Противомикробные средства на основе бета-глюканов, способы их получения и применения
Настоящая группа изобретений относится к области фармацевтики и касается получения бета-глюканов и их применения в фармацевтике. Предложено противомикробное средство, представляющее собой продукт обработки бета-глюкана йодной кислотой или ее солью с последующей очисткой и выделением, где обработку проводят в водной или водно-органической среде с содержанием органических растворителей в количестве от 0,1 до 100%, при рН в диапазоне от 1 до 14, при температуре от 0 до 100°С; и где содержание карбонильных групп в противомикробном средстве составляет от 0,1 до 3 ммоль/г. Группа изобретений относится также к способу получения указанного противомикробного средства и к противомикробным композициям, содержащим эффективное количество указанного противомикробного средства. Группа изобретений обеспечивает получение средства, обладающего противомикробной активностью при высокой биологической безопасности. 4 н. и 4 з.п. ф-лы, 13 табл.
Область техники
Настоящее изобретение относится к области органической и фармацевтической химии и касается получения бета-глюканов и их применения в фармацевтике.
Уровень техники
Бета-глюканы, представляющие собой природные полисахариды, являются одним из наиболее важных классов биополимеров, так как обладают широким спектром биологической активности. Однако на их биологические эффекты оказывают существенное влияние внутри и межмолекулярные взаимодействия между составляющими их полисахаридными молекулами. Для целенаправленного изменения биологических свойств на эти взаимодействия можно воздействовать физическими методами и химическим изменением структуры.
Самыми распространенными способами химической модификации структуры бета-глюканов являются карбоксиметилирование (Carbohydr. Polym. 2004, 57,319-325, J. Biochem. Mol. Biol. 1998, 14, 636-640), сульфатирование (Carbohydr. Res. 2003, 338, 2863-2870) и фосфорилирование (Carbohydr. Polym. 2009, 78, 581-587., Carbohydr. Res. 1997, 299, 203-208).
Более близкой к предлагаемому изобретению является модификация структуры бета-глюканов окислением. При этом основными направлениями являются окисление спиртовой группы в 6 положении с получением соответствующей кислоты и ее производных (International Immunopharmacology 2001, 1, 539-550, J. Agric. Food Chem. 2009, 57, 439-443) и окисление с последующим получением конъюгатов с белками и полифенолами (Planta, 1991, 185, 1, 1-8, RU 2014124783 A).
Наиболее близким к предлагаемому изобретению является WO2013183049А1, описывающий противовирусные композиции окисленных до соответствующих уроновых кислот глюканов, US3856775, посвященный противоопухолевой активности продуктов окисления 1,3-бета-глюканов а также (Journal of Materials Chemistry, 2017, 5, 38), посвященный противомикробной активности нанофибриллярных продуктов окисления целлюлозы.
Сущность изобретения
Настоящее изобретение относится к противомикробному средству, представляющему собой продукт обработки бета-глюкана йодной кислотой или ее солью с последующей очисткой и выделением, где обработку проводят в водной или водно-органической среде с содержанием органических растворителей в количестве от 0,1 до 100%, при рН в диапазоне от 1 до 14, при температуре от 0 до 100°С.
В предпочтительном варианте бета-глюкан представляет собой карбоксиметилцеллюлозу, бета-глюкан хлебопекарных дрожжей, бета-глюкан овса, бета-глюкан ячменя, бета-глюкан рейши, необязательно после предварительной очистки и/или фракционирования.
В предпочтительном варианте содержание карбонильных групп в противомикробном средстве составляет от 0,1 до 3 ммоль/г.
Еще одним объектом изобретения является противомикробное средство, представляющее собой продукт обработки бета-глюкана галогеналкилкарбоновой кислотой или ее солью с последующей его очисткой и выделением, где обработку проводят в водной или водно-органической среде с содержанием органических растворителей в количестве от 0,1 до 100%, при рН в диапазоне от 7 до 14, при температуре от 0 до 100°С в присутствии органических и\или неорганических оснований.
В предпочтительном варианте бета-глюкан представляет собой бета-глюкан хлебопекарных дрожжей, бета-глюкан овса, бета-глюкан ячменя, бета-глюкан рейши, необязательно после предварительной очистки и/или фракционирования.
В предпочтительном варианте степень замещения составляет от 0,1 до 1,5.
Еще одним другим объектом изобретения является противомикробное средство, представляющее собой продукт обработки бета-глюкана галогеналкилкарбоновой кислотой или ее солью с последующей очисткой и выделением полупродукта и его окислением йодной кислотой или ее солью с последующей его очисткой и выделением.
В предпочтительном варианте бета-глюкан представляет собой бета-глюкан хлебопекарных дрожжей, бета-глюкан овса, бета-глюкан ячменя, бета-глюкан рейши, необязательно после предварительной очистки и/или фракционирования.
В предпочтительном варианте содержание карбонильных групп в противомикробном средстве составляет от 0,1 до 3 ммоль/г.
Еще одним другим объектом изобретения является способ получения противомикробного средства, который включает обработку бета-глюкана йодной кислотой или ее солью в водной или водно-органической среде с содержанием органических растворителей в количестве от 0,1 до 100%, при рН в диапазоне от 1 до 14, предпочтительно от 1 до 7, при температуре от 0 до 100°С, предпочтительно от 15 до 50 °С, с последующей очисткой и выделением.
Еще одним другим объектом изобретения является способ получения противомикробного средства, который включает обработку бета-глюкана галогеналкилкарбоновой кислотой или ее солью в водной или водно-органической среде с содержанием органических растворителей в количестве от 0,1 до 100%, при рН в диапазоне от 7 до 14, при температуре от 0 до 100°С, предпочтительно от 15 до 50 °С, в присутствии органических и\или неорганических оснований с последующей очисткой и выделением.
Еще одним другим объектом изобретения является способ получения противомикробного средства, который включает стадии:
обработки бета-глюкана галогеналкилкарбоновой кислотой или ее солью в водной или водно-органической среде при рН в диапазоне от 7 до 14, при температуре от 0 до 100 °С, предпочтительно от 15 до 50 °С, с последующей их очисткой и выделением полупродукта; и
обработку полученного полупродукта йодной кислотой или ее солью в водной или водно-органической среде при рН в диапазоне от 1 до 14, предпочтительно от 1 до 7, при температуре от 0 до 100 °С, предпочтительно от 15 до 50 °С, с последующей очисткой и выделением целевого продукта.
Еще одним объектом изобретения является противомикробная композиция, содержащая эффективное количество противомикробного средства по любому из п.п.1-3 и фармацевтически приемлемые добавки.
Предложенная противомикробная композиция эффективна в отношении вирусов гриппа, герпеса, респираторных вирусных и бактериальных инфекций.
Еще одним другим объектом изобретения является противомикробная композиция, содержащая эффективное количество любого из указанных выше противомикробных средств и по меньшей мере одно другое противомикробное средство.
Предложенная противомикробная композиция эффективна в отношении вирусов гриппа, герпеса, респираторных вирусных и бактериальных инфекций.
Подробное описание изобретения
В контексте настоящего описания:
термин «бета-глюкан» означает полисахарид из мономеров бета-D-глюкозы, связанных между собой гликозидными связями;
термин «карбоксиметилцеллюлоза» означает полисахарид, получаемый по реакции взаимодействия целлюлозы с галогенуксусной кислотой или ее солями, в котором карбоксиметильная группа (-CH2-COOH) в кислой или солевой форме соединяется с гидроксильными группами глюкозных мономеров.
термин «бета-глюкан хлебопекарных дрожжей» означает бета-глюкан, полученный из пекарских дрожжей (Saccharomyces сerevisiae).
термин «бета-глюкан овса» означает полисахарид бета-1,3-1,4-D глюкана, выделяемый из овса.
термин «бета-глюкан ячменя» означает полисахарид бета-1,3-1,4-D глюкана, выделяемый из ячменя.
термин «бета-глюкан рейши» означает полисахарид бета-1,3-1,6-D глюкана, выделяемый из грибов Рейши.
Термин «йодная кислота» означает тетраоксойодат водорода HIO4 или дигидрат йодной кислоты - гексаоксойодат водорода H5IO6, молекулярная масса 227,941 г/моль.
Термин «соли йодной кислоты» означает соединение, состоящее из аниона йодной кислоты (периодата) и катиона щелочного металла, предпочтительно натрия или калия.
Термин «обработка» означает воздействие химических реагентов, проведение химической реакции при определенных условиях (температура, рН раствора, концентрация реагентов и др.).
Термин «выделение» означает процесс высаждение в растворитель, декантация, ультрафильтрация (диализ), центрифугирование, фильтрование, нейтрализация, растворение, сушка при комнатной или повышенной температуре, сушка лиофилизацией и их сочетание.
Термин «очистка» означает обессоливание, промывка растворителем, ультрафильтрация (диализ) и их сочетание.
Термин «галогеналкилкарбоновая кислота» означает алифатическая карбоновая кислота, у которой один или несколько атомов водорода в радикале замещен атомами галогена общей формулы R2R3(СН)nСООR1; где
R1 представляет собой Н;
R2, представляют собой H, линейный или разветвленный С1-С10 алкил, предпочтительно H;
n принимает значения от 0 до 10, предпочтительно n принимает значения от 1 до 2;
R3 представляет собой галоген F, Сl, Br, I, предпочтительно Сl, Br.
