Способ получения препарата для удаления ревматоидного фактора из крови больных ревматоидным артритом
Владельцы патента RU 2739352:
Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Научно-исследовательский институт клинической и экспериментальной ревматологии имени А.Б. Зборовского" (RU)
Изобретение относится к области фармацевтики, а именно к способу получения препарата для удаления ревматоидного фактора из крови больных ревматоидным артритом. Способ включает пропускание крови через сорбент, представляющий собой полиакриламидные железосодержащие гранулы, в которых в результате эмульсионной полимеризации иммобилизован Fc-фрагмент иммуноглобулина G, полученный при папаиновом гидролизе и очистке нативного человеческого иммуноглобулина G. Изобретение обеспечивает повышение сорбционной и специфической емкости препарата для удаления ревматоидного фактора из крови путем разделения человеческого иммуноглобулина IgG на фрагменты Fc и Fab и последующей работы только с фракцией, содержащей Fc фрагмент. 3 табл., 3 пр.
Изобретение относится к области медицины, а именно к ревматологии, иммунологии и биотехнологии, и может быть использовано для совершенствования метода лечения ревматоидного артрита.
В патогенезе ревматоидного артрита (РА) ведущее значение имеют аутоиммунные реакции, в результате которых в организме человека продуцируются некоторые аномальные продукты клеток иммунной системы. К таким веществам относится ревматоидный фактор (РФ). Представляющий собой иммуноглобулины человека классов М, G, А, направленные против Fc-фрагмента IgG человека. Эти антитела в организме синтезируются плазматическими клетками синовиальной оболочки и оттуда попадают в кровь. Взаимодействуя с аутоантигеном, они образуют циркулирующие иммунные комплексы (ЦИК). Оседающие, главным образом, в синовиальной оболочке суставов. ЦИК вызывают повышение активности медиаторов воспаления, нарушают микроциркуляцию, активируют хемотаксис лейкоцитов и процессы фагоцитоза ЦИК лейкоцитами и макрофагами. В процессе фагоцитоза повреждаются лизосомы нейтрофилов и макрофагов, высвобождаются лизосомальные ферменты, которые разрушают клеточные структуры. Образуются новые аутоантигены и патологический процесс приобретает характер цепной реакции. Важное патогенетическое значение большинство авторов придают РФ класса IgG, так он составляет около 80% всех иммуноглобулинов человека и животных (Введение в иммунологию Цхалтубо-Кутаисское отделение грузинского научного общества иммунологов/Под. ред. Р.И. Сепиашвили - Цхалтубо-Кутаиси 1987 С.31.), (Bond A., Cooke А.С, Sumar N., Hay F.C. Glycosylation of IgG in the MRL/Ipr model of rheumatoid arthritis // Eur. Fed. Immunol. Soc. 10 th Meet., Edinburgh, 10-12 Sept., 1990: Abstr.-Edinburgh, 1990. - P. 103.).
В настоящее время определение РФ класса IgG в крови человека широко используется в медицинской диагностической практике, особенно для обследования пациентов с подозрением на ревматоидный артрит, для мониторинга течения РА, контроля эффективности проводимых лечебных мероприятий. Больные РА, имеющие высокий уровень РФ в крови, склонны к более агрессивному течению болезни и худшему исходу, чем слабоположительные по РФ. Высокий титр РФ ассоциируется с рядом аутоиммунных заболеваний и присутствием внесуставных проявлений и ревматических узлов (Новиков Д.К. Справочник по клинической иммунологии и аллергологии./ Д.К. Новиков - Минск: Беларусь, 1987. С. 223; Смердова М.А. Ревматоидный фактор в лабораторной диагностике /М.А. Смердова, Е.Ю.Косова /Информационный бюллетень Новости «Вектор-Бест» - 2000 - Т. 3, №17. - С. 5-7).
Таким образом, РФ принадлежит важнейшая роль в иммунопатогенезе развития ревматоидного артрита. Это диктует необходимость разработки и внедрения новых методов целенаправленной патогенетической терапии, способствующих непосредственной элиминации ревматоидного фактора из крови больных РА или угнетения его синтеза В -клетками.
Известен метод удаления указанных антител методом этапного плазмафереза, при котором проводится удаление плазмы больного в экстракорпоральном контуре малыми порциями по 300 мл с последующей инфузией пациенту изотонических солевых растворов и изоонкотических донорских белковых препаратов (Митысовская Н.П., Досин Ю.М., Лабань Ф.Н. и соавт.). Динамика иммунологических показателей больных ревматоидным артритом в процессе плазмафереза /Научно-практическая ревматология. - 2000. - №4. - С. 75.). Недостатком этого метода является его низкая избирательность и специфичность. При осуществлении такой процедуры вместе с ревматоидным фактором удаляются необходимые для организма альбумин, гормоны, нормальные иммуноглобулины, лекарственные препараты. Кроме того используемые белковые препараты являются чужеродными для организма, приводя к развитию аллергических реакций, дороги в цене, что затрудняют их широкому использованию.
