10 мг/л), сульфат железа (10 мг/л), сульфат цинка (1 мг/л), хлорид марганца (3,6 мг/л), L-цистеин (20 мг/л), пантотенат кальция (10 мг/л), тиамина хлоргидрат (5 мг/л), биотин (30 мкг/л), аденин (20 мг/л), гуанин (20 мг/л), pH 7,3

- Питательная среда: 1% петон, 1% мясной сок, 0,25% хлорин натрия, 1%

дрожжевой экстракт, 2% агар, pH 7,2

- Среда для посева: 1% глюкоза, 1% пептон, 1% мясной сок, 1% дрожжевой экстракт, 0,25% хлорид натрия, аденин (100 мг/л), гуанин (100 мг/л), pH 7,5

- Ферментационная среда: 0,1% глутамат натрия, 1% хлорид аммония, 1,2% сульфат магния, 0,01% хлорид кальция, сульфат железа (20 мг/л), сульфат марганца (20 мг/л), сульфат цинка (20 мг/л), сульфат меди (5 мг/л), L-цистеин (23 мг/л), аланин (24 мг/л), никотиновая кислота (8 мг/л), биотин (45 мкг/л), тиамина хлоргидрат (5 мг/л), аденин (30 мг/л), 1,9% фосфорная кислота (85%), 2,55% глюкоза, 1,45% фруктоза.

Пример 1-2: Эксперимент по титру ферментации CJI0323

Среду для посева (2 мл) разливали в пробирки для тестирования (диаметр: 18 мм), которые затем автоклавировали и каждую из которых инокулировали ATCC6872 и CJI0323. Затем полученные в результате культуры культивировали при перемешивании при 30°C в течение 24 часов и затем использовали в качестве растворов посевной культуры. Ферментационную среду (29 мл) разливали в колбы Эрленмейера (250 мл) и автоклавировали при 121°C в течение 15 минут. После этого каждый раствор посевной культуры (2 мл) инокулировали в нее, и затем полученные в результате культуры

культивировали в течение 3 суток. Условия культивирования устанавливались следующими: 170 об./мин, температура 30°C и pH 7,5.

После культивирования количество продуцируемого IMP измеряли с использованием HPLC (SHIMAZDU LC20A), и результаты культивирования представлены в таблице 2 ниже.

[Таблица 2]

Штамм	IMP (г/л)
ATCC6872	0
CJI0323	9,52

Пример 1-3: Обнаружение белков экспорта

Условия скрининга, демонстрирующие ингибирование штамма CJI0323, определяли путем дополнительного добавления IMP в минимальную среду, дополненную 1,7% агаром. Плазмиду геномной библиотеки ATCC6872 трансформировали в штамм CJI0323 с использованием электропорации (van der Rest et al. 1999). Отбирали те колонии, в которых уменьшение роста запускалось в условиях среды, дополненной избыточным количеством IMP. Плазмиды получали из выбранных колоний, и анализировали при помощи методов секвенирования. В соответствии с вышеизложенным, один тип мембранного белка, вовлеченного в запуск уменьшения роста, идентифицировали в условиях добавления избытка IMP.

Этот один тип мембранного белка Corynebacterium идентифицировали аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 2 и нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 5 (NCBI GenBank: NZ_CP014279, WP_066795121, MFS транспортер (суперсемейство мембранных транспортеров)). Этот мембранный белок известен как MFS транспортер, но его специфическая функция не была подтверждена, и кроме того, его функция в отношении экспорта IMP все еще

неизвестна. В описании настоящего изобретения этот мембранный белок назван

ImpE2(WT).

Пример 2: Идентификация ImpE1 и ImpE2

Пример 2-1: Подтверждение impE1 и impE2

Для исследования функций мембранного белка ImpE2 структуру гена с SEQ ID NO: 5 идентифицировали в NCBI (NCBI GenBank: NZ_CP014279, WP_066795121, MFS транспортер. Было подтверждено, что исходный фрагмент длиной 7 п.о. в ORF (открытая рамка считывания) в SEQ ID NO: 5 (impE2) перекрывается на 7 п.о. с другим

геном (NCBI GenBank: NZ_CP014279, WP_066795119, регулятор транскрипции), который расположен выше относительно impE2. Поскольку функции гена, расположенного выше относительно impE2, и белка, кодируемого геном, еще не подтверждена, в описании настоящего изобретения, белок был назван ImpE1(WT) (аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 1 и нуклеотидная последовательность SEQ ID NO: 3).

Для исследования функции мембранного белка ImpE2 структуру гена с SEQ ID NO: 5 идентифицировали в NCBI (NCBI GenBank: NZ_CP014279, WP_066795121, MFS транспортер). Подтверждено, что SEQ ID NO: 5 (impE2) перекрывается на 7 п.о. с исходным фрагментом ORF (открытая рамка считывания) гена, который расположен выше относительно impE2 (NCBI GenBank: NZ_CP014279, WP_066795119, регулятор транскрипции). Функция белка, кодируемого геном, или соответствующего гена, расположенного выше относительно impE2, еще не подтверждена; в описании настоящего изобретения такой белок был назван ImpE1(WT) (аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 1 и нуклеотидная последовательность SEQ ID NO: 4).

