Твердые формы пладиенолидпиридиновых соединений и способы их применения

Изобретение относится к кристаллической форме 1 (2S,3S,6S,7R,10R,E)-7,10-дигидрокси-3,7-диметил-12-оксо-2-((R,2E,4E)-6-(пиридин-2-ил)гепта-2,4-диен-2-ил)оксациклододец-4-ен-6-ил 4-метилпиперазин-1-карбоксилата («соединение 1»), имеющей XRPD-дифрактограмму, в которой присутствует по меньшей мере три пика, выбранных из пиков при 5,9±0,2, 7,7±0,2, 12,8±0,2, 15,3±0,2, 18,2±0,2, 19,3±0,2, 21,2±0,2, 23,6±0,2 и 25,8±0,2 градуса два-тета. Изобретение также относится к Фармацевтической композиции, предназначенной для лечения рака, который является положительным для одной или нескольких мутаций в гене или белке сплайсингосомы, на основе указанного соединениея. Технический результат – получена новая кристаллическая форма (2S,3S,6S,7R,10R,E)-7,10-дигидрокси-3,7-диметил-12-оксо-2-((R,2E,4E)-6-(пиридин-2-ил)гепта-2,4-диен-2-ил)оксациклододец-4-ен-6-ил 4-метилпиперазин-1-карбоксилата и фармацевтическая композиция на его основе, которые могут найти применение в медицине для лечения рака, где рак выбран из следующих: миелодиспластический синдром, хронический лимфоцитарный лейкоз, острый лимфобластный лейкоз, хронический миеломоноцитарный лейкоз, острый миелоидный лейкоз, рак толстой кишки, рак поджелудочной железы, эндометриальный рак, рак яичников, рак молочной железы, увеальная меланома, рак желудка, холангиокарцинома и рак легких. 2 н. и 21 з.п. ф-лы, 5 табл., 7 ил.

 

[0001] Настоящее раскрытие касается новой твердой формы пладиенолидпиридиновых соединений, композиций, содержащих, по меньшей мере, одну такую твердую форму, и способов их получения и применения. Новая твердая форма пладиенолидпиридиновых соединений может быть пригодна для лечения рака, например, раковых заболеваний, при которых, как известно, полезны агенты, нацеленные на сплайсингосому и мутации в ней.

[0002] Некоторые соединения пладиенолида B, а также другие пладиенолидные соединения, раскрыты в следующих патентных заявках: WO 2002/060890; WO 2004/011459; WO 2004/011661; WO 2004/050890; WO 2005/052152; WO 2006/009276 и WO 2008/126918. Например, пладиенолидное соединение (8E,12E,14E)-7-((4-циклогептилпиперазин-1-ил)карбонил)окси-3,6,16,21-тетрагидрокси-6,10,12,16,20-пентаметил-18,19-эпокситрикоза-8,12,14-триен-11-олид, известное как E7107, является полусинтетическим производным природного продукта пладиенолида D, и сообщаются результаты исследования его фазы I.

[0003] Настоящее раскрытие касается новой твердой формы, по меньшей мере, одного объекта, выбранного из пладиенолидпиридиновых соединений, имеющих формулу I и их фармацевтически приемлемых солей (общее обозначение «соединения формулы I»):

Формула I

[0004] В некоторых вариантах осуществления твердая форма, по меньшей мере, одного соединения формулы I является кристаллической формой 1. В некоторых вариантах осуществления настоящее раскрытие касается новой твердой формы (2S,3S,6S,7R,10R,E)-7,10-дигидрокси-3,7-диметил-12-оксо-2-((R,2E,4E)-6-(пиридин-2-ил)гепта-2,4-диен-2-ил)оксациклододец-4-ен-6-ил 4-метилпиперазин-1-карбоксилата.

[0005] В некоторых вариантах осуществления настоящее раскрытие касается фармацевтических композиций, содержащих, по меньшей мере, одну твердую форму, по меньшей мере, одно соединение формулы I. В некоторых вариантах осуществления фармацевтические композиции дополнительно содержат, по меньшей мере, один дополнительный компонент, выбранный из фармацевтически приемлемых носителей, фармацевтически приемлемых разбавителей и фармацевтически приемлемых наполнителей. В некоторых вариантах осуществления настоящее раскрытие касается фармацевтических композиций, состоящих, по меньшей мере, из одной твердой формы, по меньшей мере, одного соединения формулы I и необязательно, по меньшей мере, одного дополнительного компонента. В некоторых вариантах осуществления настоящее раскрытие касается фармацевтических композиций, состоящих в основном, по меньшей мере, из одной твердой формы, по меньшей мере, одного соединения формулы I и необязательно, по меньшей мере, одного дополнительного компонента. В некоторых вариантах осуществления, по меньшей мере, одна твердая форма, по меньшей мере, одного соединения формулы I присутствует в фармацевтической композиции в терапевтически эффективном количестве.

[0006] В некоторых вариантах осуществления можно использовать, по меньшей мере, одну твердую форму, по меньшей мере, одного соединения формулы I в способах лечения субъекта с раковым заболеванием. В некоторых вариантах осуществления, по меньшей мере, одну твердую форму, по меньшей мере, одного соединения формулы I можно вводить такому субъекту в количестве, эффективном для произведения терапевтически полезной реакции. Неограничительные примеры рака включают миелодиспластический синдром, лейкоз (такой как хронический лимфоцитарный лейкоз, острый лимфобластный лейкоз, хронический миеломоноцитарный лейкоз и острый миелоидный лейкоз) и солидные опухоли (такие как рак толстой кишки, рак поджелудочной железы, эндометриальный рак, рак яичников, рак молочной железы, увеальная меланома, рак желудка, холангиокарцинома и рак легких). Рак может давать положительный тест для одной или нескольких мутаций в гене или белке сплайсингосомы, таких как перечисленные ниже в таблице 1.

[0007] В некоторых вариантах осуществления, по меньшей мере, одна твердая форма, по меньшей мере, одного соединения формулы I может быть подходящей для получения лекарства. Например, лекарство может быть предназначено для лечения рака, такого как указанные выше. В некоторых вариантах осуществления, по меньшей мере, одна твердая форма, по меньшей мере, одного соединения формулы I может быть подходящей для целевого воздействия на сплайсингосому, например, субъединицу 1 сплайсингосомы SF3B.

[0008] КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

[0009] На ФИГ. 1 показана дифрактограмма рентгеновской порошковой дифракции (XRPD) кристаллической формы 1 свободного основания соединения формулы I.

[0010] На ФИГ. 2 показаны XRPD-дифрактограммы кристаллической формы 1 свободного основания соединения формулы I, полученной медленным выпариванием разных растворов, содержащих толуол, ацетон, этилацетат, метил-третбутиловый эфир смесь (MTBE)/дихлорметан (DCM) илисмесь MTBE/гептан.

[0011] На ФИГ. 3 показаны XRPD-дифрактограммы кристаллической формы 1 свободного основания соединения формулы I, полученной из смесей MTBE/гептан или этилацетат/гептан.

[0012] На ФИГ. 4 показаны кристаллы кристаллической формы 1, полученной быстрым охлаждением свободного основания соединения формулы I из смесей MTBE/гептан или этилацетат/гептан.

[0013] На ФИГ. 5 показаны XRPD-дифрактограммы кристаллической формы 1, полученной различными способами. Верхняя дифрактограмма соответствует кристаллической форме 1, полученной быстрым охлаждением из раствора в смеси этилацетат/гептан (3:1). Средняя дифрактограмма соответствует кристаллической форме 1, полученной быстрым охлаждением из раствора в смеси MTBE/гептан (1:1). Нижняя дифрактограмма соответствует кристаллической форме 1, полученной кристаллизацией при более медленном охлаждении (охлаждают от 75°C до комнатной температуры за 2-3 час. при перемешивании в течение ночи) из раствора в смеси этилацетат/гептан (3:1) (30 об.).

[0014] На ФИГ. 6 представлено изображение предложенной упаковки кристалла в кристаллической форме 1.

[0015] На ФИГ. 7 показаны XRPD-дифрактограммы образца кристаллической формы 1 до и после измельчения.

[0016] Приведенные далее используемые здесь определения будут применяться, пока не указано по-другому.

[0017] Используемое здесь выражение «соединение формулы I» обозначает, по меньшей мере, один объект, выбранный из соединений формулы I и их фармацевтически приемлемых солей. Кроме того, пока не указано по-другому, «соединения формулы I» могут представлять собой одну или более из энантиомерных, диастереомерных и/или геометрических (или конформационных) форм соединения(ий); например, R и S конфигурации для каждого асимметрического центра, (Z) и (E) изомеры по двойной связи и (Z) и (E) конформационные изомеры. Пока не указано по-другому, изображенные здесь соединения, сосуществующие с таутомерными формами, включены в область раскрытия. Кроме того, пока не указано по-другому, считается, что изображенные здесь структуры включают соединения, которые отличаются только присутствием одного или нескольких изотопнообогащенных атомов. Например, соединения, имеющие изображенные структуры, кроме замещения атомама водорода дейтерием или тритием или замещения атома углерода ¹³C- или ¹⁴C-обогащенным углеродом включены в область этого раскрытия. Такие соединения могут быть пригодны, например, в качестве аналитических инструментов или зондов в биологических исследованиях.

[0018] Формула I может быть представлена следующим образом:

[0019] «Фармацевтически приемлемая соль» представляет собой соль, которая сохраняет желательную биологическую активность исходного соединения и не сообщает нежелательных токсикологических эффектов. Примерами таких солей являются: (a) аддитивные соли кислот, образованные неорганическими кислотами, такими как соляная кислота, бромистоводородная кислота, серная кислота, фосфорная кислота, азотная кислота и подобные; и соли, образованные органическими кислотами, такими как уксусная кислота, щавелевая кислота, винная кислота, янтарная кислота, малеиновая кислота, фумаровая кислота, глюконовая кислота, лимонная кислота, яблочная кислота, аскорбиновая кислота, бензойная кислота, дубильная кислота, пальмитиновая кислота, альгиновая кислота, полиглютаминовая кислота, нафталинсульфоновая кислота, метансульфоновая кислота, пара-толуолсульфоновая кислота, нафталиндисульфоновая кислота, полигалактуроновая кислота и подобные; и (b) соли, образованные одноэлементными анионами, такими как хлорид, бромид и йодид. Смотри, например, работы Haynes и др., «Commentary: Occurrence of Pharmaceutically Acceptable Anions and Cations in the Cambridge Structural Database» J. Pharmaceutical Sciences, vol. 94, no. 10 (2005), и Berge и др., «Pharmaceutical Salts» J. Pharmaceutical Sciences, vol. 66, no. 1 (1977), которые включены здесь в виде ссылок.

