Фармацевтическая композиция, проявляющая цитотоксичность в отношении клеток карциномы толстой кишки человека
Владельцы патента RU 2747147:
Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр онкологии имени Н.Н. Блохина" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина" Минздрава России) (RU)
Изобретение относится к фармацевтической композиции, проявляющей цитотоксичность в отношении клеток карциномы толстой кишки человека, характеризующейся тем, что она представляет собой масляный раствор, содержащий альфа-пинен, бета-пинен, бета-мирцен, 1,8-цинеол, сабинен, абиетиновую кислоту, гинзенозиды Re, Rb1, Rg2, флороглюцин, усниновую кислоту и растительное масло в качестве фармацевтически приемлемого растворителя при следующем содержании компонентов, мг/л: альфа-пинен 430-530; бета-пинен 400-500; бета-мирцен 300-400; 1,8-цинеол 380-480; сабинен 330-430; абиетиновая кислота 280-380; гинзенозид Re 300-400; гинзенозид Rb1 350-450; гинзенозид Rg2 300-400; флороглюцин 150-250; усниновая кислота 100-200; растительное масло - остальное. 6 табл., 4 пр., 2 ил.
Изобретение относится к фармакологической промышленности и медицине, в частности онкологии, касается создания фармацевтической композиции на основе действующих веществ, выделенных из растений, которая может быть использована у больных колоректальным раком с перитонеальным карциноматозом.
Колоректальный рак занимает одно из ведущих мест в России и в мире. Ежегодно в мире диагностируются более 1 млн. новых случаев. Из них примерно 50% больных погибают ежегодно от этого заболевания. Более 25% больных на момент постановки диагноза имеют IV стадию заболевания (Злокачественные новообразования в России в 2015 году. Заболеваемость и смертность / под редакцией А.Д. Каприна, В.В. Старинского, Г.В. Петровой. М.: МНИОИ им. П.А. Герцена - филиал ФГБУ «НМИРЦ» Минздрава России, 2017).
Растения - ценный источник биологически активных соединений с разнообразным терапевтическим потенциалом (Fridlender, М.; Kapulnik, Y.; Koltai, Н. Plant derived substances with anti-cancer activity: From folklore to practice. Front. Plant Sci. 2015, 6,799.).
По оценкам исследователей, более 60% лекарств с противоопухолевой активностью являются либо растительными экстрактами, либо веществами, полученными из растений (Fridlender М, Kapulnik Y, Koltai Н. Plant derived substances with anti-cancer activity: From folklore to practice. Front Plant Sci. 2015;6:799; Ijaz, S.; Akhtar, N.; Khan, M.S.; Hameed, A.; Irfan, M.; Arshad, M.A.; Ali, S.; Asrar, M. Plant derived anticancer agents: A green approach towards skin cancers, Biomed. Pharmacother., 2018, 103, 1643-1651.).
В состав большинства видов лекарственных растений, представляющих интерес для применения в онкологии, входят такие группы веществ вторичного метаболизма, как фенольные соединения (простые фенолы, флавоноиды, фенольные кислоты, дубильные вещества и др.), терпеноиды (моно-, дитерпеноиды, тритерпеновые сапонины и др.), азот/серосодержащие соединения (алкалоиды и др.) (Shin S.A., Moon S.Y., Kim W.Y., Paek S.M., Park H.H., Lee C.S. Structure-based classification and anti-cancer effects of plant metabolites. // Int J Mol Sci 2018;19(9): 2651-2685.). Они обладают выраженными противоопухолевыми, антиоксидантными, иммуномодулирующими, противовоспалительными, антибактериальными свойствами (Gali-Muhtasib, Н.; Hmadi, R.; Kareh, M.; Tohme, R.; Darwiche, N. Cell death mechanisms of plant-derived anticancer drugs: Beyond apoptosis. 2015,20,1531-1562.).
