N-ацилгидразон фенхона с фрагментом эпоксиизоиндола, используемый в качестве ингибитора репродукции вируса хантаан
Владельцы патента RU 2733472:
Федеральное бюджетное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора) (RU)
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Новосибирский институт органической химии им. Н.Н. Ворожцова Сибирского отделения Российской академии наук (НИОХ СО РАН) (RU)
Изобретение относится к производному эпоксиизоиндола формулы I и может быть использовано в медицине, фармакологии и вирусологии. Технический результат – соединение формулы I в качестве ингибитора репродукции вируса Хантаан. 1 табл., 3 пр.
Изобретение относится к химии и медицине, а именно к лекарственному средству формулы I:
,
у которого выявлена биологическая активность, заключающаяся в ингибировании репродукции вируса Хантаан 76-188. Данное соединение I может использоваться в качестве ингибитора репродукции вируса Хантаан и может быть применено в медицине, вирусологии и фармакологии.
Геморрагическая лихорадка с почечным синдромом (ГЛПС) (синонимы: геморрагический нефрозонефрит, болезнь Чурилова, эпидемический нефрозонефрит, дальневосточная геморрагическая лихорадка, корейская геморрагическая лихорадка, маньчжурская геморрагическая лихорадка, скандинавская эпидемическая нефропатия, тульская лихорадка; hemorrhagic fever with renal syndrome) - острое вирусное природно-очаговое заболевание, характеризующееся системным поражением мелких сосудов, геморрагическим диатезом, гемодинамическими расстройствами и своеобразным поражением почек с развитием острой почечной недостаточности. За последние десятилетия хантавирусные болезни включены в круг весьма актуальных и приоритетных проблем во всем мире, так называемых emerging (непредсказуемых) инфекций, грозящих сложными эпидемическими ситуациями. Это обусловлено изменчивостью генома хантавирусов, а, следовательно, чревато появлением новых типов и генетических вариантов в новых регионах мира с высокой вирулентностью для человека.
Возбудитель ГЛПС относится к семейству буньявирусов (Bunyaviridae) и принадлежит к самостоятельному роду - Hantavirus. Репликация его осуществляется в цитоплазме инфицированных клеток. К настоящему времени известно более 30 серологически и генетически отличающихся друг от друга хантавирусов. Описаны две клинические формы хантавирусной инфекции у людей:
- геморрагическая лихорадка с почечным синдромом, возбудителем которой является вирусы Hantaan, Seul, Puumala, Dobrava/Belgrade, Seoul, Amur;
- хантавирусный пульмональный синдром, впервые описан в США в 1993 г., вызывается хантавирусами Sin-Nombre, BlackCreek, NewYork, Bayou, Andes, LagunaNegra.
В европейском регионе регистрация заболеваемости ГЛПС ведется с 1963 года. Случаи заболевания ГЛПС регистрируются ежегодно, в основном в странах Северной и Центральной Европы, на Балканском полуострове и в Скандинавии. За последнее десятилетие с 2009 по 2018 гг. зарегистрировано 29 472 случая заболевания ГЛПС в 29 странах региона. В среднем, в год регистрировалось 2900 случаев заболевания. Основная доля заболевших зарегистрирована в Финляндии (75,9%) и Германии (12,9%). В Западно-Тихоокеанском регионе болезнь широко распространена в Китае. Эндемична вся территория страны, за исключением тайваньского региона. Ежегодно, на долю Китая приходится 90% от всей заболеваемости ГЛПС в мире. С 2000 года ежегодное число случаев заболевания ГЛПС сократилось более чем в 3 раза - с 37 814 в 2000 году до 11 248 в 2007 году. С 2009 по 2018 гг. ежегодное число случаев заболевания колебалось от 9000 до 25000.
В Российской Федерации в настоящее время ГЛПС является актуальной природно-очаговой болезнью вирусной этиологии. С момента начала официальной регистрации заболевания в стране (1978 г.) по настоящее время, зарегистрировано свыше 265 000 случаев заболевания ГЛПС. Большая часть из которых зарегистрирована на территории Европейской части страны. На европейские очаги России, в разные годы приходилось от 80 до 95% случаев заболевания ГЛПС от общероссийских показателей. Самые активные очаги ГЛПС располагаются в Приволжском федеральном округе, именно на эти регионы ежегодно приходится до 90% от общей заболеваемости ГЛПС по стране.