[0020] Выражение «твердая форма» относится к аморфной или кристаллической форме соединения формулы I. В некоторых вариантах осуществления твердая форма, по меньшей мере, одного соединения формулы I является кристаллической формой 1. Твердые формы можно идентифицировать и отличать друг от друга по одному или нескольким аналитическим тестам и/или физическим свойствам, таким как, например, дифрактограммы рентгеновской порошковой дифракции (XRPD), структура монокристалла, информация по тепловому потоку, получаемая методом дифференциальной сканирующей калориметрии (DSC), абсорбционно-десорбционные диаграммы, получаемые методом динамической сорбции паров (DVS), и/или термодинамическая стабильность. Однако рядовому специалисту в данной области будет понятно, что результаты таких аналитических методик могут варьироваться из-за экспериментальной ошибки, например, на ±10%. Например, возможны вариации интенсивностей и/или положений пиков на XRPD-дифрактограммах даже для одной кристаллической формы. Таким образом, рядовым специалистам в данной области будет понятно, что указанные здесь значения максимумов пиков на XRPD-дифрактограммах (в градусах два-тета) обычно соответствуют указанному значению ±0,2 градуса два-тета, допустимое отклонение.

[0021] Термин «изомеры» относится к соединениям, имеющим одинаковое количество и тип атомов и, следовательно, одинаковую молекулярную массу, но различающимся в отношении расположения или конфигурации атомов. Термин «стереоизомеры» относится к соединениям, которые имеют одинаковое соединение атомов, но разные расположения атомов в пространстве. Термин «диастереоизомеры» или «диастереомеры» относится к стереоизомерам, которые не являются энантиомерами. Термин «энантиомеры» относится к стереоизомерам, которые представляют собой несовмещаемые зеркальные изображения друг друга. Термин «геометрические изомеры» относится к цис-транс изомерам, имеющим разные положения групп относительно двойной связи, или цикла, или центрального атома.

[0022] Описанные здесь энантиомеры могут включать «энантиомерно чистые» изомеры, которые содержат по существу один энантиомер, например, в количестве, большем или равном 90%, 92%, 95%, 98% или 99%, или равном 100% одного энантиомера, по конкретному центру или центрам асимметрии. Термин «центр асимметрии» или «хиральный центр» относится к тетраэдрическому атому углерода, который содержит четыре разных заместителя.

[0023] Используемое здесь выражение «стереоизомерно чистое» обозначает соединение или его композицию, которая содержит один стереоизомер соединения и по существу не содержит других стереоизомеров этого соединения. Например, стереоизомерно чистая композиция соединения, имеющего один хиральный центр, по существу не будет содержать противоположного энантиомерного соединения. Стереоизомерно чистая композиция соединения, имеющего два хиральных центра, по существу не будет содержать диастереомеров и по существу не будет содержать противоположного энантиомерного соединения. Типичное стереоизомерно чистое соединение содержит более примерно 80% масс. одного стереоизомерного соединения и менее примерно 20% масс. других стереоизомеров соединения, предпочтительнее более примерно 90% масс. одного стереоизомера соединения и менее примерно 10% масс. других стереоизомеров соединения, еще предпочтительнее более примерно 95% масс. одного стереоизомера соединения и менее примерно 5% масс. других стереоизомеров соединения и наиболее предпочтительно более примерно 97% масс. одного стереоизомера соединения и менее примерно 3% масс. других стереоизомеров соединения. Смотри, например, патент США №7189715.

[0024] «R» и «S» как термины, описывающие изомеры, являются идентификаторами стереохимической конфигурации по асимметрично замещенному атому углерода. Асимметрично замещенный атом углерода обозначают как «R» или «S», применяя правила приоритета Кана-Ингольда-Прелога, что хорошо известно специалистам в данной области и описано в правилах International Union of Pure and Applied Chemistry (IUPAC) для номенклатуры органической химии, параграф E, стереохимия.

[0025] Используемое здесь выражение «фармацевтически приемлемый носитель» относится к нетоксичному носителю, адъюванту и/или разбавителю, который не уничтожает фармакологическую активность соединения, с которым его смешивают. Фармацевтически приемлемые носители, адъюванты и/или наполнители, которые можно использовать в композициях по этому раскрытию, включают, но не ограничены этим, ионообменники, оксид алюминия, стеарат алюминия, лецитин, сывороточные белки, такие как человеческий сывороточный альбумин, буферные вещества, такие как фосфаты, глицин, сорбиновая кислота, сорбат калия, смеси частичных глицеридов насыщенных растительных жирных кислот, воду, соли, электролиты, такие как протаминсульфат, динатрийгидрофосфат, калийгидрофосфат, хлорид натрия, соли цинка, коллоидный диоксид кремния, трисиликат магния, поливинилпирролидон, вещества на базе целлюлозы, полиэтиленгликоль, циклодекстрины, натрийкарбоксиметилцеллюлозу, полиакрилаты, воски, полиэтилен-полиоксипропиленовые блокполимеры, полиэтиленгликоль и ланолин.

[0026] Термин «лечение», «лечить» или «обработка» рака относится к обратному процессу (например, преодолению блокады дифференцировки клеток), облегчению (например, облегчению одного или нескольких симптомов, таких как утомление из-за анемии, малокровие и т.д.), и/или задержка прогрессирования (например, задержка прогрессирования такого состояния как трансформация в AML) описанного здесь ракового заболевания.

[0027] Используемый здесь термин «субъект» обозначает субъект-животное, такое как субъект-млекопитающее и, например, человека.

[0028] В некоторых вариантах осуществления твердая форма, по меньшей мере, одного соединения формулы I является кристаллической формой 1.

[0029] Можно получить аморфные формы фармацевтически приемлемых солей соединения формулы I, например, объединяя, по меньшей мере, одно свободное основание соединения формулы I с системой растворителя, содержащей, по меньшей мере, одну кислоту, выбранную из следующих: фосфорная кислота, серная кислота, соляная кислота, бромистоводородная кислота, уксусная кислота и метансульфоновая кислота, и необязательно дополнительно содержащей воду. Аморфную форму свободного основания соединения формулы I можно получить, например, медленным испарением растворов, содержащих свободное основание соединения формулы I и, по меньшей мере, один растворитель, выбранный из метанола, тетрагидрофурана, ацетонитрила и изопропилового спирта. Медленное испарение может включать неплотное закрывание пробирки, содержащей раствор, подлежащий испарению, и позволение, по меньшей мере, одному растворителю испаряться при комнатной температуре в течение примерно 3 дней или сколько необходимо. В некоторых вариантах осуществления свободное основание соединения формулы I присутствует в количестве примерно 1-2 мг и, по меньшей мере, один растворитель присутствует до испарения в объеме около 2 мл.

[0030] В некоторых вариантах осуществления кристаллическую форму 1 свободного основания соединения формулы I можно получить, например, медленным испарением (например, как описано ранее) растворов, содержащих свободное основание соединения формулы I и, по меньшей мере, один растворитель, выбранный из толуола, ацетона, этилацетата и смеси 9:1 (об./об.) MTBE/DCM. В некоторых вариантах осуществления свободное основание соединения формулы I присутствует в количестве примерно 5 мг, и, по меньшей мере, один растворитель присутствует до испарения в объеме около 5 мл. XRPD-дифрактограммы продуктов, полученных медленным испарением указанных выше растворителей, показаны на фигуре 2.

[0031] Аналогично, кристаллическую форму 1 свободного основания соединения формулы I можно получить, например, медленным охлаждением растворов, содержащих свободное основание соединения формулы I и либо смесь 1:1 (об./об.) MTBE/гептан, либо смесь 1:1 (об./об.) этилацетат/гептан, от примерно 50°C до комнатной температуры за период около 20 мин. с последующим охлаждением до -5°C и сбором фильтрованием. В некоторых вариантах осуществления свободное основание соединения формулы I присутствует в количестве от примерно 0,2 г до примерно 9 г и, по меньшей мере, один растворитель присутствует в объеме от примерно 12v до примерно 14v (примерно от 8 мл до примерно 172 мл общего объема растворителя). XRPD-дифрактограммы продуктов, получаемых медленным испарением указанных выше растворителей, показаны на фигуре 3.

[0032] Кристаллическую форму 1 свободного основания соединения формулы I также можно получить, например, медленным испарением растворов, содержащих свободное основание соединения формулы I и, по меньшей мере, одну систему растворителя, выбранную из раствора 5% метанола в этилацетате, раствора 5% метанола в MTBE, раствора 5% метанола в смеси 1:1 (об./об.) MTBE/гептан, раствора 5% метанола в смеси 1:1 (об./об.) этилацетат/гептан, раствора 5% этанола в этилацетате, раствора 5% этанола в MTBE, раствора 5% этанола в смеси 1:1 (об./об.) MTBE/гептан и раствора 5% этанола в смеси 1:1 (об./об.) этилацетат/гептан. В некоторых вариантах осуществления свободное основание соединения формулы I присутствует в количестве примерно 0,5 мг, и, по меньшей мере, один растворитель присутствует в объеме около 1 мл.

[0033] Кристаллическую форму 1 свободного основания соединения формулы I также можно получить, например, резким (быстрым) охлаждением (как описано ниже) растворов, содержащих свободное основание соединения формулы I и, по меньшей мере, одну систему растворителя, выбранную из смеси 1:1 (об./об.) MTBE/гептан и 1:1 (об./об.) этилацетат/гептан. Резкое (быстрое) охлаждение может включать повышение температуры раствора до 80°C, поддержание этой температуры в течение 10 мин. и затем помещение раствора в морозильную камеру -20°C. Через 30 мин. смесь можно вынуть из морозильной камеры и выделить твердые вещества фильтрованием. В некоторых вариантах осуществления свободное основание соединения формулы I присутствует в количестве примерно 3,9 г, и, по меньшей мере, один растворитель присутствует в объеме около 105 мл. Для анализа твердое вещество, а также небольшое количество раствора можно намазать на пластину для XRPD-образца, позволяя растворителю испаряться (например, в течение 1 час.) при комнатной температуре. Полученные кристаллы и XRPD-дифрактограммы продуктов, полученных резким (быстрым) охлаждением указанных выше растворителей и последующим фильтрованием, показаны на фигурах 4 и 5, соответственно.

[0034] Медленное выпаривание из MTBE (1% воды в MBTE, по измерениям KF) или смеси насыщенный водой MTBE/гептан не дает конверсии кристаллической формы 1 в аморфную или другую кристаллическую форму.

[0035] В некоторых вариантах осуществления настоящее раскрытие представлено кристаллической формой 1 свободного основания соединения формулы I. В некоторых вариантах осуществления настоящее раскрытие касается кристаллической формы 1, имеющей рентгеновскую порошковую дифрактограмму по существу такую, как показана на любой из фигур 1, 2, 3 и 5. Используцемая здесь рентгеновская порошковая дифрактограмма является «по существу такой, как показано» на одной или нескольких из приведенных здесь фигур, если она аналогична диаграмме на фигуре(ах) с учетом возможных вариаций в положениях пиков из-за экспериментальных отклонений и также из-за используемых условий измерения, но без учета величины (количественной или относительной) интенсивности пиков.

[0036] В некоторых вариантах осуществления XRPD-дифрактограмма кристаллической формы 1 имеет, по меньшей мере, один, по меньшей мере, два, по меньшей мере, три, по меньшей мере, четыре, по меньшей мере, пять, по меньшей мере, шесть, по меньшей мере, семь, по меньшей мере, восемь или девять пиков, выбранных из пиков, имеющих максимум при 5,869, 7,749, 12,837, 15,276, 18,220, 19,925, 21,184, 23,586 и 25,817 градуса два-тета (или округленные значения). В некоторых вариантах осуществления можно наблюдать отклонение±0,2(00) на одном или нескольких максимумах пиков.

