Способ определения иммунологической реактивности организма животных

Изобретение относится к ветеринарии и касается способа определения иммунологической реактивности организма животных, включающего исследование крови, где дополнительно проводят биологический тест, в качестве которого используют биологическую активность эритроцитов в НСТ-тесте, где инкубацию эритроцитов осуществляют в 80% растворе Хэнкса с интервалом времени от 30 минут до 3 часов; показатели сорбционной способности эритроцитов устанавливают по степени угнетения НСТ-теста нейтрофилами, и по показателям их сорбционной способности - более 40%, животных относят к особям со сниженной иммунологической реактивностью. Изобретение обеспечивает ускорение, упрощение и повышение точности определения иммунологической реактивности особей. 2 пр., 1 табл.

 

Изобретение относится к ветеринарной иммунологии, которое может быть использовано в клинической практике для оценки иммунологической реактивности организма животного, в частности к способу оценки иммуносупрессивных эффектов в биологической системе «мать-плод-новорожденный» и использовать иммунологические методы диагностики для выявления различных заболеваний животного организма на крупных и мелких животноводческих фермах.

Уровень техники

При изучении патентной и научно-технической информации выявлено несколько способов определения иммунологической реактивности.

Известен способ определения иммунологической реактивности организма путем воздействия на организм лекарственным веществом (вводят пирогенал в дозе 0,15-0,18 мкг на 1 кг веса) и при повышении температуры до 37,0-37,5°С определяют иммунологическую реактивность в пределах нормы, при 36,6-36,9°С определяют недостаточность иммунологической реактивности (См. Авт. св. СССР №1689857, М. Кл.² G01N 33/53, 1989 г.). Данный способ имеет ряд недостатков, снижающих его информативность. Так, определяемый показатель температуры тела претерпевает существенные изменения, обусловленные не только физиологическими процессами (испарение влаги с поверхности кожи, вентиляция легких и т.д.), но и неконтролируемыми технологическими параметрами (температура и влажность внешнего воздуха, теплопроводность поверхностей). Высокая вариабельность полученных результатов, также снижает информативность таких параметров для суждения о недостаточности иммунологической реактивности.

Известен способ оценки иммунологической реактивности организма, включающий взятие крови, разделение ее на плазму и форменные элементы (См. Авт. св. СССР №1686364, М. Кл.² G01N 33/53, 1991 г.). Однако для реализации способа требуется дорогостоящее оборудование и биопрепараты. Кроме того, способ недостаточно информативен, а также сложен.

Известен способ оценки иммунологической реактивности организма включающий взятие крови, разделение ее на плазму и форменные элементы и определение концентрации иммуноглобулинов и специфических антител в плазме, отличающийся тем, что, дополнительно определяют концентрацию иммуноглобулинов A, G, М и специфических сывороточных антител, сорбированных на форменных элементах крови и по соотношению концентраций иммуноглобулинов и специфических сывороточных антител в плазме и сорбированных на форменных элементах крови судят об иммунологической реактивности организма (См. Патент РФ №2126154, М. Кл.² G01N 33/53, 1999 г.).

Недостаток данного способа в том, что он применим только в специальных лабораторных условиях с применением методов иммунохимии, что сужает диапазон его полезного использования в полевых условиях. Кроме того, определение концентраций иммуноглобулинов и специфических сывороточных антител в плазме и сорбированных на форменных элементах крови достаточно сложно технически и требует значительных временных затрат, специального оборудования и реактивов.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому положительному результату, принятый авторами за прототип является способ оценки иммунологической реактивности организма, включающий взятие крови, разделение ее на плазму и форменные элементы и определение иммунологических показателей клеток крови, по которым судят о состоянии организма (См. Патент РФ №1813213, M. Кл.² G01N 33/53, 1993 г.).

Однако недостатком данного способа является повышенная травматичность, т.к. отбор крови производится из локтевой вены, что особенно сложно для тяжелобольных и в педиатрической практике. Из-за невозможности проведения анализа после длительного хранения проб исключается проведение скрининговых исследований. Способ недостаточно информативен, т.к. позволяет определить предрасположенность к небольшому количеству заболеваний, характеризуется низкой пропускной способностью из-за длительности процесса.