Более выраженный эффект проявляют комбинированные средства растительного происхождения.
Например, из уровня техники известен патент RU 2693378 С1, опубл. 02.07.2019, который раскрывает фармацевтическую композицию, проявляющую цитотоксическое действие в отношении клеток рака мочевого пузыря человека, которая представляет собой масляный фитоэкстракт плодов можжевельника обыкновенного, травы зверобоя продырявленного, цветков пижмы обыкновенной, плодов шиповника, корневищ лапчатки прямостоячей, корневищ и корней родиолы розовой, корней женьшеня настоящего, корней солодки голой, листьев мяты перечной, корневищ и корней валерианы лекарственной, травы душицы обыкновенной, листьев эвкалипта прутовидного, почек сосны обыкновенной, почек березы, взятых в определенных соотношениях.
Лекарственные средства, представляющие собой фитоэкстракты, в том числе, раскрытые в приведенном источнике, обычно хорошо переносятся, имеют менее тяжелые побочные эффекты. Однако входящие в их состав комплексы биологически активных веществ, особенно многокомпонентные, трудно стандартизуются, и могут существенно отличаться по количественному составу и биологически активным свойствам, наличию балластных веществ, в силу как особенностей растительного сырья (географическое происхождение, условия выращивания), так и технологии экстракции.
Использование чистых выделенных биоактивных фитокомпонентов позволяет обеспечить более высокий уровень терапевтической эффективности, более легкое усваивание организмом и хранение препаратов в течение длительного периода. Поэтому выявление и изучение природных комплексов биологически активных веществ в соответствии с их структурой, нетоксичных для нормальных клеток и здорового организма, но способных ингибировать развитие опухолевых процессов, снижать побочные эффекты противоопухолевых лекарств, представляется весьма актуальным для исследователей.
В настоящее время в качестве средств противораковой терапии известен ряд комбинаций на основе таких активных компонентов.
В частности, известна композиция, содержащая апигенин, арбутин, гиперозид, глицирризиновую кислоту, кверцетин, лютеолин, нарингенин, аланин, аспарагиновую кислоту, аргинин, глютаминовую кислоту, пролин, тирозин, гинзенозид Rb1, гинзенозид Rb2, гинзенозид Rc, гинзенозид Rd, гинзенозид Re, гинзенозид Rq1, аралозид А, аралозид В, аралозид С, элеутерозид А, элеутерозид В, элеутерозид С, элеутерозид Е, салидрозид, розавин, розиридин, родионин, схизандрин, схизантерин при определенных соотношениях (патент RU 2477142 С2, опубл. 10.03.2013). Данная композиция направлена на предотвращение канцерогенеза и может быть использована в клинической практике для профилактики и лечения онкологических больных.
Известны композиции для лечения раковых заболеваний, таких как рак толстой кишки, представляющие собой лекарственные средства, обогащенные, по меньшей мере, двумя фитохимическими чистыми веществами, выбранными из группы, состоящей из изофлавонов, лигнанов, сапонинов, катехинов и фенольных кислот (патент US 6395279 В1, опубл. 2002-05-28). Согласно источнику при создании композиций выбираются конкретные изофлавоны и фотохимические вещества, адаптированные к потребностям конкретных заболеваний.
Известна фармацевтическая композиция для лечения рака толстой кишки, которая включает гинсенозид Rh4 и иринотекан (CN 109045052 А, опубл. 2018.12.21). Композиция проявляет побочные эффекты в отношении системы кроветворения и может вызывать тошноту и рвоту.
Перечисленные известные из уровня техники композиции не являются достаточно эффективными в отношении метастазирования рака толстой кишки.
