Гистологический способ исследования морфологии иксодовых клещей рода dermacentor

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способу подготовки биологических материалов и изучению микроанатомии и морфологии иксодовых клещей, при помощи гистологических методов исследований, без нарушения анатомической целостности. Изобретение представляет собой способ подготовки материала, который включает в себя: погружение его в 5% раствор формалина, высушивание при помощи промакивания бумажным полотенцем, фиксацию в растопленном при 57°С в термостате гомогенезированном парафине. Вскрытие хитинового покрова с дорсальной части клеща при помощи одноразового бытового лезвия, проводку в изопропиловом спирте, заливку ксилол-парафином в разведении 50/50, нарезка гистологических срезов толщиной 5-7 мкм с дальнейшим окрашиванием гемотоксилином и эозином. Изобретение позволяет повысить точность исследований морфологии и микроанатомии иксодовых клещей. 6 ил., 1 пр.

 

Изобретение относится к ветеринарной медицине, в частности к способу подготовки биологических материалов и изучению микроанатомии и морфологии иксодовых клещей, при помощи гистологических методов исследований, без нарушения анатомической целостности.

Уровень техники

Известен способ отбора слюнной железы и гемолимфы клещей Ixodes scapularis(см. «Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks» Toni G. Patton, Gabrielle Dietrich, Kevin Brandt, Marc C. Dolan, Joseph Piesman, Robert D. Gilmore «Journal of visualized experiments» February 2012), который заключается в извлечении слюнной железы с последующей ее фиксацией на предметном стекле.

Недостатком способа является невозможность исследования тканей клеща, а также невозможность проведения гистологических исследований извлеченной слюнной железы.

Известен способ вскрытия клещей, предназначенный для дальнейшего изучения внутренней морфологии (см. «Examination of the Internal Morphology of the Ixodid Tick, Amblyomma maculatum Koch, (Acari: Ixodidae); a “How-to” Pictorial Dissection Guide» Edwards, K. T.* J. Goddard, and A. S. Varela-Stokes «Midsouth Entomologist 21-1-2009»

Недостатком данного способа является отсутствие возможности подготовки материала для проведения гистологических исследований, с целью исследования микроанатомии и морфологии иксодового клеща.

Наиболее близким по технической сущности и принятый авторами за прототип является способ исследования иксодовых клещей R. Sanguineus питающихся резистентными хозяевами, который заключается во вскрытии живого клеща Rhipicephalus sanguineus в растворе забуференного формалина, дальнейшем проведении гистологических срезов и окрашивании их по Май-Грюнвальд (см. «Histopathology of Rhipicephalus sanguineus (Acari: Ixodidae) ticks fed on resistant hosts» Viviane Aparecida Veronez Æ Ma´rcio Botelho de Castro Gerva´sio H. Bechara Æ Matias P. J. Szabo´ «24 January 2009 / Accepted: 12 June 2009 / Published online: 25 June 2009» Springer Science+Business Media B.V. 2009).

Недостатком данного способа является отсутствие возможности дальнейшего изучения микроанатомии и морфологии иксодового клеща при других типах окрашивания, а также трудоемкость в процессе подготовки материала для дальнейшего гистологического исследования.

Раскрытие изобретения

Задачей предполагаемого изобретения является разработка эффективного способа вскрытия хитинового покрова иксодового клеща с дальнейшей его подготовкой для проведения гистологических исследований.

Технический результат, который может быть получен с помощью предлагаемого способа, сводится к повышению точности исследований морфологии и микроанатомии иксодовых клещей.

Технический результат достигается с помощью способа подготовки материала, который включает в себя: погружение его в 5% раствор формалина, высушивание при помощи промакивания бумажным полотенцем, фиксацию в растопленном при 570С в термостате гомогенезированном парафине. Вскрытие хитинового покрова с дорсальной части клеща при помощи одноразового бытового лезвия, проводку в изопропиловом спирте, заливку ксилол-парафином в разведении 50/50, нарезка гистологических срезов толщиной 5-7 мкм с дальнейшим окрашиванием гемотоксилином и эозином.

Краткое описание чертежей и иных материалов

На фиг.1 Полунапитавшаяся самка иксодового клеща рода Dermacentor, зафиксированная в гомогенезированном парафине

На фиг. 2 Вскрытие зафиксированной самки иксодового клеща при помощи гистологической иглы и бытового лезвия, зафиксированного в иглодержателе,

На фиг. 3 Зафиксированная в гомогенезированном парафине самка иксодового клеща рода Dermacentor с удаленной крышкой

На фиг. 4 Гистологический срез полунапитавшейся самки иксодового клеща рода Dermacentor. Окраска гемотоксилином и эозином. Ув. ок. 10, об. 4.

На фиг. 5 Ооциты IV стадии со сформировавшейся желточной оболочкой. Напитавшаяся самка иксодового клеща, рода Dermacentor. Ув. ок. 10, об. 20

На фиг. 6 Стенка кишечника. 1-Пищеварительные клетки I и II типа, 2- Ядро пищеварительной клетки II типа. 3-мышечные волокна кишечника. 4-гемоглобин. Напитавшаяся самка иксодового клеща, рода Dermacentor. Ув. ок. 10, об. 100

Осуществление изобретения

Гистологический способ исследования морфологии иксодовых клещей рода Dermacentor включает 5 этапов.

