Тканеинженерная конструкция для восполнения объема костной ткани челюстно-лицевой области

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к тканеинженерной конструкции для восполнения объема костной ткани челюстно-лицевой области. Конструкция включает донорские мультипотенные мезенхимальные стромальные клетки на носителе, в качестве которого используют гранулы октакальций фосфата размером 150-200 мкм с размером пор 1-5 мкм, на поверхности которых инкубированы мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки, полученные из биоптата десны пациента и культивированные на среде водного золя нанокристаллического диоксида церия, стабилизированного ионами цитрата в концентрации (10-4)-(10-9) М, при этом концентрация мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток составляет 2×10⁷ клеток на 1 г носителя. Изобретение позволяет расширить арсенал технических средств.

 

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии и стоматологии, а именно к составу тканеинженерной конструкции для восполнения объема костной ткани челюстно-лицевой области.

Значительная атрофия костной ткани затрудняет лечение с использованием съемных протезов, ухудшается эстетический эффект при протезировании несъемными ортопедическими конструкциями. Зачастую становится невозможной стоматологическая реабилитация пациентов с применением дентальных имплантатов в виду недостаточного объема костной ткани. Обеспечение достаточного объема альвеолярной части челюстей перед имплантацией является основной задачей реконструктивных вмешательств с целью нормализации функционального состояния жевательного аппарата.

В реконструктивной хирургии чаще всего используют методику аутотрансплантации костной ткани. Однако этот метод имеет ряд ограничений, особенно при замещении дефектов костной ткани большого объема. Использование аутотрансплантатов, искусственных костнопластических материалов, факторов роста, тромбоцитарных концентратов не всегда дают хорошие результаты в клинической практике.

Зачастую полученный объем костной ткани недостаточен, требуется повторное хирургическое вмешательство, отмечается травматичность оперативного вмешательства. Таким образом, разработка эффективных средств и методов костной пластики, и создание оптимальных условий репаративногоостеогенеза является актуальной проблемой хирургической стоматологии.

Обогащенный лейкоцитами и тромбоцитами фибрин, представляющий собой аутологичный фибриновый сгусток (далее L-PRF), способен в зоне костной раны пролонгировано выделять факторы роста, лейкоциты, оказывая пролиферативный, ангиогенный и противовоспалительный эффекты. Отмечено сокращение сроков эпителизации лунок удаленных зубов при их заполнении обогащенным лейкоцитами и тромбоцитами фибриновым сгустком.

Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (далее ММСК) активно изучаются в течение последних десятилетий, являются оптимальной клеточной популяцией для создания тканеинженерныхконструкций. Аутогенные клетки не вступают в конфликт с собственной иммунной системой, не вызывают аллергических реакций. Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки, выделенные из биоптата десны, под воздействием индукционных факторов могут дифференцироваться в остеогенном, хондрогенном и адипогенном направлениях. Наличие прогенеторных клеток в ММСХ сливаются с резидентными клетками в тканях и за счет экспрессии маркерных антигенов дифференцируются в определенном направлении.

В результате проведенного патентно-информационного поиска были отобраны для последующего анализа следующие источники.

Известен пастообразный композиционный остеопластический материал (Патент РФ2653480). В частности в композиции для стимуляции регенерации костной ткани челюстей, содержится гидроксид кальция, сульфат бария и нанокристаллический диоксид церия в изотоническом растворе. Соотношение компонентов в композиции составляет 40-42 мас. % гидроксида кальция; не менее 8 мас. % сульфата бария; 0,3-2 мас. % нанокристаллического диоксида церия; остальное до 100 мас. % -изотонический раствор. Недостатком предложенной композиции является отсутствие в ее составе биологически активных веществ, существенно ускоряющих процесс регенерации.

Известен материал для восстановления костных структур (патент РФ №2399387), который содержит обогащенную тромбоцитами аутоплазму пациента, порошок никелида титана с размерами частиц до 100 нм, коллоидное 2,5% наноструктурированное серебро с размерами частиц до 20 нм. Способ получения известного материала заключается в том, что кровь пациента центрифугируют, отделяют плазму от сгустка крови, выделенный сгусток гомогенизируют, добавляют к нему коллоидное наноструктурированное серебро, порошок никелида и полученную после центрифугирования плазму.