Пример 2-2: Получение векторов, дефектных по impE1 или impE2

Для определения того, может ли способность экспортировать IMP уменьшаться после делеции ImpE1 или ImpE2, которые вовлечены в запуск ингибирования роста, вызванного IMP, и которые идентифицированы в примерах 1 и 2-1, предприняты попытки получить векторы, дефицитные по каждому из генов.

Фрагменты генов для конструирования векторов получали при помощи ПЦР с использованием геномной ДНК ATCC6872 в качестве матрицы.

В частности праймеры с SEQ ID NO: 6 и 7 и праймеры с SEQ ID NO: 8 и 9 использовали для ПЦР для impE1; а праймеры с SEQ ID NO: 10 и 11 и праймеры с SEQ ID NO: 12 и 13 использовали для ПЦР для impE2 (таблица 3).

[Таблица 3]

SEQ ID NO:	Праймер	Последовательность (от 5′ к 3′)
6	impE1 kop-1	GCTCTAGACGAGAAAGCTAAAGCCGGTGA
7	impE1 kop-2	GTTTTTAGCTACCATTGTTACACCCCGTGCAAGTTT
8	impE1 kop-3	GCACGGGGTGTAACAATGGTAGCTAAAAACTCCACC

9	impE1 kop-4	GCTCTAGAAATAGTTGGGGAAGTCCACTC
10	impE2 kop-1	GCTCTAGACTTGGATGACCTGGTGGAAAA
11	impE2 kop-2	CTTGGAGAAAATTTCCTACCATTCCAGTCCTTTCGT
12	impE2 kop-3	GGACTGGAATGGTAGGAAATTTTCTCCAAGGGAAAT
13	impE2 kop-4	GGACTAGTGGATTGTGTTGACGCACGATG
14	impE1E2 kop-2	CTTGGAGAAAATTTCTGTTACACCCCGTGCAAGTTT
15	impE1E2 kop-3	GCACGGGGTGTAACAGAAATTTTCTCCAAGGGAAAT

Праймеры получали на основе информации о гене Corynebacterium stationis (ATCC6872) (NCBI Genbank: NZ_CP014279), зарегистрированном в NIH GenBank, и соседних с ним нуклеотидных последовательностях.

ПЦР осуществляли с денатурацией при 94°C в течение 5 минут с последующим повторением 25 циклов, включающих денатурацию при 94°C в течение 30 секунд, отжиг при 52°C в течение 3 минут и полимеризацию при 72°C в течение 1 минуты, и последующей полимеризацией при 72°C в течение 5 минут. Полимеразную цепную реакцию с перекрывающимися праймерами осуществляли с использованием двух фрагментов гена impE1, которые амплифицировали с использованием праймеров с SEQ ID NO: 6 и 7 и праймеров с SEQ ID NO: 8 и 9 в качестве матрицы. В результате получали полинуклеотидную матрицу (1,8 т.п.о.(тысяч пар оснований)). Полученный фрагмент гена расщепляли ферментом рестрикции XbaI. pDZ-ΔimpE1 получали с использованием вектора pDZ (Корейский патент № 10-0924065 и Международная заявка на патент № 2008-033001), который получали путем расщепления ферментом рестрикции XbaI с использованием лигазы T4. В дополнение, полимерaзную цепную реакцию с перекрывающимися праймерами осуществляли с использованием фрагмента гена impE2, амплифицированного с использованием праймеров с SEQ ID NO: 10 и 11, и двух фрагментов гена impE2, амплифицированных с использованием праймеров с SEQ ID NO: 12 и 13 в качестве матриц, и получали полинуклеотидную матрицу (1.7 т.п.о.). Полученные фрагмент гена расщепляли ферментами рестрикции XbaI и speI. Фрагменты гена клонировали с использованием лигазы T4 в вектор pDZ, который был расщеплен ферментом рестрикции XbaI, и затем получали вектор pDZ-ΔimpE2.

Пример 2-3: Получение векторов, дефектных по impE1 и impE2

Поскольку гены impE1 и impE2, которые кодируют белки, вовлеченные в запуск ингибирования роста, вызванного IMP, перекрываются, существует потребность в одновременной регуляции обоих генов. Поэтому были осуществлены попытки получить вектор, дефектный как по impE1, так и по impE2.

Для ПЦР impE1 и impE2 использовали праймеры с SEQ ID NO: 6 и 14 и праймеры с SEQ ID NO: 15 и 13. Эти праймеры получали на основе информации о гене Corynebacterium stationis (ATCC6872) (NCBI Genbank: NZ_CP014279), зарегистрированной в NIH GenBank, и соседних с ним нуклеотидных последовательностях. Полимеразную цепную реакцию с перекрывающимися праймерами осуществляли с использованием фрагмента гена impE1, амплифицированного с использованием праймеров с SEQ ID NO: 6 и 14, и двух фрагментов гена impE2, амплифицированных с использованием праймеров с SEQ ID NO: 15 и 13 в качестве матриц, и получали полинуклеотидную матрицу (2,0 т.п.о.). Полученные фрагменты генов расщепляли XbaI и speI, соответственно. Фрагменты генов клонировали с использованием лигазы T4 в вектор pDZ, который был расщеплен ферментом рестрикции XbaI, и затем получали pDZ-ΔimpE1E2.

