Способ стерилизации эксплантов березы in vitro с использованием наночастиц оксида меди

Авторы патента:

Гродецкая Татьяна Александровна (RU)

Евтушенко Надежда Александровна (RU)

A01H4/00 - Разведение растений из тканевых культур

Владельцы патента RU 2780830:

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Воронежский государственный лесотехнический университет имени Г.Ф. Морозова" (RU)

Изобретение относится к области биотехнологий, в частности к культивированию тканей и органов растений, и может быть использовано в сельском и лесном хозяйстве для получения качественного посадочного материала. Способ стерилизации эксплантов березы in vitro с использованием наночастиц оксида меди осуществляют следующим образом. Молодые побеги березы предварительно отмывают в воде с добавлением поверхностно-активных веществ (ПАВ) – стеарата калия, разрезают на сегменты длиной 3-5 см, после чего стерилизуют в течение 35 мин в растворе, состоящем из 200 мл дистиллированной воды и 200 мкл 5%-ного раствора гипохлорита натрия, с последующей промывкой в дистиллированной воде. Проводят основную стерилизацию побегов березы в ламинар-боксе в растворе, содержащем 15 мл 5%-ного раствора гипохлорита натрия и 85 мл стерильной дистиллированной воды, в течение 15 мин. Последующую промывку также проводят стерильной водой. Разрезают стерильные побеги березы в асептических условиях на сегменты длиной 1,5-2 см с одной пазушной почкой – экспланты, которые впоследствии высаживают на питательную среду WPM, оптимизированную для введения в культуру in vitro эксплантов березы и содержащую сферические наночастицы оксида меди диаметром 30-80 нм в концентрации 0,1 мг/л. Способ стерилизации эксплантов березы in vitro с использованием наночастиц оксида меди отличается повышенной безопасностью и эффективностью по сравнению с известными способами и позволяет пролонгировать санирующее воздействие наночастиц оксида меди в составе модифицированной питательной среды WPM при введении в культуру in vitro, а также сократить сроки получения и увеличить количество стерильных эксплантов.

Известны способы, направленные на решение проблемы стерилизации эксплантов в культуре in vitro, включающие стерилизацию первичных эксплантов при введении в культуру in vitro с использованием стерилизующего средства «Аламинол» на основе алкилдиметилбензиламмония хлорида (Пат. РФ № 2675510; МПК А01Н 4/00; опубл. 19.12.2018) или последовательное использование водных растворов этанола и препарата «Дезавид+», содержащего полигексаметиленгуанидин гидрохлорид и алкилдиметилбензиламмоний хлорид (Пат. РФ № 2720916; А01Н 4/00; опубл. 14.05.2019).

Недостатками данных способов является токсичность алкилдиметилбензиламмония хлорида для кожных покровов человека и тканей растений (Regulatory Toxicology and Pharmacology. 2020. Т. 116. С. 104717).

Известен способ стерилизации с помощью обработки 95%-ным этанолом в течение 30 с и раствором наночастиц серебра в концентрации 1, 5, 10 и 15 мг/л в течение 10, 15, 20 мин (IET nanobiotechnology. 2015. Т. 9. № 4. С. 239-245).

Данный способ позволяет проводить эффективную стерилизацию листовых эксплантов табака, однако он является затратным по времени, а разовая обработка наночастицами серебра не имеет пролонгированного действия.

Известны способы стимуляции ростовых процессов микроклонов путем введения наночастиц серебра и оксида меди в концентрации от 0,1 до 0,0001 мг/л (Лесотехнический журнал. 2018. Т. 8. № 4 (32). С. 6-11) и наночастиц железа в концентрации 3,0, 0,3, 0,06 мг/л, цинка - 0,4, 0,16, 0,08 мг/л и меди - 0,004, 0,0008, 0,00016 мг/л (Российские нанотехнологии. 2018. Т. 13. № 3-4. С. 57-63) в питательную среду Мурасиге-Скуга (МС).