Существует метод удаления ревматоидных факторов из крови путем пропускания ее через иммуносорбент, представляющий собой нерастворимый инертный носитель (агарозный гель в форме сефарозы CL-2B или сефарозы CL-4B), к которому после активации бромцианом ковалентно пришивается нативный или химически модифицированный иммуноглобулин G человека. Указанный способ имеет ряд недостатков. Сефароза имеет крайне высокую стоимость и поэтому не может найти широкого применения для приготовления иммуносорбентов в клинической практике. Бромциан, используемый для активации данного носителя, является высокотоксичным соединением, работа с ним представляет опасность для исследователя. При приготовлении сефарозы из агарозы существенная часть активных групп носителя, к которым впоследствии присоединяется иммуноглобулин G, блокируется поперечной сшивкой геля. В процессе образования ковалентных связей между матрицей и лигандом происходит частичное блокирование активных центров молекулы антигена. Вследствие указанных причин, плотность антигенных детерминант на поверхности иммуносорбента, используемого в прототипе, оказывается недостаточной, что приводит к недостаточной эффективности удаления ревматоидных факторов из крови (Эфферентные методы в медицине. М.: Медицина 1989 С. 64).
Наиболее близким к предложенному по принципу действия и достигаемому результату является способ удаления ревматоидного фактора из крови путем пропускания ее через иммуносорбент с иммобилизированным цельным нативным IgG человека, причем в качестве носителя используют железосодержащие полиакриламидные гранулы. В нашей лаборатории был получен подобный препарат (Гонтарь И.П., Заводовский Б.В., Липницкий С.А., Зборовский А.Б. «Способ очистки крови от ревматоидного фактора»/патент №2027192, 1995 г.).
Как известно человеческий иммуноглобулин состоит из Fab и Fc фрагментов, причем фрагмент Fab составляет примерно 2/3 иммуноглобулина IgG, a Fc - 1/3 (Иммунология А. Ройт, Дж. Бростофф, Д. Мейл - Москва «Мир» 2000 С. 97-112).
В работе была повышена сорбционная и специфическая емкость препарата путем разделения человеческого иммуноглобулина IgG на фрагменты Fc и Fab, и с последующей работой только с фракцией содержащей Fc фрагмент. Для разделения IgG человека на соответствующие фрагменты, мы использовали методику расщепление папаином.
Техническим результатом является повышение сорбционной и специфической емкости препарата для удаления ревматоидного фактора из крови путем разделения человеческого иммуноглобулина IgG на фрагменты Fc и Fab, и последующей работой только с фракцией содержащей Fc фрагмент.
В работе использовали 150 мг IG (1 ампула-1,5 мл, производитель: Микроген НПО Вирион г. Томск) и 1,5 мг меркурипапаина в 10 мл 0,1 М фосфатного буфера с рН 7,0, содержащего ЭДТА и цистеин. Инкубировали смесь 16 ч. При 37°С и против дистиллированной воды, затем диализировали при перемешивании в течение 48 ч. При 4°С. Продукты расщепления подвергали диализу против 0,01 М ацетатного буфера с рН=5,5 и затем проводили хроматографию на КМ-целлюлозе. Фрагменты IgG человека элюировали после папаинового гидролиза в градиенте фосфатного буфера 0,01-0,9 М с рН5,5 при длине волны 280 нм. Хроматографию выполняли при комнатной температуре для предотвращения кристаллизации Fc -фрагмента. Были получены две фракции содержащие Fab-фрагменты иммуноглобулина G и одна фракция - Fc-фрагменты (Иммунологические методы под редакцией Г. Фримеля - Москва «Медицина» 1987 С. 417-423). Для адекватного сравнения сорбционной емкости двух сорбентов были получены одинаковые гранулы как на основе IgG, так и на основе Fc -фрагментов.
Пример 1. Получение полиакриламидных гранул с магнитными свойствами с иммобилизированным нативным иммуноглобулином G человека.
В 2 мл нативного иммуноглобулина G человека, содержащего 200 мг белка растворяли соответственно 100 мг и 300 мг метиленбисакриламида и акриламида (Реанал, Венгрия).