[0037] В некоторых вариантах осуществления XRPD-дифрактограмма кристаллической формы 1 имеет, по меньшей мере, один, по меньшей мере, два, по меньшей мере, три, по меньшей мере, четыре, по меньшей мере, пять, по меньшей мере, шесть, по меньшей мере, семь, по меньшей мере, восемь или девять пиков, выбранных из пиков, имеющих максимум при 5,9, 7,7, 12,8, 15,3, 18,2, 19,3, 21,2, 23,6 и 25,8 градуса два-тета. В некоторых вариантах осуществления можно наблюдать отклонение±0,2 на одном или нескольких максимумах пиков. В некоторых вариантах осуществления XRPD-дифрактограмма кристаллической формы 1 имеет, по меньшей мере, один, по меньшей мере, два, по меньшей мере, три, по меньшей мере, четыре, по меньшей мере, пять, по меньшей мере, шесть, по меньшей мере, семь, по меньшей мере, восемь или девять пиков, выбранных из пиков, имеющих максимум при 5,87, 7,75, 12,84, 15,28, 18,22, 19,29, 21,18, 23,59 и 25,82 градуса два-тета. В некоторых вариантах осуществления можно наблюдать отклонение±0,20 на одном или нескольких максимумах пиков. В некоторых вариантах осуществления, XRPD-дифрактограмма кристаллической формы 1 имеет, по меньшей мере, один, по меньшей мере, два, по меньшей мере, три, по меньшей мере, четыре, по меньшей мере, пять, по меньшей мере, шесть, по меньшей мере, семь, по меньшей мере, восемь или девять пиков, выбранных из пиков, имеющих максимум при 5,869, 7,749, 12,837, 15,276, 18,220, 19,295, 21,184, 23,586 и 25,817 градуса два-тета. В некоторых вариантах осуществления можно наблюдать отклонение±0,200 на одном или нескольких максимумах пиков.

[0038] В некоторых вариантах осуществления, XRPD-дифрактограмма кристаллической формы 1 имеет, по меньшей мере, один пик, выбранный из пиков при 5,9±0,2, 7,7±0,2, 12,8±0,2, 15,3±0,2, 18,2±0,2, 19,3±0,2, 21,2±0,2, 23,6±0,2 и 25,8±0,2 градуса два-тета. В некоторых вариантах осуществления XRPD-дифрактограмма кристаллической формы 1 имеет пик при 18,2±0,2 градуса два-тета. В некоторых вариантах осуществления XRPD-дифрактограмма кристаллической формы 1 имеет пики при 7,7±0,2, 15,3±0,2 и 18,2±0,2 градуса два-тета. В некоторых вариантах осуществления XRPD-дифрактограмма кристаллической формы 1 имеет пики при 7,7±0,2, 15,3±0,2, 18,2±0,2, 19,3±0,2 и 21,2±0,2 градуса два-тета.

[0039] В некоторых вариантах осуществления кристаллическая форма 1 имеет пространственную группу P2₁. В некоторых вариантах осуществления, размеры элементарной ячейки кристаллической формы 1: a=5,9306(2) Å, b=17,4304(6) Å, c=15,1800(5) Å, β=99,641(2). В некоторых вариантах осуществления элементарная ячейка кристаллической формы 1 имеет объем 1547,23(9) ų.

[0040] В некоторых вариантах осуществления настоящее раскрытие касается фармацевтических композиций, содержащих, по меньшей мере, одну твердую форму, по меньшей мере, одного соединения формулы I. В некоторых вариантах осуществления, фармацевтические композиции дополнительно содержат, по меньшей мере, один дополнительный компонент, выбранный из фармацевтически приемлемых носителей, фармацевтически приемлемых разбавителей и фармацевтически приемлемых наполнителей.

[0041] В некоторых вариантах осуществления твердая форма, по меньшей мере, одного соединения формулы I в фармацевтических композициях является аморфной формой, по меньшей мере, одного соединения формулы I. В некоторых вариантах осуществления аморфная форма, по меньшей мере, одного соединения формулы I представляет собой аморфную форму, по меньшей мере, одной фармацевтически приемлемой соли соединения формулы I. В некоторых вариантах осуществления, по меньшей мере, одна фармацевтически приемлемая соль выбрана из аддитивных солей кислот, образованных, по меньшей мере, одной кислотой, выбранной из следующих: соляная кислота, бромистоводородная кислота, серная кислота, фосфорная кислота, азотная кислота, уксусная кислота, щавелевая кислота, винная кислота, янтарная кислота, малеиновая кислота, фумаровая кислота, глюконовая кислота, лимонная кислота, яблочная кислота, аскорбиновая кислота, бензойная кислота, дубильная кислота, пальмитиновая кислота, альгиновая кислота, полиглютаминовая кислота, нафталинсульфоновая кислота, метансульфоновая кислота, пара-толуолсульфоновая кислота, нафталиндисульфоновая кислота и полигалактуроновая кислота. В некоторых вариантах осуществления, по меньшей мере, одна фармацевтически приемлемая соль выбрана из аддитивных солей кислот, образованных, по меньшей мере, одной кислотой, выбранной из соляной кислоты, серной кислоты, фосфорной кислоты, уксусной кислоты и метансульфоновой кислоты.

[0042] В некоторых вариантах осуществления твердая форма, по меньшей мере, одного соединения формулы I в фармацевтических композициях является кристаллической формой 1, по меньшей мере, одного соединения формулы I.

[0043] В некоторых вариантах осуществления настоящее раскрытие касается фармацевтических композиций, состоящих, по меньшей мере, из одной твердой формы, по меньшей мере, одного соединения формулы I и необязательно, по меньшей мере, одного дополнительного компонента. В некоторых вариантах осуществления фармацевтические композиции содержат в качестве активного ингредиента более 80%, по меньшей мере, одной твердой формы, по меньшей мере, одного соединения формулы I. В некоторых вариантах осуществления фармацевтические композиции содержат в качестве активного ингредиента более 90%, по меньшей мере, одной твердой формы, по меньшей мере, одного соединения формулы I. В некоторых вариантах осуществления фармацевтические композиции содержат в качестве активного ингредиента более 95%, по меньшей мере, одной твердой формы, по меньшей мере, одного соединения формулы I. В некоторых вариантах осуществления фармацевтические композиции содержат в качестве активного ингредиента более 99%, по меньшей мере, одной твердой формы, по меньшей мере, одного соединения формулы I.

[0044] В некоторых вариантах осуществления настоящее раскрытие касается фармацевтических композиций, состоящих по существу из, по меньшей мере, одной твердой формы, по меньшей мере, одного соединения формулы I и необязательно, по меньшей мере, одного дополнительного компонента. По меньшей мере, один дополнительный компонент не является, по меньшей мере, одним соединением формулы I.

[0045] По меньшей мере, один дополнительный компонент в фармацевтических композициях может быть выбран в зависимости от способа введения, для которого предназначена фармацевтическая композиция. Неограничительные примеры подходящих способов введения, для которых можно применять фармацевтическую композицию, включают парентеральное, пероральное введение, ингаляцию распылением, локальное, ректальное, назальное, трансбуккальное, вагинальное введение и введение с помощью имплантированного резервуара. Используемый здесь термин «парентеральный» включает методики подкожных, внутривенных, внутримышечных, внутрисуставных, внутрисиновиальных, внутригрудинных, интратекальных, внутрипеченочных, внутриочаговых и внутричерепных инъекций или вливаний. В некоторых вариантах осуществления способ введения выбран из внутривенного, перорального, подкожного и внутримышечного введения. Стерильные формы для инъекций композиций по этому раскрытию могут представлять собой, например, водные или масляные суспензии. Эти суспензии можно получить по методике, известной в данной области, с использованием подходящих диспергирующих или смачивающих агентов и суспендирующих агентов, известных в данной области. Стерильный препарат для инъекций также может представлять собой стерильный раствор или суспензию для инъекций в нетоксичном парентерально приемлемом разбавителе или растворителе, например, раствор в 1,3-бутандиоле. Неограничительные примеры наполнителей и растворителей, которые можно использовать, включают воду, раствор Рингера и изотонический раствор хлорида натрия. Кроме того, в качестве растворителя и/или суспендирующей среды можно использовать стерильные, нелетучие масла.

[0046] Для этой цели можно использовать любое мягкое нелетучее масло, в том числе синтетические моно- или ди-глицериды. Жирные кислоты, такие как олеиновая кислота и ее производные глицериды, подходят для получения препаратов для инъекций, так как представляют собой природные фармацевтически приемлемые масла, например, оливковое масло или касторовое масло, особенно в их полиоксиэтилированных версиях. Эти масляные растворы или суспензии также могут содержать спиртовой разбавитель или дисперсант с длинной цепью, такой как карбоксиметилцеллюлоза, или аналогичные диспергирующие агенты, которые обычно применяются для получения фармацевтически приемлемых дозированных форм, в том числе эмульсий и суспензий. Для получения можно также применять другие обычно используемые ПАВ, такие как Tweens, Spans и другие эмульгирующие агенты или усилители биодоступности, которые обычно используют в производстве фармацевтически приемлемых твердых, жидких и/или других дозированных форм.

[0047] Для перорального введения можно получить, по меньшей мере, одну твердую форму, по меньшей мере, одного соединения формулы I в виде приемлемой пероральной дозированной формы, включающей, но не ограниченной этим, капсулы, таблетки, водные суспензии или растворы. В случае таблеток для перорального применения обычно используемые носители включают лактозу и кукурузный крахмал. Также можно добавлять лубриканты, такие как стеарат магния. Пригодные разбавители для перорального введения формы в виде капсулы включают лактозу и высушенный кукурузный крахмал. Если требуются водные суспензии для перорального применения, активный ингредиент объединяют с эмульгирующим и/или суспендирующим агентом. Если требуется, можно также добавлять некоторые подсластители, вкусовые агенты или красители.

[0048] По меньшей мере, одну твердую форму, по меньшей мере, одного соединения формулы I по настоящему раскрытию можно применять для лечения различных типов раковых заболеваний, в том числе заболеваний, чувствительных к агентам, которые нацелены на SF3B1. Сообщается о противораковой активности пладиенолида B, которая связана с его нацеливанием на SF3b комплекс, ингибирующий сплайсинг и изменяющий модель экспрессии генов (Kotake и др., «Splicing factor SF3b as a target of the antitumor natural product pladienolide» Nature Chemical Biology 2007, 3, 570-575). Как известно, мутации в генах сплайсингосом, например, в белке субъединицы 1 сплайсинг фактора 3B (SF3B1) вовлечены в ряд раковых заболеваний, таких как злокачественные заболевания системы крови и солидные опухоли. Scott и др., «Acquired mutations that affect pre-mРНК splicing in hematologic malignancies and solid tumors» JNCI 105, 20, 1540-1549.

[0049] Неограничительные примеры злокачественных заболеваний системы крови включают раковые заболевания крови (лейкозы) и раковые заболевания лимфатических узлов (лимфомы). Неограничительные примеры лейкозов включают острый лимфобластный лейкоз (ALL), острый миелогенный лейкоз (AML), хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL), хронический миелогенный лейкоз (CML), хронический миеломоноцитарный лейкоз (CMML), острый моноцитарный лейкоз (AMoL) и т.д. Неограничительные примеры лимфом включают Ходжкинскую лимфому и неходжкинскую лимфому. Неограничительные примеры других злокачественных заболеваний системы крови включают миелодиспластический синдром (MDS).

