Средство для органотипической консервации донорской роговицы

Изобретение относится к медицинской биотехнологии, а именно к офтальмологии. Изобретение представляет собой средство для органотипической консервации донорской роговицы, содержащее среду 199, среду Хэма F-10, хондроитин-сульфат, декстран, гентамицин-сульфат, амфотерицин B и среду Дюльбекко-Игла, согласно изобретению, дополнительно содержит Циклоферон и Цимевен, а в качестве декстрана используют Декстран-Т500, при следующем соотношении компонентов, на 100 мл:

Среда 199 - 25,0 мл

Среда Хэма F-10 - 25,0 мл

Хондроитин-сульфат A - 0,5 г

Декстран-Т500 - 5,0 г

Гентамицин-сульфат - 0,00014 г

Амфотерицин B - 0,00015 г

Циклоферон - 1 мг

Цимевен - 0,5 мг

Среда Дюльбекко-Игла - остальное.

Изобретение позволяет прекратить репликацию герпесвирусов и обеспечить эффективную предоперационную профилактику передачи герпесвирусной инфекции от донора к реципиенту за счет синергетического противовирусного действия компонентов средства.

 

Изобретение относится к медицине, а именно к офтальмологии, и может быть использовано для вирусной деконтаминации трупных донорских роговиц на консервационном этапе и профилактики передачи герпетической инфекции от донора к реципиенту во время сквозной кератопластики.

Ближайшим аналогом является средство для консервации трупных донорских роговиц глаза (Патент РФ №2674585), содержащее: среду 199, среду Хэма F-10, хондроитин-сульфат, декстран-40, гентамицин-сульфат, амфотеррицин В и среду Дюльбекко-Игла, и препарат Полудан (Р/У ЛРС-002205-101114) при следующем соотношении компонентов, на 100 мл: среда 199 25,0, среда Хэма F-10 25,0, хондроитин-сульфат А 0,5, декстран-40 5,0, гентамицин-сульфат 0,00014, амфотерицин В 0,00015, Полудан 1000 ЕД, среда Дюльбекко-Игла остальное.

Недостатком этой среды является то, что использованный препарат Полудан не относится к аномальным нуклеозидам и не способен встраиваться в вирусную ДНК.

Задачей изобретения является создание многокомпонентного средства для органотипической консервации донорской роговицы (при температуре 37°С), обладающего синергетическим противовирусным действием в отношении герпесвирусов, и способствующего выработке эндогенного интерферона для герпесвирусной деконтаминации.

Техническим результатом является прекращение репликации герпесвирусов и обеспечение эффективной предоперационной профилактики передачи герпесвирусной инфекции от донора к реципиенту за счет синергетического противовирусного действия компонентов средства.

Технический результат достигается тем, что средство для органотипической консервации донорской роговицы, содержащее среду 199, среду Хэма F-10, хондроитин-сульфат, декстран, гентамицин-сульфат, амфотерицин В и среду Дюльбекко-Игла, согласно изобретению, дополнительно содержит Циклоферон и Цимевен, а в качестве декстрана используют Декстран-Т500, при следующем соотношении компонентов, на 100 мл:

Среда 199	25,0 мл
Среда Хэма F-10	25,0 мл
Хондроитин-сульфат А	0,5 г
Декстран-Т500	5,0 г
Гентамицин-сульфат	0,00014 г
Амфотерицин В	0,00015 г
Циклоферон	1 мг
Цимевен	0,5 мг
Среда Дюльбекко-Игла	Остальное