Предпочтительно, галогеналкилкарбоновая кислота представляет собой монохлоруксусную кислоту, монобромуксусную кислоту, 2-хлорпропионовую кислоту.
Термин «соль галогеналкилкарбоновой кислоты» означает соединение общей формулы R2R3(СН)nСООR1;
R1 представляет собой Li, Na, K, предпочтительно Na;
R2, представляют собой H, линейный или разветвленный С1-С10 алкил, предпочтительно H;
n принимает значения от 0 до 10, предпочтительно n принимает значения от 1 до 2;
R3 представляет собой галоген F, Сl, Br, I, предпочтительно Сl, Br.
Предпочтительно, галогеналкилкарбоновая кислота представляет собой натриевые соли монохлоруксусной кислоты, монобромуксусной кислоты, 2-хлорпропионовой кислоты.
Термин «фармацевтически приемлемая добавка» означает вещество, разрешенное для использования в фармацевтической промышленности для создания готовых лекарственных форм и не являющееся действующим веществом, но способное влиять как на биологическую эффективность действующего вещества, так и на физические свойства готовой лекарственной формы, например карбонат натрия, гидрокарбонат натрия, аскорбат натрия, лактоза, кальция стеарат, крахмал.
термин «другое противомикробное средство» означает вещество, применяемое для уничтожения вирусов, бактерий, низших грибов и простейших или подавления их жизнедеятельности, например осельтамивир, арбидол.
Термин «полупродукт» означает промежуточный продукт, который применяют для дальнейшего синтеза.
Термин «предварительная очистка» означает очистка исходного сырья с целью удаления примесей перед обработкой.
Термин «фракционирование» означает разделение исходного сырья на фракции с определенной молекулярной массы.
Термин «водно-органическая среда» означает раствор с концентрацией растворенного вещества от 0,00001 до 99,999 массовых %, в котором в качестве растворителя выступает гомогенная смесь воды и органического растворителя в массовом отношении от 100:0,1 до 0,1:100, в частности, смеси воды с этанолом, воды с ацетоном, воды с изопропанолом, воды с диоксаном.
Термин «неорганическое основание» означает любое неорганическое соединение, способное принимать положительно заряженные ионы, в частности, карбонат натрия, гидроксид калия, ацетат натрия, гидроксид натрия, гидрокарбонат натрия, карбонат цезия, карбонат калия, гидроксид лития.
Термин «органическое основание» означает любое органическое соединение, способное принимать положительно заряженные ионы, в частности, триэтиламин, 4-метилморфолин, N-этилдиизопропиламин, трет-бутилат калия, этилат натрия.
Термин «степень замещения» означает количество функциональных групп, введенных в молекулу, предпочтительно карбоксиметильных.
Методы исследования
Высокоэффективная жидкостная хроматография с УФ-спектрофотометрическим и масс-спектрометрическим детектированием (ВЭЖХ-УФ-МС)
Метод использовали для количественного определения осельтамивира в образцах. Анализ проводили на жидкостном хроматографе Agilent 1260 с последовательным детектированием на диодно-матричном и масс-селективном детекторах. Разделение проводили на хроматографической колонке Purospher STAR RP-18e, размером 125 × 4,6 мм с размером частиц 3 мкм, снабженной защитной предколонкой 12,5 × 4,6 мм с тем же сорбентом производства «Agilent», используя в качестве элюента состав, содержащий 50 об. % 100 мМ ацетата аммония с pH=6,9 и 50 об. % ацетонитрила в изократическом режиме элюирования.
Колонку поддерживали при постоянных температуре 40 oС и скорости потока 0,5 мл/мин. В используемом одноквадрупольном масс-спектрометрическом детекторе ионизация осуществляется методом электрораспыления Масс - спектрометрическое детектирование проводили в режиме регистрации положительных ионов, давление на небулайзере - 35 psi, напряжение на фрагменторе - 100 В, поток газа осушителя - 10 л/мин, напряжение на капилляре - 4000 В, режим сканирования по диапазону масс (Scan) - 300-400 Да и режим регистрации по выделенным ионам (SIM) - 313.
Гель-проникающая хроматография (ГПХ)
Метод гель-проникающей хроматографии использовали для определения молекулярной массы и молекулярно-массовых характеристик получаемых 1,4 и исходног-бета-глюканов и сырья. Анализ проводили на жидкостном хроматографе Waters с последовательным детектированием на рефрактометрическом и диодно-матричном детекторах. Разделение проводили на соединенных последовательно колонках Ultrahydrogel 1000 и Ultrahydrogel 120 размером 300 × 7.8 мм, заполненных гелем на основе гидроксилат полиметакрилата с размером пор 1000 и 120 Å соответственно (Waters), используя в качестве элюента 0,05 М фосфатный буферный раствор (рН=7,0) при изократическом режиме элюирования.
Для калибровки колонки использовали стандарты декстрана со средневесовыми молекулярными массами (Мw) 9900, 16230, 41100, 60300, 129000, 214800, 456800.
Калибровочные кривые аппроксимировали полиномом 3-го порядка. Расчет молекулярно-массовых характеристик полимера проводили с использованием универсальной калибровки и программного обеспечения «Breeze 2».
Йодометрическое титрование
Метод йодометрического титрования использовали для определения количества карбонильных групп в образцах.
Данный метод основан на окислении карбонильных групп йодом в щелочной среде. Из-за обратимости данной реакции добавляется щелочь для перевода образующихся кислот в соли. При этом щелочь также реагирует с йодом с образованием гипойодита, который окисляет карбонильную группу до карбоксильной. После окисления кабонила добавляется кислота, для выделения йода из оставшегося гипойодита натрия. Выделившийся в свободном виде йод оттитровывается тиосульфатом натрия. По разнице количества тиосульфата, пошедшего на титрование добавленного йода и избытка, оставшегося после реакции, определяется количество йода, пошедшего на окисление карбонильных групп.
Потенциометрическое кислотно-основное титрование
Данный метод используется для определения степени замещения и определения содержания карбонатов и гидрокарбонатов. Он основан на сжигании солевой формы 1,4-бета-глюкана с образованием карбоната натрия, с последующим определением его количества ацидиметрическим титрованием соляной кислотой.
Определение цитотоксического действия субстанций в культуре клеток
Исследования проводили на клеточной линии MDCK ECACC (Sigma, кат. № 85011435), на 67-70 пассажах. Линию культивировали в среде Игла MEM (ПанЭко), содержащей 10% фетальной сыворотки (HyClone), 300 мкг/мл L-глутамина и 0,1 мг/мл нормоцина.
Клетки линии MDCK ECACC вносили в 96-луночные планшеты в среде Игла MEM (ПанЭко), содержащей 10% фетальной сыворотки (HyClone), 300 мкг/мл L-глутамина и 0,1 мг/мл нормоцина из расчета 18000 кл/лунку, культивировали 24 ч и промывали бессывороточной средой 1 раз перед внесением субстанций.
Для разведения тестируемых веществ использовали поддерживающую среду следующего состава: среда Игла МЕМ (ПанЭко), содержащую 2% фетальной сыворотки (HyClone), 300 мкг/мл L-глутамина, 12 мкг/мл химопсин-трипсина и 0,1 мг/мл нормоцина.
Каждую точку тестировали в 4 параллельных лунках. Последнее разведение помещали в первые 2 лунки из 4, в две последние лунки из 4 вносили поддерживающую среду (контроль среды культивирования).
Клетки инкубировали с тестируемыми веществами в течение 48 ч в CO2-инкубаторе при температуре 37°С, после чего удаляли культуральную среду и в каждую лунку добавляли по 100 мкл поддерживающей среды и 20 мкл раствора витального красителя MTS (Promega, кат.№ G3581). После инкубации в течение 3 ч при 37°С определяли оптическую плотность при длине волны 492 нм и референсной длине волны 620 нм при помощи планшетного спектрофотометра BIO-RAD. Концентрация тестируемого вещества, уменьшающая значение оптической плотности на 50% по сравнению с контролем клеток, принималась за 50% цитотоксическую дозу (СС50). Диапазон от 1 до 30 мг/мл считается малотоксичным.
Изучение действия препаратов на инфекционный титр вируса гриппа в культуре клеток MDCK
В исследованиях использовали вирус гриппа A/Пуэрто-Рико/8/34 (H1N1), адаптированный к линии MDCK. Инфекционную и гемагглютинирующую активность вируса определяли согласно методам, рекомендованным ВОЗ.
Исследования вирусспецифического действия тестируемых веществ в отношении штамма A/Пуэрто Рико/8/34 проводили на клетках MDCK ECACC, используя в качестве поддерживающей среду Игла МЕМ (ПанЭко), содержащую 2% фетальной сыворотки (HyClone), 300 мкг/мл L-глутамина, 12 мкг/мл химопсин-трипсина и 0,1 мг/мл нормоцина. Культуру клеток MDСК ECACC подготавливали так же, как и в опытах по определению цитотоксического действия изучаемых веществ. Перед заражением вирусом клетки MDCK 1 раз промывали бессывороточной средой Игла МЕМ, добавляли предварительно подготовленные разведения препаратов в 100 мкл поддерживающей среды (однократной концентрации) и инкубировали 1 ч при 37°С. Затем добавляли по 10 мкл предварительно приготовленных 10-кратных разведений вируса. Контроли вируса и клеток культивировали в той же среде. Учет результатов проводили через 48 ч по цитопатическому действию и в реакции агглютинации (РГА). В РГА использовали 0,75% взвесь эритроцитов человека (I группа) в физиологическом растворе.