[0050] Неограничительные примеры солидных опухолей включают карциномы (такие как, например, аденокарцинома, например, рак молочной железы, рак поджелудочной железы, рак простаты, рак толстой кишки и колоректальный рак), рак легких, рак желудка, цервикальный рак, эндометриальный рак, рак яичников, холангиокарциному, глиому и меланому.

[0051] По меньшей мере, одну твердую форму, по меньшей мере, одного соединения формулы I по настоящему раскрытию можно также применять для лечения раковых заболеваний, которые могут быть чувствительны к агентам, которые нацелены на ген или белок сплайсингосомы, отличный от SF3B1. Следующие примеры являются иллюстрациями некоторых из раковых заболеваний, которые могут быть чувствительны к агентам, которые нацелены на сплайсингосому, и никоим образом не предназначены для ограничения области раскрытия. Таким образом, по меньшей мере, одну твердую форму, по меньшей мере, одного соединения формулы I по настоящему раскрытию можно вводить субъектам для лечения различных раковых заболеваний или состояний, таких как:

a) Миелодиспластический синдром (MDS): смотри, например, «SF3B1 mutations in myelodysplastic syndromes: clinical associations and prognostic implications», Damm F. и др. Leukemia, 2011, 1-4; «Frequent pathway mutations in splicing machinery in myelodysplasia» Yoshida K. и др., Nature, 2011, 478, 64-69; «Clinical significance of SF3B1 mutations in myelodysplastic syndromes and myelodysplastic/myeloproliferative neoplasms», Malcovati L. и др., Blood, 2011, 118, 24, 6239-6246; «Mutations in the spliceosome machinery, a novel and ubiquitous pathway 20 in leukemogenesis», Makishima и др., Blood, 2012, 119, 3203-3210; «Somatic SF3B1 mutation in myelodysplasia with ring sideroblasts», Pappaemannuil, E. и др., New England J. Med. 2011, DOI 10,1056/NEJMoal 103283.

b) Хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL): смотри, например, «Defects in the spliceosomal machinery: a new pathway of leukaemogenesis», Maciejewski, J.P., Padgett, R.A., Br. J. Haematology, 2012, 1-9; «Mutations in the SF3B1 splicing factor in chronic lymphocytic leukemia: associations with progression and fludarabine-refractoriness», Rossi et al, Blood, 2011, 118, 6904-6908; «Exome sequencing identifies recurrent mutations of the splicing factor SF3B1 gene in chronic lymphocytic leukemia», Quesada et al, Nature Genetics, 2011, 44, 47-52.

c) Хронический миеломоноцитарный лейкоз (CMML): смотри, например, Yoshida et al, Nature 2011; 30 «Spliceosomal gene mutations are frequent events in the diverse mutational spectrum of chronic myelomonocytic leukemia but largely absent in juvenile myelomonocytic leukemia», Kar S. A. et al, Haematologia, 2012, DOI: 10.3324/haematol.2012.064048; DeBoever и др., «Transcriptome sequencing reveals potential mechanism of cryptic 3' splice site selection in SF3B1-mutated cancers», PLOS Computational Biology, 2013, DOI: 10.1371/journal.pcbi.1004105.

d) Острый миелоидный лейкоз (AML): смотри, например, Malcovati и др., Blood 2011; Yoshida и др., Nature 2011.

e) Рак молочной железы: смотри, например, «Whole genome analysis informs breast cancer response to aromatase inhibition», Ellis и др., Nature, 2012, 486, 353-360; DeBoever и др., «Transcriptome sequencing reveals potential mechanism of cryptic 3' splice site selection in SF3B1-mutated cancers», PLOS Computational Biology, 2013, DOI: 10.1371/journal.pcbi.1004105; Maguire и др., «SF3B1 mutations constitute a novel therapeutic target in breast cancer», J Pathol 2015, 235, 571-580.

f) Увеальная меланома: смотри, например, «SF3Bl mutations are associated with alternative splicing in uveal melanoma», Furney и др., Cancer Disc. 2013, 10, 1122-1129; DeBoever и др., «Transcriptome sequencing reveals potential mechanism of cryptic 3' splice site selection in SF3Bl-mutated cancers», PLOS Computational Biology, 2013, DOI: 10.1371/journal.pcbi.1004105.

g) Эндометриальный рак: смотри, например, Tefferi и др., «Myelodysplastic syndromes», N Engl J Med. 2009; 361:1872-85.

h) Рак желудка: смотри, например, Int J Cancer. 2013 Jul;133(l):260-5, «Mutational analysis of splicing machinery genes SF3B1, U2AF1 and SRSF2 in myelodysplasia and other common tumors», Je и др.

i) Рак яичников: смотри, например, Int J Cancer. 2013 Jul;133(l):260-5, «Mutational analysis of splicing machinery genes SF3B1, U2AF1 and SRSF2 in myelodysplasia and other common tumors», Je и др.

j) Рак желчных протоков, такой как холангиокарцинома и рак поджелудочной железы: смотри, например, Biankin и др., «Pancreatic cancer genomes reveal aberrations in axon guidance pathway genes», Nature 2012, 491,399-405.

k) Рак легких: смотри, например, «Exome sequencing identifies recurrent mutations of the splicing фактор SF3B1 gene in chronic lymphocytic leukemia», Quesada и др., Nature Genetics 44, 47-52 (2012); Scott и др., «Acquired mutations that affect пре-мРНК splicing in hematologic malignancies and solid tumors», JNCI 105, 20, 1540-1549.

[0052] Кроме того, в каталоге соматических мутаций при раке (COSMIC) (Wellcome Trust Sanger Institute, Genome Research Limited, England) сообщается, что SF3B1 мутации обнаружены в образцах различных типов рака.

[0053] В некоторых вариантах осуществления, по меньшей мере, одну твердую форму, по меньшей мере, одного соединения формулы I по настоящему раскрытию вводят субъекту в количестве, которое является эффективным для лечения и/или терапевтически эффективным количеством. Количество, по меньшей мере, одной твердой формы, по меньшей мере, одного соединения формулы I по настоящему раскрытию, которое можно объединить с материалом носителя для получения композиции в виде разовой дозированной формы, может варьироваться в зависимости от субъекта, подлежащего лечению, и способа введения. В некоторых вариантах осуществления фармацевтические композиции составлены таким образом, что субъекту, принимающему эти композиции, можно вводить дозу от 0,21 мг/кг до 100 мг/кг массы тела/в день, по меньшей мере, одной твердой формы, по меньшей мере, одного соединения формулы I в пересчете на массу свободного основания формулы I. В некоторых вариантах осуществления фармацевтические композиции по настоящему раскрытию содержат от 0,21 мг до 50 мг в пересчете на массу свободного основания формулы I, по меньшей мере, одной твердой формы, по меньшей мере, одного соединения формулы I. В некоторых вариантах осуществления фармацевтические композиции по настоящему раскрытию содержат от 0,1 мг до 25 мг, по меньшей мере, одной твердой формы, по меньшей мере, одного соединения формулы I в пересчете на массу свободного основания формулы I, например, от 5 мг до 40 мг.

[0054] Режим дозировки и лечения для конкретного пациента также может зависеть от различных факторов, в том числе от активности конкретного применяемого соединения, возраста, массы тела, общего состояния здоровья, пола, питания пациента, времени введения, скорости экскреции, комбинации лекарств, мнения лечащего врача и тяжести подлежащего лечению конкретного заболевания. Масса, по меньшей мере, одной твердой формы, по меньшей мере, одного соединения формулы I по настоящему раскрытию в композиции также будет зависеть от конкретного соединения/соли в композиции.

[0055] В некоторых вариантах осуществления рак дает положительный тест и/или является положительным для одной или нескольких мутаций в гене или белке сплайсингосомы, где наличие мутации(й) («положительно») может указывать, что рак у субъекта является чувствительным к способу лечения, включающему введение соединения, имеющего целью этот белок и/или сплайсингосому. Примеры таких генов сплайсингосом включают, но не ограничены этим, гены, представленные ниже в таблице 1.

[0056] Таблица 1: гены сплайсингосомы и потенциальные заболевания

Ген сплайсингосомы	Заболевание(ия)
Сплайсинг фактор 3B субъединица 1 (SF3B1)	Смотри выше
U2 малая ядерная РНК вспомогательный фактор 1	MDS, AML, CMML, LUAD, UCEC
(U2AF1)	CMML, MDS, PMF, AML
Серин/аргинин-богатый сплайсинг фактор 2 (SRSF2)	MDS
Цинковый палец (CCCH тип), РНК-связывающий мотив и серин/аргинин богатый 2 (ZRSR2)	Пигментный ретинит
Пре-мРНК-обработка-сплайсинг фактор 8 (PRPF8)	Миелоидные опухоли
U2 малая ядерная РНК вспомогательный фактор 2 (U2AF2)	MDS, PRAD, COAD
Сплайсинг Фактор 1 (SF1)	Миелоидные опухоли, OV, COAD
Сплайсинг фактор 3 субъединица 1 (SF3A1)	MDS
PRP40 пре-мРНК обработка фактор 40 гомолог B (PRPF40B)	LUAD
РНК связывающий мотив белок 10 (RBM10)	COAD
Поли(rC) связывающий белок 1 (PCBP1)	SKCM
Crooked neck-подобный пре-мРНК сплайсинг фактор 1 (CRNKL1)	LUSC
DEAH (Asp-Glu-Ala-His) бокс геликаза 9 (DHX9)	STAD
Пептидил-пролил цис-транс изомераза-подобный 2 (PPIL2)	SKCM
РНК связывающий мотив белок 22 (RBM22)	LUAD
Низкомолекулярный ядерный рибонуклеопротеин Sm D3 (SNRPD3)	GBM, LGG
Возможно АТФ-зависимая РНК геликаза DDX5 (DDX5)	LUAD
Пре-мРНК-сплайсинг фактор ATP-зависимая РНК геликаза DHX15 (DHX15)	DLBCL
Полиаденилат-связывающий белок 1 (PABPC1)	Миелоидные опухоли

Обозначения:

MDS = AML = CMML = LUAD = UCEC = PMF = PRAD= COAD = OV = SKCM = LUSC = STAD = GBM = LGG = DLBCL=

Миелодиспластический синдром Острый миелоидный лейкоз Хронический миеломоноцитарный лейкоз Аденокарцинома легких Эндометриальная карцинома тела матки Прогрессирующий тяжелый фиброз Аденокарцинома простаты Аденокарцинома толстой кишки Серозная цистаденокарцинома яичника Меланома кожи Плоскоклеточная карцинома легких Аденокарцинома желудка Мультиформная глиобластома Слабо дифференцированная глиома головного мозга Диффузная B-крупноклеточная лимфома

[0057] В некоторых вариантах осуществления рак у субъекта может быть чувствителен к способу лечения, включающему введение, по меньшей мере, одной твердой формы, по меньшей мере, одного соединения формулы I, имеющего целью этот белок и/или сплайсингосому даже в отсутствие таких мутаций в гене или белке сплайсингосомы.

