Способ производства коллаген-ламининового матрикса для заживления язв, ожогов и ран кожи человека

Изобретение относится к области медицинской биотехнологии, к тканеинженерным подходам регенеративной медицины, а именно к способу производства коллаген-ламининового матрикса, обладающего ранозаживляющим действием. Способ включает получение тканеинженерной раневой композиции при помощи формирования устойчивой матрицы в виде гелевой пленки из экстрагированного коллагена I типа сухожилий хвостов крыс и культивирования монослоя иммортализованных кератиноцитов кожи линии НаСаТ на коллагеновой пленке, отличающийся тем, что при помощи раствора детергентов SDS (додецилсульфат натрия) и Triton-X-100 (октилфенилполиоксиэтилен) в течение 1 суток при температуре +4°С проводят децеллюлирование (выведение клеток из конечного продукта) фиксированной 4% параформальдегидом коллагеновой подложки, с сохранением на ее поверхности ламинина (основного белка базальной мембраны), синтезированного клетками линии НаСаТ in vitro. Изобретение обеспечивает получение биодеградируемого ранозаживляющего композитного материала, отличающегося простотой изготовления, длительностью срока хранения и позволяющего отказаться от трансплантации кожи, например, при глубоких и обширных ожогах, трофических язвах и др.

 

Изобретение относится к медицинским биотехнологиям, а именно, к клеточным технологиям и тканеинженерным подходам для задач регенеративной медицины. Способ заключается в том, что наряду с консервативными методами лечения, предлагается заместительная терапия повреждений кожных покровов при помощи полимерных матриксов, гистотипически подобных тканям организма, с биологически активными агентами: клеточными производными - коллагенами и ламининами, способствующими структурообразовательной функции поврежденной области.

Важнейшее и быстро развивающееся направление современной регенеративной медицины - применение клеточных технологий. Задача клеточных технологий в этом случае заключается не только в трансплантации живых клеток в область дефекта, но и в полном восстановлении структуры и функции кожного покрова, в стимуляции регенеративных процессов и создании микроокружения для реализации потенциала собственных тканей и клеток. Для решения таких задач используют методы тканевой инженерии [8]. Тканевая инженерия призвана решить многие задачи регенеративной медицины, которая рассматривает вопросы улучшения продолжительности и качества жизни человека за счет восстановления утраченных структур и функций органов и тканей. Перспективным способом лечения и восстановления тканей может быть применение новых материалов, созданных на основе клеточных технологий [2, 3, 5, 6].

В настоящее время для лечения длительно незаживающих ран (трофические язвы, ожоги) и восстановления или временного закрытия обширных участков кожи разрабатывают подходы, основанные на применении дерматотропных биомедицинских клеточных продуктов. Применение клеточных технологий в стимуляции регенерации тканей заключается в использовании клеток разных типов, биоматриксов и тканеинженерных конструкций в различных вариантах и сочетаниях.

Известны способы покрытия обширных ожогов эпидермальными аутотрансплантатами. Однако при применении эпидермальных пластов для лечения ожоговых больных возникают трудности с приживаемостью, в случае аллогенных трансплантатов иммуногенностью и доступностью. Успешно применялись в доклинических и клинических исследованиях различные другие типы клеток - дермальные фибробласты, мезенхимальные стволовые клетки костного мозга, индуцированные плюрипотентные стволовые клетки. Однако данный подход к терапии, как правило, требует большого количества клеточного материала. Это не является серьезной проблемой при лечении небольших ран, но может ей стать при обработке обширных повреждений [8].

Известны способы эффективного применения для восстановления кожи дермальных компонентов - коллагеновых гелей, губок, модифицированных природными и синтетическими полимерами коллагеновых подложек, однако регенеративные процессы осложняются низкой стабильностью, биосовместимостью [9].