Недостатком большинства способов оценки иммунологической реактивности организма является их акцентирование на возможности оценить клеточно-опосредованный иммунный ответ, который у живого организма особенно важно при иммунодефиците и иммуносупрессии. Иммунодефицит характеризуется снижением способности вызывать эффективный иммунный ответ. Такой неполный иммунный ответ или его отсутствие могут возникнуть в результате первичного или приобретенного (вторичного) иммунодефицита.

В настоящее время основной проблемой, связанной со многими маркерами, используемыми для мониторинга и определения связанных с иммунодефицитом заболеваний, является отсутствие клеточного иммунитета.

Существует необходимость в разработке способа определения иммунологической реактивности организма животных, который позволял бы оценить комбинированное функциональное состояние клеточно-опосредованной иммунологической реактивности врожденного и приобретенного иммунитета в функциональной системе «мать-плод-новорожденный» и определить факторы, вызывающие иммуносупрессию.

Раскрытие изобретения

Задачей предлагаемого изобретения является разработка способа определения иммунологической реактивности организма животных, направленного на более релевантную оценку клеточно-опосредованной иммунологической реактивности по реакции НСТ-теста крови материнского организма в присутствии сыворотки крови новорожденного животного, обладающего ускорением, упрощением и повышением точности прогнозирования развития новорожденного организма.

Технический результат достигается путем оценки адсорбирующей способности эритроцитов при инкубации в растворе Хэнкса. (80% раствор смеси). Инкубацию проводят с интервалом времени от 30 минут до 3 часов. Показатели адсорбционной способности устанавливали по степени угнетения НСТ-теста компетентными клетками (нейтрофилами). Наиболее активное подавление иммуносупрессорных свойств установлено при падении биологической активности в НСТ-тесте до 40%, что связано с пределом рецепторной емкости данных клеток.

Технический результат достигается при помощи способа определения иммунологической реактивности организма животных, включающего исследование крови путем проведения биологического теста, в качестве которого используют биологическую активность эритроцитов в НСТ-тесте и по показателям их сорбционной активности - более 40%, животных относят к особям со сниженной иммунологической реактивностью среди однородной выборки.

Краткое описание чертежей и иных материалов

В таблице 1 приведены показатели сорбционной активности эритроцитов беременных свиноматок в НСТ-тесте %.

Осуществление изобретения

Примеры конкретного выполнения способа определения иммунологической реактивности организма животных.

Пример 1.

В качестве объекта исследования использовали эритроцитарные клетки 42 супоросных свиноматок (вторая половина беременности) 3-х групп, 4 группа служила контролем.

У животных отбирали 500 мкл капиллярной крови в пробирку, содержащую 45 мкл консерванта ЭДТ. После центрифугирования и удаления супернатанта к 200 мкл эритроцитарной массы добавляли 1,4 мл 100 мкМ раствора нильского голубого. Пробу центрифугируют при 3 тыс.об/мин 10 мин и супернатант удаляли. К 200 мкл эритроцитарной массы добавляли 1,4 мл 100 мкМ нильского голубого, приготовленного на физиологическом растворе с рН 7,4. Смесь перемешивали инкубировали при комнатной температуре 20 мин, затем центрифугировали 5-10 мин при 3 тыс об/мин и измеряли оптическую плотность в супернатанте при 630 нм. Чтобы исключить концентрационное снижение оптической плотности красителя, отобранную пробу супернатанта разводили в 2 раза дистиллированной водой и измеряли поглощение в кювете толщиной 0,5 см

Опытные группы подвергались гипериммунизации (использовали ассоциированные вакцины) во время беременности, а контрольная группа особей оставалась на тривиальной (принятой в хозяйстве) антигенной нагрузке. Адсорбирующую способность проводили при инкубации отмытых эритроцитов (три раза) в растворе Хэнкса. (80% раствор смеси). Инкубацию проводили с интервалом времени от 30 минут до 3 часов. Показатели адсорбционной способности устанавливали по степени угнетения НСТ-теста компетентными клетками (нейтрофилами).

