Способ оценки токсического действия биметаллического феррум-гадолиниевого нанокомпозита, инкапсулированного в природную полимерную матрицу арабиногалактана, на лабораторных животных

Авторы патента:

Владельцы патента RU 2733504:

Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Восточно-Сибирский институт медико-экологических исследований" (RU)

Изобретение относится к области экспериментальной медицины, общей токсикологии и нанотоксикологии и касается критериев диагностики токсического действия биметаллических нанокомпозитов, инкапсулированных в природную полимерную матрицу арабиногалактана. Способ оценки токсического действия биметаллического феррум-гадолиниевого нанокомпозита, инкапсулированного в природную полимерную матрицу арабиногалактана, на лабораторных животных заключается в том, что токсикант животным опытной группы вводят перорально в дозе 500 мкг/кг в течение 10 дней, дистиллированную воду животным контрольной группы вводят перорально по 0,5 мл на протяжении 10 дней, изготавливают срезы коры головного мозга, одну часть срезов тканей коры головного мозга животных контрольной и опытной групп окрашивают гематоксилином и эозином, другую - на антитела к белку теплового шока 70, проводят обзорную микроскопию полученных препаратов, подсчитывают на единицу площади среза количество клеток астроглии и количество нейронов с экспрессией белка теплового шока 70, сравнивают полученные показатели обеих групп животных и при снижении числа клеток астроглии в 1,16 раза и увеличении числа нейронов сенсомоторной коры с экспрессией белка теплового шока 70 в 11,5 раз в опытной группе по сравнению с контрольной делают заключение о развитии патологического процесса в ткани сенсомоторной коры головного мозга при воздействии биметаллического феррум-гадолиниевого нанокомпозита, инкапсулированного в природную полимерную матрицу арабиногалактана. 1 табл.

Установлено, что применение чистого гадолиния в высоких концентрациях приводит к кумуляции его в организме, развитию нефротоксических и нейротоксических эффектов, панкреатиту, гемолизу эритроцитов и, в ряде случаев, развитию анафилактической реакции [1-4]. Одним из способов решения данной проблемы является применение гадолиния в наноформе [5]. Способность наночастиц металлов создавать агломераты явилась одной из причин разработки биметаллического нанокомпозита железо-гадолиний - Fe-Gd, инкапсулированного в природную полимерную матрицу арабиногалактана (АГ), не подверженного агломерации.

Для вновь синтезированных нанокомпозитов металлов необходимо проведение исследования их токсичности. В литературе встречаются исследования, в которых показано, что нанопрепараты оксида гадолиния обладают цитотоксическими свойствами [6-12]. Они способны ингибировать экспрессию антиапоптотитческого белка Bcl-2 и одновременно усиливать экспрессию проапоптотического белка Вах, подавляющего защитные функции Вс1-2, что приводит к развитию в клетке апоптоза [13, 14].

Известен способ диагностики ртутной энцефалопатии у мелких лабораторных животных, включающий проведение обзорной микроскопии срезов головного мозга животных, с изучением соотношения количества измененных и неизмененных нейронов и электронной микроскопии с определением степени увеличения площади ядра нейронов на препаратах животных опытной и контрольной групп. Данный способ предназначен для определения изменений в клетках животных, подвергавшихся воздействию ртути [15].

Известен способ оценки токсического действия наночастиц серебра, инкапсулированных в полимерную матрицу арабиногалактана (АГ), на ткань головного мозга крыс в отдаленном периоде, включающий внутрижелудочное введение препарата в организм животных, последующую декапитацию, изготовление срезов коры головного мозга, их окрашивание на антитела к белку caspase-3, проведение обзорной микроскопии полученных препаратов, при которой подсчитывают количество патологически измененных нейронов без экспрессии каспазы 3, число патологически измененных нейронов с экспрессией каспазы 3, количество нормальных нейронов без экспрессии каспазы 3, количество нормальных нейронов с экспрессией каспазы 3, общее количество нейронов на единицу площади среза, после чего по изменению количества названных показателей в опытной и контрольной группах делают заключение о развитии патологического процесса [16].

Задачей изобретения является разработка технологии оценки последствий воздействия биметаллического феррум-гадолиниевого нанокомпозита, инкапсулированного в природную полимерную матрицу арабиногалактана на экспериментальных животных и расширение арсенала методов оценки патологических нарушений у экспериментальных животных.