В клинических исследованиях с положительными результатами по закрытию относительно небольших ран показано применение эпидермальных и дермальных кожных эквивалентов, состоящих из бычьего коллагена с неонатальными фибробластами человека (Apligraf), аллогенных фибробластов крайней плоти новорожденных на синтетической подложке (Dermagraft), трехмерных коллагеновых гелей с фибробластами, однако в данных вариациях возникают сложности с инфицированностью, иммуногенностью, хранением и транспортировкой тканеинженерных конструкций [8, 10].

Заявленный способ выполняют следующим образом. Коллаген первого типа выделяется из сухожилий крысиных хвостов. Для этого требуются взрослые крысы линии Вистар (или аналоги), весом от 300 грамм, содержащиеся в условиях лабораторных вивариев, исключающих наличие инфекций, паразитов и т.д. Крысиные хвосты после усыпления животных можно хранить несколько лет в заморозке при -20°С. Перед выделением коллагена, хвосты отмывают при помощи стандартных моющих средств и стерилизуют 70% этанолом в течение суток перед экстрагированием коллагена. Далее все манипуляции производят в стерильных условиях (в ламинарных шкафах 1 или 2-го класса биобезопасности). Кожу с хвоста снимают при помощи скальпеля и пинцетов, хвост разрезается на куски по 2-3 см. Полученные таким образом куски хвоста еще раз инкубируются в 70% этаноле 15 минут. Затем при помощи пинцетов сухожилия извлекаются из хвоста, расщепляются на тонкие волокна и помещаются в сосуд со стерильным раствором 0,1% ледяной уксусной кислоты. Коллаген начинает экстрагироваться в раствор практически сразу, раствор приобретает вязкость и окрасу по типу синевато-опалесцирующей дымки. Для получения правильной концентрации и консистенции раствора, сухожилия с одного хвоста следует растворять в 100-150 мл раствора. Затем раствор инкубируется при +4°С в течении месяца. По возможности, каждый день следует доставать бутыль с раствором и размешивать осадок. В итоге образуется густая вязкая жидкость с нерастворенным осадком на дне. Далее раствор коллагена центрифугируется (1 час при 1500g ≈ 4000 об./мин. при радиусе ротора 10 см, при комнатной температуре) для осаждения нерастворенных волокон коллагена. Супернатант сливается в стерильные емкости для хранения. Концентрацию раствора можно посчитать, выпарив в суховоздушном термостате водную фракцию и взвесив образовавшийся осадок. Раствор коллагена можно считать приемлемым, при концентрации коллагена не ниже 1 мг/мл (обычно получается 3-5 мг/мл).

Для полимеризации коллагена следует нейтрализовать кислый раствор уксусной кислоты. Для этого раствор коллагена заливают в стерильную чашку Петри (радиус чашки по необходимости - 3 см, 6 см, либо 10 см.) и добавляют с перемешиванием соответствующее количество 0,1 М раствора NaOH, для создания общего рНраствора ≈ 7.0-7.2. Кислотность раствора можно легко определить, добавив концентрат среды M199 содержащей краситель феноловый красный, цвет которого меняется в зависимости от рН. Необходимый цвет раствора - алый красный. Варьируя количество раствора коллагена, можно создавать матриксы различной глубины. Полимеризация коллагена происходит в течение 3-5 минут, поэтому все процедуры необходимо проводить быстро, желательно на льду. После добавления всех необходимых ингредиентов и перемешивания, чашку Петри с коллагеновым гелем ставят в инкубатор на +37°С на несколько часов (сутки оптимально).

На следующий день на коллагеновый гель высаживают клетки линии НаСаТ в плотности 10-40 тысяч клеток на см². Клетки линии НаСаТ являются иммортализованными кератиноцитами человека, хорошо пролиферируют и широко используются в научных исследованиях. Сверху доливается необходимое количество полной ростовой культуральной среды для клеток НаСаТ и композиция далее инкубируется в течении нескольких суток до достижения плотного и сверхплотного клеточного монослоя. В течение этого времени клетки НаСаТ синтезируют ламининовый слой базальной мембраны на поверхности геля.