При этом из уровня техники известно, что метастазирование в брюшину является фатальным вариантом прогрессирования колоректального рака. Метахронный перитонеальный карциноматоз возникает у 4,2% радикально оперированных больных. Рецидив карциноматоза брюшины после проведения полной циторедуктивной операции наблюдается более чем у 50% пациентов (Segelman J., Акте О., Gustafsson U.O., Bottai М., Martling A. External validation of models predicting the individual risk of metachronous peritoneal carcinomatosis from colon and rectal cancer. // Colorectal Dis. - 2016. - Vol. 18(4):378-385).
Классический подход, включающий циторедуктивную операцию с последующей гипертермической внутрибрюшной химиотерапией позволил у контингента больных с ограниченным перитонеальным карциноматозом (PCL<5) улучшить выживаемость. При этом медиана безрецидивной выживаемости составила 13,3 месяца (Сушков О.И., Шелыгин Ю.А., Ачкасов С.И., Пономаренко А.А. и др. Факторы прогноза выживаемости больных, оперированных по поводу перитонеального карциноматоза при раке толстой кишки // Хирургия. Журнал имени Н.И. Пирогова 2019, №8, выпуск 2, с. 16-23).
Лишь полная циторедукция может позволить пациентам пережить пятилетний рубеж (Gelli М., Huguenin J., de Baere Т. at al. Peritoneal and extraperitoneal relapse after previous curative treatment of peritoneal metastases from colorectal cancer: What survival can we expect? // Eur J Cancer. 2018 Sep; 100:94-103; Elias D., Mariani A., Cloutier A.S., Blot F. et al. Modified selection criteria for complete cytoreductive surgery plus HIPEC based on peritoneal cancer index and small bowel involvement for peritoneal carcinomatosis of colorectal origin. // Eur J Surg Oncol. 2014 Nov; 40(11): 1467-73).
Следовательно, на сегодняшний день актуальной является проблема повышения эффективности лечения больных колоректальным раком с перитониальным карциноматозом. Использование препаратов, обладающих не только цитостатитическим, но иммуномодулирующим и антиоксидантным действием при самостоятельном их применении после циторедуктивных операций, а также в сочетании с циторедуктивными операциями с последующей внутрибрюшной гипертермической химиотерапией могло бы повысить эффект элиминации остаточных опухолевых клеток в брюшной полости.
Из уровня техники известна фармацевтическая композиция, обладающая противоопухолевым действием, способностью индуцировать систему апоптоза в клетках, оказывать антирецидивное и антиметастатическое действие, проявляющая иммуномодулирующее, антибактериальное, ранозаживляющее, противовоспалительное, обезболивающее воздействия, содержащая капсульный экстракт хвойных деревьев, дополнительно выделенную из него фракцию монотерпеноидов, включающую сесквитерпеноиды, нейтральные дитерпеноиды, дитерпеновые кислоты, тритерпеновые кислоты, ненасыщенные и насыщенные жирные кислоты, фенольные соединения и монотерпеноиды, а также растительное масло (патент ЕА 017659 В1. опубл. 2013.02.28). Данное решение может быть указано в качестве ближайшего аналога-прототипа.
Задачей изобретения является создание эффективной фармацевтической композиции, проявляющей цитотоксическое действие в отношении клеток карциномы толстой кишки человека.
Поставленная задача решается тем, что предложена фармацевтическая композиция с иммуномодулирующими и антиоксидантными компонентами (далее ФК), проявляющая цитотоксичность в отношении клеток карциномы толстой кишки человека, характеризующаяся тем, что она представляет собой масляный раствор, содержащий альфа-пинен, бета-пинен, бета-мирцен 1,8-цинеол, сабинен, абиетиновую кислоту, гинзенозиды Re, Rb1, Rg2, флороглюцин, усниновую кислоту при следующем содержании компонентов, мг/л:
| альфа-пинен | 430-530 |
| бета-пинен | 400-500 |
| бета-мирцен | 300-400 |
| 1,8-цинеол | 380-480 |
| сабинен | 330-430 |
| абиетиновая кислота | 280-38 |
| гинзенозид Re | 300-400 |
| гинзенозид Rb1 | 350-450 |
| гинзенозид Rg2 | 300-400 |
| флороглюцин | 150-250 |
| усниновая кислота | 100-200 |
растительное масло остальное
Техническим результатом изобретения является повышение эффективности элиминации остаточных опухолевых клеток в брюшной полости у больных колоректальным раком с перитониальным карциноматозом.
