Способ консервации оздоровленного in vitro материала картофеля

Изобретение относится к сельскому хозяйству и биотехнологии. Осуществляют консервацию микрочеренков картофеля в биокапсулах, которая заключается в использование пазушных почек микрорастений размером не более 0,5 см и двух составов питательных сред. В питательной среде 1 подобран минеральный и витаминный состав, обеспечивающий жизнедеятельность экспланта. Состав питательной среды 2 образует оболочку, способствующую защите инкапсулируемого объекта от негативного воздействия окружающей среды и обеспечивающую его сохранность в течение 1,5-2 лет. Биокапсулы хранят в условиях климатической камеры при температуре 3-4°С и освещении 1-2 тыс. люкс. Изобретение позволяет увеличить срок беспересадочного хранения материала в in vitro коллекции и сохраняет возможность поддержания большого количества посадочных единиц. 5 ил., 3 табл.

 

Изобретение относится к области сельского хозяйства и может быть использовано при хранении здорового семенного материала картофеля в коллекции in vitro.

Известен способ хранения материала при низких плюсовых температурах (+8…10°С), согласно которому ингибируется рост и развитие растений, задерживается формирование морфологических структур, что позволяет осуществить повторное черенкование микрорастений с периодичностью 8-12 месяцев /1/.

К недостаткам известного способа хранения in vitro материала относятся высокие материальные затраты на круглогодичное обеспечение фито- и температурного режима, обеспечивающих сохранность здорового исходного материала в виде микрорастений. Немаловажным фактором также является хранение ограниченного количества эксплантов (не более 10-и по каждой линии), что сдерживает процесс подготовки и сертификации in vitro материала при необходимости тиражирования сорта для дальнейшего использования в процессе оригинального семеноводства.

Известен способ хранения in vitro материала с применением криоконсервации. При температуре жидкого азота клеточное деление прекращается и останавливается метаболизм растения. В таких условиях растительный материал может быть сохранен без изменений на протяжении долгого периода времени 121.

К недостаткам известного способа хранения относится его исключительное использование с целью долгосрочного хранения генетических ресурсов. Хранение с учетом системного применения биоматериала для поддержании активной коллекции и ускоренного клонального микроразмножения не целесообразно.

Задачей, на решение которой направлено изобретение, является консервация микрочеренков сортов картофеля с целью сохранения качественных характеристик in vitro материала для практичности их использования в реализации семеноводческих программ и тиражирования до необходимых объемов.

Технический результат достигается тем, что консервация микрочеренков картофеля в биокапсулах позволяет увеличить срок беспересадочного хранения биоматериала в активной коллекции in vitro и сохраняет возможность поддержания большого количества посадочных единиц, которые при необходимости могут быть использованы в программе клонального размножения и доведения до необходимых объемов микрорастений.

Для приготовления биокапсул используют стерильные лабораторные инструменты и посуду, автоклавированные составы питательных сред и дистиллированную воду. Маточные и питательные среды готовят на магнитных мешалках с обогревом.