После достижения необходимой плотности клеток, получившийся матрикс фиксируют при помощи 4% параформальдегида, в течение 1 суток при +4°С. Таким образом, все белки композиции сшиваются между собой, образуя нерастворимый единый комплекс, клетки инактивируются. После фиксации, трансплант отмывают от формальдегида при помощи стерильного раствора фосфатно-солевого буфера (PBS), 3 раза по 15 минут с покачиванием на орбитальном шейкере. Далее проводят этап децеллюлирования матрикса при помощи раствора детергентов SDS и Triton-Х-100, в течении 1 суток при +4°С. Во время этого процесса нарушаются связи между липидами, липидами и белками, высвобождаются и вымываются все внутриклеточные компоненты, происходит деградация ДНК и РНК клеток. После децеллюлирования, трансплант отмывают от детергентов при помощи стерильного раствора фосфатно-солевого буфера (PBS), 6 раз по 1 часу с покачиванием на орбитальном шейкере. Последний этап промывки проводят в течение суток при +4°С. Далее матрикс можно хранить в течении месяца при +4°С в растворе PBS, либо два года высушенным в заморозке при -20°С.

Получившийся матрикс представляет собой белковую композицию, состоящую из двух основных компонентов - коллагена первого типа, и ламинина базальной мембраны, находящихся в полном гистотипическом подобии со строением кожи человека. Коллаген составляет строму транспланта, а ламинин покрывает строму в виде базальной мембраны. Матрикс стерильный, иммунотолерантный (поскольку коллаген является высоко консервативным и иммунотолерантным белком, а ламинин -человеческого происхождения), лишен какой-либо клеточной составляющей, что переводит его в разряд изделий медицинского назначения и сильно упрощает процедуру регистрации. В конечную композицию матрикса можно добавлять различные добавки (антибиотики, факторы роста, цитокины) что делает его удобной базовой моделью с большим потенциалом развития. Клеточную линию НаСаТ можно поменять на другие иммортализованные клеточные линии эпителиального типа, производящие ламинины других типов, что позволит использовать матрикс для лечения других эпителио-мезенхимных дефектов (уротелия мочеточника, эпителия гортани, эпителия кишечника и т.д.).

Проведенные исследования in vitro позволили, с помощью клеточных технологий и применения биполимерного субстрата, получить данные о возможности образования устойчивой тканеинженерной гистотипической композиции на основе экстрагированного в виде гелевой пленки коллагеновой матрицы с децеллюлированной ламининовой поверхностью. Иммуногистохимический флуоресцентный анализ идентифицировал экспрессию композитных белков - коллагена I типа и ламинина, а также панцитокератина - маркера эпителиальных клеток. Таким образом, предлагаемый вариант трехмерной матрицы представляет собой белковую композицию, состоящую из двух основных компонентов - коллагена первого типа, и ламинина базальной мембраны, находящихся в полном гистотипическом подобии со строением кожи человека. Семейства белков коллагенов и ламининов являются двумя самыми распространенными типами белков кожного покрова человека. Коллаген является основой мезенхимного компонента дермы кожи, обеспечивая ее механическую прочность и упругость. Ламинин является основой любых базальных мембран органов, в том числе и базальной мембраны кожи [1, 7].

Результаты контролируемых исследований динамики течения моделируемого раневого процесса в течение 21 суток, полученные на модели лоскутной кожно-мышечной раны у крыс-самцов линии Вистар, свидетельствуют о том, что в группах с применением коллаген-ламининовой матрицы на 7, 14 сутки ускорялась динамика сокращения площади раневых дефектов. Рост грануляционной ткани наблюдали со дна раны, в новообразованиях соединительной ткани отмечали васкуляризацию.