Пример 2-4: Получение штаммов, дефектных по impE1 и impE2

Каждую из двух плазмид, полученных в примере 2-2, и одну плазмиду, полученную в примере 2-3, трансформировали в CJI0323 путем электропорации (с использованием способа трансформации, раскрытого в Appl. Microbiol. Biotechnol. (1999) 52: 541 - 545). Штаммы, в которых вектор был встроен в хромосому путем рекомбинации гомологичных последовательностей, отбирали на среде, содержащей канамицин (25 мг/л). Отобранные первичные штаммы подвергали второму кроссинговеру. Генетический дефект в окончательно трансформированных штаммах определяли путем осуществления ПЦР с использованием пары праймеров с SEQ ID NO: 6 и 9, SEQ ID NO: 10 и 13 и SEQ ID NO: 6 и 13.

Отобранные штаммы были названы CJI0323_ΔimpE1, CJI0323_ΔimpE2 и CJI0323_ΔimpE1E2. Кроме того, оценивали способности вышеприведенных штаммов продуцировать IMP.

Среду для посева (2 мл) разливали в тестируемые пробирки (диаметром 18 мм), которые затем автоклавировали и каждую из которых инокулировали CJI0323, CJI0323_ΔimpE1, CJI0323_ΔimpE2 и CJI0323_ΔimpE1E2. После этого полученные в

результате культуры культивировали при перемешивании при 30°C в течение 24 часов и затем использовали в качестве растворов посевных культур. Ферментационную среду (29 мл) разливали в колбы Эрленмейера (250 мл) для встряхивания и автоклавировали при 121°C в течение 15 минут. Затем раствор посевной культуры (2 мл) инокулировали в нее, и полученные в результате культуры культивировали в течение 3 суток. Условия культивирования устанавливались следующими: 170 об./мин, температура 30°C и pH

7,5.

После завершения культивирования количество продуцируемого IMP измеряли при помощи HPLC, и результаты для культуры представлены в таблице 4 ниже.

[Таблица 4]

Штамм	IMP (г/л)
CJI0323	9,52
CJI0323_ΔimpE1	1,92
CJI0323_limpE2	1,88
CJI0323_ΔimpE1E2	1,80

Количество IMP, накопленное в каждом штамме, сравнивали с количеством IMP

для родительского штамма Corynebacterium stationis CJI0323. В результате обнаружено, что в соответствии с представленным в таблице 4 выше концентрации IMP в штаммах CJI0323_ΔimpE1, CJI0323_ΔimpE2 и CJI0323_ΔimpE1E2 уменьшались на приблизительно 8 г/л в тех же самых условиях по сравнению с родительским штаммом, что подтверждает то, что ImpE1 и ImpE2 представляют собой белки, вовлеченные в экспорт IMP.

Пример 3: Усиление дикого типа impE1 и impE2

Штамм дикого типа рода Corynebacterium не может продуцировать IMP или продуцирует очень небольшое количество IMP. Поэтому в CJI0323, который представляет собой штамм, продуцирующий IMP, белок ImpE был нокаутирован и затем восстановлен путем внедрения белка дикого типа ImpE, и, таким образом, активность ImpE была усилена, что подтверждает то, что способность экспортировать IMP увеличилась за счет усиления дикого типа ImpE. Усиление активности белка достигалось с использованием способа “увеличения числа копий” и способа усиления промотора среди способов усиления.

Пример 3-1: Получение вектора с внедренными impE1 и impE2 дикого типа

Для получения штамма, в который внедрен ImpE дикого типа, фрагменты гена

для получения вектора получали при помощи ПЦР с использованием геномной ДНК ATCC6872 в качестве матрицы. Для ПЦР impE1 и impE2 дикого типа использовали праймеры с SEQ ID NO: 6 и 13. Полноразмерные фрагменты гена impE1 и impE2 дикого типа, которые амплифицировали с использованием праймеров с SEQ ID NO: 6 и 13, обрабатывали ферментами рестрикции XbaI и SpeI, и затем клонировали в сайт фермента рестрикции XbaI вектора pDZ для получения pDZ-impE1E2(WT).

Пример 3-2: Получение вектора дикого типа, усиленного impE1

Для получения вектора, усиленного ImpE1, фрагменты гена для получения вектора получали путем ПЦР с использованием геномной ДНК ATCC6872 в качестве матрицы. Для амплификации impE1 использовали праймеры с SEQ ID NO: 16 и 17, включающие приблизительно 370 п.о. вышеприведенного impE1, которые, как считают, представляют собой промоторную область. Амплифицированные фрагменты гена impE1 обрабатывали ферментом рестрикции XbaI и затем клонировали в сайт фермента рестрикции XbaI на векторе pDZ для получения pDZ-impE1(WT)2-1. Затем для получения двух копий вектора impE1 подвергали ПЦР с парой праймеров с SEQ ID NO:

18 и 19. Каждый полученный фрагмент ДНК расщепляли NotI, который представляет собой фермент рестрикции ДНК, и клонировали в pDZ-impE1(WT)2-1, расщепленный тем же самым ферментом рестрикции ДНК. Полученный вектор был назван pDZ-impE1(WT) 2X.