В сосуд, содержащий 100 мл гексана и 0,5 мл эмульгатора СПЭН-85, подавали под давлением 0,2-1 атм газообразный азот по трубке сечением 0,8 мм таким образом, чтобы создавать интенсивное перемешивание в течение 5 мин. В колбу для полимеризации вносили 1 мл физиологического раствора с 200 мг окиси железа с гидрофильными свойствами и 10 мг персульфата аммония, через 1-2 мин. Добавляли 2 мл раствора, содержащего мономеры акриламида, метиленбисакриламида, IgG человека и 20 мкл NNN N-тетраметилендиамина (ТЭМЭД). После завершения полимеризации гранулы в течение 10-15 мин. отмывали ацетоном и физиологическим раствором с детергентом Твин-20 от непрореагировавших мономеров, эмульгатора и гексана. Гранулы имели стандартную сферическую форму с размером частиц геля 10-100 мкм. Соотношение полимерный носитель-железо = 2:1 (в пересчете на сухую массу).
Пример 2. Получение полиакриламидных гранул с магнитными свойствами с иммобилизированными Fc-фрагментами иммуноглобулина G человека.
Данный вид полиакриламидных гранул с магнитными свойствами и иммобилизированным Fc-фрагментами иммуноглобулина G человека получали аналогичным образом см. пример 1., только вместо 200 мг нативного иммуноглобулина G, брали 200 мг Fc- фрагмента этого иммуноглобулина, предварительно полученного при гидролизе папаином и его последующей очистки.
Пример 3. Сорбция ревматоидного фактора из крови больных ревматоидным артритом.
Для проведения сорбции использовали оригинальное устройство, создающее осевой и поперечный градиент магнитного поля напряженностью 4000-5000 Э, которое позволяет удерживать гранулы во взвешенном состоянии, одновременно перемещая их в различных направлениях (поперечном, продольном), что способствовало большему контакту иммуносорбента с кровью и препятствовало адгезии гранул друг с другом (Гонтарь И.П, Заводовский Б.В.., Зборовский А.Б., Зборовская И.А., Кабаков А.П., Самарин Н.В. «Способ проведения экстракорпоральной иммуносорбции»/ патент на изобретение №2098140, 1997 г.).
В колонку объемом 10 мл, оборудованного электромагнитом, вносили магнитоуправляемые полиакриламидные гранулы (МПГ) с иммобилизированным иммуноглобулином G человека при постоянной рециркуляции при t=370 с помощью насоса «MICROPERPEX» (LKB, Швеция) со скоростью 10 мл в час.. Используя эту колонку, была проведена обработка in vitro гепаринизированной крови 10 больных РА с высокой степенью активности основного заболевания. Через колонку перфузировали 20 мл нативной гепаринизированной крови со скоростью 10 мл/ч. После окончания перфузии МПГ отмывали от несвязавшихся белков забуференным физиологическим раствором рН 7,4 и проводили десорбцию РФ с сорбента 1 М глицин-HCI буфером рН2,2 двукратно по 10 мин. В качестве контроля использовали 10 сывороток крови практически здоровых лиц. Концентрацию ревматоидного фактора определяли непрямым твердофазным иммуноферментным методом (ИФА) на полистироловых планшетах (ELISA-тест) по классической методике, описанной в ряде источников литературы (Иммунологические методы / Под ред. Г. Фримеля: Пер. с англ.- М.: Медицина, 1987. - С. 472), (Bampton J., Park J., Kyle K. et al. Measurement of IgM, IgA and IgG rheumatoid factors by ELISA and comparison with other methods // Ann. Rheum. Diseases. - 1982. - Vol. 9 - P. 359-365.). Была также проведена проверка травматичности форменных элементов (эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов). До и после сорбции определяли содержание их по общепринятым методикам (Лабораторные методы исследования в клинике /Под ред. Меньшикова В.В. - М.: Медицина., 1987. - С. 458). Количество форменных элементов крови достоверно не изменялось. Значения всех исследуемых показателей для каждого образца измеряли двукратно до и после перфузии.
Аналогично провели адсорбцию ревматоидного фактора, используя сорбент с иммобилизированным Fc-фрагментом иммуноглобулина G.
Средняя величина оптической плотности у доноров для IgG составила 0,036±0,004, была определена верхняя граница нормальных показателей оптической плотности для IgG-РФ, определяемая как М+2σ составила 0,08.
Динамика плазменной концентрации ревматоиного фактора в том и другом случае приведена в таблице 1.
Эффективность удаления РФ с помощью МПГ на основе нативного IgG и Fc -фрагмента была определена в процессе длительности проведения этой процедуры (мин). Было выявлено, что сорбция РФ на основе Fc -фрагмента проходила быстрее, более чем в 2 раза, чем на основе нативного IgG (таб. 2, 3)
Способ получения препарата для удаления ревматоидного фактора из крови больных ревматоидным артритом, включающий пропускание крови через сорбент, представляющий собой полиакриламидные железосодержащие гранулы, отличающийся тем, что в результате эмульсионной полимеризации в гранулы иммобилизуют Fc-фрагмент иммуноглобулина G, полученный при папаиновом гидролизе и очистке нативного человеческого иммуноглобулина G.