Границы природных очагов ГЛПС расширяются, постепенно вовлекая в этот процесс территории, ранее считавшиеся свободными от ГЛПС. В настоящее время обнаружены новые очаги хантавирусной инфекции в Республике Алтай, Новосибирской, Иркутской и Кемеровской областях. В 2018 году в Российской Федерации зарегистрировано 5855 случаев заболевания ГЛПС.
Тяжесть течения болезни, и исход зависит от этиологии заболевания. Примерно у четверти больных ГЛПС-Пуумала протекает в легкой форме, у половины больных - в среднетяжелой и еще у четверти - в тяжелой форме. Геморрагический синдром встречается у 14-20% пациентов с ГЛПС-Пуумала. Летальность при ГЛПС-Пуумала составляет 0,4-1%. Заболевание ГЛПС-Хантаан протекает тяжелее, чем ГЛПС-Пуумала: более чем у трети пациентов заболевание протекает в тяжелой форме, геморрагический синдром наблюдается почти у половины пациентов. Летальность при ГЛПС-Хантаан составляет 5-10%. ГЛПС-Сочи регистрируется в субтропической зоне Краснодарского края и представляет собой наиболее тяжелую форму ГЛПС из регистрируемых к настоящему времени этиологических форм болезни. Более половины пациентов с ГЛПС-Сочи переносят заболевание в тяжелой форме и имеют выраженные геморрагические проявления. Летальность при ГЛПС-Сочи составляет 11-14%.
Основным путем заражения является воздушно-пылевой, при котором вирус, содержащийся в биологических выделениях грызунов, в виде аэрозоля попадает через верхние дыхательные пути в легкие человека, где условия для его размножения наиболее благоприятны, и затем с кровью переносится в другие органы и ткани. Заражение возможно также через поврежденную кожу при контакте с экскрементами инфицированных грызунов или со слюной в случае укуса зверьком человека. Случаев заражения и передачи возбудителя ГЛПС от человека к человеку за всю историю изучения этой инфекции не зафиксировано. У человека абсолютная восприимчивость к возбудителю этой инфекции.
Несмотря на тяжесть протекания этой болезни и широкое распространение, специфической противовирусной терапии на данный момент нет. Лечение может проводиться препаратом широкого спектра действия - рибавирином; при этом на ранней стадии болезни двумя препаратами рибавирина - виразолом внутривенно в дозе 16 мг/кг 4 раза в сутки 3 дня (внутривенное введение) с последующим приемом внутрь рибавирина по 1000 мг в сутки до 5 дней [«Геморрагическая лихорадка с почечным синдром у взрослых» Клинические рекомендации. Рассмотрены и рекомендованы к утверждению Профильной комиссией по инфекционным болезням Минздрава России 2014]. В отечественной клинической практике этиотропная терапия ГЛПС не укрепилась, учитывая неэффективность противовирусных препаратов в более поздние сроки болезни, когда госпитализируется большая часть пациентов с тяжелыми формами инфекции, и ее исход определяет не вирусная нагрузка, а полиорганная недостаточность и неотложные состояния. Современные клинические исследования (плацебо-контролируемые, с двойным слепым контролем) показали неэффективность рибаверина в лечении ГЛПС [Mertz, G.J., Miedzinski, L., Goade, D., Pavia, А. Т., Hjelle, В., Hansbarger, С.O., Levy, H., Koster, F.Т., Baum, K., Lindemulder, A., Wang, W., Riser, L., et al. (2004). Placebocontrolled, double-blind trial of intravenous ribavirin for the treatment of hantavirus cardiopulmonary syndrome in North America. Clin. Infect. Dis. 2004, Vol. 39, 1307-1313].
Наиболее близким к заявляемому соединению - прототипом, является Триазаверин II.
Указанное соединение - натриевая соль 2-метилтио-6-нитро-1,2,4-триазоло[5,1-с]-1,2,4-триазин-7-она дигидрата может использоваться для профилактики и лечения вирусных заболеваний и состояний, вызванных вирусом Хантаан или вирусом восточного энцефаломиелита лошадей («Противовирусное средство и способ профилактики и лечения вирусных инфекций» патент RU №2457844, МПК A61K 31/53, опубл. 10.08.2012 г.). Недостатком известного соединения является невысокая противовирусная активность на животных моделях.
Задачей изобретения является создание нового эффективного ингибитора репродукции вируса Хантаан, вызывающего ГЛПС.
Технический результат: повышение эффективности подавления репродукции вируса Хантаан и расширение ассортимента ингибиторов репродукции данного вируса.
Поставленная задача решается использованием нового соединения формулы I, обладающего выраженными свойствами ингибитора репродукции вируса Хантаан. 