Пример 3-3: Получение вектора дикого типа, усиленного impE1 и impE2

Для получения штамма, в котором impE1 и impE2 оба были усилены, внедряемые гены impE1 и impE2 дикого типа амплифицировали при помощи ПЦР с использованием праймеров с SEQ ID NO: 16 и 20. Амплифицированные фрагменты генов обрабатывали XbaI, представляющим собой фермент рестрикции, и затем клонировали в сайт фермента рестрикции XbaI вектора pDZ для получения pDZ- impE1E2(WT)2-1. После этого для получения двух копий вектора impE1E2 подвергали ПЦР с парой праймеров с SEQ ID NO: 18 и 21. Каждый полученный фрагмент ДНК расщепляли NotI, представляющим собой фермент рестрикции ДНК, и клонировали в pDZ-impE1E2(WT)2-1, расщепленный тем же самым ферментом рестрикции ДНК. Полученный вектор был назван pDZ-impE1E2(WT) 2X.

[Таблица 5]

SEQ ID NO:	Праймер	Последовательность (от 5′ к 3′)
16	impE1 2-1	GCTCTAGAGAACGGAGTCATCTCCTTTGC
17	impE1 2-2	GGGTCTAGAGAAGCGGCCGCCTACCATTCCAGTCCTTTCGT
18	impE1 2-3	AAGGAAAAAAGCGGCCGCGAACGGAGTCATCTCCTTTGC
19	impE1 2-4	AAGGAAAAAAGCGGCCGCCTACCATTCCAGTCCTTTCGT
20	impE1E2 2-2	GGGTCTAGAGAAGCGGCCGCCCAAACGCTCTGCAAGAAACTG
21	impE1E2 2-4	ATAAGAATGCGGCCGCCCAAACGCTCTGCAAGAAACTG

Пример 3-4: Оценка штаммов дикого типа с внедренными/усиленными

impE1 и impE2

pDZ-impE1E2(WT), полученный в примере 3-1, трансформировали в CJI0323_ΔimpE1E2, представляющий собой штамм, полученный в примере 2, путем электропорации (с использованием способа трансформации, раскрытого в Appl. Microbiol. Biotechnol. (1999) 52:541-545). После этого штаммы, в которых вектор был внедрен в хромосому путем рекомбинации гомологичных последовательностей, отбирали на среде, содержащей канамицин (25 мг/л). Отобранные первичные штаммы подвергали второму кроссинговеру. Внедрение генов в окончательно трансформированные штаммы определяли путем осуществления ПЦР с использованием пар праймеров с SEQ ID NO: 6 и 13. После этого полученный штамм CJI0323_ΔimpE1E2_impE1E2(WT) оценивали для определения способностей продуцировать IMP, когда impE1 и impE2 дикого типа внедрены в штамм CJI0323.

Кроме того, векторы pDZ-impE1(WT) 2X и pDZ-impE1E2(WT) 2X трансформировали в штамм CJI0323_ΔimpE1E2_impE1E2(WT) с использованием электропорации, и затем штаммы, в которые вектор был внедрен в хромосому путем рекомбинации гомологичных последовательностей, отбирали на среде, содержащей канамицин (25 мг/л). Отобранные первичные штаммы подвергали второму кроссинговеру. Усиление генов в окончательно трансформированных штаммах определяли путем осуществления ПЦР с использованием пар праймеров с SEQ ID NO:

16 и 19 и SEQ ID NO: 16 и 21. CJI0323_ΔimpE1E2_impE1E2(WT), CJI0323_ΔimpE1E2_impE1E2(WT)_impE1(WT) 2X и CJI0323_ΔimpE1E2_impE1E2(WT)_impE1E2(WT) 2X культивировали тем же самым образом как в примере 2-4 с получением штаммов, и оценивали способности продуцировать IMP вышеприведенными штаммами. После завершения культивирования количество продуцированного IMP измеряли при помощи HPLC, и результаты культивирования представлены в таблице 6 ниже.

[Таблица 6]

Штамм	IMP (г/л)
CJI0323_ΔimpE1E2	1,80
CJI0323_ΔimpE1E2_impE1E2(WT)	2,32
CJI0323_ΔimpE1E2_impE1E2(WT)_impE1(WT) 2X	2,52
CJI0323_ΔimpE1E2_impE1E2(WT)_impE1E2(WT) 2X	2,97

Накопленное количество IMP в каждом штамме сравнивали с количеством у родительского штамма Corynebacterium stationis CJI0323_ΔimpE1E2_impE1E2(WT). В результате было обнаружено, что в соответствии с представленным в вышеприведенной таблице 6, концентрация IMP у штамма, в котором активности ImpE1 или ImpE1 и ImpE2 были одновременно усилены в тех же самых условиях, была увеличена на 28%. У микроорганизма рода Corynebacterium, который не продуцирует IMP или продуцирует его следовое количество, увеличение продукции IMP вследствие увеличения активности белка ImpE может быть интерпретировано как весьма существенное.

Полученные штаммы CJI0323 и CJI0323_ΔimpE1E2_impE1E2(WT)_ impE1E2(WT) 2X(CJI2236) были названы Corynebacterium stationis CN01-0323 и Corynebacterium stationis CN01-2236, соответственно. Эти штаммы были депонированы в соответствии с Будапештским договором в Korean Culture Center of Microorganisms (Корейском центре культур микроорганизмов) (KCCM) 7 ноября 2017 года и 25 октября 2017 года, соответственно. Кроме того, эти штаммы были обозначены как KCCM12151P и KCCM12137P, соответственно.