Расчет значений 50% цитотоксической концентрации (CC50) и 50% эффективной концентрации (IC50) для каждого из изученных соединений проводили при помощи пакета программ Exсel и GraphPad Prism 6.01. За рабочую модель для анализа CC50 принимали 4-параметрическое уравнение логистической кривой (пункты меню «Нелинейная регрессия» - «Sigmoidal dose-response (variable slope)»). Для анализа IC50 принимали 4-параметрическое уравнение логистической кривой (пункты меню «Нелинейная регрессия» - «log (inhibitor) vs. response (variable slope)»). Вирусингибирующее действие исследуемых веществ (ΔlgTCID50) оценивали по снижению заражающей вирусной дозы в опыте по сравнению с контролем, вычисляемое по методу Рида и Менча. На основании всех полученных данных, рассчитывали химиотерапевтический индекс (ХТИ) по уравнению:
ХТИ=СС50/ IC50.
Активация культуры ФЛЭЧ веществами
Клетки ФЛЭЧ использовали в концентрации 2 х105 в 1 мл ростовой питательной среды, содержащей ЭТС. Клеточную взвесь разливали в 96-луночные плоскодонные планшеты (Costar/Corning, USA) по 100 мкл в лунку. Планшеты инкубировали при температуре 37°С в атмосфере с 5%-содержанием СО2. Инкубация продолжалась 24 ч.
Раститровку раствора препаратов проводили двойными разведениями в лунках с ФЛЭЧ. В результате концентрация препаратов составляла от 2000 до 15 мкг/мл.
Каждая доза препаратов была внесена в 2 лунки планшета с клетками ФЛЭЧ для получения достаточного объема надосадка. Для контроля влияния культуральной среды на планшете были отведены по 1 вертикальному ряду (всего по 8 лунок).
Инкубацию проводили при температуре 37°С в атмосфере с 5%-содержанием СО2. Через 4 ч надосадки отбирали для дальнейших исследований.
В лунки с монослоем ФЛЭЧ вносили вирус энцефаломиокардита мышей (ВЭМ) в цитопатогенной дозе (100 ЦПД вируса) в среде Игла МЕМ без сыворотки. Учет цитопатического действия вируса на монослое фибробластов осуществляли через 24 ч на инвертированном микроскопе, согласно методике постановки интерферонового статуса (Ф.И. Ершов, 1984).
Определение противовирусной эффективности вещества в отношении вируса гриппа А/California/7/09 pdm (H1N1) на модели гриппозной пневмонии мышей при экстренно-профилактической схеме введения
Предварительно взвешенные мыши линии BALB/c и ICR (CD-1) из питомника НПП «Питомник лабораторных животных» ФИБХ РАН (Московская обл., г. Пущино) (100% самцов, средний вес 12-16 г) инфицировались интраназально под легким наркозом вирусом гриппа А/California/7/09 pdm (H1N1) в дозе 10MLD50/50 мкл (в случае BALB/c) или 1MLD50/50 мкл (в случае ICR). В предварительном опыте было проведено определение доз путем титрования аллантоисного вируса на таких же мышах, которые затем использовались в основном опыте.
Изучение действия исследуемых препаратов при экстренно-профилактической схеме введения осуществляли путем перорального введения (внутрижелудочно с помощью зонда) вещества инфицированным животным через 1 ч, 25 ч, 49 ч, 73 ч и 97 ч после заражения в объеме 100 мкл в пяти дозах (0,1 мг/кг/мышь, 1 мг/кг/мышь, 12 мг/кг/мышь, 100 мг/кг/мышь и 400 мг/кг/мышь) в случае использования мышей BALB/c и в четырех дозах (0,1 мг/кг/мышь, 1 мг/кг/мышь, 12 мг/кг/мышь, 100 мг/кг/мышь) в случае использования мышей ICR.
Препарат сравнения Озельтамивира фосфат зараженным животным вводили внутрижелудочно с помощью зонда один раз в сутки через 1 ч, 25 ч, 49 ч, 73 ч и 97 ч после инфицирования в дозе 25 мг/кг/мышь. Мышам контрольной группы вводили в тех же условиях плацебо (физиологический раствор). За животными наблюдали в течение 14 сут. после заражения, учитывая гибель мышей от гриппозной пневмонии в группах леченых животных и в контроле. Специфичность гибели животных от гриппозной пневмонии подтверждали регистрацией патологоанатомических изменений в легких павших животных опытной и контрольных групп.
В каждой группе было по 15 животных. За лечеными и контрольными животными велось ежедневное наблюдение. Химиотерапевтическую активность соединений на модели гриппозной пневмонии мышей оценивали по трем критериям: показатель защиты от смертельной вирусной инфекции, увеличение средней продолжительности жизни и весу животных по сравнению с контрольной группой (интактные мыши).
Активность препаратов оценивали, сравнивая летальность у животных, принимавших препарат и контрольной группы. Снижение летальности леченых животных по отношению к контролю выражали в процентах.
Все результаты были статистически обработаны по программе EXEL и представлены в виде средних значений и средних отклонений.
Оценка способности образцов активировать иммунологически активные рецепторы
Исследование способности образцов активировать рецептор dectin-1а человека проводилось ген-репортерным методом с использованием специализированных трансгенных клеточных линий производства компании Invivogen: «HEK-Blue™ hDectin-1a Cells» - репортерная клеточная линия на основе клеток HEK 293, экспрессирующая ген dectin-1а человека и «HEK-Blue™ Null1 Cells» - контрольная клеточная линия, являющаяся родительской по отношению к линии, экспрессирующей dectin-1а. Активацию рецепторов оценивали по цветной реакции с секретируемой щелочной фосфатазой (SEAP). При оценке специфичности реакции учитывали, что родительская клеточная линия экспрессирует низкие уровни TLR3, TLR5 и NOD1-рецепторов.
Аналогичным образом, с использованием ген-репортерных линий «THP-1 CD14» и «HEK293-hTLR4 CD14/MD2» оценивали способность образцов активировать рецептор CD14.
Исследования проводили согласно инструкции производителя клеточных линий в диапазоне нетоксичных концентраций β-глюканов, что контролировалось в параллельном эксперименте при помощи витального красителя MTS.
Постановка стимуляции лимфоцитов крови веществами
Из периферической крови, взятой в пробирки BD VACUTAINER с гепарином, выделяли лимфоциты в градиенте плотности HISTOPAQUE-1077 центрифугированием 15 мин при 400 g.
Выделенные и отмытые лимфоциты в полной питательной среде (рабочая среда RPMI-1640 с 10% - эмбриональной телячьей сывороткой) вносили в лунки 96-луночного круглодоного планшета в концентрации 2,5-3 х 106 кл в 1 мл (в объеме 100 мкл). Количество лимфоцитов в лунке 2,5-3 х 105.
Рабочая концентрация растворов исследуемых препаратов для стимуляции составляла 2 мг/мл (концентрация в лунке - 1 мг/мл, т.е. вносили 100 мкл указанного раствора вещества).
Инкубацию проводили при температуре 37°С в атмосфере с 5%-содержанием СО2. Через 20 ч надосадки отбирали для дальнейших исследований и хранили порционно при -40°С, а лимфоциты, собранные из тех же лунок, исследовали на содержание среди них CD69+ Т-клеток. Токсичность веществ в данной концентрации не проявлялась, так как лимфоциты при цитофлюрометрии выглядели стандартно и находились в определенном для них гейте.
Постановка костимуляции клеток крови веществами и ФГА
Образцы цельной крови доноров обрабатывали следующим образом: в лунки культурального 96-луночного круглодонного планшета с 60 мкл рабочей культуральной среды RPMI-1640 добавляли 20 мкл крови, 20 мкл ФГА (12,5 мкг/мл), 100 мкл раствора исследуемых препаратов (2 мг/мл). Общий объем содержимого каждой лунки - 200 мкл, итоговая концентрация экспериментальных веществ - 1 мг/мл.
Через 24 часа культивирования при 37 °С с 5% содержанием СО2 собирали культуральные супернатанты, которые разливали порционно и хранили до постановки ИФА при -40 °С.
Определение активации Т-лимфоцитов, произошедшей в ходе стимуляции, по повышению процента клеток, экспрессирующих маркер CD69
С лимфоцитов, прошедших этап стимуляции, собирали надосадок в объеме 100 мкл, а лимфоциты ресуспендировали в оставшемся объеме культуральной среды (100 мкл). Далее к ним добавляли моноклональные антитела, меченные флуорохромами: CD3 (FITC), CD69 (PE), CD8 (PC5), - все производства Beckman Coulter (США). Пробоподготовка проводилась на автоматической станции TQprep (Beckman Coulter) по безотмывочной технологии. Измерения проводились на проточном цитометре Cytomics FC500 (Beckman Coulter, США) в измерительном протоколе для 3-х цветной метки. Таким образом, получали сведения, какие именно Т-клетки активировались веществами и в каком количестве (%).