Соединение формулы I после проведения углубленных фармакологических исследований, может быть использовано, как в чистом виде, так и в качестве компонента новых низкотоксичных высокоэффективных против вируса Хантаан лекарственных форм.
Исследования биологической активности агента I, проведенные с использованием МТТ теста в отношении вируса Хантаан штамм 76-188, показали высокую эффективность данного вещества в качестве ингибитора репродукции вируса.
Синтез соединения проводили по схеме 1. Ход реакций отслеживали отбором проб и анализом хромато-масс спектров. По описанной в литературе методике [
, 
, 
, Rak J., 
, 
,
,
, 
Synthesis and biological activity evaluation of hydrazone derivatives based on a 
base skeleton, Bioorg. Med. Chem. 2015, Vol. 23, 1651-1659] получали гидразон фенхона III.Синтез эпоксизоиндольной кислоты формулы IV описан ранее в литературе [F. I. Zubkov, V. P. Zaytsev, Е. V. Nikitina, V. N. Khrustalev, S. V. Gozun, E. V. Boltukhina, A. V. Varlamov. "Skeletal Wagner-Meerwein rearrangement of perhydro-3a,6;4,5-diepoxyisoindoles". Tetrahedron 2011, Vol. 67, №47, 9148-9163], взаимодействие кислоты IV с этилхлорформатом приводит к смешанному ангидриду V, реакция последнего без дополнительного выделения с гидразоном III приводит к целевому агенту I.
Спектральные исследования выполнены в Химическом Сервисном Центре коллективного пользования СО РАН. Спектры ЯМР 1Н и 13С регистрировали на спектрометрах Bruker AV-400 (1Н: 400.13 МГц, 13С: 100.61 МГц), DRX-500 (1Н: 500.13 МГц, 13С: 125.76 МГц) и AV-600 (1Н: 600.30 МГц, 13С: 150.95 МГц). В качестве внутреннего стандарта использовали остаточные сигналы растворителя - хлороформа (1Н 7.24, 13С 76.90 м.д.). Отнесение сигналов в спектрах ЯМР проводилось с привлечение стандартных одномерных и двумерных экспериментов. Нумерация атомов в соединении дана для отнесения сигналов в спектрах ЯМР и не совпадает с нумерацией атомов в номенклатурном названии. Хромато-масс-спектры записывали на газовом хроматографе Agilent 7890 А с квадрупольным масс-спектрометром Agilent 5975С в качестве детектора, кварцевая колонка НР-5MS 300000.25 мм, газ-носитель - гелий. Растворители перед использованием сушились и перегонялись.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1. Методика синтеза соединения I.
Карбоновую кислоту (3.0 ммоль) IV растворяли в хлороформе (100 мл) с добавлением (0.44 мл, 3.2 ммоль) триэтиламина, затем по каплям добавляли раствор этилхлорформиата (0.28 мл, 3.0 ммоль) в хлороформе (30 мл). Реакционная смесь перемешивалась на магнитной мешалке при комнатной температуре в течение 15 мин, после чего добавляли по каплям раствор гидразона фенхона III (0.5 г, 3.0 ммоль) в хлороформе. Реакционную смесь перемешивали в течение 4 часов, после чего промывали водой (3×10 мл). Органический слой сушили над прокаленным Na2SO4 в течение 5 ч. Растворитель упаривали на ротационном испарителе. Полученный продукт выделяли с помощью колоночной хроматографии на силикагеле, в качестве элюента была использована система хлороформ/метанол.
6-Метил-1-оксо-2-фенил-N'-[(2Z)-1,3,3-триметилбицикло[2.2.1]гепт-2-илиден]-1,2,3,6,7,7а-гексагидро-3а,6-эпоксиизоиндол-7-карбогидразид (I).
Выход 80%.