Известные способы позволяют стимулировать ростовые процессы у микроклонов, но не учитывают стерилизующее действие наночастиц.

Известен способ поддержания стерильности микроклонов березы в культуре in vitro путем использования антибиотиков цефотаксима, карбенициллина, гентомицина в составе питательной среды WPM (Woody plant medium) (Достижения науки и образования. 2018. № 4 (26). C. 4-7).

Недостатком этого способа является возможное негативное влияние антибиотиков на процессы роста и развития микроклонов (Ecotoxicology. 2021. Т. 30. № 8. С. 1598-1609).

Известен способ дезинфекции эксплантов альдрованды путем использования наночастиц серебра в концентрации 5 мг/л в 1/5 питательной среды МС (Applied Sciences. 2021. Т. 11. № 8. С. 3653).

Данный способ позволяет снизить инфекционную нагрузку на экспланты альдрованды, но негативно влияет на их регенерационную способность и скорость роста.

Известен способ использования наночастиц оксида меди (IOP Conference Series: Earth and Environmental Science. IOP Publishing. 2020. Т. 595. № 1. С. 012001), включающий стадии отмывки молодых побегов в воде с добавлением поверхностно-активных веществ, их разрезки на сегменты длиной 3-5 см, стерилизации в течение 35 мин в растворе, состоящем из 200 мл дистиллированной воды и 200 мкл 5%-ного раствора гипохлорита натрия, с последующей промывкой в дистиллированной воде, основной стерилизации побегов в ламинар-боксе в растворе, содержащем 15 мл 5%-ного раствора гипохлорита натрия и 85 мл стерильной дистиллированной воды, в течение 15 мин, промывки стерильной водой и разрезки стерильных побегов в асептических условиях на сегменты длиной 1,5-2 см с одной пазушной почкой - экспланты, которые впоследствии высаживают на модифицированную питательную среду. Способ применяют для стерилизации эксплантов гибрида тополя×осину. В качестве модифицированной питательной среды используют безгормональную питательную среду Мурасиге-Скуга (МС0), содержащую пластинчатые наночастицы оксида меди длиной 500 нм, шириной 300 нм, толщиной 50 нм, в концентрации 0,75, 1,5, 3, 6 и 15 мкг/л. Принят за прототип.

Недостатками данного способа являются его неотработаннность на эксплантах древесных растений с высоким процентом обсемененности микроорганизмами (40 и более % контаминированных эксплантов), а также сложность подбора концентрации наночастиц оксида меди (1,5-3 мкг/л) из-за их узкого диапазона воздействия.

Задача, на решение которой направлено изобретение, заключается в разработке способа стерилизации эксплантов березы на стадии введения в культуру in vitro.

Это достигается тем, что в способе стерилизации эксплантов березы in vitro с использованием наночастиц оксида меди, включающем стадии отмывки молодых побегов в воде с добавлением поверхностно-активных веществ, их разрезки на сегменты длиной 3-5 см, стерилизации в течение 35 мин в растворе, состоящем из 200 мл дистиллированной воды и 200 мкл 5%-ного раствора гипохлорита натрия, с последующей промывкой в дистиллированной воде, основной стерилизации побегов в ламинар-боксе в растворе, содержащем 15 мл 5%-ного раствора гипохлорита натрия и 85 мл стерильной дистиллированной воды, в течение 15 мин, промывки стерильной водой и разрезки стерильных побегов в асептических условиях на сегменты длиной 1,5-2 см с одной пазушной почкой - экспланты, которые впоследствии высаживают на модифицированную питательную среду, согласно изобретению, в качестве модифицированной питательной среды используют питательную среду WPM, оптимизированную для введения в культуру in vitro эксплантов березы и содержащую сферические наночастицы оксида меди диаметром 30-80 нм в концентрации 0,1 мг/л, что позволяет пролонгировать действие санирующего эффекта, а также сократить сроки получения и увеличить количество стерильных эксплантов.