Действующие вещества, входящие в состав фармацевтической композиции, могут быть выделены известными физико-химическими методами из растительного сырья.
В качестве растительного сырья могут быть использованы различные части представителей семейства Pinaceae (сосна, пихта), плоды можжевельника обыкновенного (Juniperus communis), кориандра посевного (Coriandrum sativum), листья эвкалипта прутовидного {Eucalyptus viminalis), трава тимьяна обыкновенного (Thymus vulgaris), почки березы повислой (Betulapendula), корневище папоротника (щитовника) мужского (Dryopteris filix-mas), лишайники семейства Cladoniaceae, корень женьшеня настоящего (Panax ginseng) и другие растения, содержащие активные соединения, входящие в формулу изобретения.
В таблице 1 представлен перечень и характеристика химических веществ, входящих в состав фармкомпозиции.
В качестве растительного масла может быть использовано любое подходящее в качестве фармацевтически приемлемого растворителя масло, такое как соевое масло, масло авокадо, льняное масло, кунжутное масло, оливковое масло, рапсовое масло, кукурузное масло, подсолнечное масло. Наиболее предпочтительным является использование льняного, кукурузного и рапсового масла.
Биологически активные соединения, входящие в состав заявляемой фармацевтической композиции, обладают разносторонним фармакологическим действием.
Например, альфа/бета-пинены, бета-мирцен, 1,8-цинеол, сабинен, абиетиновая кислота, гинзенозиды Re, Rb1, Rg2 блокируют сигнальные пути активации ядерного фактора транскрипции NF-kB (Jain Н., Dhingra N., Narsinghani Т., Sharma R. Insights into the mechanism of natural terpenoids as NF-κВ inhibitors: an overview on their anticancer potential. // Exp. Oncol. 2016; 38(3): 158-68; Lee C.W., Song K.H., Kim Y.S., Kim H.P. Ginsenosides from Korean Red Ginseng ameliorate lung inflammatory responses: inhibition of the MAPKs/NF-κB/c-Fos pathways. // J Ginseng Res. 2018;42(4):476-484).
Альфа-пинен, 1,8-цинеол, гинзенозиды Re, Rb1, Rg2 обладают цитостатическим и проапоптотическим действием наряду с увеличением активности эффекторной каспазы-3 (Hou J., Zhang Y., Zhu Y., Zhou В. et al. α-Pinene Induces Apoptotic Cell Death via Caspase Activation in Human Ovarian Cancer Cells. // Med Sci Monit. 2019; 25:6631-6638; Abdalla A.N., Shaheen U., Abdallah Q., Flamini G. et al. Proapoptotic Activity of Achillea membranacea Essential Oil and Its Major Constituent 1,8-Cineole against A2780 Ovarian Cancer Cells. // Molecules. 2020 Mar 30; 25(7): 1582-1594; Xiao H., Xue Q., Zhang Q. et al. How Ginsenosides Trigger Apoptosis in Human Lung Adenocarcinoma Cells. // Am J Chin Med. 2019; 47(8):1737-1754)
Флороглюцин проявляет противовоспалительные свойства (Ashour R., Okba M.M., Menze E.T., El Gedaily R.A. Eucalyptus Sideroxylon Bark Anti-inflammatory Potential, Its UPLC-PDA-ESI-qTOF-MS Profiling, and Isolation of a New Phloroglucinol. // J Chromatogr Sci. 2019 Jul 1; 57(6):565-574).