Полученные результаты свидетельствуют о значительной вариабельности в зависимости от групп животных, использованных при исследовании (см. таблица 1). Сорбционная активность эритроцитов у контрольной группы особей характеризуется незначительным падением биологической активности в НСТ-тесте до 40%. Более выраженное падение сорбционной активности установлено в опытных группах из-за изменения содержания белков, повышения эластичности, снижения прочности и иммунологической активности.

Таким образом наиболее активное подавление иммуносупрессорных свойств крови установлено при биологической активности в НСТ-тесте до 40%, а повышение связано с пределом рецепторной емкости данных клеток.

Поэтому целесообразно использовать автологическую сорбционную активность эритроцитов в качестве иммунологических диагностических тестов для оценки иммунологической реактивности особей.

Пример 2.

Доказательством того, что у свиноматок опытных групп в период беременности имело место быть снижение иммуносупресорных свойств, может служить увеличение скорости оседания эритроцитов и снижения их количества у поросят опытных групп по отношению к контрольной. Известно, что изоиммунные антитела, а такие сенсибилизированные лейкоциты, попадая в организм плода через плаценту или с молозивом, вступают в иммунологическую реакцию с эритроцитами новорожденного, которые содержат антитела. Это приводит к изменению коллоидных свойств оболочек эритроцитов, в результате чего они легко агглютинируют и подвергаются разрушению.

Важным критерием жизнеспособности новорожденных животных является заболеваемость и летальность в процессе онтогенеза. В результате проведенных испытаний было установлено, что возрасте 30 дней заболеваемость в опытных группах составила 16,0, 12,0, 9,0%, а в контрольной 7,0%. Летальность в опытных группах составила 14,0%. В контрольной группе случаев падежа не регистрировалось. Дальнейшие наблюдения до 7 месячного возраста показали, что процент заболеваемости и летальности в опытных группах значительно выше, чем в контрольной. Всего пало в опытной группе 22,0%, а в контрольной 7,0%.

Сегодня достоверно известно, что эритроциты вовлекаются в патологический процесс не только при гематологических заболеваниях, но и претерпевают серьезные изменения структуры и функции при болезнях разного генеза. Доказано, что выявленные закономерности нарушений структуры и функции мембраны эритроцитов с определенной долей коррекции, обусловленной, прежде всего, видовой специфичностью клеток, могут быть экстраполированы на иные мембранные системы. Повышенный интерес исследователей к эритроциту при болезнях разного генеза обусловлен его участием в процессах, связанных с поддержанием гомеостаза, в том числе иммунных. Существующие данные не оставляют сомнений в том, что эритроциты являются важным звеном механизма иммунорегуляции при патологических состояниях и в условиях стресса.

Из проведенного исследования можно сделать вывод о том, что предлагаемое изобретение обладает в отношении известных разработок следующими преимуществами:

1. Предлагаемый способ предназначен для определения иммунологической реактивности организма животных.

2. Обладает меньшей трудоемкостью в применении, делая его простым и доступным по техническому выполнению на любом сельскохозяйственном предприятии.

3. НСТ тест практически не требует затрат: для исследования необходимо небольшое количество крови. Кроме того, для проведения анализа не используется специальное оборудование.

Способ определения иммунологической реактивности организма животных, включающий исследование крови, отличающийся тем, что дополнительно проводят биологический тест, в качестве которого используют биологическую активность эритроцитов в НСТ-тесте, где инкубацию эритроцитов осуществляют в 80% растворе Хэнкса с интервалом времени от 30 минут до 3 часов; показатели сорбционной способности эритроцитов устанавливают по степени угнетения НСТ-теста нейтрофилами, и по показателям их сорбционной способности - более 40%, животных относят к особям со сниженной иммунологической реактивностью.