Наночастицы оксида меди применяются в качестве стимуляторов роста (Лесотехнический журнал. 2018. Т. 8. № 4 (32). С. 6-11); Российские нанотехнологии. 2018. Т. 13. № 3-4. С. 57-63), поверхностного стерилизующего агента семян растений (J Anim Plant Sci. 2019. Т. 29. № 2. С. 453-460), промывочного раствора (IOP Conference Series: Earth and Environmental Science. IOP Publishing, 2019. Т. 392. № 1. С. 012024) и компонента питательной среды для стерилизации эксплантов при введении в культуру in vitro (Applied Sciences. 2021. Т. 11. № 8. С. 3653).

Технический результат, заключающийся в увеличении количества стерильных эксплантов березы in vitro более чем на 20%, достигается за счет воздействия наночастиц оксида меди на патогенную микрофлору бактериального и грибкового происхождения, которые относятся к III классу опасности - малоопасные вещества, и обладают выраженным стерилизующим действием, являясь альтернативой использованию антибиотиков, и, в то же время, не снижают жизнеспособность эксплантов. Введение наночастиц оксида меди непосредственно в среду культивирования позволяет пролонгировать санирующий эффект, а их низкая концентрация в культивационной среде способствует уменьшению их агломерации и предотвращает токсический эффект от воздействия на микроклоны и кожные покровы человека.

Способ стерилизации эксплантов березы in vitro с использованием наночастиц оксида меди осуществляют следующим образом.

1. Молодые побеги березы предварительно отмывают в воде с добавлением поверхностно-активных веществ (ПАВ) - стеарата калия, разрезают на сегменты длиной 3-5 см, после чего стерилизуют в течение 35 мин в растворе, состоящем из 200 мл дистиллированной воды и 200 мкл 5%-ного раствора гипохлорита натрия, с последующей промывкой в дистиллированной воде.

2. Проводят основную стерилизацию побегов березы в ламинар-боксе в растворе, содержащем 15 мл 5%-ного раствора гипохлорита натрия и 85 мл стерильной дистиллированной воды, в течение 15 мин Последующую промывку также проводят стерильной водой.

3. Разрезают стерильные побеги березы в асептических условиях на сегменты длиной 1,5-2 см с одной пазушной почкой - экспланты, которые впоследствии высаживают на питательную среду WPM, оптимизированную для введения в культуру in vitro эксплантов березы и содержащую сферические наночастицы оксида меди диаметром 30-80 нм в концентрации 0,1 мг/л.

Состав питательной среды WPM, модифицированной наночастицами оксида меди и используемой на стадии введения в культуру березы in vitro, представлен в таблице 1.

Эффективность стерилизации с использованием наночастиц оксида меди представлена в таблице 2.

Как видно из таблицы 2, число стерильных эксплантов березы увеличивалось на 11,7-26,7% с одновременным сохранением жизнеспособности при использовании наночастиц оксида меди в среде культивирования.

Таким образом, способ стерилизации эксплантов березы in vitro с использованием наночастиц оксида меди отличается повышенной безопасностью и эффективностью по сравнению с известными способами и позволяет пролонгировать санирующее воздействие наночастиц оксида меди в составе модифицированной питательной среды WPM при введении в культуру in vitro, а также сократить сроки получения и увеличить количество стерильных эксплантов.