Пример 3-5: Получение усиленного вектора дикого типа impE1 или impE2 с усиленным промотором

Фрагменты гена для получения вектора, которые заменяют промотор каждого

гена на усиленный промотор, получали путем ПЦР с использованием геномной ДНК

ATCC6872 в качестве матрицы.

Для усиления промотора использовали промотор Pcj7 (выложенная в открытый доступ публикация Корейского патента № 10-0620092), который, как сообщалось, обладает сильной экспрессией в Corynebacterium stationis.

Для ПЦР impE1 каждый фрагмент гена, амплифицированный с использованием праймеров с SEQ ID NO: 22 и 13 и праймеров с SEQ ID NO: 24 и 25, обрабатывали ферментами рестрикции XbaI и NdeI, и затем клонировали в сайт рестрикции ферментом XbaI вектора pDZ. Для усиления фрагментов гена фрагменты, полученные путем осуществления ПЦР с праймерами с SEQ ID NO: 30 и 31 с использованием геномной ДНК ATCC6872 в качестве матрицы обрабатывали NdeI, и полученный вектор обрабатывали NdeI для получения вектора pDZ-Pcj7_impE1(WT).

Для ПЦР impE2 каждый фрагмент гена, амплифицированный с использованием праймеров с SEQ ID NO: 26 и 27 и праймеров с SEQ ID NO: 28 и 29, обрабатывали ферментами рестрикции XbaI и NdeI, и затем клонировали в сайт фермента рестрикции XbaI вектора pDZ. Полученные фрагменты гена Pcj7 и полученный вектор обрабатывали NdeI для получения вектора pDZ-Pcj7_impE2(WT).

[Таблица 7]

SEQ ID NO:	Праймер	Последовательность (от 5′ к 3′)
22	impE1 Pcj7-1	GCTCTAGAGGTGAGCGCGAAGGGGACGCG
23	impE1 Pcj7-2	GGAATTCCATATGTGTTACACCCCGTGCAAGTTT
24	impE1 Pcj7-3	GGAATTCCATATGCATGCTGTGCAAGAAGTT
25	impE1 Pcj7-4	GCTCTAGATTCAGCATTGGCCACTGGGAA
26	impE2 Pcj7-1	GCTCTAGATTGCATGCTGTGCAAGAAGTT
27	impE2 Pcj7-2	GGAATTCCATATGCTACCATTCCAGTCCTTTCGT
28	impE2 Pcj7-3	GGAATTCCATATGGTAGCTAAAAACTCCACC
29	impE2 Pcj7-4	GCTCTAGAAATAGTTGGGGAAGTCCACT

		C
30	Pcj7 F	GGAATTCCATATGTCCCAGCGCTACTAATAGG
31	Pcj7 R	GGAATTCCATATGGAGTGTTTCCTTTCGTTGGG

Пример 3-6: Оценка штамма, в котором заменены промоторы impE1 и impE2 дикого типа

Каждую из двух плазмид, полученных в примере 4-1, трансформировали в CJI0323_ΔimpE1E2_impE1E2(WT), представляющий собой штамм, полученный в примере 3-3, путем электропорации (с использованием способа трансформации, раскрытого в Appl. Microbiol. Biotechnol. (1999) 52:541-545). После этого штаммы, в которых вектор был внедрен в хромосому путем рекомбинации гомологичных последовательностей, отбирали на среде, содержащей канамицин (25 мг/л). Отобранные первичные штаммы подвергали второму кроссинговеру. Усиление гена в окончательно трансформированных штаммах определяли путем осуществления ПЦР с использованием пар праймеров с SEQ ID NO: 22 и 25 и SEQ ID NO: 26, и 27. Два штамма, полученные выше, были названы CJI0323_ΔimpE1E2_impE1E2(WT)_Pcj7/impE1(WT) и CJI0323_ΔimpE1E2_impE1E2(WT)_Pcj7/impE2(WT). Кроме того, на основе полученного штамма подвергали трансформации CJI0323_ΔimpE1E2_impE1E2(WT)_Pcj7/impE1(WT), pDZ-Pcj7_impE2(WT). После этого штамм, в котором вектор был внедрен в хромосому путем рекомбинации гомологичных последовательностей, был отобран на среде, содержащей канамицин (25 мг/л). Отобранный первичный штамм подвергали вторичному кроссинговеру. Усиление гена в окончательно трансофрмированном штамме определяли путем осуществления ПЦР с использованием пар праймеров с SEQ ID NO: 26 и 29. Полученный выше штамм был назван CJI0323_ΔimpE1E2_impE1E2(WT)_Pcj7/impE1(WT)_Pcj7/impE2(WT). После этого каждый из полученных штаммов CJI0323_ΔimpE1E2_impE1E2(WT)_Pcj7/impE1(WT), CJI0323_ΔimpE1E2_impE1E2(WT)_Pcj7/impE2(WT) и CJI0323_ΔimpE1E2_impE1E2(WT)_Pcj7/impE1(WT)_Pcj7/impE2(WT) культивировали тем же самым образом, как в примере 2-4, и затем оценивали их продуктивности в отношении IMP.