Известен способ получения миобластов путем культивирования фибробластоподобных клеток, выделенных из слизистой оболочки полости рта человека, включающий: а) биопсию из слизистой оболочки полости рта человека; б) обработку биоптата, предусматривающую отмывку, измельчение, ферментативное расщепление ткани десны протеолитическими ферментами; в) культивирование выделенных из дезагрегированной ткани фибробластоподобных клеток на подходящей среде для получения культуры миобластов; г) иммунофенотипическое тестирование культуры миобластов на иммунофенотип и исключение вирусной и бактериальной контаминации. (пат. РФ №2576842). В данном патенте описан метод получение миогенных клеток (миобластов, предшественников миобластов) из нового, ранее не известного источника, а именно при культивировании фибробластподобных клеток, выделенных из слизистой оболочки полости рта (десны) человека.

Перечисленные выше материалы обладают рядом недостатков:

- композиционные материалы устойчивы к резорбции, содержат соединения неясного состава и биологического воздействия;

- материалы не обеспечивают стабильности физико-химических условий в области раны, что делает возможным резкие изменения скорости и направления течения процессов резорбции и регенерации;

- не обеспечивают выраженного остеогенетического эффекта на ранних стадиях регенерации костной ткани.

Известен биотрансплантат, выбранный в качестве прототипа для лечения дегенеративных и травматических заболеваний костной ткани челюстно-лицевой области (патент РФ №2380105), характеризующийся тем, что содержит аутологичные или донорские мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (ММСК) из костного мозга или жировой ткани взрослых доноров, которые распределены в фибриновом сгустке в концентрации 5-7 млн клеток в 1 мл, представляющем собой полимеризованную обогащенную тромбоцитами плазму крови пациента, и матрицу-носитель (в виде крошки, стружки), имеющую в основе своей структуры коллаген-минеральный комплекс, идентичный по составу натуральному костному материалу. Недостатком является недостаточная эффективность восстановления костной ткани, а также существует риск инфицирования прионами и возникновения иммунного ответа у пациента из-за использования эмбриональной телячьей сыворотки в составе культуральной среды. В этом же патенте описан способ получения биотрансплантата для лечения дегенеративных и травматических заболеваний костной ткани по п. 1, характеризующийся тем, что выделенные из костного мозга или жировой ткани ММСК, ферментативно дезагригируют трипсином и вносят из расчета 5-7 млн клеток на 1 мл аутогенной обогащенной тромбоцитами плазмы, перемешивают, при необходимости с добавлением дополнительных компонентов, полученную суспензию смешивают с материалом матрицы-носителя, представляющей собой коллаген-минеральный комплекс в виде блоков, стружки или крошки, отмытым раствором Хэнкса с цефазолином (1 г/Л), затем по каплям добавляют раствор тромбина 50 Ед/мл на 10% растворе хлорида кальция до загустевания и полимеризуют при температуре 37°С в течение 30-40 мин, полученный трансплантат культивируют при 37°С в течение от 3 до 30 сут в остеогенной культуральной среде.

Задачей предлагаемого технического решения является повышение эффективности хирургического лечения пациентов хирургического профиля путем совершенствования костнопластических операций за счет применения новых тканеинженерных конструкций.

Техническим результатом является возможность использования обогащенного лейкоцитами и тромбоцитами фибрина, полученного из крови пациента известным способом, в составе тканеинженерной конструкции, использование ММСК, выделенных из биоптата десны пациента, использование в качестве носителя октакальций фосфата (ОКФ), обладающего хорошей резорбцией, биосовместимостью, имеющего развитую пористую поверхность, с культивированием на среде, содержащей цитратный нанодисперсный CeO₂, обладающий высокой антиоксидантной активностью. Доказана эффективность применения предлагаемой тканеинженерной конструкции. Использование конструкции в таком составепозволит существенно снизить риск осложнений и сократить период реабилитации пациентов после хирургического устранения дефектов челюстных костей.