Значимым являлось повышение % CD69+ клеток на 2% по сравнению с их содержанием в культуре, не стимулированной веществами (т.е. со спонтанной экспрессией).
Реактивы
Бланоза 7 MF (Nа-карбоксиметилцеллюлоза) - продукт фирмы «Ashland». Порошок светло-желтого цвета. Степень карбоксиметилирования 0,80. Содержание основного вещества 99,5% (мин.).
Бета-глюканы рейши, хлебопекарных дрожжей, овса, ячменя - продукт фирмы «Purest-R».
Осельтамивир фосфат - продукт фирмы «Sigma Aldrich». Порошок белого цвета. Содержание основного вещества 99,2%.
Монохлоруксусная кислота - продукт фирмы «ООО ИРеа 2000». Квалификация ч. Изготовлен согласно ГОСТ 5836-85.
Йодная кислота - продукт фирмы «Panreac». Белый кристаллический порошок. Содержание основного вещества - 98%.
Пункт 1.
Образец 1.
В химический стакан емкостью 2000 мл добавляют 960 мл воды и 80 г КМЦ. Реакционную смесь перемешивают 3 часа, после чего к раствору добавляют раствор 7,5 г йодной кислоты в 50 г воды и перемешивают 24 часа при 25 ° С. Избыток окислителя нейтрализуют, высаживают продукт в ацетоне. Выпавший осадок фильтруют, промывают водным раствором ацетона и чистым ацетоном и сушат.
Образец 2.
В химический стакан емкостью 2000 мл добавляют 960 мл воды и 80 г КМЦ. Реакционную смесь перемешивают 3 часа, после чего к раствору добавляют раствор 7,5 г йодной кислоты в 50 г воды и перемешивают 24 часа при 25 ° С. Избыток окислителя нейтрализуют, высаживают продукт в ацетоне. Выпавший осадок фильтруют, промывают водным раствором ацетона и чистым ацетоном и сушат. Полученный продукт растворяют в растворе карбоната натрия, доводят рН до 3-4, высаживают продукт в ацетоне, осадок отфильтровывают и промывают водным ацетоном, ацетоном и сушат.
Образец 3.
В химический стакан емкостью 2000 мл добавляют 960 мл воды и 80 г КМЦ. Реакционную смесь перемешивают 3 часа, после чего к раствору добавляют раствор 7,5 г йодной кислоты в 50 г воды и перемешивают 24 часа при 25 ° С. Избыток окислителя нейтрализуют, высаживают продукт в ацетоне. Выпавший осадок фильтруют, промывают водным раствором ацетона и чистым ацетоном и сушат. Полученный продукт растворяют в растворе карбоната натрия, доводят рН до 3-4, высаживают продукт в ацетоне, осадок отфильтровывают и промывают водным ацетоном, ацетоном и сушат. Полученный продукт растворяют в растворе гидрокарбоната натрия, доводят рН до 6-7, перемешивают 30 минут. Полученный продукт сушат.
Образец 4.
В химический стакан емкостью 2000 мл добавляют 960 мл воды и 80 г КМЦ. Реакционную смесь перемешивают 3 часа, после чего к раствору добавляют раствор 7,5 г йодной кислоты в 50 г воды и перемешивают 24 часа при 25 ° С. Избыток окислителя нейтрализуют, высаживают продукт в ацетоне. Выпавший осадок фильтруют, промывают водным раствором ацетона и чистым ацетоном и сушат. Полученный продукт растворяют в растворе карбоната натрия, доводят рН до 3-4, высаживают продукт в ацетоне, осадок отфильтровывают и промывают водным ацетоном, ацетоном и сушат. Полученный продукт растворяют в растворе карбоната натрия, доводят рН до 9-10, перемешивают 30 минут. Полученный продукт сушат.
Образец 5.
В химический стакан емкостью 2000 мл добавляют 960 мл воды и 80 г КМЦ. Реакционную смесь перемешивают 3 часа, после чего к раствору добавляют раствор 22,5 г йодной кислоты в 50 г воды и перемешивают 24 часа при 25 ° С. Избыток окислителя нейтрализуют, высаживают продукт в ацетоне. Выпавший осадок фильтруют, промывают водным раствором ацетона и чистым ацетоном и сушат.
Образец 6.
В химический стакан емкостью 2000 мл добавляют 960 мл воды и 80 г КМЦ. Реакционную смесь перемешивают 3 часа, после чего к раствору добавляют раствор 22,5 г йодной кислоты в 50 г воды и перемешивают 24 часа при 25 ° С. Избыток окислителя нейтрализуют, высаживают продукт в ацетоне. Выпавший осадок фильтруют, промывают водным раствором ацетона и чистым ацетоном и сушат. Полученный продукт растворяют в 5% карбонате натрия, фракционируют через мембрану 10 кДа, полученный продукт сушат.
Образец 7.
В химический стакан емкостью 2000 мл добавляют 960 мл воды и 80 г КМЦ. Реакционную смесь перемешивают 3 часа, после чего к раствору добавляют раствор 22,5 г йодной кислоты в 50 г воды и перемешивают 24 часа при 25 ° С. Избыток окислителя нейтрализуют, высаживают продукт в ацетоне. Выпавший осадок фильтруют, промывают водным раствором ацетона и чистым ацетоном и сушат. Полученный продукт растворяют в растворе карбоната натрия, доводят рН до 3-4, высаживают продукт в ацетоне, осадок отфильтровывают и промывают водным ацетоном, ацетоном и сушат.
Образец 8.
В химический стакан емкостью 2000 мл добавляют 960 мл воды и 80 г КМЦ. Реакционную смесь перемешивают 3 часа, после чего к раствору добавляют раствор 22,5 г йодной кислоты в 50 г воды и перемешивают 24 часа при 25 ° С. Избыток окислителя нейтрализуют, высаживают продукт в ацетоне. Выпавший осадок фильтруют, промывают водным раствором ацетона и чистым ацетоном и сушат. Полученный продукт растворяют в растворе карбоната натрия, доводят рН до3-4, высаживают продукт в ацетоне, осадок отфильтровывают и промывают водным ацетоном, ацетоном и сушат. Полученный продукт растворяют в растворе гидрокарбоната натрия, доводят рН до 6-7, перемешивают 30 минут. Полученный продукт сушат.
Образец 9.
В химический стакан емкостью 2000 мл добавляют 960 мл воды и 80 г КМЦ. Реакционную смесь перемешивают 3 часа, после чего к раствору добавляют раствор 22,5 г йодной кислоты в 50 г воды и перемешивают 24 часа при 25 ° С. Избыток окислителя нейтрализуют, высаживают продукт в ацетоне. Выпавший осадок фильтруют, промывают водным раствором ацетона и чистым ацетоном и сушат. Полученный продукт растворяют в растворе карбоната натрия, доводят рН до 3-4, высаживают продукт в ацетоне, осадок отфильтровывают и промывают водным ацетоном, ацетоном и сушат. Полученный продукт растворяют в растворе карбоната натрия, доводят рН до 9-10, перемешивают 30 минут. Полученный продукт сушат.
Образец 10.
В химический стакан емкостью 5000 мл добавляют 1800 мл воды и 75 г КМЦ. Реакционную смесь перемешивают 3 часа, после чего к раствору добавляют раствор 15 г йодной кислоты в 150 г воды и перемешивают несколько часов при 40 °С и 20 часов при 25 ° С. Затем к реакционной массе добавляют карбонат натрия, доводят рН до 8-9, фракционируют через мембрану 10 кДа, доводят рН до 3-4. Полученный продукт сушат.
Образец 11.
В химический стакан емкостью 5000 мл добавляют 1800 мл воды и 75 г КМЦ. Реакционную смесь перемешивают 3 часа, после чего к раствору добавляют раствор 30 г йодной кислоты в 150 г воды и перемешивают несколько часов при 40 °С и 20 часов при 25 ° С. Затем диализуют относительно воды через диализные мешки 12-14 кДа в течение 48 часов. Полученный продукт сушат.
Образец 12.
В химический стакан емкостью 5000 мл добавляют 1800 мл воды и 75 г КМЦ. Реакционную смесь перемешивают 3 часа, после чего к раствору добавляют раствор 30 г йодной кислоты в 150 г воды и перемешивают несколько часов при 40 °С и 20 часов при 25 ° С. Затем диализуют относительно воды через диализные мешки 12-14 кДа в течение 48 часов. Полученный продукт сушат. Полученный продукт растворяют в воде, добавляют раствор аскорбата натрия в 0,1М растворе гидроксида натрия, перемешивают 30 минут. Полученный продукт сушат.
Образец 13.
В химический стакан емкостью 5000 мл добавляют 1800 мл воды и 75 г КМЦ. Реакционную смесь перемешивают 3 часа, после чего к раствору добавляют раствор 30 г йодной кислоты в 150 г воды и перемешивают несколько часов при 40 °С и 20 часов при 25 ° С. Избыток окислителя нейтрализуют, высаживают продукт в ацетоне. Выпавший осадок фильтруют, промывают водным раствором ацетона и чистым ацетоном и сушат. Полученный продукт растворяют в 5% карбонате натрия, фракционируют через мембрану 10 кДа, полученный продукт сушат.
