Способ определения стадии атопического дерматита

Изобретение относится к медицине, а именно к аллергологии и иммунологии, и может быть использовано для определения стадии атопического дерматита. В сыворотке крови пациента методом иммуноферментного анализа выделяют маркер воспаления IL-36. Для чего в лунки планшета вносят 100 мкл раствора для разведения образцов и 100 мкл сыворотки крови пациента с атопическим дерматитом. Инкубируют 120 мин при встряхивании на шейкере при температуре 37±1°С и 700 об/мин и промывают планшет 5 раз промывочным раствором. После чего вносят в лунки 100 мкл маркера воспаления IL-36 и инкубируют в течение 60 мин при встряхивании на шейкере при температуре 37±1°С и 700 об/мин. Затем 5 раз промывают планшет промывочным раствором и добавляют во все лунки стрептавидин-пероксидазу хрена и инкубируют в течение 30 мин при встряхивании на шейкере при температуре 37±1°С и 700 об/мин и промывают 5 раз планшет промывочным раствором. Вносят в лунки 100 мкл тетраметилбензидина плюс и инкубируют в защищенном от света месте 25 мин при температуре от 18°С до 25°С. После добавления стопреагента в лунки планшета измеряют величину оптической плотности растворов на спектрофотометре вертикального сканирования в двухволновом режиме 450 нм и 620 нм. При значениях маркера воспаления IL-36 в сыворотке крови от 0,02 до 600 пг/мл определяют стадию ремиссии атопического дерматита. При значениях маркера воспаления IL-36 в сыворотке крови от 601 пг/мл до 9800 пг/мл определяют стадию обострения атопического дерматита. Способ обеспечивает возможность повысить точность определения стадии атопического дерматита, дать объективную его оценку и совершенствовать диагностику этого заболевания, за счет определения в сыворотке крови пациента концентрации IL-36, являющегося специфическим маркером воспаления. 2 пр.

 

Изобретение относится к области медицины, а именно к аллергологии-иммунологии и касается способов оценки степени тяжести атопического дерматита (АтД).

Известен способ оценки степени тяжести АтД путем применения шкалы SCORAD (Scoring of Atopic Dermatitis). SCORAD предусматривает бальную оценку шести объективных симптомов: эритема, отек/папулезные элементы, корки/мокнутие, экскориации, лихенификация/шелушение, сухость кожи. Интенсивность каждого признака оценивается по 4-уровневой шкале: 0 - отсутствие, 1 - слабая, 2 - умеренная, 3 - сильная. При оценке площади поражения кожного покрова следует использовать «правило девятки», в котором за единицу измерения принята площадь поверхности ладони больного, эквивалентная одному проценту всей поверхности кожи. Цифрами указано значение площади для больных в возрасте старше 2 лет, а в скобках - для детей в возрасте до 2 лет. Оценку субъективных симптомов (ощущение зуда, нарушение сна) проводят у детей в возрасте старше 7 лет и взрослых; у детей младшего возраста оценку субъективных симптомов проводят с помощью родителей, которым предварительно объясняют принцип оценки.

Расчет индекса SCORAD производится по формуле: А/5+7В/2+С, где

А - распространенность поражения кожи,

В - сумма уровней интенсивности клинических симптомов АтД,

С - сумма оценок субъективных нарушений по визуальной аналоговой шкале.

Значения индекса могут варьировать в пределах от 0 до 103 (Общероссийская общественная организация «РОДВК», «РААКИ», «СПР». Клинические рекомендации 2020. Атопический дерматит).

Недостатком данного способа является то, что он субъективный, недостаточно точный, не позволяет объективно оценить степень тяжести АтД, может быть применим только в период обострения. Оценка субъективных симптомов может проводиться только при условии понимания родителями или детьми старше 7 лет принципа оценки. Наиболее частой ошибкой является регистрация «нарушения сна», т.к. сон может нарушиться и при других обстоятельствах, не связанных с АтД. Кроме того, практикующие врачи испытывают определенные трудности с применением шкалы SCORAD, связанные с затратой времени на заполнение оценочного листа и его непосредственный расчет.