Техническая сущность предлагаемого решения заключается в использовании тканеинженерной конструкции для восполнения объема костной ткани челюстно-лицевой области, включающей донорские мультипотенные мезенхимальные стромальные клетки, обогащенную тромбоцитами плазму крови пациента и носитель. В качестве носителя используют гранулы октакальцийфосфата размером 150-250 мкм, на поверхности которых инкубированы мультипотентные мезенхимальные стромальным клетки, полученные из биоптата десны пациента, из расчета 2×10⁷ клеток на 1 г носителя.

И также в использовании способа получения тканеинженерной конструкции характеризующегося тем, что культивирование мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток осуществляют с использованием в качестве культуральной среды водного золя нанокристаллического диоксида церия, стабилизированного ионами цитрата в концентрации (10-4)-(10-9) М, затем полученные мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки смешивают с гранулами октакальцийфосфата из расчета 2×10⁷ клеток на 1 г носителя и инкубируют при 37°С и 5% CO₂ в течение 24 часов, после чего тканеинженерную конструкцию используют по назначению.

Использование исследуемой тканеинженерной конструкции ускоряет процесс остеорепарации и способствует послеоперационной реабилитации пациентов при следующих вмешательствах: увеличения объема костной ткани по ширине и высоте; синус-лифтинг; консервация лунок после удаления; заполнение костных дефектов при цистэктомии.

Тканеинженерная конструкция рекомендована к клиническому применению при реконструктивных хирургических вмешательствах.

Использование мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток, выделенных из слизистой оболочки полости рта, представляется более удобным ввиду доступности тканевого источника и минимальной инвазивности забора биоптата.

Применение (L-PRF) тканеинженерной конструкции позволяет снизить послеоперационные осложнения, сократить сроки реабилитации пациента в послеоперационном периоде.

Предлагаемое техническое решение иллюстрируется следующей методикой получения тканеинженерной конструкции.

1. Подготовка аутологичного фибринового сгустка (L-PRF) по стандартной методике.

У пациентов из локтевой вены проводился забор венозной крови в стерильные одноразовые стеклянные вакуумные пробирки объемом 9 мл. Непосредственно после забора крови пробирки помещались в центрифугу. Процесс центрифугирования проходил в заданном режиме: 1300 оборотов в течение 8 минут. После этого в пробирках формировались три слоя - плазма крови, тромбоциты и лейкоциты в структуре фибринового сгустка, и эритроциты, осажденные на дне пробирки. Затем из пробирок с использованием прямого пинцета отбирали богатый лейкоцитами и тромбоцитами фибриновый сгусток, помещали в стерильную чашку и использовали сразу или в течение нескольких часов. Фибриновый сгусток (L-PRF) мелко диспергировали и смешивали с тканеинженерной конструкцией.

2. Подготовка водного золя нанокристаллического диоксида церия, стабилизированного ионами цитрата.

Этот золь был получен путем растворения 0,24 г лимонной кислоты в 25 мл 0,05 М водного раствора нитрата церия(III), который затем быстро добавлялся при перемешивании к 100 мл 3 М раствора аммиака и затем выдерживался в течение 2 часов. Просвечивающая электронная микроскопия показала, что золь состоит из слабо агрегированных почти изотропных частиц CeO2 размером 2-3 нм. Значение рН золя находилось в диапазоне 7,2-7,4. Средний гидродинамический радиус наночастиц CeO2, определенный методом динамического рассеяния света с помощью субмикронного анализатора размера частиц N5 «BeckmanCoulter» (США), составил 2-3 нм. (Шекунова Т.О. Синтез, биологическая и фотокаталитическая активность золей диоксида церия, стабилизированных цитрат-ионом / Т.О. Шекунова, Д.О. Гиль, О.С.Иванова, В.К. Иванов, Ю.Д. Третьяков // Наносистемы: физика, химия, математика. 2013. Т. 4. №1. С. 83-89).

3. Культивирование аутологичных ММСК слизистой оболочки полости рта.