Образец 14.
В химический стакан емкостью 150 мл добавляют 62,5 мл воды и 5 г бета-глюкана ячменя. Реакционную смесь перемешивают 1 час, после чего к суспензии добавляют раствор 2,03 г йодной кислоты в 6,9 мл воды и перемешивают 18 часов при 25 ° С. Осадок отделяют центрифугированием и промывают сначала водой, затем чистым ацетоном и сушат.
Образец 15.
В химический стакан емкостью 250 мл добавляют 50 мл воды и 5 г бета-глюкана овса. Реакционную смесь перемешивают 1 час, после чего к суспензии добавляют раствор 2,5 г йодной кислоты в 10 мл воды, доводят рН до 3-4 и перемешивают 20 часов при 25 ° С. Затем реакционную смесь диализуют относительно воды через диализные мешки 1 кДа в течение 120 часов, после чего лиофилизуют.
Образец 16.
В химический стакан емкостью 600 мл добавляют 300 мл воды и 15 г бета-глюкана овса. Реакционную смесь перемешивают 1 час, после чего к суспензии добавляют раствор 7,6 г йодной кислоты в 30 мл воды, доводят рН до 3-4 и перемешивают 18 часов при 25 ° С. Осадок отделяют центрифугированием и промывают сначала водой, затем чистым ацетоном и сушат.
Образец 17.
В химический стакан емкостью 500 мл добавляют 365 мл 0,5М водного раствора натрия гидроксида и растворяют 7,3 г бета-глюкана ячменя, после чего фракционируют через мембрану 10 кДа, полученный продукт сушат. Полученный продукт растворяют в 62,5 мл воды, после чего добавляют раствор 1,42 г йодной кислоты в 4,7 мл воды и перемешивают 20 часов при 25 ° С. Избыток окислителя нейтрализуют, высаждают продукт в ацетон, осадок отфильтровывают, промывают водным раствором ацетона и чистым ацетоном и сушат.
Образец 18.
В химический стакан добавляют 70 мл воды и 5 г β-глюкана грибов Рейши. Реакционную смесь перемешивают 1 час, после чего добавляют раствор 2,1 г йодной кислоты в 10 мл воды и перемешивают 72 часа при 25 ° С. Избыток окислителя нейтрализуют, высаждают продукт в ацетон, осадок отфильтровывают, промывают водным раствором ацетона и чистым ацетоном и сушат.
Путем перйодатного окисления исходных бета-глюканов по реакции Малапрада был получен ряд образцов, приведенный в таблице 1. Для работы были использованы как природные бета-глюканы (хлебопекарных дрожжей, овса, ячменя, грибов рейши), так и синтетический 1,4- бета-глюкан (карбоксиметилцеллюлоза).
Согласно литературным данным, окисление протекает преимущественно по С2 и С3 пиранозного кольца с его разрывом. В нашем случае реакция сопровождалась снижением молекулярной массы и увеличением числа карбонильных групп в продукте по сравнению с исходным глюканом (Таблица 1).
Таблица 1
Образцы, полученные путем перйодатного окисления бета-глюканов
| Образец | Бета-глюкан | Mw, Да | Поли дисперсность | COH, ммоль/г |
| 1 | КМЦ | 23080 | 2,2 | 0,50 |
| 2 | КМЦ | 214030 | 10,9 | 0,62 |
| 3 | КМЦ | 44490 | 3,12 | 0,51 |
| 4 | КМЦ | 27210 | 2,02 | 0,46 |
| 5 | КМЦ | 7410 | 1,8 | 1,27 |
| 6 | КМЦ | 15250 | 1,4 | 0,73 |
| 7 | КМЦ | 27260 | 2,6 | 1,79 |
| 8 | КМЦ | 25990 | 2,67 | 1,69 |
| 9 | КМЦ | 11570 | 1,91 | 1,66 |
| 10 | КМЦ | 33300 | 2,0 | 1,15 |
| 11 | КМЦ | 15370 | 1,7 | 1,08 |
| 12 | КМЦ | 14070 | 1,9 | 0,53 |
| 13 | КМЦ | 11740 | 1,4 | 1,47 |
| 14 | Бета-глюкан ячменя | 14070 | 1,9 | 0,53 |
| 15 | Бета-глюкан овса | 3790 | 1,52 | 1,18 |
| 16 | Бета-глюкан овса | 3250 | 1,48 | 1,46 |
| 17 | Бета-глюкан ячменя | 12770 | 1,93 | 1,10 |
| 18 | Бета-глюкан Рейши | 20560 | 5,77 | 1,93 |
Все продукты обработки бета-глюкана йодной кислотой в указанных условиях проведения процесса (интервалах рН и температуры, состав растворителей) в указанном интервале содержания карбонильных групп обладали противовирусной активностью в отношении вируса гриппа (см. таблица 2) и вируса энцефаломиокардита мышей (см. таблица 3), отсутствующей у исходных бета-глюканов. При этом активность возрастала пропорционально росту числа карбонильных групп.
Таблица 2.
Противовирусная активность образцов in vitro в отношении вируса гриппа A/Пуэрто-Рико/8/34 (H1N1)
| Образец | Бета-глюкан | Цитотоксичность (СС50 ср.), мг/мл |
Противовирусная активность в отношении вируса гриппа A/Пуэрто-Рико/8/34 (H1N1) | Химио- терапевтический индекс |
|
| Эффективная доза (IC50 ср.), мг/мл | Вирусингибирующее действие, ΔlgTCID50 ср. | ||||
| 1 | КМЦ | 8,39 | 0,09 | 1,25 | 89,66 |
| 2 | КМЦ | >60,00 | 2,33 | 1,00 | >25 |
| 3 | КМЦ | 14,80 | 0,13 | 2,50 | 115,96 |
| 4 | КМЦ | 19,25 | 0,54 | 2,43 | 35,48 |
| 5 | КМЦ | 9,50 | 0,05 | 1,56 | 195,71 |
| 6 | КМЦ | 31,20 | 1,07 | 1,25 | 29,17 |
| 7 | КМЦ | 26,44 | 1,59 | 2,25 | 16,59 |
| 8 | КМЦ | 6,10 | 0,28 | 3,42 | 21,74 |
| 9 | КМЦ | 8,13 | 0,22 | 3,61 | 36,43 |
| 10 | КМЦ | 3,98 | 0,13 | 2,21 | 30,27 |
| 11 | КМЦ | 2,49 | 0,31 | 3,75 | 8,00 |
| 12 | КМЦ | 2,98 | 0,05 | 1,50 | 63,81 |
| 13 | КМЦ | 6,94 | 0,21 | 1,90 | 32,52 |
| 14 | Бета-глюкан ячменя | 20,10 | 0,43 | 3,66 | 46,39 |
| 15 | Бета-глюкан овса | 18,50 | 0,41 | 3,11 | 45,40 |
| 16 | Бета-глюкан овса | 29,02 | 0,32 | 2,59 | 89,87 |
| 17 | Бета-глюкан ячменя | 24,02 | 0,38 | 4,06 | 63,93 |
| 18 | Бета-глюкан гриба Рейши | 13,32 | 0,27 | 3,24 | 49,56 |
* Вещества с выраженной противовирусной активностью имеют ΔlgTCID50 cр.≥1,50.
Таблица 3.
Защищенность культуры ФЛЭЧ от цитопатического воздействия вируса энцефаломиокардита мышей (ВЭМ), возникающая после стимуляции ее тестируемыми веществами (% защиты монослоя ФЛЭЧ) в течение 4 ч
| Дозы, мкг | Тестируемые вещества | |||
| - | Образец 12 | Образец 13 | КМЦ 7 MF | |
| 2000 | 3 | 18 | 32 | 16 |
| 1000 | 2 | 31 | 40 | 41 |
| 500 | 0 | 39 | 41 | 33 |
| 250 | 6 | 32 | 42 | 25 |
| 125 | 0 | 28 | 31 | 15 |
| 62 | 1 | 18 | 33 | 14 |
| 31 | 0 | 10 | 24 | 9 |
| 15 | 0 | 1 | 7 | 1 |
Следует отметить, что вещества 12, 13 и КМЦ 7 MF способны оказывать защиту от цитопатопатического действия ВЭБ на монослой клеток ФЛЭЧ (% защищенности монослоя - 20-40%), однако у веществ 12 и 13 эта способность выше.
Противовирусная активность образца 10 in vivo в отношении вируса гриппа А/California/7/09 pdm (H1N1) на модели гриппозной пневмонии мышей при экстренно-профилактической схеме введения
Результаты исследований показали, что образец 10 дозозависимым способом проявляет противовирусную активность в отношении вируса гриппа /California/7/09 pdm (H1N1) как на белых беспородных мышах ICR, так и на линейных мышах BALB/c, при заражающей дозе от 1 до 10 MLD50. При этом в протестированном диапазоне наибольшей активностью обладает доза 0,1 мг/кг/мышь, которая не только достоверно вызывает защиту зараженных гриппом животных, но и существенно увеличивает продолжительность их жизни по сравнению с вирусным контролем, лишь немного уступая контрольному препарату прямого действия (озельтамивиру фосфату) (см. таблицу 4).