Способ консервации оздоровленного in vitro материала картофеля характеризующийся тем, что предварительно готовят в дистиллированной воде маточные растворы (таб. 1) макросолей, содержащие 11,5 г/л NH₄H₂PO₄, 40,4 г/л KNO₃, 24,6 г/л MgSO₄⋅7H₂O; маточный раствор смеси микросолей, содержащий в 1 л дистиллированной воды 8,4 г MnSO₄⋅H₂O, 2,9 г ZnSO₄⋅7H₂O, 0,3 г CuSO₄⋅5H₂O, 6,2 г Н_{3 В}О₃, 0,3 г Na₂Mo₄-2H₂O, 0,03 г CoCl₂⋅6H₂O; маточный раствор витаминов, содержащий 0,8 г/л Ki, 10,0 г/л меоинозита, 1,0 г/л тиамина, 0,5 г/л никотиновой кислоты, 0,5 г/л пиридоксина; маточный раствор хелата железа, содержащий на 100 мл 557,0 мг FeSO₄⋅7H₂O и 745,0 мг трилон Б, затем для получения питательной среды 1 (таб. 2) маточные растворы смешивают в 100 мл рабочего раствора в количествах 2,0 мл NH₄H₂PO₄, 3,0 мл KNO₃, 3,0 мл MgSO₄⋅7H₂O 0,1 мл маточного раствора смеси микросолей, маточные растворы витаминов в количествах 1,0 мл меоинозита, по 0,1 мл Ki, тиамина, никотиновой кислоты, пиридоксина, маточный раствор хелата железа в количестве 5,0 мл; добавляют 2,0 г сахарозы и 3,0 г альгината натрия до получения однородной массы; затем готовят питательную среду 2 (таб. 3), смешивая маточные растворы макросолей в 200 мл рабочего раствора в количествах 4,0 мл NH₄H₂PO₄, 3,0 мл KNO₃, 3,0 мл MgSO₄⋅7H₂O, 0,2 мл маточного раствора микросолей, аналогичного раствору, используемому в приготовлении питательной среды 1, маточные растворы витаминов в количествах 2,0 мл меоинозита, по 0,2 мл Ki, тиамина, никотиновой кислоты, пиридоксина, маточный раствор хелата железа в количестве 1,0 мл; 3,0 г CaCl₂⋅2H₂O; добавляют 4,0 г сахарозы; питательные среды 1 и 2 автоклавируют при температуре 120-121°С в течении 20 мин, в работе их используют в холодном виде, при этом маточные и питательные среды хранят не более 6 месяцев при температуре 4°С; затем из микрорастений выделяют сегменты с пазушными почками не более 0,5 см и помещают в питательную среду 1 не более, чем на 10 мин, затем перемещают в питательную среду 2 на 15 мин, образовавшиеся капсулы пропускают через сито, промывают дистиллированной водой, размещают в стерильные чашки Петри, плотно закрывают парафильмом и хранят при 3-4°С и освещении 1-2 тыс.люкс.

Заключение биоматериала в оболочку из хлорида кальция способствует защите инкапсулируемого объекта от негативного воздействия окружающей среды и сохраняет его жизнеспособность к регенерации в течение определенного периода времени. Для таких целей целесообразно использовать специализированные инкубаторы, где поддерживается температурный и световой режим. Жизнеспособность инкапсулированных микрочеренков в такие условия сохраняется до двух лет. Альтернативным способом хранения могут оказаться бытовые холодильники, однако в отсутствие освещения период консервации не превышает одного года.

Для использования биокапсул в целях клонального микроразмножения необходимое количество чашек Петри перемещают в асептических условиях ламинар-бокса, где с соблюдением стерильности открывают и поочередно размещают биокапсулы в пробирки с питательной средой. После культивирования биокапсул на новую питательную среду пробирки

размещают в условиях фитотрона при 16-часовом (шестнадцати часовом) фотопериоде и 23-25°С. Регенерация микрорастений из биокапсул зависит от длительности периода хранения и сортовых особенностей законсервированных эксплантов.

Согласно требованиям действующего отраслевого стандарта /3/ от момента получения линии in vitro и до ее использования для высадки на субстрактах допускается проведение не более 10 (десяти) черенкований. При известном способе поддержание генетического материала в культуре in vitro в виде растущих микрорастений с периодичным депонированием и соблюдением требований отраслевого стандарта возможно использование биоматериала в семеноводческих программах не более двух лет. Внедрение метода биоинкапсуляции микрочеренков позволит сохранять сорта и использовать линии in vitro на семенные цели до 7-8 лет, увеличивая потенциал их сохранения и применения в 3-4 раза, соответственно.

Практическое применение нового метода хранения активной коллекции в виде биокапсул позволяет:

- уменьшить ежегодный объем проводимых работ в культуре ткани;

- минимизировать затраты на поддержание in vitro материала в виде растущих микрорастений;

- сократить периодичность черенкований и увеличить период использования линий in vitro материала;

- исключить снижение качественных характеристик при систематическом черенковании биоматериала;

- обеспечить сохранность здорового состояния исходного материала.