[0058] Скрининг или тестирование мутаций можно выполнять любыми известными способами, такими как генотипирование, фенотипирование и т.д., амплификация нуклеиновой кислоты, электрофорез, микроматрицы, блот-анализ, функциональные исследования, иммуноисследования и т.д. Способы скрининга могут включать, например, отбор биологического образца у указанного субъекта, имеющего раковые клетки/ткань.

[0059] Следующие примеры изложены для более полного понимания представленного здесь раскрытия. Следует понимать, что эти примеры приведены только с целью иллюстрации и не предназначены для ограничения данного раскрытия никоим образом.

[0060] ПРИМЕРЫ

[0061] Микроволновое нагревание выполняют, используя микроволновый испускатель или инициатор Biotage Emrys. Колоночную хроматографию проводят, используя Isco Rf200d. Удаление растворителя выполняют, используя либо роторный испаритель Büchi, либо центробежный испаритель Genevac. Препаративную ЖХ/МС выполняют, используя автоочиститель Waters и колонку 19×100 мм XTerra 5 мкм МС C18 в условиях кислотной подвижной фазы. ЯМР спектры регистрируют на спектрометре Varian 400 МГц.

[0062] Если применяют выражение «инертная атмосфера» для описания реактора (например, реакционного сосуда, колбы, стеклянного реактора и подобного), это означает, что воздух в реакторе замещен по существу не содержащим влаги или сухим инертным газом (таким как азот, аргон и подобные).

[0063] Общие способы и экспериментальные детали получения соединения формулы I по настоящему раскрытию указаны ниже.

[0064] Здесь используют следующие аббревиатуры:

MeOH: ДМФА: KHMDS: ЖХМС: TBS Cl: ТГФ: ТСХ:

метанол диметилформамид калий бис(триметилсилил)амид жидкостная хроматография-масс-спектрометрия трет-бутилдиметилсилилхлорид тетрагидрофуран тонкослойная хроматография

[0065] Материалы: следующие соединения являются коммерчески доступными и/или могут быть получены рядом способов, хорошо известных специалисту в области органического синтеза. Соединения формулы I можно получить, применяя описанные здесь взаимодействия и методики. Следует понимать, что далее в описании синтетических способов все предлагаемые условия реакций, в том числе выбор растворителя, реакционная атмосфера, температура взаимодействия, продолжительность эксперимента и методики обработки, можно выбирать так, чтобы они соответствовали стандартным условиям для взаимодействий, пока не указано по-другому. Специалисту в области органического синтеза понятно, что функциональность, присутствующая на разных частях молекулы, должна быть совместима с предлагаемыми реагентами и реакциями. Заместители, несовместимые с условиями реакции, очевидны специалисту в данной области, и поэтому указываются альтернативные способы. Исходные материалы для примеров являются либо коммерчески доступными, либо их легко получить стандартными способами из известных материалов.

[0066] Информация по ЖХМС

Подвижные фазы: A (0,1% муравьиная кислота в H₂O) и B (0,1% муравьиная кислота в ацетонитриле).

Градиент: B 5% → 95% за 1,8 мин.

Колонка: колонка Acquity BEH C18 (1,7 мкм, 2,1×50 мм).

[0067] В патентах США №№7884128 и 7816401 (оба озаглавлены «Process for Total Synthesis of Pladienolide B and Pladienolide D») описаны способы, известные в данной области для синтеза пладиенолида B и D. Синтез пладиенолида B и D также можно проводить, применяя способы, известные в данной области и описанные в работе Kanada и др. «Total Synthesis of the Potent Antitumor 20 Macrolides Pladienolide B and D», Angew. Chem. Int. Ed. 46:4350-4355 (2007). В работе Kanada и др. и публикации PCT заявки WO 2003/099813, озаглавленной «Novel Physiologically Active Substances», описаны способы, известные в данной области для синтеза E7107 (соединение 45 из WO'813) из пладиенолида D (11107D из WO '813). Соответствующий патент США 7550503, Kotake и др.

[0068] Синтез (S)-2-(1-((1-фенил-1H-тетразол-5-ил)сульфонил)пропан-2-ил)пиридина

[0069] Стадия 1: к раствору соли гидрохлориду 2-(пиридин-2-ил)уксусной кислоты MMMMMM (50,2 г, 288,2 ммоль, 1,2 экв.) в метаноле (500 мл, 0,5M) при 0°C добавляют по капле тионилхлорид (31,5 мл, 432,2 ммоль, 1,5 экв.). Реакционную смесь перемешивают при 0°C в течение 60 мин. или до завершения взаимодействия по данным ЖХМС или ТСХ. Реакцию осторожно гасят при помощи карбоната натрия и водный слой экстрагируют этилацетатом. Объединенные органические слои промывают водой, насыщенным соляным раствором, сушат над сульфатом магния, фильтруют и концентрируют в вакууме. Результирующий продукт (NNNNNN, 41,5 г, 275,2 ммоль, 95%) используют на следующей стадии без дополнительной очистки.

[0070] Стадия 2: к раствору сложного эфира NNNNNN (41,5 г, 275,2 ммоль, 1,2 экв.) в ТГФ (1500 мл, 0,2M) при 0°C добавляют натрий 2-метилпропан-2-олат (28,6 г, 288,3 ммоль, 1,25 экв.) и реакционную смесь перемешивают в течение 30 мин. при 0°C до добавления йодметана (34,3 мл, 549,1 ммоль, 2,2 экв.). Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 1 час. или до завершения взаимодействия по данным ЖХМС или ТСХ. Реакцию гасят хлоридом аммония и избыток растворителя удаляют в вакууме. Затем сырой материал экстрагируют этилацетатом. Объединенные органические слои промывают насыщенным соляным раствором и сушат над сульфатом магния. После фильтрования смесь концентрируют в вакууме. Результирующий метиловый сложный эфир (OOOOOO, 41,3 г, 250 ммоль, 91%) используют далее без очистки.

[0071] Стадия 3: к раствору метилового сложного эфира OOOOOO (43,2 г, 260,3 ммоль, 1,2 экв.) в ТГФ (1500 мл, 0,1M) при 0°C добавляют по капле литийалюминийгидрид (312 мл, 312,4 ммоль, 1,2 экв., раствор в ТГФ). Реакционной смеси позволяют постепенно нагреться до 0°C в течение 30 мин. и затем до комнатной температуры в течение 1 час. или до завершения взаимодействия по данным ЖХМС или ТСХ. Реакцию осторожно гасят водой, гидроксидом натрия и водой. После перемешивания смеси в течение 30 мин. отфильтровывают белый осадок и растворитель удаляют в вакууме. Затем реакционную смесь экстрагируют диэтиловым эфиром и объединенные органические фракции промывают водой, насыщенным соляным раствором, сушат над сульфатом магния, фильтруют и концентрируют в вакууме. Результирующий спирт (PPPPPP, 30,2 г, 219,2 ммоль, 84%) используют далее без очистки.

[0072] Стадия 4: к раствору спирта PPPPPP (30,2 г, 219,2 ммоль, 1,2 экв.) в дихлорметане (700 мл, 0,3M) при 0°C добавляют триэтиламин (61,5 мл, 437,4 ммоль, 2,2 экв.) и DMAP (2,7 г, 21,9 ммоль, 0,1 экв.). Добавляют уксусный ангидрид (24,8 мл, 262,4 ммоль, 1,2 экв.) и реакционную смесь перемешивают в течение 30 мин. или до завершения взаимодействия по данным ЖХМС или ТСХ. Реакцию гасят хлоридом аммония, органический слой промывают насыщенным соляным раствором, сушат над сульфатом магния и фильтруют. Затем результирующий раствор выпаривают и сырой ацетат (QQQQQQ, 37,2 г, 206,2 ммоль, 94%) используют на следующей стадии без дополнительной очистки.

[0073] Стадия 5: раствор ацетата QQQQQQ (39,4 г, 219,8 ммоль, 1,2 экв.) растворяют в диэтиловом эфире (100 мл) и затем добавляют 118 г силикагеля. Избыток эфира удаляют в вакууме и затем сырое твердое вещество разбавляют в водном буфере, pH 7 (1970 мл, 0,1M) (гидроксид натрия/одноосновный фосфат натрия/вода). Добавляют свиную панкреатическую липазу тип II (3,3 г, (15 мг/ммоль)) и реакционную смесь перемешивают при 37°C в течение 4 час. или до завершения взаимодействия по данным ТСХ или ЖХМС (через 4 час. конверсия достигает 40% согласно ELSD, определяют энантиомерный избыток методом хиральной SFC, показывая энантиомерное отношение 13:1=S:R). (Условия SFC: программа SFC Investigator (Waters/Thar): Chromscope v1.2, метод: изократический 15% сорастворитель 95:5=гептан:IPA +0,1% DEA за 10 мин., колонка: Lux-Amylose-2, 4,6×250 мм, 5 мкм, общий поток: 4 мл/мин. (3,80 мл от CO₂ насоса, 0,20 мл от модифицирующего насоса), температуру печи устанавливают 35°C и давление в системе устанавливают 100 бар, времена удерживания: требуемый и основной (S)-энантиомер 6,9 мин., меньший (R)-энантиомер 8,4 мин.). Силикагель отфильтровывают и экстрагируют водный слой этилацетатом три раза. Объединенные органические слои промывают насыщенным соляным раствором, сушат над сульфатом магния и концентрируют. Продукт очищают колоночной хроматографией на силикагеле (гексан:этилацетат в качестве элюента), получая требуемый спирт (RRRRRR, 12,5 г, 91 ммоль, 41%).

[0074] Стадия 6: к раствору спирта RRRRRR (12,5 г, 91,2 ммоль, 1,20 экв.) в дихлорметане (570 мл, 0,16M) при комнатной температуре добавляют триэтиламин (13,9 мл, 100,1 ммоль, 1,1 экв.). Реакционную смесь охлаждают до 0°C и затем добавляют метансульфонилхлорид (7,44 мл, 95,5 ммоль, 1,25 экв.). Реакционную смесь перемешивают при 0°C в течение 30 мин. или до завершения взаимодействия по данным ТСХ или ЖХМС. Реакцию гасят бикарбонатом натрия и слои разделяют. Затем водный слой экстрагируют дихлорметаном. Объединенные органические слои промывают насыщенным соляным раствором, сушат над сульфатом магния и концентрируют в вакууме. Результирующий сульфонат SSSSSS (19,2 г, 89 ммоль, 98%) используют далее без дополнительной очистки.

[0075] Стадия 7: к раствору сульфоната SSSSSS (19,2 г, 89 ммоль, 1,2 экв.) в ДМФА (120 мл, 0,1M) при комнатной температуре добавляют карбонат цезия (40,7 г, 125,2 ммоль, 1,4 экв.) и 1-фенил-1H-тетразол-5-тиол (19,1 г, 107,1 ммоль, 1,2 экв.). Результирующую смесь перемешивают при 50°C в течение 48 час. или до завершения взаимодействия по данным ТСХ или ЖХМС. После охлаждения смеси до комнатной температуры добавляют насыщенный соляный раствор и водный слой экстрагируют три раза диэтиловым эфиром. Объединенные органические слои промывают водой, насыщенным соляным раствором и сушат над сульфатом магния. После фильтрования растворитель удаляют в вакууме и остаток очищают колоночной хроматографией на силикагеле (гексан/этилацетат), получая требуемый продукт (TTTTTT, 28,9 г, 88 ммоль, 99%).