Поставленная задача решается путем проведения гистологического и иммуногистохимического анализа ткани головного мозга белых крыс после воздействия биметаллического нанокомпозита, содержащего наночастицы железа и гадолиния, инкапсулированных в природную полимерную матрицу арабиногалактана, с последующей морфометрической обработкой и интерпретацией полученных результатов.

Способ осуществляется следующим образом: животным опытной группы перорально с помощью зонда вводят биметаллический нанокомпозит в дозе 500 мкг/кг в течение 10 дней. Животным контрольной группы также перорально с помощью зонда давали дистиллированную воду. После окончания воздействия, животных опытной и контрольной групп декапитируют. Затем, готовят срезы тканей сенсомоторной коры головного мозга обеих групп.m,Далее, часть срезов окрашивают гематоксилином и эозином по общепринятой методике [17], другую часть срезов окрашивают на антитела к белкам теплового шока 70 (БТШ 70). При проведении обзорной микроскопии определяют на единицу площади количество нейронов с экспрессией БТШ 70 и клеток астроглии. Вычисляют изменение количества нейронов с экспрессией БТШ 70 и клеток астроглии в препаратах опытной группы относительно аналогичных показателей в препаратах контрольной группы. При снижении числа клеток астроглии в 1,16 раза в опытной группе по сравнению с контрольной группой и увеличении числа нейронов с экспрессией БТШ 70 в опытной группе в 11,5 раз по сравнению с контрольной группой, делают заключение о развитии патологического процесса в ткани сенсомоторной коры головного мозга.

Предлагаемый способ отличается от прототипа [16] критериями морфометрических изменений в нейронах сенсомоторной коры головного мозга, с помощью которых диагностируют поражение ткани головного мозга при воздействии биметаллического феррум-гадолиниевого нанокомпозита, инкапсулированного в природную полимерную матрицу арабиногалактана.

Таким образом, заявленное изобретение соответствует критериям изобретения «новизна» и «изобретательский уровень», так как оно явным образом не следует для специалиста из уровня техники. Предлагаемое изобретение соответствует критерию «промышленная применимость», так как оно может использоваться в экспериментальной медицине (токсикологии, фармакологии, патологической физиологии, патологической анатомии) для верификации моделирования патологических состояний центральной нервной системы животных. Технология оценки безопасности нанопрепаратов, основанная на морфологическом анализе структурных изменений внутренних органов и тканей организма и молекулярной диагностике экспрессии внутриклеточных белков, позволит не допускать к производству и применению лекарственные формы и диагностические препараты, способные вызывать отдаленные последствия воздействия.

Для определения информативных морфометрических критериев для определения токсичности биметаллического феррум-гадолиниевого нанокомпозита проведен эксперимент на 20 особях беспородных белых крыс-самцов массой от 200 до 260 грамм

Животным опытной группы (10 особей) перорально, через зонд, на протяжении 10 дней вводили водный раствор биметаллического нанокомпозита, инкапсулированного в природную полимерную матрицу арабиногалактана (АГ Fe-Gd)) из расчета 500 мкг/кг. Животные контрольной группы (10 особей) получали на протяжении 10 дней перорально с помощью зонда 0,5 мл дистиллированной воды. После окончания воздействия животные были декапитированы. После декапитации головной мозг от каждого исследуемого животного был извлечен и фиксирован в нейтральном буферном растворе формалина (10%), обезвожен этанолом восходящей концентрации (70, 80, 90, 95 и 100%) и помещен в гомогенизированную парафиновую среду для гистологических исследований HistoMix (BioVitrum, Россия). Далее, с помощью микротома МС-1 (Россия), изготавливались срезы толщиной 4-5 мкм. Для исследования биологического ответа организма на субклеточном уровне применяли иммуногистохимический метод определения активности проапоптотического белка caspase 3 (NeoMarkers, США), антиапоптотического белка bcl-2 (Dako, Дания) и стресс-белка БТШ 70 (NeoMarkers, США). Полученные на микротоме срезы были помещены на полизиновые стекла (Thermo Scientific, Германия) и окрашены на антитела к исследуемым белкам, в соответствии с протоколом, предложенным производителем. Дополнительно для проведения морфометрической оценки структуры сенсомоторной коры головного мозга проводили окраску гематоксилином и эозином. Окрашенные срезы фиксировались полистиролом и накрывались покровным стеклом. После высыхания полистирола полученные микропрепараты просматривали на светооптическом исследовательском микроскопе. Исследование полученных срезов осуществляли при помощи светооптического исследовательского микроскопа Olympus ВХ 51 (Япония) с вводом микроизображений в компьютер при помощи камеры Olympus (Япония).