При этом среда 199 имеет следующий состав, мг/л: Л-аланин 25; Л-аргинина хлорид 70; аспарагиновая кислота 30; Л-цистеина хлорид - 0,0987; Л-цистина двунатриевая соль; Л-глютаминовая кислота 66,82; Л-глютамин 100; глютатион 0,05; глицин 50; Л-гистидина хлорид одноводный 21,88; Л-гидрооксипролин 10; Л-изолейцин 20; Л-лейцин 60; Л лизина хлорид 70; Л-метионин 15; Л-фенилаланин 25; Л-пролин 40; Л-серин 25; Л-треонин 30; Л-триптофан 10; Л-тирозина двунатриевая соль - 49,72; Л-валин 25; Л-аскорбиновая кислота 0,05; биотин 0,01; кальциферол 0,1; Д-кальция пантотенат 0,01; холина хлорид 0,5; фолиевая кислота - 0,01; и-инозитол 0,05; менафтона натрия бисульфат трехводный 0,019; никотиновая кислота 0,025; никотинамид 0,025; пара-амино-бензойная кислота 0,05; пиридоксальхлорид 0,025; пиридоксинхлорид 0,025; рибофлавин 0,01; тиамина хлорид 0,01; Д-Л-токоферола фосфата двунатриевая соль 0,01; витамина А-ацетат 0,1147; кальция хлорид двухводный 185,5; железа нитрат девятиводный 0,01; калия хлорид 400; калия дегидроортофосфат 60; магния сульфат семиводный 200; натрия хлорид 8000; натрия гидроортофосфат 47,5; аденина сульфат 10; 5-АМФ 0,2; АТФ двунатриевая соль 10; холестерол 0,2; 2-дезоксирибоза 0,5; Д-глюкоза 1000; гуанина хлорид - 0,3; гипоксантин 0,3; Д-рибоза 0,5; натрия ацетата 36,71; натриевая соль фенола красного 17; тимин 0,3; твин 80-5; урацил 0,3; ксантин 0,3.

Среда Хэма F-10 имеет следующий состав, мг/л: Л-аланин 8,91; Л-аргинина хлорид 210,7; Л-аспарагин 1-водный - 15,01; Л-аспарагиновая кислота 13,31; Л-цистеина хлорид 31,53; Л-глютаминовая кислота 14,71; Л-глютамин 146,2; глицин 7,51; Л-гистидина хлорид одноводный 20,96; Л-изолейцин 2,62; Л-лейцин 13,12; Л-лизин 29,3; Л-метионин 4,48; Л-фенилаланин 4,96; Л-пролин 11,51; Л-серин 10,5; Л-треонин 3,57; Л-триптофан 0,61; Л-тирозина натриевая соль 2,25; Л-валин 3,51; биотин 0,024; Д-кальция пантотенат 0,715; хлорид холина 0,698; фолиевая кислота 1,32; и-инозитол 0,541; никотинамид 0,611; пиридоксин-хлорид 0,206; рибофлавин 0,376; тиамина хлорид 1,012; витамин В12 1,36; кальция хлорид двухводный 44,1; сульфат меди пятиводный 0,0025; сульфат железа семиводный 0,8346; хлорид калия - 285; калия дегидрофосфат 83; магния сульфат семиводный 152,7; натрия хлорид 7400; натрия гидроортофосфат 156,2; цинка сульфат семиводный 0,0288; Д-глюкоза 1100; гипоксантин 4,08; липоевая кислота 0,206; натриевая соль фенола красного 12; натрия пируват 110; тимидин 0,727.

Среда Дюльбекко-Игла имеет следующий состав, мг/л: Л-аргинин 84; Л-цистина двунатриевая соль 56,78; Л-глютамин 584; глицин 30; Л-гистидина хлорид одноводный 42; Л-изолейцин 104,8; Л-лейцин 104,8; Л-лизина хлорид 146,2; Л-метионин 30; Л-фенилаланин - 66; Л-серин 42; Л-треонин 95,2; Л-триптофан 16; Л-тирозина двунатриевая соль 89,5; Л-валин 93,6; Д-кальция пантотенат 4; холина хлорид 4; фолиевая кислота 4; и-инозитол 7; никотинамид 4; пиридоксаль-хлорид 4; рибофлавин 0,4; тиамина хлорид 4; кальция хлорид двухводный 264,9; нитрат железа девятиводный 0,1; калия хлорид 400; магния сульфат семиводный 200; натрия хлорид 6400; натрия бикарбонат 3700; натрия дигидроортофосфат двухводный 141,3; Д-глюкоза 4500; натриевая соль фенола красного 15; натрия пируват 110.