[0076] Стадия 8: к раствору сульфида TTTTTT (31,5 г, 105,9 ммоль, 1,2 экв.) в EtOH (700 мл, 0,1M) при -10°C добавляют тетрагидрат молибдата аммония (6,5 г, 5,3 ммоль, 0,25 экв.) и пероксид водорода (108 мл, 1060 ммоль, 5,2 экв., 33% водный раствор). Реакционную смесь перемешивают при -10°C в течение 4 час. или до завершения взаимодействия по данным ТСХ или ЖХМС. Реакцию гасят водой и раствором метабисульфита натрия. Сырой продукт собирают фильтрованием и очищают колоночной хроматографией на силикагеле (гексан:этилацетат в качестве элюента), получая требуемый продукт (UUUUUU, 23,2 г, 70,4 ммоль, 66%). ¹H ЯМР (400 МГц, хлороформ-d) δ: 1,50 (д, J=7,23 Гц, 3 H) 1,66 (ш.с., 1H) 3,75 (м, 1H) 3,94 (дд, J=14,81, 5,22 Гц, 1H) 4,55 (дд, J=14,68, 7,91 Гц, 1H) 7,14-7,22 (м, 2H) 7,29 (с, 1H) 7,57-7,70 (м, 6H) 8,44-8,49 (м, 1H).

[0077] Затем бесцветное масло перекристаллизовывают, используя смесь толуол/гептан (1/1) (1 мл толуола и 1 мл гептана на 100 мг соединения. Смесь осторожно нагревают для смешивания двух растворителей. Cмеси дают охладиться до комнатной температуры в течение 12 час. (Если перекристаллизации не наблюдается, добавляют к раствору один кристалл. Кристалл поможет получить кристаллы при помощи затравки.) Кристаллы образуются медленно во времени. Их можно выделять фильтрованием или удалением жидкого слоя при помощи пипетки. Затем кристаллы промывают гептаном и затем быстро толуолом. Анализируют er сульфона до и после перекристаллизации. (Условия SFC: программа SFC Investigator (Waters/Thar): метод Chromscope v1.2: изократический 10% сорастворитель MeOH за 10 мин., колонка: ChiralPak IC, 4,6×250 мм, 5 мкм, общий поток: 4 мл/мин. (3,80 мл от CO₂ насоса, 0,20 мл от модифицирующего насоса), температуру печи устанавливют при 35°C и давление в системе устанавливают 100 бар, времена удерживания: требуемый и основной (S)-энантиомер 3,5 мин., меньший (R)-энантиомер 3,8 мин.).

[0078] Типичный синтез соединения 1

Схема I

[0079] Стадия 1: синтез (2S,3S,6S,7R,10R,E)-10-((трет-бутилдиметилсилил)окси)-2-((R,2E,4E)-7-((2R,3R)-3-((2S,3S)-3-((трет-бутилдиметилсилил)окси)пентан-2-ил)оксиран-2-ил)-6-гидрокси-6-метилгепта-2,4-диен-2-ил)-7-гидрокси-3,7-диметил-12-oxoоксациклододец-4-ен-6-илацетата. Раствор пладиенолида D (F, 5,3 г, 9,7 ммоль, 1,2 экв.) в ДМФА (80 мл, 0,1M) в атмосфере азота при 0°C обрабатывают имидазолом (4,6 г, 67,8 ммоль, 7,2 экв.) и TBSCl (7,3 г, 48,4 ммоль, 5,2 экв.). Реакционной смеси позволяют нагреться до комнатной температуры и перемешивают в течение 20 час. или до завершения взаимодействия по данным ЖХМС или ТСХ. Реакционную смесь экстрагируют этилацетатом и органический слой промывают насыщенным соляным раствором, сушат над сульфатом натрия, фильтруют и концентрируют в вакууме. Результирующее масло очищают колоночной хроматографией на силикагеле (гексан/этилацетат в качестве элюента), получая требуемый продукт (G, 7,5 г, 9,6 ммоль, 99%).

[0080] Стадия 2: синтез (2S,3S,6S,7R,10R,E)-10-((трет-бутилдиметилсилил)окси)-2-((6R,E)-7-((2R,3S)-3-((трет-бутилдиметилсилил)окси)пентан-2-ил)оксиран-2-ил)-4,5,6-тригидрокс-6-метилгепт-2-ен-2-ил)-7-гидрокси-3,7-диметил-12-oxoоксациклододец-4-ен-6-илацетата. К раствору олефина G (7,6 г, 9,7 ммоль, 1,2 экв.) в дегазированной смеси TEF:H₂O (210 мл:21 мл, 0,21M) в атмосфере азота при 0°C добавляют тетраоксид осмия (24,4 мл, 1,9 ммоль, 0,2 экв., 2,5% раствор в трет-бутаноле), а затем N-метилморфолин N-оксид (2,3 г, 19,5 ммоль, 2,2 экв.). Реакционной смеси позволяют нагреться до комнатной температуры и перемешивают в течение 13 час. или до завершения взаимодействия по данным ЖХМС или ТСХ. Реакцию гасят сульфитом натрия, разбавляют этилацетатом и органический слой промывают водой, сушат над сульфатом магния, фильтруют и концентрируют в вакууме. Результирующее масло очищают колоночной хроматографией на силикагеле (дихлорметан/метанол в качестве элюента), получая требуемый продукт (H, 6,8 г, 8,3 ммоль, 86%).

[0081] Стадия 3: синтез (2S,3S,6S,7R,10R,E)-10-((трет-бутилдиметилсилил)окси)-7-гидрокси-3,7-диметил-12-оксо-2-((E)-4-оксобут-2-ен-2-ил)оксациклододец-4-ен-6-илацетата. К раствору диола H (7,9 г, 9,7 ммоль, 1,2 экв.) в бензоле (350 мл, 0,23 M) в атмосфере азота при комнатной температуре добавляют тетраацетат свинца (8,6 г, 19,4 ммоль, 2,2 экв.). Реакционную смесь перемешивают в течение 30 мин. или до завершения взаимодействия по данным ЖХМС или ТСХ. Реакционную смесь концентрируют и очищают колоночной хроматографией на силикагеле (гексан/этилацетат в качестве элюента), получая требуемый продукт (I, 2,5 г, 5,26 ммоль, 54%).

[0082] Стадия 4: синтез (2S, 3S, 6S, 7R, 10R,E)-10-((трет-бутилдиметилсилил)окси)-7-(1-этоксиэтокси)-3,7-диметил-12-оксо-2-((E)-4-оксобут-2-ен-2-ил)оксациклододец-4-ен-6-илацетата. К раствору альдегида I (1,4 г, 2,9 ммоль, 1,2 экв.) в ТГФ (9,5 мл, 0,5M) добавляют этоксиэтилен (11,1 мл, 40,2 экв.) и пиридиний пара-толуолсульфонат (0,27 г, 0,3 ммоль, 0,1 экв.) при комнатной температуре. Реакционную смесь перемешивают в течение 24 час. или до завершения взаимодействия по данным ЖХМС или ТСХ. Реакцию гасят бикарбонатом натрия и разбавляют этилацетатом. Этилацетат промывают водой, насыщенным соляным раствором, сушат над сульфатом магния, фильтруют и концентрируют в вакууме. Результирующее масло очищают колоночной хроматографией на силикагеле (гексан/этилацетат в качестве элюента), получая требуемый продукт (J, 1,2 г, 2,2 ммоль, 75%).

[0083] Стадия 5: синтез (2S,3S,6S,7R,10R,E)-10-((трет-бутилдиметилсилил)окси)-7-(1-этоксиэтокси)-3,7-диметил-12-оксо-2-((R,2E,4E)-6-(пиридин-2-ил)гепта-2,4-диен-2-ил)оксациклододец-4-ен-6-ил)ацетата. К раствору (S)-2-(1-((1-фенил-1H-тетразол-5-ил)сульфонил)пропан-2-ил)пиридина (UUUUU) (695,2 мг, 2,1 ммоль, 1,5 экв.) в ТГФ (20 мл, 0,26M) в атмосфере азота при -78°C добавляют по капле KHMDS (4,2 мл, 2,1 ммоль, 1,5 экв.) и реакционную смесь перемешивают в течение 20 мин. Затем добавляют по капле альдегид J (780,2 мг, 1,4 ммоль, 1,2 экв.) в ТГФ (1,2 мл). Реакционную смесь перемешивают при -78°C в течение 90 мин. и затем дают нагреться до -20°C в течение 1 час. Реакцию гасят хлоридом аммония, разбавляют этилацетатом и нагревают до комнатной температуры. Органический слой промывают водой, насыщенным соляным раствором, сушат над сульфатом магния, фильтруют и концентрируют в вакууме. Результирующее масло очищают колоночной хроматографией на силикагеле (гексан/этилацетат в качестве элюента), получая требуемый продукт (K, 490 мг, 0,7 ммоль, 53%).

[0084] Стадия 6: синтез (4R,7R,8S,11S,E)-4-((трет-бутилдиметилсилил)окси)-7-(1-этоксиэтокси)-8-гидрокси-7,11-диметил-12-((R,2E,4E)-6-(пиридин-2-ил)гепта-2,4-диен-2-ил)оксациклододец-9-ен-2-она. К раствору ацетата K (490 мг, 0,7 ммоль, 1,2 экв.) в метаноле (15 мл, 0,25M) при комнатной температуре добавляют карбонат калия (155 мг, 0,4 ммоль, 1,5 экв.). Взаимодействие проводят в течение 24 час. или до завершения взаимодействия по данным ЖХМС или ТСХ. Реакцию гасят водой, разбавляют этилацетатом, промывают насыщенным соляным раствором, сушат над сульфатом магния, фильтруют и концентрируют в вакууме. Результирующее пенистое твердое вещество (L, 459 мг, 0,7 ммоль, 100%) используют на следующей стадии без дополнительной очистки.

[0085] Стадия 7: синтез (2S,3S,6S,7R,10R,E)-10-((трет-бутилдиметилсилил)окси)-7-(1-этоксиэтокси)-3,7-диметил-12-оксо-2-((R,2E,4E)-6-(пиридин-2-ил)гепта-2,4-диен-2-ил)оксациклододец-4-ен-6-ил 4-метилпиперазин-1-карбоксилата. К раствору спирта L (459 мг, 0,7 ммоль, 1,2 экв.) в дихлорметане (0,5 мл, 0,1M) при комнатной температуре добавляют N,N-диметиламинопиридин (27,3 мг, 0,2 ммоль, 0,3 экв.) и триэтиламин (1,2 мл, 7,4 ммоль, 10,2 экв.), а затем 4-нитрофенилхлорформиат (451 мг, 02,2 ммоль, 3:0 экв.). Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение трех часов. Затем добавляют N-метилпиперазин (299 мг, 2,98 ммоль, 4,2 экв.) при комнатной температуре. После перемешивания в течение 1 час. реакцию гасят водой и разбавляют дихлорметаном. Органический слой промывают 1N раствором гидроксида натрия и органический слой концентрируют. Результирующее масло очищают колоночной хроматографией на силикагеле (гексан/этилацетат в качестве элюента), получая требуемый продукт (M, 553 мг, 0,75 ммоль, 100%).