Таблица 4.
| Вещество | % защиты | Средняя продолжительность жизни, сутки, (М ± σ) | |||
| Название | Доза, мг/кг/мышь | ||||
| ICR, 1MLD50 | BALB/c, 10 MLD50 | ICR, 1MLD50 | BALB/c, 10 MLD50 | ||
| Образец 10 | 0,1 | 26,67 | 13,34 | 12,33±2,87 | 7,40±4,61 |
| 1 | 6,67 | 13,34 | 10,60±3,79 | 6,60±4,60 | |
| 12 | 0,00 (-6,67) | 0,00 | 10,53±3,48 | 6,27±3,35 | |
| 100 | 0,00 | 0,00 | 10,47±3,64 | 5,40±3,50 | |
| 400 | н/д* | 6,66 | н/д | 6,00±4,05 | |
| Озельтамивира фосфат | 25 | 40,00 | 20,00 | 13,25±2,05 | 7,87±4,09 |
| Контроль вируса | - | 0,00 | 0,00 | 10,93±3,43 | 5,00±2,96 |
| Интактные | - | 100,00 | 100,00 | 14,00±0,00 | 14,00±0,00 |
*н/д - нет данных
Способность вещества 13 активировать иммунологически значимые рецепторы
Введение в структуру бета-глюкана карбонильных групп путем обработки йодной кислотой в указанных условиях для 1,4-бета-глюкана (карбоксиметилцеллюлоза) привело к появлению способности к активации рецептора CD14, отсутствующей у исходного бета-глюкана. Проведенные исследования показали, что образец 13, в отличие от 1,3- и 1,6-β-глюканов, не активирует рецептор dectin-1a, однако приобретает способность активировать рецептор CD14. Таким образом, образец 13 обладает уникальными иммунологическими свойствами, отличающими его от других β-глюканов.
Активация Т-лимфоцитов образцами 12 и 13, регистрируемая по изменению количества клеток, экспрессирующих СD69, среди Т-хелперов и цитотоксических лимфоцитов (ЦТЛ)
Молекула СD69 является маркером ранней (в первые 4-24 ч воздействия) активации Т-лимфоцитов и удобным объектом для быстрой оценки различных веществ в плане их способности активировать лимфоциты. В ходе культивирования лимфоцитов обычно процент СD3+СD69+ клеток несколько возрастает даже в отсутствие стимулирующих добавок, но у здоровых людей редко превышает 5-8%. Характер влияния веществ, добавляемых в культуру для стимуляции лимфоцитов, оценивается по Δ = (% СD3+СD69+ в стимулированной пробе) - (% СD3+СD69+ в спонтанной пробе). В нашем исследовании активирующее влияние исследуемых веществ оценивалось отдельно на Т-хелперы (СD3+СD4+СD69+) и на ЦТЛ (СD3+СD8+СD69+). Результаты наших исследований см. в табл. 5
Таблица 5.
Влияние исследуемых веществ на уровень активации Т-хелперов и ЦТЛ в культуре у 12 человек (индивидуальные данные)
| № донора крови | Спонтанно активированные (%) | Дополнительно активированные веществами (Δ, %) | ||||||
| Т-хелперы | ЦТЛ | Т-хелперы | ЦТЛ | |||||
| Образец 12 | Образец 13 | КМЦ 7 MF | Образец 12 | Образец 13 | КМЦ 7 MF | |||
| 1 | 3,0 | 2,6 | 2,1 | 4,6 | 2,7 | 5,0 | ||
| 2 | 3,5 | 7,5 | 9,8 | 9,3 | 10,0 | 9,8 | ||
| 3 | 2,8 | 7,7 | 4,0 | 1,9 | 2,7 | 0,0 | ||
| 4 | 1,0 | 1,7 | 2,3 | 2,4 | 2,8 | 1,6 | ||
| 5 | 2,0 | 6,9 | 8,0 | 7,2 | 5,1 | 2,0 | ||
| 6 | 3,2 | 11,0 | 5,1 | 4,4 | 2,0 | 1,3 | ||
| 7 | 3,5 | 2,8 | 1,8 | 0,7 | ||||
| 8 | 2,6 | 5,7 | 0,0 | 0,0 | ||||
| 9 | 0,1 | 1,0 | 0,2 | 0,0 | ||||
| 10 | 0,1 | 1,2 | 0,2 | 1,2 | ||||
| 11 | 0,7 | 4,0 | 0,1 | 2,3 | ||||
| 12 | 0,3 | 1,0 | 0,0 | 1,7 |
В данной серии экспериментов оказалось, что вещества 12 и 13 активируют и Т-хелперы, и ЦТЛ практически у всех людей, в то время как вещество КМЦ 7 MF - у 1 донора. Следовательно, вещества 12 и 13 оказывают более выраженное активирующее действие на лимфоциты по повышению процента CD69+ Т-лимфоцитов, чем вещество КМЦ 7 MF.
В условиях ко-стимуляции с ФГА в клетках крови людей со «сниженным соотношением CD4/CD8 клеток» вещества 12, 13 и КМЦ 7 МF высоко стимулируют продукцию IL-1β клетками крови, при этом 12 и 13 - значительно больше, чем КМЦ 7 МF (определяли методом ИФА с помощью тест-системы производства «Вектор-Бест»). В группе здоровых доноров вещества 12 и 13 также высоко продуцируют IL-1β, в отличие от КМЦ 7 МF, неспособного к продукции данного цитокина.
Таким образом, введение в структуру бета-глюкана карбонильных групп обработкой йодной кислотой в указанных условиях для 1,4-бета-глюкана (карбоксиметилцеллюлоза) привело к увеличению способности вызывать продукцию цитокинов и активации иммунокомпетентных клеток по сравнению с исходным бета-глюканом.
Пункт 2.
Образец 19.
В химический стакан емкостью 250 мл добавляют 100 мл изопропилового спирта и 5 г бета-глюкана овса. Реакционную смесь перемешивают ночь, после чего к раствору добавляют 25 г 30%-масс. водного раствора натрия гидроксида и перемешивают 1 час. Затем к полученной суспензии добавляют раствор 3,5 г монохлоруксусной кислоты в 25 мл изопропилового спирта и перемешивают 3 часа при температуре 72 °С. Раствор декантируют, осадок растворяют в воде, доводят рН до 2-3, высаждают продукт в ацетон, осадок отфильтровывают и промывают ацетоном. После этого осадок растворяют в воде, доводят рН до 8 и высаждают продукт в ацетон, промывают чистым ацетоном и сушат.
Образец 20.
В химический стакан емкостью 250 мл добавляют 100 мл изопропилового спирта и 5 г бета-глюкана хлебопекарных дрожжей. Реакционную смесь перемешивают ночь, после чего к раствору добавляют 25 г 30%-масс. водного раствора натрия гидроксида и перемешивают 1 час. Затем к полученной суспензии добавляют раствор 3,5 г монохлоруксусной кислоты в 25 мл изопропилового спирта и перемешивают 5 часов при температуре 72 °С. Раствор декантируют, осадок растворяют в воде, доводят рН до 2-3, высаждают продукт в ацетон, осадок отфильтровывают и промывают ацетоном. После этого осадок растворяют в воде, доводят рН до 8 и высаждают продукт в ацетон, промывают чистым ацетоном и сушат.
Образец 21.
В химический стакан емкостью 600 мл добавляют 200 мл изопропилового спирта и 15 г бета-глюкана хлебопекарных дрожжей. Реакционную смесь перемешивают 1 час, после чего к раствору добавляют 75 г 10%-масс. водного раствора натрия гидроксида и перемешивают еще 1 час. Затем к полученной суспензии добавляют раствор 10,70 г монохлоруксусной кислоты в 55 мл изопропилового спирта и перемешивают 5 часов при температуре 72 °С. Раствор декантируют, осадок растворяют в воде, доводят рН до 2-3, высаждают продукт в ацетон, осадок отфильтровывают и промывают ацетоном. После этого осадок растворяют в воде, доводят рН до 8 и высаждают продукт в ацетон, промывают чистым ацетоном и сушат.
Путем алкилирования исходных бета-глюканов монохлоруксусной кислотой был получен ряд образцов (таблица 6). Данный тип модификации структуры приводит к возрастанию содержания в бета-глюкане карбоксильных групп, отражаемому показателем степени замещения.
Таблица 6
Образцы, полученные путем алкилирования бета-глюканов
| Образец | Бета-глюкан | Mw, Да | Поли дисперсность | Степень замещения |
| 19 | овса | 101980 | 2,51 | 0,25 |
| 20 | хлебопекарных дрожжей | 636820 | 6,61 | 0,89 |
| 21 | хлебопекарных дрожжей | 285100 | 11,4 | 0,42 |
Полученные продукты обработки бета-глюкана галогеналкилкарбоновой кислотой в указанных условиях проведения процесса (интервалах рН и температуры, состав растворителей) в указанном интервале степени замещения обладали противовирусной активностью в отношении вируса гриппа (см. таблица 7) отсутствующей у исходных бета-глюканов. Однако, в отличие от окисленных образцов, отсутствовала однозначная зависимость между значением степени замещения и биологической эффективностью.
Таблица 7.