После завершения культивирования количество продуцированного IMP измеряли при помощи HPLC, и результаты культивирования представлены в таблице 8 ниже.

[Таблица 8]

Штамм	IMP (г/л)
CJI0323_ΔimpE1E2_impE1E2(WT)	2,32
CJI0323_ΔimpE1E2_impE1E2(WT)_Pcj7/impE1(WT)	2,47
CJI0323_ΔimpE1E2_impE1E2(WT)_Pcj7/impE2(WT)	2,81
CJI0323_limpE1E2_impE1E2(WT)_Pcj7/impE1(WT)_Pcj7/impE2(WT)	2,97

Накопленное количество IMP в каждом штамме сравнивали с количеством для

родительского штамма Corynebacterium stationis CJI0323_ΔimpE1E2_impE1E2(WT). В результате было обнаружено, что в соответствии с представленным в таблице 8 выше концентрации IMP для штаммов, в которых активности ImpE1 и/или ImpE2 усилены, были увеличены на 28% в тех же самых условиях.

Полученные штаммы CJI0323_ΔimpE1E2_impE1E2(WT)_Pcj7/impE1(WT) и CJI0323_ΔimpE1E2_impE1E2(WT)_Pcj7/impE2(WT) были депонированы в соответствии с Будапештским договором в Korean Culture Center of Microorganisms (KCCM) 2 ноября 2017 года. Кроме того, эти штаммы были обозначены KCCM12357P и KCCM12358P, соответственно.

Пример 4: Усиление impE1 и impE2 в продуцирующем IMP штамме

Пример 4-1: Получение штамма с модификациями impE1, impE2 на основе штамма, продуцирующего IMP

Для подтверждения усиливающих эффектов impE1 и impE2 получали штаммы,

продуцирующие IMP, в которых были ослаблены активности аденилосукцинатсинтетазы и IMP-дегидрогеназы, которые соответствуют пути разрушения IMP в ATCC6872. Инициирующий кодон был изменен путем замены первого основания с ‘a’ на ‘t’ в каждой нуклеотидной последовательности генов purA и guaB, кодирующих вышеуказанные два фермента. Штамм, в котором экспрессия двух генов была ослаблена в ATCC6872, был назван CJI9088. Векторы pDZ-impE1(WT) 2X и pDZ-impE1E2(WT)2X, полученные в примере 3-3, трансформировали в штамм CJI9088 путем электропорации, и штаммы, в которых векторы были внедрены в хромосому путем рекомбинации гомологичных последовательностей, отбирали на среде, содержащей канамицин (25 мг/л). Отобранные первичные штаммы подвергали второму

кроссинговеру. Внедрение генов в окончательно трансформированные штаммы определяли путем осуществления ПЦР с использованием пар праймеров в соответствии с SEQ ID NO: 6 и 13.

Оценивали продуктивности CJI9088 и полученных штаммов CJI9088_impE1(WT)2X и CJI9088_impE1E2(WT)2X. После завершения культивирования способности продуцировать IMP измеряли при помощи HPLC, и результаты культивирования представлены в таблице 9 ниже.

[Таблица 9]

Штамм	IMP (г/л)
CJI9088	0,52
CJI9088_impE1(WT) 2X	0,68
CJI9088_impE1E2(WT) 2X	0,87

В результате подтверждения накопленного в среде количества IMP обнаружено, что способности продуцировать IMP увеличивались на 67% по сравнению с родительским штаммом CJI9088. Исходя из вышеприведенных результатов было подтверждено, что способности продуцировать IMP могут быть увеличены путем усиления активности белка (ImpE) в соответствии с описанием настоящего изобретения, который экспортирует IMP.

Исходя из вышеизложенного, специалист в данной области техники, к которой относится настоящее изобретение, будет способен понять, что настоящее изобретение может быть воплощено в других конкретных формах без модификации технических принципов или существенных характеристик настоящего изобретения. В этой связи раскрытые в настоящем описании типичные воплощения приведены только для иллюстративных целей и их не следует рассматривать, как ограничивающие объем настоящего изобретения. Наоборот, предполагается, что настоящее изобретение охватывает не только эти типичные воплощения, но также и различные альтернативы, модификации, эквиваленты и другие воплощения, которые могут быть включены в сущность и объем настоящего изобретения, как определено в прилагаемой формуле изобретения.