Известен способ оценки степени тяжести течения атопического дерматита, который осуществляется следующим образом. У детей в периферической крови определяют уровень маркеров CD95+ лимфоцитов. При CD95+ выше 60,09% диагностируют острую стадию заболевания, а при CD95+ от 20,33 до 60,09% - хроническую стадию (патент RU №2461828, G01N 33/49, А61В 10/00, 20.09.2012).

Недостатком способа является его дорогостоящее оснащение, длительность и высокая трудоемкость.

Известен способ прогнозирования течения и оценки эффективности лечения атопического дерматита путем определения содержания в сыворотке крови белка - лактоферрина(ЛФ) в мкг/мл, альфа-1-антитрипсина(а1-AT) в г/л, альфа-2-макроглобулина(а2-МГ) в г/л, далее вычисляют коэффициент К по определенной формуле и при его значениях от 6 до 15 прогнозируют легкую степень тяжести заболевания, а при 15 и более - среднюю и тяжелую степень тяжести заболевания. Через месяц после лечения проводят повторное обследование с вычислением коэффициента К и при его снижении на 30% и более от его исходного значения лечение считают эффективным, прогнозируют длительную ремиссию, а при снижении коэффициента К менее 30% от его исходного значения лечение считают малоэффективным, прогнозируют короткий период ремиссии и высокий риск рецидива (патент RU №2603463, G01N 33/48, А61В 5/00, 27.11.2016).

Недостатком способа является многоступенчатость его процесса. Это занимает длительное время, что отсрочивает постановку диагноза и представляет неудобства практикующему врачу.

Наиболее близким способом диагностики степени тяжести АтД, является определение повышения уровня сывороточного IgE в периферической крови, методом иммуноферментного анализа: в лунки стриповиммуносорбента (мышиные моноклональные антитела к общему IgE) внести 20 мкл сыворотки крови пациентов. Инкубировать планшет на термостатируемом шейкере со скоростью 500 об/мин при температуре (37±1)°С в течение 1 ч 30 мин. Затем промыть лунки планшета раствором для промывания планшета 5 раз. Внести немедленно во все лунки по 100 мкл раствора тетраметилбензидина и инкубировать планшет на термостатируемом шейкере со скоростью 500 об/мин при температуре (37±1)°С в течение 10 мин. Далее внести во все лунки стриповиммуносорбента по 100 мкл стопреагента и планшет встряхивать на шейкере в течение 1-2 мин. Через 1 мин после остановки реакции, определить оптическую плотность в лунках стриповиммуносорбента в одноволновом режиме фотометра при длине волны 450 нм. Количество содержания IgE в сыворотке крови у здоровых людей в возрасте от 1 года до 9 лет составляет 53 МЕ/мл, от 9 до 15 лет - 0-200 МЕ/мл, после 18 лет - 0-1000 МЕ/мл (Мирзоян В.Л., Разнатовский К.И., Монахов К.Н. Атопический дерматит. Алгоритмы диагностики и лечения: учебное пособие. - СПб.: Изд-во СЗГМУ им. И.И. Мечникова, 2018. - 64 с).

Недостатками способа являются невозможность дифференциального исключения других заболеваний, также связанных с повышением уровня сывороточного IgE (чесотка, Т-клеточная лимфома, фотодерматозы и др.), большая вероятность пропустить пациента с атопическим дерматитом (т.к. пациенты могут иметь различные типы реакций обострения: немедленные (или IgE-опосредованные), отсроченные (или не связанные с IgE) или сочетание этих видов реакций),и отсутствие разделения результатов анализа по степеням тяжести заболевания.

Задачей предлагаемого изобретения является совершенствование диагностики атопического дерматита, объективная оценка степени тяжести атопического дерматита и описание клинических проявлений атопического дерматита.

Технический результат изобретения - повышение точности оценки степени тяжести атопического дерматита, объективная его оценка и совершенствование диагностики этого заболевания.