Циклоферон (регистрационное удостоверение, номер: Ρ N001049/03), в ампулах, содержит действующее вещество - меглюмина акридонацетат 125,0 мг, вспомогательное вещество - вода для инъекций до 1,0 мл.

Цимевен (регистрационное удостоверение, номер: Π N011681/01), лиофилизированный порошок во флаконах, содержит ганцикловир 500 мг.

Каждая в отдельности взятая среда, как-то: среда 199 как наиболее сложная по своему составу, среда Хэма F-10 и Среда Дюльбекко-Игла как наиболее универсальные, поддерживает высокую жизнеспособность чувствительных клеток перевиваемых линий. Однако для органных культур, которые в процессе культивирования остаются интактными и не относятся к перевиваемым линиям, требуется экспериментальный подбор соотношений нескольких сред, в зависимости от гистогенетической характеристики органной культуры. В этой связи для эндотелия трупной донорской роговицы, который относится к глиальной ткани, наиболее оптимальным является выбор трех сред - среда 199, среда Хэма F-10 и Среда Дюльбекко-Игла, в заявленных соотношениях, имитирующих аминокислотный и метаболический состав водянистой влаги передней камеры интактного глаза.

Хондроитин-сульфат А относится к цитопротекторам - вискоэлластикам, обладая соответствующим знаком и электронным зарядом, он образует поверхностную защитную пленку на клетках эндотелиального пласта роговицы. Тем самым предотвращается механическое повреждение и десквамация клеток эндотелия роговицы в процессе консервации донорского материала.

Декстран-Т500 имеет молекулярную массу 500000 D, относится к высокомолекулярным онкотическим компонентам среды и, таким образом, подобранный в заявленной концентрации, предотвращает процесс набухания клеток и коллоидного вещества стромы донорской роговой оболочки в процессе краткосрочной органотипической консервации.

Для предотвращения роста патогенной микрофлоры добавлены: гентамицин-сульфат, оказывающий бактерицидное действие в отношении широкого спектра грамотрицательных и грамположительных микроорганизмов, и амфотерицин В, обладающий фунгицидным и фунгистатическим действиями.

Препарат Циклоферон представляет собой иммуностимулирующее средство - индуктор эндогенных интерферонов. Обладает противовирусной, в т.ч. противогерпетической активностью за счет активации врожденных биологических внутриклеточных механизмов противовирусной защиты. Усиливает действие аномальных нуклеозидов.

Препарат Цимевен относится к фармакологической группе аномальных нуклеозидов и обладает противовирусной активностью в отношении герпесвирусов. Усиливает действие индукторов интерферонов.

Заявленное средство для органотипической консервации донорской роговицы благодаря входящим в его состав компонентам в обозначенных концентрациях приводит к синергетическому усилению противогерпетической активности.

В результате этого создаются условия для наиболее эффективной элиминации вирусов группы герпеса из трупных донорских роговиц человека на этапе консервации при помощи современных фармакологических противовирусных препаратов, что способствует профилактике передачи герпесвирусной инфекции реципиентам во время кератопластики.

Это подтверждают результаты исследования, в котором использовались образцы консервационных растворов для вирусной деконтаминации. Заявленное средство, полученное по указанной формуле, являлось опытным образцом. В качестве контрольного образца использовался ближайший аналог - средство для консервации роговицы, полученное по Патенту РФ №2674585.

Для оценки противовирусной эффективности использовали экспериментальную модель герпесвирусной инфекции in vitro, заключающуюся в изучении коэффициента вирусного ингибирования данными средствами.

В качестве инфекционного агента использовался вирус простого герпеса 1 типа, который добавлялся в культуру клеток VERO в виде вируссодержащей жидкости.

По результатам проведенного исследования, коэффициент ингибирования опытного образца - заявленного средства составил 62,2%, в то время как коэффициент ингибирования контрольного образца составил 35,3% (р<0,05). Таким образом, было установлено, что заявленное средство обладает более выраженным противовирусным эффектом по сравнению с ближайшим аналогом.