Противовирусная активность образцов in vitro в отношении вируса гриппа A/Пуэрто-Рико/8/34 (H1N1)
| Образец | Бета-глюкан | Цитотоксичность (СС50 ср.), мг/мл |
Противовирусная активность в отношении вируса гриппа A/Пуэрто-Рико/8/34 (H1N1) | Химио- терапевтический индекс |
|
| Эффективная доза (IC50 ср.), мг/мл | Вирусингибирующее действие, ΔlgTCID50 ср. | ||||
| 19 | Бета-глюкан овса | 16,06 | 0,18 | 1,41 | 87,33 |
| 20 | Бета-глюкан хлебопекарных дрожжей | 8,22 | 1,04 | 1,00 | 7,88 |
| 21 | Бета-глюкан хлебопекарных дрожжей | >35 | 0,39 | 2,25 | >88 |
Пункт 3.
Образец 22.
В химический стакан емкостью 600 мл добавляют 173 мл изопропилового спирта и 10,5 г бета-глюкана овса. Реакционную смесь перемешивают ночь, после чего к раствору добавляют 65 г 10%-масс. водного раствора натрия гидроксида и перемешивают 1 час. Затем к полученной суспензии добавляют раствор 9,13 г монохлоруксусной кислоты в 47 мл изопропилового спирта и перемешивают 5 часов при температуре 72 °С. Раствор декантируют, осадок растворяют в воде, доводят рН до 2-3, высаждают продукт в ацетон, осадок отфильтровывают и промывают ацетоном. После этого осадок растворяют в воде, доводят рН до 8 и высаждают продукт в ацетон, промывают чистым ацетоном и сушат. Полученный продукт растворяют в 162,5 мл воды, после чего добавляют раствор 1,77 г йодной кислоты в 6,32 мл воды и перемешивают 18 часов при 25 ° С. Избыток окислителя нейтрализуют, высаждают продукт в ацетон. Выпавший осадок отфильтровывают, промывают ацетоном. Полученный продукт растворяют в воде, доводят до рН 8 и высаждают в ацетон, промывают водным раствором ацетона и чистым ацетоном и сушат.
Образец 23.
В химический стакан емкостью 600 мл добавляют 160 мл изопропилового спирта и 12,0 г бета-глюкана хлебопекарных дрожжей. Реакционную смесь перемешивают ночь, после чего к раствору добавляют 60 г 10%-масс. водного раствора натрия гидроксида и перемешивают 1 час. Затем к полученной суспензии добавляют раствор 8,56 г монохлоруксусной кислоты в 44 мл изопропилового спирта и перемешивают 5 часов при температуре 72 °С. Раствор декантируют, осадок растворяют в воде, доводят рН до 2-3, высаждают продукт в ацетон, осадок отфильтровывают и промывают ацетоном. После этого осадок растворяют в воде, доводят рН до 8 и высаждают продукт в ацетон, промывают чистым ацетоном и сушат. Полученный продукт растворяют в 175 мл воды, после чего добавляют раствор 1,45 г йодной кислоты в 4,8 мл воды и перемешивают 18 часов при 25 ° С. Избыток окислителя нейтрализуют, высаждают продукт в ацетон. Выпавший осадок отфильтровывают, промывают ацетоном. Полученный продукт растворяют в воде, доводят до рН 8 и высаждают в ацетон, промывают водным раствором ацетона и чистым ацетоном и сушат.
Образец 24.
В химический стакан емкостью 300 мл добавляют 118 мл изопропилового спирта и 8,85 г бета-глюкана ячменя. Реакционную смесь перемешивают ночь, после чего к раствору добавляют 44,25 г 10%-масс. водного раствора натрия гидроксида и перемешивают 1 час. Затем к полученной суспензии добавляют раствор 3,88 г монохлоруксусной кислоты в 25 мл изопропилового спирта и перемешивают 5 часов при температуре 72 °С. Раствор декантируют, осадок растворяют в воде, доводят рН до 2-3, высаждают продукт в ацетон, осадок отфильтровывают и промывают ацетоном. После этого осадок растворяют в воде, доводят рН до 8 и высаждают продукт в ацетон, промывают чистым ацетоном и сушат. Полученный продукт растворяют в 131 мл воды, после чего добавляют раствор 1,77 г йодной кислоты в 6,2 мл воды и перемешивают 18 часов при 25 ° С. Избыток окислителя нейтрализуют, высаждают продукт в ацетон. Выпавший осадок отфильтровывают, промывают ацетоном. Полученный продукт растворяют в воде, доводят до рН 8 и высаждают в ацетон, промывают водным раствором ацетона и чистым ацетоном и сушат.
Комбинация алкилирования монохлоруксусной кислотой с последующим окислением по Малапраду карбоксиметилированнных бета-глюканов были получены образцы, отличающиеся от исходных бета-глюканов содержанием карбонильных групп и степенью замещения (таблица 8).
Таблица 8
Образцы, полученные путем окисления и алкилирования бета-глюканов
| Образец | бета-глюкан | Mw, Да | Поли дисперсность | COH, ммоль/г | Степень замещения |
| 22 | Бета-глюкан овса | 14790 | 2,0 | 0,70 | 0,33 |
| 23 | Бета-глюкан хлебопекарных дрожжей | 285100 | 11,4 | 0,66 | 0,42 |
| 24 | Бета-глюкан ячменя | 32510 | 2,2 | 0,47 | 0,49 |
Полученные продукты обработки бета-глюкана галогеналкилкарбоновой кислотой с последующей обработкой полупродукта йодной кислотой в указанных условиях проведения процесса (интервалах рН и температуры, состав растворителей) в указанном интервале содержания карбонильных групп обладали противовирусной активностью в отношении вируса гриппа (см. таблица 9), отсутствующей у исходных бета-глюканов.
Таблица 9.
Противовирусная активность образцов in vitro в отношении вируса гриппа A/Пуэрто-Рико/8/34 (H1N1)
| Образец | Бета-глюкан | Цитотоксичность (СС50 ср.), мг/мл |
Противовирусная активность в отношении вируса гриппа A/Пуэрто-Рико/8/34 (H1N1) | Химио- терапевтический индекс |
|
| Эффективная доза (IC50 ср.), мг/мл | Вирусингибирующее действие, ΔlgTCID50 ср. | ||||
| 22 | Бета-глюкан овса | 27,50 | 1,69 | 1,00 | 16,31 |
| 23 | Бета-глюкан хлебопекарных дрожжей | >36 | 0,52 | 1,97 | >69 |
| 24 | Бета-глюкан ячменя | 40,60 | 0,52 | 1,00 | 78,08 |
Композиции, содержащие фармацевтически приемлемые добавки.
Вышеописанные способы модификации структуры бета-глюканов позволяют вводить в состав получаемых продуктов фармацевтически приемлемые добавки. Данная возможность иллюстрируется нижеприведенными примерами.
Таблица 10.
| Образец | Бета-глюкан | Фармацевтически приемлемые добавки | Цитотоксичность (СС50 ср.), мг/мл |
Противовирусная активность в отношении вируса гриппа A/Пуэрто-Рико/8/34 (H1N1) | Химио- терапевтический индекс |
|||
| Na2CO3, % | NaHCO3, % | Аскорбат натрия, % | ||||||
| Эффективная доза (IC50 ср.), мг/мл | Вирусингибирующее действие, ΔlgTCID50 ср. | |||||||
| 3 | КМЦ | 1,28 | 16,28 | - | 14,80 | 0,13 | 2,50 | 115,96 |
| 4 | КМЦ | 17,36 | 13,26 | - | 19,25 | 0,54 | 2,43 | 35,48 |
| 8 | КМЦ | 0,89 | 16,51 | - | 6,10 | 0,28 | 3,42 | 21,74 |
| 9 | КМЦ | 12,80 | 18,56 | - | 8,13 | 0,22 | 3,61 | 36,43 |
| 12 | КМЦ | - | - | 0,21 | 2,98 | 0,05 | 1,50 | 63,81 |
| 20 | Бета-глюкан хлебопекарных дрожжей | 5,43 | - | - | 8,22 | 1,04 | 1,00 | 7,88 |
| 22 | Бета-глюкан овса | 0,42 | 1,67 | - | 27,50 | 1,69 | 1,00 | 16,31 |
| 23 | Бета-глюкан хлебопекарных дрожжей | 0,51 | - | - | >36 | 0,52 | 1,97 | >69 |
| 24 | Бета-глюкан ячменя | 0,94 | - | - | 40,60 | 0,52 | 1,00 | 78,08 |
Композиции с противомикробными субстанциями.
Образец 25.
В химический стакан емкостью 2000 мл добавляют 960 мл воды и 80 г КМЦ. Реакционную смесь перемешивают 3 часа, после чего к раствору добавляют раствор 7,5 г йодной кислоты в 50 г воды и перемешивают 24 часа при 25 ° С. Избыток окислителя нейтрализуют, высаживают продукт в ацетоне. Выпавший осадок фильтруют, промывают водным раствором ацетона и чистым ацетоном и сушат. Полученный продукт растворяют в 5% карбонате натрия, фракционируют через мембрану 10 кДа, доводят рН до 3-4, полученный продукт сушат. Полученный продукт растворяют в воде, добавляют 0,02% масс. осельтамивира фосфата, перемешивают 30 минут. Полученный продукт сушат.
Образец 26.