Полученные данные по восстановлению целостности кожного покрова свидетельствуют о том, что созданная репаративная композиция обладает высокой эффективностью ранозаживления, благодаря направленному росту регенерирующей ткани с поддержанием процессов васкуляризации. Разработанный биосовместимый коллаген-ламининовый ранозаживляющий материал, основанный на комбинации полимерной подложки и продукта синтеза кератиноцитов человека, при этом лишенный клеточной составляющей, отличается сравнительной простотой изготовления, длительностью срока хранения, что позволяет рекомендовать конструкцию к внедрению.

Литература

1. Алексеева Н.Т. Морфологические особенности раневого процесса в коже при региональном лечебном воздействии. - дисс. на соиск. д.м.н. - 2015. -327 с.

2. Григорян А.С, Кругляков П.В. Применение в тканевой инженерии крупных сосудов трансплантантов на основе аутогенных мононуклеарных клеток костного мозга // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. - 2009. - Том IV. - №3. - С. 37-41.

3. Капорская А.Н., Синицына Т.Ю., Азизов И.Г. Создание биополимерных матриц для регенеративного тканегенеза. - Актуальные вопросы биомедицинской инженерии. Сборник материалов VI Всероссийской научной конференции для молодых ученых. - 2017. - С. 39.

4. Обзор рынка биотехнологий в России и оценка перспектив его развития, аналитический обзор компании «FrostandSullivan». - 2014. - 69 с.

5. Панарин Е.Ф., Нудьга Л.А., Петрова В.А., Бочек А.М., Гофман И.В, Лебедева М.Ф., Блинова М.И., Спичкина О.Г., Юдинцева Н.М., Пинаев Г.П. Матрицы для культивирования клеток кожи человека на основе природных полисахаридов - хитина и хитозана // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. - 2009. -Том IV. - №3 - С. 42-46.

6. Шаповалова Е.Ю., Бойко Т.А., Барановский Ю.Г., Каракулькина О.А., Барановский А.Г. Оптимизация типа коллагена каркаса в биоинженерных конструкциях для заживления язв кожи с учетом эмбриогенеза кожи у эмбрионов человека // Вестник Уральской медицинской академической науки - 2014. - №5 - С. 107-110.

7. Gould L.J. Topical Collagen-Based Biomaterals for Chronic Wounds: Rationale and Clinical Application. // Advances in wound care (New Rochelle). - 2016. - Volume 5. - №1. - P. 19-31.

8. Meleshina A.V., Bystrova A.S., Rogovaya O.S., Vorotelyak E.A., Vasiliev A.V., Zagaynova E.V. Tissue-engineered skin constructs and application of stem cells for creation of skin equivalents (review). // Sovremennye tehnologii v medicine. - 2017 - 9(1) - P. 198-218.

9. Still J., Glat P., Silverstein P., Griswold J., Mozingo D. The use of a collagen sponge/living cell composite material to treat donor sites in burn patients. // Burns. - 2003 - 29(8) - P. 837-841.

10. Waymack P., Duff R.G., Sabolinski M. The effect of a tissue engineered bilayered living skin analog, over meshed split-thickness autografts on the healing of excised burn wounds. The Apligraf Burn Study Group. // Burns. - 2000 - 26(7) - P. 609-619.

Способ производства коллаген-ламининового матрикса, обладающего ранозаживляющим действием, включающий получение тканеинженерной раневой композиции при помощи формирования устойчивой матрицы в виде гелевой пленки из экстрагированного коллагена I типа сухожилий хвостов крыс и культивирования монослоя иммортализованных кератиноцитов кожи линии НаСаТ на коллагеновой пленке, отличающийся тем, что при помощи раствора детергентов SDS (додецилсульфат натрия) и Triton-X-100 (октилфенилполиоксиэтилен) в течение 1 суток при температуре +4°С проводят децеллюлирование (выведение клеток из конечного продукта) фиксированной 4% параформальдегидом коллагеновой подложки, с сохранением на ее поверхности ламинина (основного белка базальной мембраны), синтезированного клетками линии НаСаТ in vitro.