Биоптат десны помещен в стандартную ростовую среду для транспортировки с последующим культивированием из него клеточной популяции. Затем проводят инкубацию при +4°С не менее 8 часов. В качестве культуральной среды использовали водный золь нанокристаллического диоксида церия, стабилизированного ионами цитрата в концентрациях (10-4)-(10-9) М.

Проведена экспансия клеток по стандартной методике культивирования ММСК. При достижении монослоем 70-80% конфлуэнтности клетки двукратно отмывали стерильным раствором фосфатно-солевого буфера, сняли с поверхности флаконов 0,05% раствором трипсина-ЭДТА (инкубация в течение 2-3 минут), активность трипсина блокировали добавлением 3-5 мл отмывочной среды. Открепившиеся ММСК были собраны в стерильные пробирки, центрифугированы и пересеяны с плотностью около 10⁴ клеток на см². Далее ММСК культивировали до достижения необходимого количества, но не более 4 пассажей.

4. Подготовка тканеинженерной конструкции на октакальцийфосфатном носителе к трансплантации.

Гранулы синтетического октакальцийфосфата размером 150 -250 мкм были помещены в чашку Петри (d=94) таким образом, чтобы они образовали линию. Клеточную суспензию(1 мл) по каплям переносили по линии на гранулы ОКФ из расчета 2×10⁷ клеток на 1 г носителя. Затем в чашке Петриаутологичные ММСК инкубировались при 37°С и 5% CO₂ в течение 24 часов. (надо смешать гранулы с ММСК из расчета 2×10⁷ клеток на 1 г носителя)

После инкубирования композитную тканеинженерную конструкцию, состоящую из носителя (октакальцийфосфата) и аутологичных ММСК десны, трижды отмывали от культуральной среды стерильным раствором фосфатно-солевого буфера и ресуспендировали в 0,5 мл физиологического раствора, помещали в стерильные пробирки с номером, соответствующим коду донора, и транспортировали в клинику в медицинском термоконтейнере при комнатной температуре.

Для обеспечения оптимальной жизнеспособности клеток тканеинженерную конструцию рекомендовано использовать в течение 12 часов с момента нанесения клеток на носитель.

На основании данных иммунофенотипирования, подсчета колониеобразующих единиц, данных о культивировании, характеристиках композитной тканеинженерной конструкции составляется паспорт клеточного продукта и тканеинженерной конструкции перед каждым применением.

Выводы

- мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки, полученные из биоптата десны пациента, характеризуются высокой пролиферативной и секреторной активностью, а также способностью к дифференцировке в остеобластическом направлении;

- совершенствование свойств материалов на основе октакальций фосфатов может быть осуществлено при использовании биотехнологии, позволяющей сформировать на поверхности гранул слой мезенхимальных клеток, выделенных и культивированных из биоптата слизистой оболочки полости рта;

- объем вновь образованной ретикулофиброзной и пластинчатой костной ткани в периферической и центральной зонах костных дефектов превышает показатели контрольных групп в связи с выраженным остеоиндуктивным действием тканеинженерной конструкции, благодаря которой они индуцируют образование костного регенерата не только со стороны краев костного дефекта, но и в его центре;

- оптимизированые условия для образования химических связей между носителем ОКФ и ММСК десневого происхождения позволяют создать единый комплекс - тканеинженерный остеопластический материал;

- использование тканеинженерной конструкции способствует сокращению сроков эпителизации послеоперационных ран, лунок удаленных зубов;

- октакальцийфосфат не оказывает цитотоксического действия на ММСК десневого происхождения.

Тканеинженерная конструкция для восполнения объема костной ткани челюстно-лицевой области, включающая донорские мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки на носителе, в качестве которого используют гранулы октакальций фосфата размером 150-200 мкм с размером пор 1-5 мкм, на поверхности которых инкубированы мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки, полученные из биоптата десны пациента и культивированные на среде водного золя нанокристаллического диоксида церия, стабилизированного ионами цитрата в концентрации (10-4)-(10-9) М, при этом концентрация мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток составляет 2×10⁷ клеток на 1 г носителя.