Указанный технический результат в способе оценки степени тяжести атопического дерматита достигается тем, что в сыворотке крови пациента, методом иммуноферментного анализа выделяют специфический маркер воспаления IL-36. Для этого в лунки планшета вносят 100 мкл раствора для разведения образцов и 100 мкл сыворотки крови пациента с атопическим дерматитом. Инкубируют 120 мин при встряхивании на шейкере при температуре 37±1°С и 700 об/мин и промывают планшет 5 раз промывочным раствором. Затем вносят в лунки 100 мкл маркера воспаления IL-36 и инкубируют в течение 60 мин при встряхивании на шейкере при температуре 37±1°С и 700 об/мин. Затем 5 раз промывают планшет промывочным раствором и добавляют во все лунки стрептавидин-пероксидазу хрена и инкубируют в течение 30 мин при встряхивании на шейкере при температуре 37±1°С и 700 об/мин, и промывают планшет 5 раз промывочным раствором. Затем вносят в лунки 100 мкл тетраметилбензидина плюс и инкубируют в защищенном от света месте 25 мин при температуре от 18 до 25°С. Добавляют в лунки планшета 100 мкл стопреагента и измеряют величину оптической плотности растворов на спектрофотометре вертикального сканирования в двухволновом режиме 450 нм и 620 нм. Маркер воспаления IL-36 проявляет характерное свечение в данном волновом диапазоне, определяющем его количественное значение в сыворотке крови пациента. Так, при значениях маркера воспаления IL-36 в сыворотке крови от 0,02 до 600 пг/мл, определяют стадию ремиссии атопического дерматита, а при значениях маркера воспаления IL-36 в сыворотке крови от 601 пг/мл до 9800 пг/мл определяют стадию обострения атопического дерматита.

Новизна заявляемого способа оценки степени тяжести атопического дерматита заключается в том, что в сыворотке крови пациента методом иммуноферментного анализа выделяют специфический маркер воспаления IL-36, который позволяет объективно оценить степень тяжести атопического дерматита, что является важным шагом на пути совершенствования диагностики этого заболевания.

Были проведены исследования, в которых участвовали 80 больных атопическим дерматитом. Пациенты были поделены на две группы по степени тяжести клинического проявления атопического дерматита (согласно показателю SCORAD). В группе ремиссия (SCORAD≤10) состояло 14 человек, группа обострения была поделена на две подгруппы: ограниченная форма обострения атопического дерматита (SCORAD≤40) включала 46 чел и распространенная форма обострения атопического дерматита (SCORAD≤55) - 20 чел.

В результате исследований сыворотки крови пациентов с атопическим дерматитом выявлены статистически достоверные различия для специфического маркера воспаления IL-36 в зависимости от степени тяжести атопического дерматита. Материалы исследования были подвергнуты статистической обработке с использованием методов параметрического и непараметрического анализа. Накопление, корректировка, систематизация исходной информации и визуализация полученных результатов осуществлялись в электронных таблицах MicrosoftOfficeExcel 2016. Статистический анализ проводился с использованием программы STATISTIC А 13.3 (разработчик - StatSoft.Inc). Номинальные данные описывались с указанием абсолютных значений. В результате статистического анализа полученных данных в каждой группе пациентов, методом параметрической статистики (критерий корреляции Пирсона, r_xy) определилось наличие линейной связи между специфическим маркером воспаления IL-36 и степенью тяжести атопического дерматита. Наиболее высокая связь - в группе пациентов с ограниченной формой обострения атопического дерматита (r_xy 0.97), и в группе ремиссии (r_xy 0.94). Также при расчете непараметрического статистического критерия (U-критерий Манна-Уитни) наибольшая статистическая значимость определяется между следующими группами: ограниченная форма обострения атопического дерматита и ремиссия. В результате исследования количество специфического маркера воспаления IL-36 в сыворотке крови пациентов с атопическим дерматитом в статистически достоверных группах, разделенных по степени тяжести, следующее: в группе ремиссии - от 0.02 до 600 пг/мл, а в группе обострения (ограниченная форма) - от 601 до 9800 пг/мл.

На практике способ осуществляют следующим образом.