Таблица 1 Состав питательной среды WPM, модифицированной наночастицами оксида меди и используемой на стадии введения в культуру березы in vitro
Компоненты	Содержание, мг/л
Макросоли
Нитрат аммония NH₄NO₃	400,0
Калий дигидрофосфат KH₂PO₄	170,0
Сульфат калия K₂SO₄	990,0
Сульфат магния MgSO₄×7H₂O	370,0
Нитрат кальция Ca(NO₃)₂	556,0
Хлорид кальция CaCl₂	96,0
Микросоли
Борная кислота H₃BO₃	6,2
Сульфат марганца (II) MnSO₄×H₂O	22,3
Хлорид кобальта CoCl₂×6H₂O	0,025
Сульфат меди (II) CuSO₄×5H₂O	0,025
Сульфат цинка ZnSO₄×7H₂O	8,6
Fe-хелат
Сульфат железа (II) FeSO₄×7H₂O	37,3
Натриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты Na₂EDTA×2H₂O	27,8

Инозитол	100,0
Глицин	2,0
Тиамин-HCl	0,1
Пиридоксин-HCl	0,5
Никотиновая кислота	0,5
Сахароза	20000,0
Наночастицы оксида меди CuO	0,1
Агар	6000,0-7000,0
	рН 5,6-5,8

Таблица 2 Влияние наночастиц оксида меди в составе модифицированной питательной среды WPM на основные показатели эксплантов березы на стадии введения в культуру in vitro
Концентрация наночастиц, мг/л	Число стерильных эксплантов, %	Число жизнеспособных эксплантов, %
0,1	86,7±4,4	100,0±0,0
1	76,7±6,0	98,3±1,7
5	71,7±3,3	95,0±2,9
10	81,7±4,4	90,0±2,9
Контроль (без наночастиц оксида меди)	60,0±5,0	95,0±2,9

Способ стерилизации эксплантов березы in vitro с использованием наночастиц оксида меди, включающий стадии отмывки молодых побегов в воде с добавлением поверхностно-активных веществ, их разрезки на сегменты длиной 3-5 см, стерилизации в течение 35 мин в растворе, состоящем из 200 мл дистиллированной воды и 200 мкл 5%-ного раствора гипохлорита натрия, с последующей промывкой в дистиллированной воде, основной стерилизации побегов в ламинар-боксе в растворе, содержащем 15 мл 5%-ного раствора гипохлорита натрия и 85 мл стерильной дистиллированной воды, в течение 15 мин, промывки стерильной водой и разрезки стерильных побегов в асептических условиях на сегменты длиной 1,5-2 см с одной пазушной почкой – экспланты, которые впоследствии высаживают на модифицированную питательную среду, отличающийся тем, что в качестве модифицированной питательной среды используют питательную среду WPM, оптимизированную для введения в культуру in vitro эксплантов березы и содержащую сферические наночастицы оксида меди диаметром 30-80 нм в концентрации 0,1 мг/л, что позволяет пролонгировать действие санирующего эффекта, а также сократить сроки получения и увеличить количество стерильных эксплантов.

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ получения микрорастений подвоя косточковых культур (ПК СК 1), включающий их размножение в условиях in vitro, где на этапе укоренения используется питательная безгормональная среда, содержащая аммоний азотнокислый, калий азотнокислый, магний сернокислый, калий фосфорнокислый, кальций хлористый, борную кислоту, марганец сернокислый, цинк сернокислый, калий йодистый, натрий молибденовокислый, медь сернокислую, кобальт хлористый, сахарозу, тиамин хлорид, пиридоксин хлорид, никотиновую кислоту, агар-агар и воду, в качестве источника железа используется Fe-EDDHA.

Способ клонального микроразмножения in vitro сортового хмеля // 2777200

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ клонального микроразмножения in vitro сортового хмеля, включающий стерилизацию двухпочковых черенков с последующим культивированием на питательной среде, размножение побегов, их укоренение с последующей адаптацией к условиям ex vitro.