Далее при помощи системы микроскопии и анализа Image Scope М были проанализированы заранее выбранные параметры анализа полученных фотоматериалов: общее количество нормальных нейронов на единицу площади, количество гиперхромных нейронов, количество актов нейронофагии, количество клеток астроглии, количество нейронов с экспрессией проапоптотического белка каспаза 3, антиапоптотического белка bcl-2 и стресс-белка БТШ 70. Изменение показателя выражалось в отношении количественного показателя образца опытной группы к значению аналогичного показателя из контрольной группы. Статистическую обработку результатов проводили с помощью пакета прикладных программ «Statistica 6.0» (Statsoft Inc., США).

Статистическую значимость различий в независимых выборках определяли по методу Манна - Уитни. Достигнутый уровень значимости признаков - при р≤0,05.

Как видно из таблицы, наиболее информативными являются изменения показателей числа клеток астроглии и числа нейронов с экспрессией БТШ 70.

Число клеток астроглии в опытной группе по сравнению с контрольной снизилось в 11.6 раза (203,0:174,0=11.6).

Количество нейронов с экспрессией БТШ 70 в опытной группе по сравнению с контрольной увеличилось в 11,5 раз (23,0:2,0=11,5).

Данные изменения свидетельствуют о развитии патологического процесса в ткани сенсомоторной коры головного мозга при воздействии биметаллического феррум-гадолиниевого нанокомпозита, инкапсулированного в природную полимерную матрицу арабиногалактана.

Предлагаемый способ диагностики позволяет оценить воздействие биметаллических нанокомпозитов на экспериментальных животных и расширяет арсенал методов оценки действия токсических веществ на организм лабораторных животных, повышает точность верификации токсического воздействия биметаллического нанокомпозита, так как при оценке изменений в ткани коры головного мозга выявляют не только структурные повреждения, но непосредственно изменения в белковых комплексах нейрона.

Литература

1. Шевцов М. АЯковлева., Л.Ю., Николаев Б.П. Магнитные наночастицы в диагностике и терапии злокачественных опухолей головного мозга // Лучевая диагностика и терапия. 2013. №3 (4). С. 29-39.

2. Наполов Ю.К., Лукьянов С.В., Свиридов Н.К., Воржанов А.А. Проблема безопасности применения хелатов гадолиния как рентгеноконтрастных средств // Медицинская визуализация. 2004. №5. С. 130-136.

3. Наполов Ю.К., Коробкова И.З., Черкавская О.В., Горгадзе Т.Т., Калиничев А.С. Теории патогенеза побочного действия рентгеноконтрастных средств // Вестник рентгенологии и радиологии. 2006. №5. С. 54-62.

4. Раптанова В.А., Сперанская А.А., Прошин С.Н. Контраст-индуцированные нефропатии (фармакология рентгеноконтрастных средств) // ЕДИАТР. 2016. Т. VII №1.C. 97-105.

5. Тимербаев А.Р. Роль масс спектрометрии в разработке и внедрении в медицину металлсодержащих наночастиц // Журнал аналитической химии. 2015. Т. 70. №9. С. 899-915.

6. Туранская С.П., Турелик М.П., Петрановская А.Л., Туров В.В., Горбик П.П. Нанокомпозиты в нейтронозахватной терапии // Поверхность. 2010. №2 (17). С. 355-374.

7. De Stasio G., Casalbore P., Pallini R., Gilbert В., Ciotti M.T., Rosi G., Festinesi A., Larocca L.M., Rinelli A., Perret D., Mogk D.W., Perfetti P., Mehta M.P., Mercanti D. Gadolinivim in human glioblastoma cells for gadolinium neutron capture therapy // Cancer Research. 2001. V. 61. P. 4272-4277.

8. Наврузов C.H., Ходжаева H.X., Кулабдуллаев Г.А., Абдуллаева Г.А., Ким А.А., Джураева Г.Т. Медико-биологические исследования по нейтрон-захватной терапии на атомном реакторе ИЯФ АН РУз // Злокачественные опухоли. 2015. №1. С. 10-23.