[0086] Стадия 8: cинтез (2S,3S,6S,7R,10R,E)-7,10-дигидрокси-3,7-диметил-12-оксо-2-((R,2E,4E)-6-(пиридин-2-ил)гепта-2,4-диен-2-ил)оксациклододец-4-ен-6-ил 4-метилпиперазин-1-карбоксилата (соединение 1). К раствору простого силилового эфира (M, 553 мг, 0,74 ммоль, 1,2 экв.) в метаноле (20 мл, 0,24M) при комнатной температуре добавляют пара-метокситолуолсульфоновую кислоту (425 мг, 2,2 ммоль, 3,2 экв.). Реакционную смесь перемешивают в течение 3 час. или до завершения взаимодействия по данным ЖХМС или ТСХ. Реакцию гасят бикарбонатом натрия и разбавляют этилацетатом. Органический слой промывают водой, насыщенным соляным раствором, сушат над сульфатом магния, фильтруют и концентрируют в вакууме. Результирующее масло очищают колоночной хроматографией на силикагеле (гексан/этилацетат в качестве элюента), получая требуемое соединение 1 (184 мг, 0,33 ммоль, 44%). ¹H ЯМР (400 МГц, хлороформ-d) δ: 0,82-1,20 (м, 3H) 1,22-1,48 (м, 8H) 1,50-1,63 (м, 1H) 1,66-1,83 (м, 4H) 1,97 (с, 1H) 2,27 (с, 1H) 2,33 (с, 3H) 2,40 (ш.с., 3H) 2,45-2,68 (м, 3H) 3,44-3,61 (м, 5H) 3,74 (дд, J=14,2, 7,2 Гц, 2H) 5,24 (д, J=9,3 Гц, 1H) 5,17 (д, J=10,5 Гц, 1H) 5,57-5,76 (м, 2H) 6,22 (дд, J=15,1, 7,5 Гц, 1H) 6,13 (д, J=10,8 Гц, 1H) 6,34 (ддд, J=15,1, 10,7, 1,2 Гц, 1H) 7,14 (т, J=6,2 Гц, 1H) 7,18 (д, J=7,4 Гц, 1H) 7,63 (т, J=7,3 Гц, 1H) 8,57 (д, J=5,1 Гц, 1H). MS (ES+)=556,4 [M+H].

[0087] Типичный синтез кристаллической формы 1

[0088] Свободное основание соединения формулы I (290 мг, 0,52 ммоль, 1 масс., 1 об.) суспендируют в MTBE (3,22 г, 11 масс., 4,35 мл, 15 об.) и нагревают до спокойного кипения с обратным холодильником, после чего образуется белый осадок. Добавляют N-гептан (2,98 г, 10,3 масс., 4,35 мл, 15 об.), поддерживая внутреннюю T≥52°C. Результирующую смесь нагревают при спокойном кипении с обратным холодильником в течение 5 мин., охлаждают до комнатной температуры за 20 мин. и далее до -5°C. После перемешивания при -5°C в течение 10 мин. белый осадок собирают фильтрованием, ополаскивают смесью н-гептана (1,50 мл, 5,2 об.) и MTBE (0,50 мл, 1,7 об.), сушат в атмосфере азота/вакууме в течение 5 мин. и затем переносят в ампулу и дополнительно сушат в вакууме в течение 1 час., получая форму 1 в виде белого кристаллического порошка (206 мг, 0,37 ммоль, 0,71 масс., 71% выход).

[0089] Типичный синтез кристаллической формы 1

[0090] Свободное основание соединения формулы I из 2 партий (8,17 г+4,10 г; всего 12,27 г, 22,1 ммоль, 1 масс., 1 об.) объединяют в колбе на 500 мл (для переноса используют ТГФ, 3×10 мл) и концентрируют, получая 16,41 г желтого масла, которое суспендируют/растворяют в MTBE (61,4 мл, 5 об.). Белый осадок образуется вскоре после добавления MTBE. Смесь концентрируют в вакууме для замены растворителя, получая 15,48 г светло-желтого твердого вещества (остается ~3 г растворителей). Добавляют MTBE (86 мл, 7 об.) (25°C) и смесь нагревают при 50-53°C в течение 0,5 час., получая свободно текущую суспензию. Добавляют н-гептан (86 мл, 7 об.), поддерживая внутреннюю T≥50°C (за 10 мин.). Прекращают нагревание и смеси дают охладиться до комнатной температуры (0 час.: 54°C; 0,5 час.: 38°C; 1 час.: 28°C; 2,5 час.: 25°C). Через 2,5 час. собирают осадок фильтрованием, ополаскивают смесью MTBE (10 мл, 0,82 об.) и N-гептана (20 мл, 1,6 об.) и сушат в атмосфере азота/вакууме в течение 2 час., получая форму 1 в виде не совсем белого кристаллического порошка (9,25 г, 16,3 ммоль, 0,74 масс., 73,8% выход).

[0091] Типичный синтез кристаллической формы 1

[0092] Свободное основание соединения формулы I (с остаточными растворителями; 379 мг, 0,682 ммоль, 1 масс., 1 об., 1 экв.) растворяют в MTBE (2,75 мл, 7 об.) и нагревают до 50°C (белый осадок образуется примерно при 40°C). Добавляют N-гептан (2,75 мл, 7 об.), поддерживая внутреннюю T выше 50°C. По завершении добавления смеси дают охладиться. Через 1 час. (25°C), осадок собирают фильтрованием (прилагают ультразвук для разрыхления твердого вещества), ополаскивают смесью MTBE (0,79 мл, 2 об.) и N-гептана (0,79 мл, 2 об.) и сушат в атмосфере азота/вакууме при температуре окружающей среды в течение 1 час., получая форму 1 в виде белого кристаллического порошка (205 мг, 0,37 ммоль, 0,54 масс., 54% выход).

[0093] Типичный синтез кристаллической формы 1

[0094] Свободное основание соединения формулы I (0,380 г, 0,684 ммоль, 1 масс., 1 об., 1 экв.) растворяют в этилацетате (1,14 мл, 3 об.) и нагревают до 65°C (белый осадок образуется при около 40°C). Добавляют N-гептан (3,42 мл, 9 об.), регулируя внутреннюю T выше 65°C. Результирующей суспензии дают охладиться до комнатной температуры при перемешивании в течение ночи. Осадок собирают фильтрованием (прилагают ультразвук для разрыхления твердого вещества), ополаскивают смесью н-гептана (0,95 мл, 2,5 об.) и этилацетата (0,19 мл, 0,5 об.) и сушат в атмосфере азота/вакууме в течение 1 час., получая форму 1 в виде белого кристаллического порошка (230 мг, 0,414 ммоль, 0,605 масс., 60,5% выход).

[0095] Рентгеновская порошковая дифракция

[0096] Получают XRPD-дифрактограммы кристаллической формы 1, используя дифрактометр X'Pert Pro (Yamato Scientific Co., Ltd.) в режиме передачи. Образец помещают между двух пленок Mylar и фиксируют в держателе образца. Аналитические условия получения XRPD-дифрактограмм показаны ниже в таблице 2.

[0097] Таблица 2: аналитические условия для XRPD-дифрактограмм

Источник рентгеновского излучения	CuKα
Детектор	Полупроводниковый матричный детектор
Напряжение на трубке	45 кВ
Ток трубки	40 мА
Щель Соллера	0,22 радиана
Скорость сканирнования	0,242 градуса/мин.
Размер шага	0,217 гроадуса
Диапазон сканирования	От 3 до 40 градусов

[0098] Таблица 3: перечень типичных пиков для кристаллической форма 1

Градусы 2 тета (°2θ)	D (Å)
5,869	15,25997
7,749	11,40903
12,837	6,89629
15,105	5,86545
15,276	5,80015
15,569	5,69171
15,940	5,56006
16,102	5,50441
18,220	4,86914
19,295	4,60026
19,947	4,45144
20,325	4,36934
21,184	4,19416
21,356	4,16077
23,586	3,77217

[0099] На фигуре 1 представлена типичная XRPD-дифрактограмма кристаллической формы 1.

[0100] Рентгеновская дифракция монокристалла

[0101] Для определения структуры кристалла кристаллической формы 1 применяют рентгеновский дифракционный анализ монокристалла. Свободное основание соединения формулы I (12,21 мг) растворяют в этилацетате (1 мл) и добавляют н-гептан (1 мл). Кристаллы выращивают методом медленного испарения при комнатной температуре в течение 1 дня. Бесцветный монокристалл (0,3×0,2×0,1 мм) устанавливают на стекловолокне. Дифракционные данные собирают при комнатной температуре на системе детектирования рентгенографического изображения R-AXIS RAPID II-R (Rigaku) применяя метод осцилляций по ω оси и используя Cu-Kα излучение и графитовый монохроматор.

[0102] Данные для кристалла и данные по уточнению структуры для формы 1 суммированы в таблице 4. Считают, что решенная структура содержит в каждой элементарной ячейке две молекулы свободного основания соединения формулы I, ориентированные почти напротив друг друга. На фигуре 6 изображена предполагаемая упаковка кристалла формы 1.

[0103] Таблица 4: данные для кристалла и уточнение структуры для формы I

Параметр	Значение
Эмпирическая формула	C31H45N3O6
FW	555,70
Пространственная группа	P21
Размеры элементарной ячейки:
a [Å]	5,9306(2)
b [Å]	17,4303(6)
c [Å]	15,1800(5)
α [°]	90°
β [°]	99,641(2)
γ [°]	90°
V [Å3]	1547,03(9)
Z	2
Dc [мг/мм3]	1,220
Размер кристалла [мм3]	0,3×0,2×0,1
Температура (K)	173(2)
Излучение (длина волны, Å)	1,54178
Монохроматор	Фиксированный монохроматор
Линейный коэф. поглощения, мм-1	0,682
Сбор данных
Количество измеренных отражений Полнота исследования Rmerge 1)	Всего: 15656 Специфические: 5363 0,981 0,05849
Определение и уточнение структуры
Определение структуры Уточнение Количество отражений Количество переменных Остатки: R; Rw2)	Прямые способы (SHELXS97) Полноматричный метод наименьших квадратов по F2 5363 361 0,1118; 0,1983

[0104] Измельчение образца кристаллической формы 1 при помощи ступки и пестика дает изменение в рентгеновской дифрактограмме, как показано на фигуре 7, возможно, указывая на образование аморфного материала.

[0105] Исследование стабильности твердого состояния выполняют на кристаллической форме 1 при следующих условиях:

Хранение при 25°C в течение 7 и 14 дней

Хранение при 40°C/75% RH (открытый) в течение 7 и 14 дней

Хранение при 60°C в течение 7 и 14 дней

В таких условиях существенного разрушения не наблюдается, и XRPD и TGA-DSC анализы образца, хранившегося при 40°C/75% RH (открытым) в течение 14 дней, не показывают изменения кристалличности.