Абиетиновая кислота, альфа/бета-пинены, бета-мирцен, гинзенозиды Re, Rb1, Rg2 обладают высокой антибактериальной активностью (Ghaffari Т., Kafil H.S., Asnaashari S. et al. Chemical Composition and Antimicrobial Activity of Essential Oils from the Aerial Parts of Pinus eldarica Grown in Northwestern Iran. // Molecules. 2019;24(17): 3203-3213; Wang L., Huang Y., Yin G., Wang J. et al. Antimicrobial activities of Asian ginseng, American ginseng, and notoginseng Phytother Res. 2019 Dec 29. doi: 10.1002/ptr.6605).
Усниновая кислота - молекула с разноплановыми биологическими свойствами, включающими антибактериальную, противовирусную, противоопухолевую, антиоксидантную активности (Патент RU №2536873; Лузина О.А., Салахутдинов Н.Ф. Биологическая активность усниновой кислоты и ее производных. Часть 2 Действие усниновой кислоты и ее производных на высшие организмы, молекулярные и физико-химические аспекты биологической активности. // Биоорганическая химия 2016; том 42, №3, с. 276-300).
Вещества, входящие в формулу изобретения, такие как мирцен, цинеол, гинзенозиды Rb1 и Rg2, проявляют антиоксидантную активность, подавляя накопление малонового диальдегида и повышая уровни глутатиона, каталазы и глутатионпероксидазы (Ciftci О., Ozdemir I., Tanyildizi S., Yildiz S., Oguzturk H. Antioxidative effects of curcumin, β-myrcene and 1,8-cineole against 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin-induced oxidative stress in rats liver. Toxicol Ind Health 2011; 27(5):447-53; Shaukat A., Yang С, Yang Y., Guo Y.F. et al. Ginsenoside Rb 1: A novel therapeutic agent in Staphylococcusaureus-induced Acute Lung Injury with special reference to Oxidative stress and Apoptosis. // Microb Pathog. 2020 12; 143:104109; Chen C.F., Chiou W.F., Zhang J.T. Comparison of the pharmacological effects of Panax ginseng and Panax quinquefolium. // Acta Pharmacol. Sin. 2008 Sep; 29(9): 1103-8).
Подобранное согласно изобретению сочетание компонентов с иммуномодулирующими, антиоксидантными и цитотоксическими свойствами неожиданно позволило получить уникальный комплекс биологически активных компонентов, обеспечивающих вышеуказанный технический результат.
Далее для подтверждения возможности осуществления изобретения представлены примеры составов заявленной фармацевтической композиции, проявляющей цитотоксическое действие в отношении клеток карциномы толстой кишки человека.
Пример 1.
ФК1 - масляный раствор, содержащий бета-мирцен, альфа-пинен, бета-пинен, 1,8-цинеол, сабинен, флороглюцин, гинзенозид Re, гинзенозид Rb1, гинзенозид Rg2, абиетиновую кислоту, усниновую кислоту при следующем содержании компонентов (мг/л):
| альфа-пинен | 430 |
| бета-пинен | 400 |
| бета-мирцен | 300 |
| 1,8-цинеол | 380 |
| сабинен | 330 |
| абиетиновая кислота | 280 |
| гинзенозид Re | 300 |
| гинзенозид Rb1 | 350 |
| гинзенозид Rg2 | 300 |
| флороглюцин | 150 |
| усниновая кислота | 100 |
растительное масло остальное
Входящие в состав ФК1 вещества в обозначенном выше количестве растворяют в 1 л растительного масла. В качестве растворителя можно применять льняное, кукурузное, рапсовое масло.
Пример 2.