9. Yin J.C, Chen D.Q., Zhang Y., Li C.R., Liu L.Z., Shao Y.Z. MRI relaxivity enhancement of gadolinium oxide nanoshells with a controllable shell thickness // Physical chemistry chemical physics. 2018. Vol. 20 (15). P. 10038-10047.

10. Hsu B.Y.W., Tan A., Seifalian A.M., Li X.; Wang J. Relaxivity and toxicological properties of manganese oxide nanoparticles for MRI applications // RSC Advances. 2016. Vol. 6 (51). P. 45462-45474.

11. Шибаев А.В., Гервиц Л.Л., Филиппова О.Е., Гуляев М.В., Анисимов Н.В., Пирогов Ю.А., Хохлов А.Р. Новый двумодальный контрастный агент для магнитно-резонансной томографии // Журнал радиоэлектроники. 2016. №3. С. 1-8.

12. Орлова М.А., Трофимова Т.П., Орлов А.П., Шаталов О.А., Наполов Ю.К., Свистунов А.А., Чехонин В.П. Противоопухолевая активность производных фуллерена и возможности их использования для адресной доставки лекарств // Онкогематология. 2013. №2. С. 83-89.

13. Попов А.Л., Татарникова О.Г., Шекунова Т.О., Попова Н.Р., Баранчиков А.Е., Иванов В.К., Козик В.В. Исследование воздействия нанокристаллического диоксида церия, допированного гадолинием (Cel-xGdx02-y), на функциональное состояние и жизнеспособность клетоклинии NCTC clone L929 // Вестник Томского государственного университета. Химия. 2017. №8. С. 68-87.

14. Alarifi S., Huma A., Alkahtani S., Alessia M. Regulation of apoptosis through bcl-2/bax proteins expression and DNA damage by nano-sized gadolinium oxide // International Journal of Nanomedicine. 2017. №12. P. 4541-4551.

15. Е.А.Титов, Л.М. Соседова. Способ диагностики ртутной энцефалопатии у мелких лабораторных животных: Пат. 2471247 RU: 27.12.2012.

16. Титов Е.А., Новиков М.А., Соседова Л.М. Способ оценки токсического действия наночастиц серебра, инкапсулированных в полимерную матрицу арабиногалактана, на ткань головного мозга лабораторных животных в отдаленном периоде воздействия: Пат. 2578545 RU: 12.01.2015

17. Коржевский Д.Э. Краткое изложение основ гистологической техники для врачей и лаборантов-гистологов. СПб.: Кроф, 2005. 48 стр.

Способ оценки токсического действия биметаллического феррум-гадолиниевого нанокомпозита, инкапсулированного в природную полимерную матрицу арабиногалактана, на лабораторных животных, включающий воздействие на животных опытной группы токсикантом, на животных контрольной группы дистиллированной водой с последующим изготовлением срезов коры головного мозга, их окрашиванием гематоксилином и эозином, и микроскопией, отличающийся тем, что токсикант животным опытной группы вводят перорально в дозе 500 мкг/кг в течение 10 дней, дистиллированную воду животным контрольной группы вводят перорально по 0,5 мл на протяжении 10 дней, одну часть срезов тканей коры головного мозга животных контрольной и опытной групп окрашивают гематоксилином и эозином, другую - на антитела к белку теплового шока 70, проводят обзорную микроскопию полученных препаратов, подсчитывают на единицу площади среза количество клеток астроглии и количество нейронов с экспрессией белка теплового шока 70, сравнивают полученные показатели обеих групп животных и при снижении числа клеток астроглии в 1,16 раза и увеличении числа нейронов сенсомоторной коры с экспрессией белка теплового шока 70 в 11,5 раз в опытной группе по сравнению с контрольной делают заключение о развитии патологического процесса в ткани сенсомоторной коры головного мозга при воздействии биметаллического феррум-гадолиниевого нанокомпозита, инкапсулированного в природную полимерную матрицу арабиногалактана.

Изобретение относится к медицине, а именно к ветеринарной хирургии и артрологии. Выполняют оперативный доступ к хрящу методом кранио-латеральной миниартротомии.

Способ моделирования неразвивающейся беременности у крыс в условиях эксперимента // 2732873

Изобретение относится к экспериментальной медицине, а именно к гигиене с основами экологии человека, и может быть использовано для моделирования неразвивающейся беременности у крыс в условиях эксперимента.