На следующем этапе оценивалось влияние опытного и контрольного средства на жизнеспособность и функции эндотелиального слоя роговицы. Для этого исследовались 12 роговиц, непригодных для трансплантации, полученных из Глазного тканевого банка ФГАУ «НМИЦ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова» Минздрава России. Одна роговица от каждого донора входила в опытную группу, в то время как парная включалась в контрольную группу.

По данным иммуноцитохимического анализа эндотелиальный пласт клеток всех опытных и контрольных роговиц оставался жизнеспособным в до 6-х суток консервации как в опытной, так и в контрольной группе. Потеря эндотелиальных клеток в обеих группах была незначительной и не превышала 1,5%. Анализ функциональной активности эндотелиального слоя двух групп проводился путем изучения экспрессии характерного маркера помпальной функции клеток - фермента Na⁺/K⁺-АТФазы. По результатам сравнительного анализа с использованием программного обеспечения не было установлено отличий между группами.

Таким образом, установлено, что заявленное средство обладает выраженным противовирусным эффектом и превосходит по коэффициенту вирусного ингибирования ближайший аналог, при этом является безопасным для эндотелиальных клеток, не вызывает их повреждения, не нарушает их функциональную активность.

Средство для органотипической консервации донорской роговицы в количестве 100 мл получают следующим образом: в условиях ламинарной комнаты в химически чистую и стерильную мерную колбу сливают вместе две среды: 25 мл среды 199 и 25 мл среды Хэма F-10. Далее последовательно вносят 0,00014 г гентамицин-сульфата, 0,00015 амфотерицина В. Состав разделяют на две равные части по 25 мл и растворяют в первой части 5 г декстрана-Т500, а во второй части 0,5 г хондроитин-сульфата А путем медленного нанесения сухого вещества на поверхность жидкой смеси. После внесения указанных компонентов растворы оставляют до полного набухания на 80-120 минут, после чего полностью растворяют. Затем оба раствора сливают вновь вместе в мерную колбу, добавляют Циклоферон в количестве 1 мг, Цимевен в количестве 0,5 мг и добавляют среду Дюльбекко-Игла до метки 100 мл. Затем, после префильтрации через фильтр «Миллипор» с диаметром пор 0,45 мкм, полученные 100 мл средства для органотипической консервации донорской роговицы, разливают по 20 мл во флаконы, с одновременной «Глубинной стерилизацией» через систему миллипоровых фильтров с диаметром пор 0,22 мкм. Флаконы укупориваются стерильными крышками и помещаются в холодильник для хранения при температуре 4°С не более суток, либо используются сразу для вирусной деконтаминации при температуре 37°С.

Средство используют следующим образом. В условиях стерильного бокса во флакон 20 мл с заявленным средством помещают роговично-склеральный диск, направленный для вирусной деконтаминации, плотно закрывают крышкой и консервируют при температуре 37-38°С в течение 24-х часов, после чего переносят в среду для консервации роговицы, полученную по Патенту РФ №2069951, в условия гипотермии (4-8°С) и хранят в ней.

Использование предлагаемого средства для органотипической консервации донорской роговицы в Глазных тканевых банках России позволит обеспечить более эффективную предоперационную профилактику передачи герпесвирусной инфекции от донора к реципиенту во время сквозной кератопластики за счет синергетического действия входящих в состав противовирусных компонентов.

Средство для органотипической консервации донорской роговицы, содержащее среду 199, среду Хэма F-10, хондроитин-сульфат, декстран, гентамицин-сульфат, амфотерицин В и среду Дюльбекко-Игла, отличающееся тем, что оно дополнительно содержит Циклоферон и Цимевен, а в качестве декстрана используют Декстран-Т500, при следующем соотношении компонентов, на 100 мл:

Среда 199	25,0 мл
Среда Хэма F-10	25,0 мл
Хондроитин-сульфат А	0,5 г
Декстран-Т500	5,0 г
Гентамицин-сульфа	0,00014 г
Амфотерицин В	0,00015 г
Циклоферон	1 мг
Цимевен	0,5 мг
Среда Дюльбекко-Игла	Остальное