ФК2 - масляный раствор, содержащий бета-мирцен, альфа-пинен, бета-пинен, 1,8-цинеол, сабинен, флороглюцин, гинзенозид Re, гинзенозид Rb1, гинзенозид Rg2, абиетиновую кислоту, усниновую кислоту при следующем содержании компонентов (мг/л):
| альфа-пинен | 480 |
| бета-пинен | 450 |
| бета-мирцен | 350 |
| 1,8-цинеол | 430 |
| сабинен | 380 |
| абиетиновая кислота | 330 |
| гинзенозид Re | 350 |
| гинзенозид Rb1 | 400 |
| гинзенозид Rg2 | 350 |
| флороглюцин | 200 |
| усниновая кислота | 150 |
| растительное масло | остальное |
Входящие в состав ФК2 вещества в обозначенном выше количестве растворяют в 1 л растительного масла. В качестве растворителя можно применять льняное, кукурузное, рапсовое масло.
Пример 3.
ФК3 - масляный раствор, содержащий бета-мирцен, альфа-пинен, бета-пинен, 1,8-цинеол, сабинен, флороглюцин, гинзенозид Re, гинзенозид Rb1, гинзенозид Rg2, абиетиновую кислоту, усниновую кислоту при следующем содержании компонентов (мг/л):
| альфа-пинен | 530 |
| бета-пинен | 500 |
| бета-мирцен | 400 |
| 1,8-цинеол | 480 |
| сабинен | 430 |
| абиетиновая кислота | 380 |
| гинзенозид Re | 400 |
| гинзенозид Rb1 | 450 |
| гинзенозид Rg2 | 400 |
| флороглюцин | 250 |
| усниновая кислота | 200 |
| растительное масло | остальное |
Входящие в состав ФК3 вещества в обозначенном выше количестве растворяют в 1 л растительного масла. В качестве растворителя можно применять льняное, кукурузное, рапсовое масло.
Пример 4 Изучение фармакологической активности.
Определение цитотоксической активности фармацевтической активности (ФК1-ФК3) проводили на клеточной линии НСТ 116 карциномы толстой кишки человека колориметрическим методом с использованием МТТ-теста (Mosmann Т. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. // J. Immunol. Methods. 1983. - Vol.65 (1-2): 55-63).
Клетки культивировали в среде RPMI-1640, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки, 2 мМ L-глутамин (ПанЭко, Россия) и пенициллин-стрептомицин (ПанЭко, Россия), при 37°С в атмосфере 5% СО2.
Опухолевые клетки засевали в 96-луночные плоскодонные планшеты (Costar, USA). Концентрация клеток в каждой лунке - 1,7×104 кл/мл полной питательной среды RPMI-1640. Через сутки в лунки с клетками добавляли (по 20 мкл/лунку) льняное масло, исходные масляные растворы ФК1-ФК3, а также их разведения с шагом в 2 раза (1:2; 1:4; 1:8; 1:16; 1:32). Каждую концентрацию исследовали в триплетах. В контрольные лунки с клетками вносили по 20 мкл среды, которую использовали для приготовления разведений растворов. Планшеты с клетками, обработанными ФК1-ФК3 в разных разведениях, инкубировали при 37°С в атмосфере 5% СО2 в течение 24 часов, после чего добавляли в лунки 20 мкл раствора МТТ[3-(4,5-диметилтиазолин-2)-2,5 дифенилтетразолий бромид] в концентрации 1 мг/мл и инкубировали 4 ч при 37°С в 5% СО2. После образования формазана надосадочную жидкость удаляли, осадок растворяли в 150 мкл диметисульфоксида (ДМСО). Далее планшеты помещали на 10 минут в термостат при температуре 37°С, затем 10 минут встряхивали на шейкере, после чего интенсивность окрашивания среды измеряли на фотометрическом анализаторе иммуноферментных реакций «Multiskan EX (Thermo Labsystems) при λ=540 нм. Величина поглощения прямо пропорциональна количеству выживших клеток.
Цитотоксичность, Ц (в %) определяли по формуле:
Ц=(1-(Оо/Ок))*100%,
где Ок - оптическая плотность в контрольных лунках, Оо - оптическая плотность в опытных лунках.