Разработанный способ хранения сортов картофеля в культуре in vitro в виде биокапсул относится к категории краткосрочного хранения и позволяет систематически включать нужные сорта в процесс клонального микроразмножения и тиражировать их до необходимых объемов.

Предложенный способ прост в исполнении, не требует дополнительных материальных вложений, сокращает затраты на поддержание коллекции in vitro и позволяет сохранить качество исходного оздоровленного материала картофеля.

Способ консервации оздоровленного in vitro материала картофеля

Источники информации

1. Westcott, R. J., 1981. Tissue-culture storage of potato germplasm. Minimal growth storage. Potato Research, 24 (3): 331-342.

2. Mix G., 1984. Long-term storage in vitro of potato gene material. Plant Research and Development. 19: 122-127.

3. Отраслевой стандарт OCT 10 004-93 «Картофель семенной оздоровленный исходный материал. Выращивание в условиях in vitro».

Способ консервации оздоровленного in vitro материала картофеля, характеризующийся тем, что предварительно готовят в дистиллированной воде маточные растворы макросолей, содержащие 11,5 г/л NH₄H₂PO₄, 40,4 г/л KNO₃, 24,6 г/л MgSO₄⋅7H₂O; маточный раствор смеси микросолей, содержащий в 1 л дистиллированной воды 8,4 г MnSO₄⋅H₂O, 2,9 г ZnSO₄⋅7H₂O, 0,3 г CuSO₄⋅5H₂O, 6,2 г Н₃ВО₃, 0,3 г Na₂Mo₄⋅2H₂O, 0,03 г CoCl₂⋅6H₂O; маточный раствор витаминов, содержащий 0,8 г/л Ki, 10,0 г/л меоинозита, 1,0 г/л тиамина, 0,5 г/л никотиновой кислоты, 0,5 г/л пиридоксина; маточный раствор хелата железа, содержащий на 100 мл 557,0 мг FeSO₄⋅7H₂O и 745,0 мг трилон Б, затем для получения питательной среды 1 маточные растворы смешивают в 100 мл рабочего раствора в количествах 2,0 мл NH₄H₂PO₄, 3,0 мл KNO₃, 3,0 мл MgSO₄⋅7H₂O, 0,1 мл маточного раствора смеси микросолей, маточные растворы витаминов в количествах 1,0 мл меоинозита, по 0,1 мл Ki, тиамина, никотиновой кислоты, пиридоксина, маточный раствор хелата железа в количестве 5,0 мл; добавляют 2,0 г сахарозы и 3,0 г альгината натрия до получения однородной массы; затем готовят питательную среду 2, смешивая маточные растворы макросолей в 200 мл рабочего раствора в количествах 4,0 мл NH₄H₂PO₄, 3,0 мл KNO₃, 3,0 мл MgSO₄⋅7H₂O, 0,2 мл маточного раствора микросолей, аналогичного раствору, используемому в приготовлении питательной среды 1, маточные растворы витаминов в количествах 2,0 мл меоинозита, по 0,2 мл Ki, тиамина, никотиновой кислоты, пиридоксина, маточный раствор хелата железа в количестве 1,0 мл; 3,0 г CaCl₂⋅2H₂O; добавляют 4,0 г сахарозы; питательные среды 1 и 2 автоклавируют при температуре 120-121°С в течение 20 мин, в работе их используют в холодном виде, при этом маточные и питательные среды хранят не более 6 месяцев при температуре 4°С; затем из микрорастений выделяют сегменты с пазушными почками не более 0,5 см и помещают в питательную среду 1 не более чем на 10 мин, затем перемещают в питательную среду 2 на 15 мин, образовавшиеся капсулы пропускают через сито, промывают дистиллированной водой, размещают в стерильные чашки Петри, плотно закрывают парафильмом и хранят при 3-4°С и освещении 1-2 тыс. люкс.