--->

<110> CJ CheilJedang Corporation

<120> IMP-producing microorganism and method of producing IMP using the

same

<130> OPA18596

<150> KR10-2017-0173504

<151> 2017-12-15

<160> 31

<170> KoPatentIn 3.0

<210> 1

<211> 222

<212> PRT

<213> Unknown

<220>

<223> ImpE1

<400> 1

Leu His Ala Val Gln Glu Val Asn Asp Asn Glu Glu Asp Ser Leu Pro

1 5 10 15

Gly Ser Asp Leu Gly Leu Arg Glu Gln Lys Arg Leu Ala Thr Lys His

20 25 30

Arg Ile Glu Asp Ala Ala Thr Arg Leu Val Asp Glu Ser Ser Phe Asp

35 40 45

Lys Val Thr Ile Glu Glu Ile Cys Glu Ala Ala Gly Ile Ser Arg Arg

50 55 60

Thr Phe Phe Asn Tyr Phe Ser Thr Lys Glu Ser Ala Val Ile Gly Ala

65 70 75 80

Ser Ser Glu Pro Leu Thr Glu Lys Gln Arg Asn Asp Phe Leu Asn Ala

85 90 95

Asp Ala Ser Asn Leu Leu Gln Leu Met Val Glu Gln Ile Lys Gln His

100 105 110

Leu Glu Ser Ser His Gln Ser Gln Ala Ile His Asp Arg Arg Gln Arg

115 120 125

Ile Phe Ala Asp Pro Asp Val Ala Val Arg Ala Met Ala Phe Arg Lys

130 135 140

Glu Arg Ser Arg Glu Thr Met Glu Leu Ile Ala Gln Arg Leu Arg Glu

145 150 155 160

His Pro Glu Glu Gln Arg Ala Pro Glu Leu Asp Pro Glu Thr Glu Ala

165 170 175

Met Leu Leu Ser Gly Phe Ile Arg Glu Ala Thr Trp Met Ala Ile Ser

180 185 190

Arg Pro Asp Arg Asp Cys Ala Leu Pro Val Gly Asp Arg Ile Tyr Arg

195 200 205

Ala Met Glu Leu Val Lys Asn Tyr Thr Lys Gly Leu Glu Trp

210 215 220

<210> 2

<211> 549

<212> PRT

<213> Unknown

<220>

<223> ImpE2

<400> 2

Met Val Ala Lys Asn Ser Thr Pro Ser Thr Ala Gly His Ala Ser Ala

1 5 10 15

His Thr Ala Glu Glu Phe Pro Val Ala Asn Ala Glu Met Ala Thr Pro

20 25 30

Ser Ala Ile Asp Pro Asn His Gly Lys Lys Thr Ala Asp Asn Val Gly

35 40 45

Ile Ile Phe Ala Ala Leu Met Leu Thr Met Leu Met Ser Ser Leu Gly

50 55 60

Gln Met Ile Phe Gly Ser Ala Leu Pro Thr Ile Val Gly Glu Leu Gly

65 70 75 80

Gly Val Asp Gln Met Ser Trp Val Ile Ser Ala Phe Met Val Thr Met

85 90 95

Thr Ile Ala Met Pro Leu Ala Gly Gln Leu Gly Asp Arg Met Gly Arg

100 105 110

Lys Trp Val Tyr Ile Ser Gly Ile Ser Ile Phe Val Ile Gly Ser Thr

115 120 125

Leu Gly Gly Phe Ala Asn Gly Met Gly Met Leu Ile Thr Gly Arg Ala

130 135 140

Ile Gln Gly Phe Gly Ala Gly Ile Met Met Ile Ser Ser Gln Ser Ile

145 150 155 160

Val Ala Glu Val Val Ser Ala Arg Glu Arg Gly Lys Phe Met Gly Ile

165 170 175

Met Gly Gly Val Phe Gly Val Ser Ser Val Leu Gly Pro Val Leu Gly

180 185 190

Gly Trp Phe Thr Asp Gly Pro Gly Trp Arg Trp Gly Leu Trp Ile Asn

195 200 205

Ile Pro Leu Gly Leu Leu Ala Ile Ile Val Cys Ala Phe Val Leu Lys

210 215 220

Leu Arg Val Gly Glu Gln Gly Phe Lys Gly Phe Asp Trp Met Gly Phe

225 230 235 240

Ala Ala Ile Ala Ile Thr Thr Ser Thr Leu Ile Leu Leu Thr Thr Trp

245 250 255

Gly Gly Ser Glu Tyr Glu Trp Thr Ser Pro Thr Ile Leu Ser Met Ala

260 265 270

Ala Val Val Ile Val Gly Ala Leu Leu Thr Val Phe Ile Glu Ser Arg

275 280 285

Ala Ser Gln Pro Leu Ile Pro Val Gln Leu Phe Lys Asn Arg Asn Met

290 295 300

Val Leu Thr Thr Leu Ala Gly Thr Val Leu Gly Leu Ala Met Met Gly

305 310 315 320

Val Leu Gly Tyr Met Pro Thr Tyr Leu Gln Met Val His Thr Leu Thr

325 330 335

Pro Thr Glu Ala Gly Leu Met Met Ile Pro Met Met Val Gly Met Ile

340 345 350

Gly Val Ser Thr Gly Val Gly Phe Ile Ile Ala Lys Thr Gly Asn Tyr

355 360 365

Lys Tyr Tyr Pro Ile Ala Gly Leu Ala Ile Thr Ala Phe Ala Leu Trp

370 375 380

Trp Met Ser Gln Met Thr Val Glu Thr Ser Leu Thr Gly Ile Gly Val

385 390 395 400

Arg Phe Leu Val Phe Gly Val Gly Leu Gly Phe Val Met Gln Val Leu

405 410 415

Val Leu Ile Val Gln Asn Ser Phe Pro Val Ser Gln Val Gly Thr Ala