Опухолевые клетки считали чувствительными к исследуемым составам фармацевтической композиции, если количество погибших клеток в культуре составляло не менее 50%.
Результаты представлены в таблицах 2-4.
В таблице 2 отражены результаты МТТ-теста по определению цитотоксического действия варианта фармкомпозиции ФК1 на клетки линии НСТ-116. В качестве растворителя использовали льняное масло.
В таблице 3 показаны результаты МТТ-теста по определению цитотоксического действия фармкомпозиции ФК2 на клетки линии НСТ-116. В качестве растворителя использовали льняное масло.
В таблице 4 представлены результаты МТТ-теста по определению цитотоксического действия фармкомпозиции ФК3 на клетки линии НСТ-116. В качестве растворителя использовали льняное масло.
Как следует из результатов, клетки линии НСТ 116 оказались чувствительными к цитотоксическому воздействию предлагаемых примеров ФК. ФК1-ФК3 как в исходном виде, так и в разведениях от 1:2 до 1:16 проявили высокое цитотоксическое действие в отношении клеток линии НСТ 116. Их гибель составила от 71 до 84,3%. Наибольшую цитотоксичность ФК1-ФК3 оказали в разведении 1:16 (80,9±3,4; 81,9±4,0; 84,3±7,5% соответственно). При большем разведении цитотоксическая активность фармкомпозиций снижалась (20,6±7,7; 21,2±5,2; 24,8±3,2% соответственно). У льняного масла цитотоксичность не была обнаружена.
Таким образом, предлагаемые варианты ФК как в исходном виде, так и в разведениях от 1:2 до 1:16 проявили высокую цитотоксичность по отношению клеток линии НСТ 116.
Определение механизма клеточной гибели, индуцируемой ФК, проводили на примере ФК3 в разведении 1:16, где показана наибольшая цитотоксичность в отношении опухолевых клеток.
Вид клеточной гибели (апоптоз/некроз), т.е. выявление апоптических или некротических клеток, а также количество живых/погибших клеток (в %) определяли методом двойного окрашивания Аннексином V-FITC (AnnV-FITC) и пропидием йодида (PI).
Клетки линии НСТ 116 вносили в 6-луночные планшеты в количестве 200 тысяч/лунка в 4 мл полной среды RPMI-1640 с 10% фетальной бычьей сыворотки. Через сутки в лунки с клетками добавляли ФК3 в цитотоксичной концентрации, ранее определенной в МТТ- тесте (разведение 1:16). В контрольных лунках клетки инкубировали без препаратов. Через 24 ч инкубации клетки отмывали в 500 мкл раствора Версена. Для оценки клеточной гибели использовали FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I (BD, 556547). Клетки помещали в пробирки для проточной цитометрии в 100 мкл аннексин-связывающего буфера, добавляли по 5 мкл AnnV-FITC и 5 мкл PL Образцы инкубировали в темноте при комнатной температуре в течение 15 минут. Далее к пробам добавляли 400 мкл аннексин-связывающего буфера и проводили анализ на проточном цитомфлуориметре FACSCanto II (Becton Dickinson).
Окрашенные по AnnV-FITC и PI клетки оценивали по следующим критериям: живые клетки, отрицательные по AnnV-FITC и PI (AnnV-FITC-/PI-), ранние апоптические клетки, положительные по AnnV-FITC и отрицательные по PI (AnnV-FITC+/PI-), поздние апоптические клетки, положительные по AnnV-FITC и PI (AnnV-FITC+/PI+) и некротические клетки, отрицательные по AnnV-FITC и положительные по PI (AnnV-FITC-/PI+).
Результаты двойного окрашивания клеток линии НСТ 116 AnnV-FITC, и PI представлены на фигуре 1 и в таблице 5. На фигуре 1 показаны результаты двойного окрашивание клеток карциномы толстой кишки человека линии НСТ 116 с применением AnnV-FITC, и PI (А - контроль (интактные клетки); Б - клетки, обработанные ФК3 в разведении 1:16).