У пациентов проводят сбор венозной крови в количестве 5 мл натощак с утра в стерильную вакуумную пробирку. В холодовой центрифуге при 1000 об/мин, в течение 10 мин, при 4°С из венозной крови пациента получают сыворотку крови, в количестве 2 мл. Затем 100 мкл сыворотки крови пациента с атопическим дерматитом добавляют в лунки планшета, в которые уже было внесено 100 мкл раствора для разведения образцов. После этого планшет инкубируют 120 мин при встряхивании на шейкере при температуре 37±1°С и 700 об/мин и промывают 5 раз промывочным раствором. Затем вносят в лунки 100 мкл маркера воспаления IL-36 и инкубируют в течение 60 мин при встряхивании на шейкере при температуре 37±1°С и 700 об/мин, затем 5 раз промывают планшет промывочным раствором и добавляют во все лунки стрептавидин-пероксидазу хрена и инкубируют в течение 30 мин при встряхивании на шейкере при температуре 37±1°С и 700 об/мин, и промывают 5 раз промывочным раствором. Затем вносят в лунки 100 мкл тетраметилбензидина плюс и инкубируют в защищенном от света месте 25 мин при температуре от 18 до 25°С. После добавления 100 мкл стопреагента в лунки, измеряют величину оптической плотности растворов на спектрофотометре вертикального сканирования в двухволновом режиме: 450 нм и 620 нм. Маркер воспаления IL-36 проявляет характерное свечение в данном волновом диапазоне, определяющем его количественное значение в сыворотке крови пациента. При значениях маркера воспаления IL-36 в сыворотке крови от 0, 02 до 600 пг/мл определяют стадию ремиссии атопического дерматита, а при значениях маркера воспаления IL-36 в сыворотке крови от 601 пг/мл до 9800 пг/мл определяют стадию обострения атопического дерматита.

Данный способ позволяет объективно оценить степень тяжести атопического дерматита, повысить его точность, что позволит усовершенствовать диагностику и способствует назначению лечения в соответствии с тяжестью заболевания, тем самым повысить эффективность лечения и увеличить длительность ремиссии.

Эффективность предлагаемого способа поясняется следующими клиническими примерами:

Клинический пример 1

Пациент А., 10 лет впервые обратился к дерматологу по месту жительства. Жалобы: сухость, зуд средней интенсивности на коже туловища, верхних и нижних конечностей; при осмотре: распространенные экскориационные высыпания на коже туловища, верхних и нижних конечностей. Предварительный диагноз: Ксероз кожи? Атопический дерматит?

Для дифференциальной диагностики заболевания были проведены два иммуноферментных анализа: определение уровня сывороточного IgE в крови пациента, в результате которого сывороточный IgE в периферической крови пациента не выявлен; и определение количества специфического маркера воспаления IL-36 в сыворотке крови пациента, предлагаемым авторами способом: стерильную пробирку с венозной кровью пациентов поместили в холодовую центрифугу, где при 1000 об/мин, в течение 10 мин, при 4°С получили сыворотку крови, в количестве 2 мл. Затем 100 мкл сыворотки крови пациента с атопическим дерматитом добавили в лунки планшета, в которые уже было внесено 100 мкл раствора для разведения образцов. После этого планшет инкубировали 120 мин при встряхивании на шейкере при температуре 37±1°С и 700 об/мин и промывали 5 раз промывочным раствором. Затем внесли в лунки 100 мкл маркера воспаления IL-36 и инкубировали в течение 60 мин при встряхивании на шейкере при температуре 37±1°С и 700 об/мин, затем 5 раз промыли планшет промывочным раствором и добавили во все лунки стрептавидин-пероксидазу хрена и инкубировали в течение 30 мин при встряхивании на шейкере при температуре 37±1°С и 700 об/мин, и промыли 5 раз промывочным раствором. Затем внесли в лунки 100 мкл тетраметилбензидина плюс и инкубировали в защищенном от света месте 25 мин при температуре от 18 до 25°С. После добавления 100 мкл стопреагента в лунки измерили величину оптической плотности растворов на спектрофотометре вертикального сканирования в двухволновом режиме: 450 нм и 620 нм. В результате данного исследования специфический маркер воспаления определился в количестве 1469,87 пк/мл, что подтверждает наличие атопического дерматита у пациента в стадии обострения.