420 425 430

Thr Ala Ala Asn Asn Phe Phe Arg Gln Ile Gly Ser Ala Leu Gly Ala

435 440 445

Ser Ile Val Gly Ser Met Phe Ile His Asn Met Gln Asn Glu Met Ala

450 455 460

Thr Arg Leu Pro Asp Ala Leu Ala Ser Leu Gly Lys Glu Gly Ala Ala

465 470 475 480

Ile Ser Gln Gln Phe Gln Gly Ala Asp Ala Ala Asn Ser Leu Thr Pro

485 490 495

His Ala Val Ala Glu Leu Pro Asp Val Leu Arg Asp Ala Ile Leu Asn

500 505 510

Ser Tyr Asn Asp Gly Leu Thr Pro Val Ile Gly Met Met Val Pro Leu

515 520 525

Ala Ile Val Ala Met Leu Ile Leu Phe Pro Leu Arg Gln Glu Arg Leu

530 535 540

Lys Glu Thr Ile Glu

545

<210> 3

<211> 2312

<212> DNA

<213> Unknown

<220>

<223> impE1E2

<400> 3

ttgcatgctg tgcaagaagt taatgacaat gaagaagact ccctccctgg cagtgacctc 60

gggttaaggg agcagaagcg attggcaacc aagcatcgca tcgaagacgc cgcgacacgg 120

ttggttgatg aatcgagctt tgacaaagta acaattgaag aaatttgcga agccgccggg 180

atttcccgac gcaccttttt taattatttc agcacgaaag aaagcgccgt tattggcgcg 240

tcctcggaac cgttgacgga aaagcaacgc aatgacttct tgaatgctga cgccagcaat 300

ctcctgcagc tgatggttga gcagatcaaa caacacttgg agtcttctca ccagagtcaa 360

gcgattcacg accgtcgtca gcgaatcttt gcggatccgg atgtcgcggt acgtgcaatg 420

gcgtttcgca aggaacgctc acgggaaacc atggagctaa tcgctcaacg tcttcgggag 480

catcctgaag aacaacgcgc cccagaattg gatccggaaa cagaggcgat gctgctgagc 540

ggattcattc gcgaagccac ctggatggct atctcacgac ccgatcgtga ttgtgcactg 600

ccagtgggtg accgcatcta tcgcgcgatg gaattggtaa agaattacac gaaaggactg 660

gaatggtagc taaaaactcc accccaagca cggccggcca cgccagtgct cacactgcgg 720

aagaattccc agtggccaat gctgaaatgg caacgccttc agcaatcgac ccaaaccacg 780

gtaaaaagac cgcggataac gtcggcatta tcttcgctgc cttgatgctc accatgctga 840

tgagctcttt ggggcagatg attttcggtt ccgctctgcc aaccatcgtc ggcgagctcg 900

gcggcgtgga ccagatgagc tgggtaattt cagcatttat ggtcaccatg accattgcta 960

tgccactagc cggtcagctc ggtgaccgca tgggccgcaa gtgggtctac atctcaggta 1020

tctccatttt cgttattggc tcgacgctcg gtggctttgc caatggcatg ggcatgctga 1080

tcaccggacg tgcaatccag ggcttcggtg ccggcatcat gatgatttcc tcgcagtcga 1140

ttgtggctga ggttgtctcc gcacgtgagc gcggcaagtt catgggtatt atgggcggcg 1200

tctttggcgt ctcctccgta ctgggtccag ttctcggtgg ctggttcacc gatggtcccg 1260

gttggcgttg gggcctgtgg atcaacattc cactgggtct gctggcaatt attgtctgcg 1320

ctttcgtact gaagctgcgc gtgggcgagc aaggctttaa gggctttgac tggatgggtt 1380

ttgcggccat cgcaatcacg accagcaccc tgattctgct caccacttgg ggcggaagcg 1440

aatacgagtg gacttcccca actattttgt ccatggctgc cgtagtcatc gtcggcgcgc 1500

tgctcaccgt gttcattgag tcgcgtgcat cccagccgct gatcccggtt cagctattta 1560

agaaccgcaa catggttttg accaccctcg ccggtactgt tttgggtctg gccatgatgg 1620

gcgtgctcgg ctacatgcca acctacctgc agatggtgca caccctgacg ccaactgaag 1680

caggcttgat gatgatcccg atgatggtcg gcatgatcgg tgtctccact ggtgttggct 1740

tcatcatcgc taagaccggc aactacaagt actaccccat cgcgggcctg gccatcacgg 1800

cgtttgcttt gtggtggatg tcccagatga ccgttgagac ttcattgacc ggtatcggag 1860

ttcgcttcct tgtattcggt gtcggcttgg gctttgtcat gcaggtactg gtgctgattg 1920

ttcaaaactc cttccctgta tcgcaggtcg gtactgccac ggcggctaat aacttcttcc 1980

gccagattgg ttcggcattg ggtgcttcca tcgtgggttc gatgttcatt cacaatatgc 2040

agaatgagat ggctacccgt ttgcctgatg cccttgcatc gttgggcaag gaaggcgccg 2100

ctatttcgca gcagttccaa ggtgcagatg ccgccaactc cttgactccg cacgcagtcg 2160

cagagcttcc cgatgtcctc cgtgacgcta tcttaaattc ctacaatgac ggtctgaccc 2220

ccgtgattgg catgatggtg ccactggcca ttgttgcaat gctgattttg ttcccactgc 2280

gccaagagcg cttgaaggaa accatcgaat aa 2312

<210> 4

<211> 669

<212> DNA

<213> Unknown

<220>

<223> ImpE1

<400> 4