В таблице 5 представлены результаты влияния ФК3 на гибель клеток карциномы толстой кишки человека линии НСТ 116. Из таблицы 5 видно, что при воздействии ФК3 в разведении 1:16 выявлено 27% живых опухолевых клеток, что согласуется с результатами МТТ-теста: ФК3 в разведении 1:16 вызывал гибель более 80% клеток линии НСТ 116. Вместе с тем, определено 47,6% клеток на стадии раннего апоптоза и 24,3% клеток на стадии позднего апоптоза. Иными словами, около 72% опухолевых клеток обнаружено на стадии апоптоза. Некротический механизм гибели наблюдали у 1,1% опухолевых клеток.
Для определения активации каспазы-3, эффекторного фермента, участвующего в апоптотической трансформации клетки, использовали FITC Active Caspase-3 Apoptosis Kit (BD Pharmingen).
Клетки линии НСТ 116 вносили в 6-луночные планшеты в количестве 200 тысяч/лунку в 4 мл полной среды RPMI-1640 с 10% фетальной бычьей сыворотки. Через сутки в лунки с клетками добавляли ФК3 в разведении 1:16. В контрольных лунках клетки инкубировали без препаратов. Через 24 ч инкубации клетки отмывали в 500 мкл раствора Версена. Затем клетки дважды отмывали холодным PBS, ресуспенидровали в холодном Cytofix/Cytoperm буфере в концентрации 1*106 клеток/0,5 мл буфера. В течение 20 минут проводили инкубацию на льду. Затем отмывали от Cytofix/Cytoperm дважды в Perm/wash буфере (0,5 мл буфера на 1*106 клеток) при комнатной температуре. Разводили антитела к активной каспазе-3 в Perm/wash буфере (на одну пробирку 20 мкл антител в 100 мкл буфера). Клетки ресуспендировали в полученном растворе с антителами и инкубировали 30 минут при комнатной температуре в темноте. Далее отмывали каждый образец в 1 мл Perm/wash буфера, ресуспендировали в 0,5 мл Perm/wash буфере и анализировали на проточном питометре FACS Canto II (Becton Dickinson).
В таблице 6 приведены результаты воздействия ФК3 на активацию каспазы-3. Фигура 2 иллюстрирует активацию каспазы-3 под действием ФК3 (А - контроль, интактные клетки; Б - клетки, обработанные ФК3 в разведении 1:16). Исследование показало, что фармкомпозиции (на примере а ФК3) активируют проапоптический фермент, эффекторную каспазу-3, что полагает гибель клеток по типу программированной смерти (механизм апоптоза).
Таким образом, полученные данные свидетельствует о способности предлагаемых вариантов ФК оказывать высокую цитотоксичность в отношении клеток карциномы толстой кишки человека, вызывая гибель опухолевых клеток по механизму апоптоза.
Фармацевтическая композиция, проявляющая цитотоксичность в отношении клеток карциномы толстой кишки человека, характеризующаяся тем, что она представляет собой масляный раствор, содержащий альфа-пинен, бета-пинен, бета-мирцен, 1,8-цинеол, сабинен, абиетиновую кислоту, гинзенозиды Re, Rb1, Rg2, флороглюцин, усниновую кислоту и растительное масло в качестве фармацевтически приемлемого растворителя при следующем содержании компонентов, мг/л:
| альфа-пинен | 430-530 |
| бета-пинен | 400-500 |
| бета-мирцен | 300-400 |
| 1,8-цинеол | 380-480 |
| сабинен | 330-430 |
| абиетиновая кислота | 280-380 |
| гинзенозид Re | 300-400 |
| гинзенозид Rb1 | 350-450 |
| гинзенозид Rg2 | 300-400 |
| флороглюцин | 150-250 |
| усниновая кислота | 100-200 |
| растительное масло | остальное |