[0106] Биологические исследования

[0107] Протокол исследования жизнеспособности клеток

[0108] Клетки (WiDr и Panc05,24 полученные от ATCC) высевают на 96-луночные планшеты, 2000 клеток/100 мкл/лунка, и инкубируют в течение ночи. Отработанную среду удаляют и добавляют свежую среду, содержащую 9 разных концентраций соединения (100 мкл/лунка), при регулировании концентрации ДМСО из маточного раствора соединения до 0,1%. Каждую обработку соединением выполняют в двух экземплярах или трех экземплярах при каждой концентрации.

[0109] Другой планшет с высеянными клетками определяют в качестве планшета с временем начала отсчета (Tz), к которому добавляют 0,1% ДМСО в среде (100 мкл/лунка), а затем реагент CellTiter-Glo® (Promega Corporation, Madison, Wisconsin) (50 мкл/лунка) для определения ATP как замены жизнеспособности клеток. Среднее значение из определений множества лунок этого планшета используют в качестве Tz.

[0110] Планшеты, обработанные соединением, инкубируют в течение 72 час. при 37°C. Затем добавляют реагент CellTiter-Glo® (50 мкл/лунка) и определяют ATP. Среднее значение из определений в двух или трех экземплярах лунок, обработанных соединением, используют как Ti и засеянные планшеты со средой, имеющей 0,1% ДМСО без соединения, используют в качестве контрольного роста (C).

[0111] Отношение «процентное ингибирование роста/процентная жизнеспособность» рассчитывают следующим образом:

[(Ti-Tz)/(C-Tz)]×100 для концентраций, для которых Ti≥Tz

[(Ti-Tz)/Tz]×100 для концентраций, для которых Ti<Tz.

*Время начала отсчета (Tz), контрольный рост (C) и тестовый рост в присутствии соединения (Ti)

Строят график отношения «процентное ингибирование роста/процентная жизнеспособность» относительно концентрации соединения для определения E_max.

[0112] Рассчитывают 50% ингибирование роста (GI₅₀) из [(Ti-Tz)/(C-Tz)]×100=50, что соответствует концентрации лекарства, дающей при обработке соединением 50% уменьшение повышения ATP без обработки при контрольном росте (C).

[0113] Протокол исследования (биохимического) in vitro сплайсинга

[0114] Получают конструкцию биотин-меченой пре-мРНК аденовирусного типа 2 при удалении интрона (Ad2) (Berg, M.G. и др. 2012 Mol. Cell Bio., 32(7):1271-83) посредством in vitro транскрипции. Путем генного синтеза генерируют Ad2 конструкцию, содержащую Exon 1 (41 нуклеотид), Intron (231 нуклеотид) и Exon 2 (72 нуклеотида), и клонируют в сайты EcoRI и XbaI вектора pGEM®-3Z (Promega) посредством Genewiz® (South Plainfield, New Jersey). Затем линеаризуют плазмиду XbaI посредством биологической переработки и очищают. In vitro транскрипции и очистку транскрибированной пре-мРНК выполняют, используя набор для транскрипции MEGAscript® T7 (Invitrogen™, Life Technologies™, Grand Island, New York) и набор для очистки MEGAclear™ (Invitrogen™, Life Technologies™, Grand Island, New York), соответственно, следуя инструкциям производителей. Соотношение биотин-16-UTP (Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, Indiana) к холодному UTP составляет 1:13 для включения приблизительно двух молекул биотина на сплайсированную Ad2 мРНК.

[0115] Исследование сплайсинга in vitro выполняют при 30°C в 25 мкл реакционной смеси, содержащей 95 мкг ядерный экстракт HeLa (Promega Corporation, Madison, Wisconsin), 47 нМ Ad2 пре-мРНК, ингибитор 25U RNasin RNase (Promega Corporation, Madison, Wisconsin), буфер 1X SP (0,5 мМ ATP, 20 мМ креатинфосфат, 1,6 мМ MgCl₂) и соединения в ДМСО (при 1% конечной концентрации ДМСО). Через 90 мин. инкубации взаимодействие останавливают, добавляя 18 мкл 5M NaCl и смеси инкубируют с 10 мкл покрытых стрептавидином магнитных гранул M-280 (Invitrogen™, Life Technologies™, Grand Island, New York) в течение 30 мин. при комнатной температуре, собирая Ad2 пре- и сплайсированную мРНК. Гранулы промывают дважды 100 мкл буфера, содержащего 10 мМ Tris pH=7,5, 1 мМ EDTA и 2M NaCl, и затем инкубируют в буфере для нанесения РНК на гель, содержащем 95% формамида, при 70°C в течение 10 мин., элюируя РНК. Ad2 РНК разлагают 6% TBE-UREA гелем, переносят на нейлоновую мембрану, производят УФ-сшивку и тестируют IRDye®-меченым стрептавидином (LI-COR, Lincoln, Nebraska). Определяют количество сплайсированной РНК, измеряя интенсивность полос флуоресценции с применением программы LI-COR Image Studio.

[0116] Результаты

[0117] Данные, представленные ниже в таблице 5. E_max относится к максимально достижимой реакции на соединение в исследованном диапазоне доз, при этом отрицательное значение указывает на клеточную летальность. Большее отрицательное значение E_max указывает на большую клеточную летальность для конкретного соединения.

[0118] WIDr-R клетки являются клетками рака толстой кишки, которые имеют химически-индуцированную R1074H мутацию и, как показано, устойчивы к пладиенолиду B с точки зрения ингибирования роста (Yokoi, A. и др., 2011 FEBS Journal, 278:4870-4880). Противоскрининговые соединения в этом исследовании жизнеспособности с «устойчивой» клеточной линией WiDr-R могут показать, обладают ли эти соединения ненаправленным эффектом(ами). Соединения, которые не имеют активности по ингибированию роста (GI₅₀) на устойчивой клеточной линии WiDr-R, но сохраняют активность на исходной клеточной линии WiDr, указывают на то, что модуляция механизма сплайсинга ответственна за ингибирование роста, которое наблюдают на исходной клеточной линии WiDr.

[0119] Описанное выше исследование in vitro сплайсинга (IVS) представляет собой биохимическое исследование, которое отслеживает ингибирование сплайсинга типичной пре-мРНК в мРНК. Это биохимическое исследование дает возможность исследователям оценивать, при какой концентрации соединения сплайсинг данного конкретного транскрипта ингибируется в неклеточном контексте и используется для демонстрации механистической ингибирующей активности сплайсинга.

[0120] Таблица 5: биологическая активность соединения 1

Номер соединения	Панель 05.24 (mt SF3B1 клетки) Emax(%)	Панель 05.24 (mt SF3B1 клетки), GI50 (нМ)	WiDr GI50 (нМ)	WiDr-R GI50 (нМ)	Исследование in vitro сплайсинга (IVS) (нМ)
1	-66,09	32,72	31,78	>1000	1330,00

[0123] Ключ

Панель 05.24 клеточных линий: клетки рака поджелудочной железы, мутантная SF3B1 клеточная линия (Q699H и K700E мутации в SF3B1).

WiDr клетки: клетки рака толстой кишки (дикий тип SF3B1)

WiDr-R клетки: клетки рака толстой кишки (химически индуцированный SF3B1 мутант, устойчивый к E7107 (R1074H мутации)).

1. Кристаллическая форма 1 (2S,3S,6S,7R,10R,E)-7,10-дигидрокси-3,7-диметил-12-оксо-2-((R,2E,4E)-6-(пиридин-2-ил)гепта-2,4-диен-2-ил)оксациклододец-4-ен-6-ил 4-метилпиперазин-1-карбоксилата («соединение 1»), имеющая XRPD-дифрактограмму, в которой присутствует, по меньшей мере, три пика, выбранных из пиков при 5,9±0,2, 7,7±0,2, 12,8±0,2, 15,3±0,2, 18,2±0,2, 19,3±0,2, 21,2±0,2, 23,6±0,2 и 25,8±0,2 градуса два-тета.

2. Кристаллическая форма 1 соединения 1 по п. 1, где соединение 1 является стереоизомерно чистым, то есть содержит менее 5 мас.% других стереоизомеров соединения.

3. Кристаллическая форма 1 соединения 1 по п. 1, где один из трех пиков находится при 18,2±0,2 градуса два-тета.

4. Кристаллическая форма 1 соединения 1 по 1, где XRPD-дифрактограмма имеет пики при 7,7±0,2, 15,3±0,2 и 18,2±0,2 градуса два-тета.

5. Кристаллическая форма 1 соединения 1 по п. 1, где XRPD-дифрактограмма имеет пики при 7,7±0,2, 15,3±0,2, 18,2±0,2, 19,3±0,2 и 21,2±0,2 градуса два-тета.

6. Кристаллическая форма 1 соединения 1 по п. 1, имеющая XRPD-дифрактограмму по существу такую, как показана на фигуре 1.

7. Фармацевтическая композиция, предназначенная для лечения рака, который является положительным для одной или нескольких мутаций в гене или белке сплайсингосомы, содержащая терапевтически эффективное количество кристаллической формы 1 соединения 1 по любому из пп. 1-6 и, по меньшей мере, один дополнительный компонент, выбранный из фармацевтически приемлемых носителей, фармацевтически приемлемых разбавителей и фармацевтически приемлемых наполнителей.

8. Кристаллическая форма 1 соединения 1 по любому из пп. 1-6 , предназначенная для лечения рака, где рак выбран из следующих: миелодиспластический синдром, хронический лимфоцитарный лейкоз, острый лимфобластный лейкоз, хронический миеломоноцитарный лейкоз, острый миелоидный лейкоз, рак толстой кишки, рак поджелудочной железы, эндометриальный рак, рак яичников, рак молочной железы, увеальная меланома, рак желудка, холангиокарцинома и рак легких.

9. Кристаллическая форма 1 соединения 1 по п. 8, где рак представляет собой рак толстой кишки.

10. Кристаллическая форма 1 соединения 1 по п. 8, где рак представляет собой рак поджелудочной железы.

11. Кристаллическая форма 1 соединения 1 по п. 8, где рак представляет собой лейкоз.

12. Кристаллическая форма 1 соединения 1 по п. 8, где рак представляет собой миелодиспластический синдром.

13. Кристаллическая форма 1 соединения 1 по п. 8, где рак представляет собой хронический миеломоноцитарный лейкоз.

14. Кристаллическая форма 1 соединения 1 по п. 8, где рак представляет собой острый миелоидный лейкоз.

15. Кристаллическая форма 1 соединения 1 по п. 8, где рак является положительным для одной или нескольких мутаций в гене или белке сплайсингосомы.

16. Кристаллическая форма 1 соединения 1 по п. 15, где указанный ген или белок сплайсингосомы является сплайсинг фактором 3B, субъединица 1.

17. Фармацевтическая композиция по п. 7, где рак представляет собой рак толстой кишки.

18. Фармацевтическая композиция по п. 7, где рак представляет собой рак поджелудочной железы.

19. Фармацевтическая композиция по п. 7, где рак представляет собой лейкоз.

20. Фармацевтическая композиция по п. 7, где рак представляет собой миелодиспластический синдром.

21. Фармацевтическая композиция по п. 7, где рак представляет собой хронический миеломоноцитарный лейкоз.

22. Фармацевтическая композиция по п. 7, где рак представляет собой острый миелоидный лейкоз.

23. Фармацевтическая композиция по п. 7, где указанный ген или белок сплайсингосомы является сплайсинг фактором 3B, субъединица 1.