В химический стакан емкостью 2000 мл добавляют 960 мл воды и 80 г КМЦ. Реакционную смесь перемешивают 3 часа, после чего к раствору добавляют раствор 7,5 г йодной кислоты в 50 г воды и перемешивают 24 часа при 25 ° С. Избыток окислителя нейтрализуют, высаживают продукт в ацетоне. Выпавший осадок фильтруют, промывают водным раствором ацетона и чистым ацетоном и сушат. Полученный продукт растворяют в 5% карбонате натрия, фракционируют через мембрану 10 кДа, доводят рН до 3-4, полученный продукт сушат. Полученный продукт растворяют в воде, добавляют 0,2% масс. осельтамивира фосфата, перемешивают 30 минут. Полученный продукт сушат.
Образец 27.
В химический стакан емкостью 2000 мл добавляют 960 мл воды и 80 г КМЦ. Реакционную смесь перемешивают 3 часа, после чего к раствору добавляют раствор 7,5 г йодной кислоты в 50 г воды и перемешивают 24 часа при 25 ° С. Избыток окислителя нейтрализуют, высаживают продукт в ацетоне. Выпавший осадок фильтруют, промывают водным раствором ацетона и чистым ацетоном и сушат. Полученный продукт растворяют в 5% карбонате натрия, фракционируют через мембрану 10 кДа, доводят рН до 3-4, полученный продукт сушат. Полученный продукт растворяют в воде, добавляют 2% масс. осельтамивира фосфата, перемешивают 30 минут. Полученный продукт сушат.
Образец 28.
В химический стакан емкостью 5000 мл добавляют 1800 мл воды и 75 г КМЦ. Реакционную смесь перемешивают 3 часа, после чего к раствору добавляют раствор 15 г йодной кислоты в 150 г воды и перемешивают несколько часов при 40 °С и 20 часов при 25 ° С. Затем к реакционной массе добавляют карбонат натрия, доводят рН до 8-9, фракционируют через мембрану 10 кДа, доводят рН до 3-4. Полученный продукт сушат. Полученный продукт растворяют в воде, добавляют 0,02% масс. осельтамивира фосфата, перемешивают 30 минут. Полученный продукт сушат.
Образец 29.
В химический стакан емкостью 5000 мл добавляют 1800 мл воды и 75 г КМЦ. Реакционную смесь перемешивают 3 часа, после чего к раствору добавляют раствор 15 г йодной кислоты в 150 г воды и перемешивают несколько часов при 40 °С и 20 часов при 25 ° С. Затем к реакционной массе добавляют карбонат натрия, доводят рН до 8-9, фракционируют через мембрану 10 кДа, доводят рН до 3-4. Полученный продукт сушат. Полученный продукт растворяют в воде, добавляют 0,2% масс. осельтамивира фосфата, перемешивают 30 минут. Полученный продукт сушат.
Образец 30.
В химический стакан емкостью 5000 мл добавляют 1800 мл воды и 75 г КМЦ. Реакционную смесь перемешивают 3 часа, после чего к раствору добавляют раствор 15 г йодной кислоты в 150 г воды и перемешивают несколько часов при 40 °С и 20 часов при 25 ° С. Затем к реакционной массе добавляют карбонат натрия, доводят рН до 8-9, фракционируют через мембрану 10 кДа, доводят рН до 3-4. Полученный продукт сушат. Полученный продукт растворяют в воде, добавляют 2% масс. осельтамивира фосфата, перемешивают 30 минут. Полученный продукт сушат.
При добавлении субстанции осельтамивира фосфата к модифицированным бета-глюканам были получены композиции, обладающие противовирусной активностью (таблицы 11, 12).
Таблица 11
Композиции с осельтамивиром
| Образец | бета-глюкан | Mw, Да | Поли дисперсность | COH, ммоль/г | Содержание осельтамивира, % масс |
| 25 | КМЦ | 52150 | 2,53 | 0,33 | 0,02 |
| 26 | КМЦ | 52150 | 2,53 | 0,33 | 0,20 |
| 27 | КМЦ | 52150 | 2,53 | 0,33 | 2,00 |
| 28 | КМЦ | 33300 | 2,0 | 1,15 | 0,02 |
| 29 | КМЦ | 33300 | 2,0 | 1,15 | 0,20 |
| 30 | КМЦ | 33300 | 2,0 | 1,15 | 2,00 |
Таблица 12.
Противовирусная активность образцов in vitro в отношении вируса гриппа A/Пуэрто-Рико/8/34 (H1N1)
| Номер образца | бета-глюкан | Цитотоксичность (СС50 ср.), мг/мл |
Противовирусная активность в отношении вируса гриппа A/Пуэрто-Рико/8/34 (H1N1) | Химио- терапевтический индекс |
|
| Эффективная доза (IC50 ср.), мг/мл | Вирусингибирующее действие, ΔlgTCID50 ср. | ||||
| 25 | КМЦ | 32,68 | 0,0044 | 2,44 | 7 423,90 |
| 26 | КМЦ | 38,52 | 0,00054 | 2,50 | 71 856,73 |
| 27 | КМЦ | 32,63 | 0,000025 | 2,44 | 1 280 315,52 |
| 28 | КМЦ | 32,47 | 0,0453 | 2,68 | 716,66 |
| 29 | КМЦ | 26,70 | 0,00043 | 2,81 | 61 990,09 |
| 30 | КМЦ | 26,23 | 0,0000065 | 2,53 | 4 048 672,57 |
Получение бета-глюканов, комбинирующих противовирусные и иммуноактивные свойства
Таблица 13.
Приобретение противовирусной активности у иммунологически активных образцов бета-глюканов
| № образца | бета-глюкан | Иммунологическая активность на репортерной клеточной линии hDectin-1a | Цитотоксичность (СС50 ср.), мг/мл |
Противовирусная активность в отношении вируса гриппа A/Пуэрто-Рико/8/34 (H1N1) | Химио- терапевтический индекс |
|
| Эффективная доза (IC50 ср.), мг/мл | Вирусингибирующее действие, ΔlgTCID50 ср. | |||||
| Бета-глюкан хлебопекарных дрожжей | Бета-глюкан хлебопекарных дрожжей | + | >2* | ? | 1,00 | ? |
| Бета-глюкан овса | Бета-глюкан овса | + | >2* | 0,21 | 0,75 | - |
| Бета-глюкан рейши | Бета-глюкан рейши | + | н/д | - | 0,25 | - |
| КМЦ | КМЦ | - | н/д | н/д | н/д | н/д |
| 15 | Бета-глюкан овса | + | 18,50 | 0,41 | 3,11 | 45,40 |
| 16 | Бета-глюкан овса | + | 29,02 | 0,32 | 2,59 | 89,87 |
| 17 | Бета-глюкан ячменя | + | 24,02 | 0,38 | 4,06 | 63,93 |
| 18 | Бета-глюкан гриба Рейши | н/д | 13,32 | 0,27 | 3,24 | 49,56 |
| 19 | Бета-глюкан овса | + | 16,06 | 0,18 | 1,41 | 87,33 |
| 20 | Бета-глюкан хлебопекарных дрожжей | + | 8,22 | 1,04 | 1,00 | 7,88 |
*предел растворимости препарата.
Результаты экспериментов показали, что протестированные варианты β-глюканов, за исключением КМЦ, обладали способностью специфическим образом активировать рецептор дектин-1а, не оказывая стимулирующего действия на родительскую клеточную линию. При этом наблюдались различия в способности β-глюканов активировать дектин-1а, в зависимости от их структуры (см. табл. 13).
1. Противомикробное средство, представляющее собой продукт обработки бета-глюкана йодной кислотой или ее солью с последующей очисткой и выделением, где обработку проводят в водной или водно-органической среде с содержанием органических растворителей в количестве от 0,1 до 100%, при рН в диапазоне от 1 до 14, при температуре от 0 до 100°С; и где содержание карбонильных групп в противомикробном средстве составляет от 0,1 до 3 ммоль/г.
2. Противомикробное средство по п. 1, где бета-глюкан представляет собой карбоксиметилцеллюлозу, бета-глюкан хлебопекарных дрожжей, бета-глюкан овса, бета-глюкан ячменя, бета-глюкан рейши, необязательно после предварительной очистки и/или фракционирования.
3. Противомикробное средство по п. 1 или 2, эффективное в отношении вирусов гриппа, герпеса, респираторных вирусных и бактериальных инфекций.
4. Способ получения противомикробного средства по п. 1, который включает обработку бета-глюкана йодной кислотой или ее солью в водной или водно-органической среде с содержанием органических растворителей в количестве от 0,1 до 100%, при рН в диапазоне от 1 до 14, при температуре от 0 до 100°С с последующей очисткой и выделением.
5. Противомикробная композиция, содержащая эффективное количество противомикробного средства по п. 1 или 2 и фармацевтически приемлемые добавки.
6. Противомикробная композиция, содержащая эффективное количество противомикробного средства по п. 1 или 2 и по меньшей мере одно другое противомикробное средство.
7. Противомикробная композиция по п. 6, дополнительно содержащая фармацевтически приемлемые добавки.
8. Противомикробная композиция по любому из пп. 5-7, эффективная в отношении вирусов гриппа, герпеса, респираторных вирусных и бактериальных инфекций.