Способ выращивания растительного сырья ириса сибирского (iris sibirica l.) с заданным содержанием экстрактивных веществ // 2773523

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для индустриального производства высокоценного сырья с целью получения лекарств, биологически активных добавок, функциональных пищевых продуктов, лечебно-профилактической косметики и индивидуальных биологически активных веществ. Изобретение представляет собой способ получения растительного сырья ириса сибирского (Iris sibirica L.) клональным микроразмножением и выращиванием в условиях гидропоники с заданным содержанием экстрактивных веществ, включающий введение эксплантов в культуру in vitro, культивирование на питательной среде MS для получения регенерантов, их размножение и укоренение, согласно изобретению культивирование проводят на трехъярусной универсальной аэропонной установке, заполненной питательным раствором по прописи Мурасиге-Скуга с концентрацией макро-, микросолей, кальция хлористого и хелата железа с добавлением 10,0 мкМ БАП + 1,0 мкМ НУК + 0,1 мкМ ИМК для получения сырья с содержанием экстрактивных веществ 15,5±0,5% на абсолютно сухое сырье (на а.с.с.) и флавоноидов 6,9±0,9% на а.с.с., или 5,0 мкМ БАП для получения сырья с содержанием гидроксикоричных кислот 5,19±0,09% на а.с.с.

Способ получения стерильных проростков семян мачка желтого // 2773121

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к культивированию тканей и органов растений, и может быть использовано для получения каллусной и суспензионной ткани, как источника растительного сырья для фармацевтической и косметической промышленности, в садоводстве для получения оздоровленного посадочного материала, повышения эффективности клонального микроразмножения, селекционной практике для выведения новых сортов растений.

Способ выращивания карельской березы // 2772492

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ выращивания карельской березы, включающий высадку двухлетних саженцев на фоновом грунте с внесением минеральных удобрений и поливом.

Способ введения в культуру in vitro, получения каллусов и растений-регенерантов вздутоплодника сибирского (phlojodicarpus sibiricus (steph.) к.-pol.), с использованием в качестве первичных эксплантов вегетативных и генеративных органов // 2771960

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к области введения в культуру in vitro, получения каллусных культур и растений-регенерантов на твердых агаризованых средах, с использованием в качестве первичных эксплантов вегетативных и генеративных органов Phlojodicarpus sibiricus (Steph.) К.-Pol.

Способ создания удвоенных гаплоидов капусты белокочанной (brassica oleracea l.) в культуре изолированных микроспор // 2769815

Способ создания удвоенных гаплоидов капусты белокочанной (Brassica oleracea L.) в культуре изолированных микроспор относится к области сельскохозяйственной биотехнологии и может быть использован для снижения трудоемкости получения удвоенных гаплоидов капусты в культуре изолированных микроспор. Способ, характеризующийся тем, что выделение и очистку микроспор осуществляют с использованием 13%-ного раствора сахарозы (рН 5,8), инициирующий стресс оказывают инкубированием выделенных и очищенных микроспор в 13%-ном растворе сахарозы (рН 5,8) в темноте при температуре 32,5±0,1°С в течение 48 часов, после воздействия инициирующего стресса раствор сахарозы заменяют на питательную среду NLN-13 (рН 5,8), затем определяют плотность суспензии микроспор, доводят ее до 4×104 микроспор/мл и инкубируют до формирования эмбриоидов в климатической комнате.

Способ получения оздоровленного посадочного материала гладиолуса гибридного (gladiolus hybridus hort.) // 2764188

Изобретение относится к области биотехнологии. Клубнепочки гладиолуса гибридного подвергают двухэтапной стерилизации.

Способ формирования коллекции и длительного депонирования винограда in vitro // 2764104

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ формирования коллекции и длительного депонирования винограда in vitro, относится к сельскому хозяйству, в частности к виноградарству, и может быть использован для длительного хранения ценных и редких сортов винограда в коллекции in vitro.

Способ выращивания растений земляники с использованием метода in vitro // 2762979

Изобретение относится к области биотехнологии. Сущность изобретения заключается в том, что у укорененных микрорастений в период с начала августа по февраль месяц, с периодичностью 1-1,5 месяца полностью удаляют сформировавшиеся и начинающие отмирать корни и листья, а их в виде вегетирующих почек высаживают повторно и дифференцированно на питательные среды, содержащие ауксин, учитывая при этом диаметр почки.