Клинический пример 2

Пациент П., 16 лет обратился к дерматологу по месту жительства с актом РВК из военкомата, для подтверждения отсрочки от военной службы. На момент осмотра врачебной комиссии жалобы на сухость, зуд слабой интенсивности на коже туловища, единичные высыпания на коже локтевых сгибах. Для подтверждения диагноза атопического дерматита определили уровень сывороточного IgE. В результате иммуноферментного анализа, сывороточный IgE в периферической крови не выявлен.

При дифференциальной диагностике заболевания иммуноферментным анализом, предлагаемым авторами, выявлен специфический маркер воспаления IL-36 в сыворотке крови пациентов, проводимый следующим образом: стерильную пробирку с венозной кровью пациентов поместили в холодовую центрифугу, где при 1000 об/мин, в течение 10 мин, при 4°С получили сыворотку крови, в количестве 2 мл. Затем 100 мкл сыворотки крови пациента с атопическим дерматитом добавили в лунки планшета, в которые уже было внесено 100 мкл раствора для разведения образцов. После этого планшет инкубировали 120 мин при встряхивании на шейкере при температуре 37±1°С и 700 об/мин и промывали 5 раз промывочным раствором. Затем внесли в лунки 100 мкл маркера воспаления IL-36 и инкубировали в течение 60 мин при встряхивании на шейкере при температуре 37±1°С и 700 об/мин, затем 5 раз промыли планшет промывочным раствором и добавили во все лунки стрептавидин-пероксидазу хрена и инкубировали в течение 30 мин при встряхивании на шейкере при температуре 37±1°С и 700 об/мин, и промыли 5 раз промывочным раствором. Затем внесли в лунки 100 мкл тетраметилбензидина плюс и инкубировали в защищенном от света месте 25 мин при температуре от 18 до 25°С. После добавления 100 мкл стопреагента в лунки измерили величину оптической плотности растворов на спектрофотометре вертикального сканирования в двухволновом режиме: 450 нм и 620 нм. В результате предложенного авторами метода, был определен специфический маркер воспаления в сыворотке крови пациентов, в количестве 598 пк/мл, что подтверждает наличие атопического дерматита у пациента в стадии ремиссии.

Приведенные примеры показывают, что предлагаемый авторами способ позволяет более точно определить степень тяжести атопического дерматита и способствует быстрому назначению лечения в соответствии с тяжестью заболевания, тем самым повышая эффективность лечения и увеличивая длительность ремиссии.

Способ определения стадии атопического дерматита, заключающийся в том, что в сыворотке крови пациента, методом иммуноферментного анализа выделяют маркер воспаления IL-36, для чего в лунки планшета вносят 100 мкл раствора для разведения образцов и 100 мкл сыворотки крови пациента с атопическим дерматитом; инкубируют 120 мин при встряхивании на шейкере при температуре 37±1°С и 700 об/мин и промывают планшет 5 раз промывочным раствором, после чего вносят в лунки 100 мкл маркера воспаления IL-36 и инкубируют в течение 60 мин при встряхивании на шейкере при температуре 37±1°С и 700 об/мин, затем 5 раз промывают планшет промывочным раствором и добавляют во все лунки стрептавидин-пероксидазу хрена и инкубируют в течение 30 мин при встряхивании на шейкере при температуре 37±1°С и 700 об/мин и промывают 5 раз планшет промывочным раствором; вносят в лунки 100 мкл тетраметилбензидина плюс и инкубируют в защищенном от света месте 25 мин при температуре от 18°С до 25°С, а после добавления стопреагента в лунки планшета измеряют величину оптической плотности растворов на спектрофотометре вертикального сканирования в двухволновом режиме 450 нм и 620 нм, и при значениях маркера воспаления IL-36 в сыворотке крови от 0,02 до 600 пг/мл определяют стадию ремиссии атопического дерматита, а при значениях маркера воспаления IL-36 в сыворотке крови от 601 пг/мл до 9800 пг/мл определяют стадию обострения атопического дерматита.