Способ прижизненной оценки микроструктуры опухолевой ткани в эксперименте // 2732823

Изобретение относится к экспериментальной медицине и может быть использовано для прижизненной оценки микроструктуры опухолевой ткани в эксперименте. Проводят эластографическое исследование в центре опухоли, в ходе которого получают ОКЭ-изображения.

Способ исследования поведения и физического состояния мелких лабораторных животных // 2732701

Изобретение относится к биомедицине и может использоваться для определения адаптогенной активности и специфического влияния некоторых лекарственных средств и химических соединений на организм мелких лабораторных животных.

Способ коррекции эндотелиальной дисфункции пептидом, имитирующим альфа-спираль b эритропоэтина, при adma-подобной модели преэклампсии // 2732107

Изобретение относится к медицине, в частности к экспериментальной фармакологии, и может быть использовано для коррекции эндотелиальной дисфункции у беременных. Способ коррекции эндотелиальной дисфункции при ADMA-подобной модели преэклампсии включает воспроизведение модели преэклампсии у крыс линии Wistar ежедневным с 14 по 20 день беременности внутрибрюшным введением L-нитро-аргинин-метилового эфира в дозе 25 мг/кг, коррекцию моделируемой патологии путем внутрибрюшинного введения пептида, имитирующего α-спираль B эритропоэтина (P-αB), в дозе 50 мкг/кг/сут с 10-х по 20-е сутки беременности.

Способ моделирования экспериментальной амилоидной тиреопатии у крыс // 2732008

Изобретение относится к медицине и экспериментальной биологии и может быть применено для экспериментального моделирования амилоидной тиреопатии у крыс для выявления новых механизмов развития и способов профилактики данной патологии.

Способ коррекции микроциркуляции в плаценте пептидом, имитирующим альфа-спираль b эритропоэтина, при adma-подобной модели преэклампсии // 2731919

Изобретение относится к медицине, в частности к экспериментальной фармакологии, и может быть использовано для коррекции нарушений микроциркуляции в плаценте. Для этого осуществляют воспроизведение модели преэклампсии у крыс линии Wistar ежедневным с 14 по 20 день беременности внутрибрюшным введением L-нитро-аргинин-метилового эфира в дозе 25 мг/кг.

Способ повышения концентрации белка ирисина в плазме крови, в эксперименте // 2731815

Изобретение относится к медицине, а именно к нормальной физиологии, геронтологии, и может быть использовано для повышения концентрации белка ирисина в плазме крови, в эксперименте, заключающемся в физических тренировках.

Способ оценки степени влияния экспериментальной ишемии на нервную ткань головного мозга белых крыс при окрашивании препаратов гематоксилином и эозином // 2731649

Изобретение относится к медицине, а именно к экспериментальной нейроморфологии, и может быть использовано для оценки степени влияния экспериментальной ишемии на нервную ткань головного мозга белых крыс при окрашивании препаратов гематоксилином и эозином.

Способ создания экспериментальной модели периимплантита // 2730970

Изобретение относится к области медицины, а именно к экспериментальной челюстно-лицевой хирургии. У взрослой овцы Северо-Кавказской породы производят перфорацию кортикальной пластинки челюстной кости по вершине альвеолярного гребня беззубого участка челюсти хирургической фрезой диаметром 2 мм со скоростью вращения 1200 об/мин на глубину 5 мм без охлаждения.

Способ управляемой лазерной локальной гипертермии клеток или микроорганизмов // 2731813

Изобретение относится к области биомедицинских клеточных технологий. Предлагается способ лазерной локальной гипертермии клеток или микроорганизмов, включающий использование золотых нанозвезд, облучение клеток или микроорганизмов линейно-поляризованным лазерным излучением, согласно изобретению золотые нанозвезды осаждают на поверхность клетки или микроорганизмов из коллоидного раствора, облучение осуществляют импульсным излучением из диапазона длин волн 500-1200 нм, контролируют положение максимума и спектральную ширину плазмонного резонанса с помощью измерения спектральной зависимости коэффициента пропускания коллоидного раствора нанозвезд в видимом и ближнем ИК диапазоне, определяют добротность плазмонного резонанса, Q=λmax/Δλ1/2, как отношение длины волны λmax, соответствующей максимуму плазмонного резонанса, к его спектральной ширине Δλ1/2, соответствующей уменьшению плазмонного резонанса вдвое.