ЯМР 1Н (400 МГц, CDCl3, δ, м. д.): 1.33-1.58 (2Н, m, 2Н-2), 1.68-1.74 (1H, m, Н-3), 1.60-1.66 (1Н, m, Н-3), 1.64-1.66 (1Н, m, Н-4), 1.23-1.63 (2Н, m, 2Н-7), 1.07 (3Н, s, Ме-8), 1.25 (3Н, s, Ме-9), 1.13 (3Н, s, Ме-10), 3.91-3.96 (1Н, m, Н-12), 2.91 (1Н, d, J=3.9, Н-13), 4.15-4.19 (1Н, m, Н-15), 4.35-4.40 (1Н, m, Н-15), 6.62 (2Н, d J=5.6, Н-17), 6.28 (1Н, d, J=5.6, Н-18), 7.26-7.31 (2Н, m, Н-22, Н-26), 7.54-7.61 (2Н, m, Н-23, Н-25), 7.05-7.10 (1Н, m, Н-24), 1.64, 1.62 (3Н, s, Ме-20). ЯМР 13С (125 МГц, CDCl3, δ, м.д.): 167.31 (С-6), 50.98 (С-1), 33.91 (С-2), 24.83 (С-3), 49.60 (С-4), 42.34 (С-5), 42.59 (С-7), 23.20 (С-8), 23.03 (С-9), 16.98 (С-10), 165.29 (С-11), 43.46 (С-12), 54.73 (С-13), 170.91 (С-14), 50.17 (С-15), 86.75 (С-16), 136.33 (С-17), 140.43 (С-18), 89.39 (С-19), 139.10 (С-21), 128.43 (С-22, С-26), 120.18 (С-23, С-25), 124.28 (С-24), 15.77 (С-20). Найдено: m/z 433.2356 [M]+C26H31O3N3. Вычислено: М=433.2360.
Пример 2.
Определение цитотоксичности соединений на клетках линии 293FT.
Стоковый раствор соединения I в ДМСО (в концентрации 100 мМ) добавлялись в ростовую среду к клеткам-мишеням линии 293FT в различных концентрациях - от 10 мкМ до 500 мкМ - на 48 ч. По окончании инкубации клеток с веществом, к культурам клеток добавляли тетразолиевый краситель МТТ (3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-тетразолиум бромид) до рабочей концентрации 0.5 мг/мл и инкубировали в течение 4 ч. Образующийся осадок формазана растворяли добавлением в ростовую среду 10% раствора додецилсульфата натрия с 0.01М соляной кислотой. Количество формазана (пропорциональное количеству жизнеспособных клеток) определяли спектрофотометрически, измеряя абсорбцию при длине волны света 570 нм. Процент жизнеспособных клеток в культурах, содержащих разные концентрации исследуемого вещества I определяли по отношению к контролю (который представлял собой культуру клеток 293FT, инкубируемую в ростовой среде с ДМСО в отсутствие соединений), пользуясь формулой
% жизнеспособных клеток[1]=ОП [1]/ОП[ДМСО].
За величину CD50 (50% цитотоксическая концентрация) принимали концентрацию вещества, при которой выживало 50% клеток по сравнению с контролем.
Пример 3.
Определение противовирусного действия соединения I в отношении вируса Hantaan 76-188 in vitro на культуре клеток Vero.
В работе был использован вирус Hantaan 76-188, полученный из Государственной коллекции возбудителей вирусных инфекций и риккетсиозов ФБУН ГНЦ БВ «Вектор» Роспотребнадзора в виде культуральной жидкости (титр вируса 2,5 lgTCD50/ml).
Определение эффективных (IC50) концентраций соединений было проведено в тесте снижения цитопатического действия вируса HantaanHa клетки в трех повторах. Метод основан на способности жизнеспособных клеток поглощать и накапливать суправитальный краситель нейтральный красный. Культура клеток Vero была выращена в 96 - луночных культуральных планшетах с конфлюэнтностью не менее 90%. Готовили последовательные трехкратные разведения соединений, начиная с концентрации 150 мкг/мл. В эксперименте использовали вирус Hantaan в дозе 10 TCD50 на лунку.
Определение ингибирующей активности и токсической концентрации соединения проводили одновременно. Для этого в культуральный планшет с монослоем клеток вносили разведения соединений, затем вносили поддерживающую среду без вируса (для определения токсической концентрации соединений) и жидкость содержащую вирус (для определения ингибирующей активности соединений). Культуральные планшеты инкубировали при 37°С в течение 10 суток, затем окрашивали МТТ. Учет результатов проводили на планшетном анализаторе (Thermo Scientific Multiskan FC), обработку данных осуществляли при помощи программы SOFTmax PRO 4.0 с использованием 4-х параметрического метода анализа. Для всех исследованных соединений определены 50% токсическая концентрация (CD50) и концентрации 50% ингибирования (IC50). В дальнейшем, для каждого соединения рассчитывался индекс селективности (SI) - отношение токсичности соединения и ингибирующей активности против вируса Hantaan (CD50 / IC50) (табл.1).
Из таблицы 1 видно, что индекс селективности (SI) заявляемого соединения в 5 раз выше соединения-прототипа (триазаверина).
N-Ацилгидразон фенхона с фрагментом эпоксиизоиндола формулы I:
,
используемый в качестве ингибитора репродукции вируса Хантаан 76-188.