1 этап

Иксодовый клещ, вне зависимости от пола, фиксируют щитком вниз в чашке Петри. Затем в анальное отверстие при помощи инсулинового шприца вводят внутрь забуференный 5% формалин в объеме 0,05 мл для самца, 0,1 мл для ненапитавшейся и полунапитавшейся самки, и 0,15 мл для напитавшейся самки. После проведения данной процедуры каждого из клещей помещают в отдельную стеклянную пробирку, содержащую забуференный 5% формалин, таким образом, чтобы формалин в 2 раза превышал объем клеща. Дальнейшая фиксацию клещей проводят в течение 7 суток в темном сухом помещении. После фиксации, клещей достают из пробирок, промакивают одноразовыми полотенцами для удаления остатков формалина. Гомогенезированный парафин помещают в чашку Петри и растапливают в термостате при температуре 57%. После полного расплавления парафина, чашку Петри достают из термостата и оставляют до полного остывания и затвердевания. Чашку Петри помещают под бинокулярный микроскоп, при помощи которого в дальнейшем будет осуществлена работа с клещом. Затем берут пинцет прямой и при помощи спиртовки разогревают обратную плоскую сторону пинцета до того, как начнет появляться дымка. Сразу же после нагрева, данным пинцетом создают небольшое углубление на поверхности парафина. Затем, до того, как парафин остыл, при помощи пинцета клещ помещают щитком наверх в чашку Петри таким образом, чтобы его щиток был поверх парафина. Лапки дополнительно утапливают при помощи гистологических игл. Клеща оставляют в чашке Петри на 10-15 минут до полного застывания парафина (фиг. 1).

После фиксации клеща в парафине, проводят его вскрытие. Для этого используют иглодержатель, в который закреплена ¼ часть бытового лезвия от Т-образного станка (фиг. 2).

Вскрытие самок отличается от вскрытия самцов ввиду наличия свободной и эластичной части тела.

Вскрытие самок проводят следующим образом.

Первый поверхностный надрез делают краем лезвия в нижнем правом крае щитка, не допуская утапливания лезвия внутрь. Лезвие держат параллельно поверхности парафина и продолжают надрез по краю контура тела клеща, вплоть до того, пока лезвие не дойдет до левого нижнего края щитка. Разрез, находящийся у левого края щитка, соединяют с первоначальным надрезом.

Затем, при помощи глазного пинцета прямого и гистологических игл удаляют верхнюю крышку, оттягивая в каудальном направлении (фиг. 3).

Вскрытие самца проводят следующим образом.

Первый поверхностный надрез делают краем лезвия по краю щитка, начиная от головы и не допуская утапливания лезвия внутрь клеща. Лезвие держат параллельно поверхности парафина и продолжают надрез по краю щитка, вплоть до того, пока лезвие не соединится с первым надрезом. Затем, при помощи глазного пинцета прямого и гистологических игл удаляют верхнюю крышку, оттягивая в каудальном направлении Щиток также удаляется при помощи пинцета и гистологических игл.

По завершению вскрытия, берут пинцет прямой и подогревают плоскую его часть на спиртовке. Затем расплавляют парафин при помощи разогретого пинцета и извлекают клеща.

Этап 2

Для дальнейшей обработки клеща подготавливают 5 емкостей с изопропиловым спиртом (Купавнареактив, ХЧ, Россия), заполненных таким образом, чтобы объем изопропилового спирта в три раза превышал объем клеща. Вскрытые клещи (с удаленной крышкой у самок и удаленным щитком у самцов) помещают в емкость номер 1 на 30 минут. Затем клещей достают из емкости номер 1, содержащую изопропиловый спирт, обсушивают при помощи бумажного полотенца и помещают в емкость номер 2, содержащую изопропиловый спирт. Данную процедуру повторяют с емкостью 3,4 и 5. В итоге общее нахождение клеща в растворе должно быть 2,5 часа. Затем клещей вытаскивают из емкости 5 и просушивают одноразовым бумажным полотенцем, удаляя оставшийся изопропиловый спирт.

Этап 3

Предварительно перед тем, как помещают клещей в изопропиловый спирт, подготавливают 2 емкости с гомогенезированным парафином, разогретым до жидкого состояния в термостате при температуре 57°С. Клещей помещают в горячий парафин, содержащийся в емкости номер 1, и оставляют в термостате на 5 часов. Затем клещей достают из емкости 1 и помещают в емкость 2 с горячим парафином и оставляют в термостате на 5 часов. Таким образом клещи должны находится в горячем парафине 10 часов.

Этап 4

Проводят стандартную гистологическую заливку клещей из термостата, находящихся на 3 этапе. При заливке, каждого клеща помещают дорсально к гистологическому блоку таким образом, чтобы при проведении гистологических срезов, его дорсальная часть без хитинового покрова была сверху.

Этап 5

Предварительно проводят подготовку предметных стекол, нанося на стекла адгезив (белок-глицерин). Гистологическую нарезку клещей проводят на микротоме толщиной среза 5-7мкм, после чего срезы помещают столик для подсушивания гистологических препаратов на 3 минуты. Затем, подсушенные стекла со срезами помещают на планшетку и оставляют в термостате на 10 часов при температуре 56°С, после чего, стекла извлекают из термостата и оставляют на 20 минут до полного застывания парафина на их поверхности. После данного этапа гистологические срезы клещей окрашивают гемотоксилином и эозином по стандартной гистологической методике. По окончанию процедуры покраски, на стекла помещают покровные стекла с монтирующей средой (фиг. 4, 5, 6).

Изобретение по сравнению с прототипом и другими известными техническими решениями имеет следующие преимущества:

- Сохранение целостности гистологических срезов, что дает возможность для более точных исследований.

- Возможность использовать как стандартные методы гистологической окраски, так и не стандартные (гистохимический метод), что позволит более детально исследовать отдельные органы, а также клеточные структуры иксодовых клещей.

- Упрощенный процесс обработки материала.

- Сниженная стоимость гистологического препарата за счет малого расхода жидких реактивов и буферов.

Гистологический способ исследования морфологии иксодовых клещей рода Dermacentor, включающий в себя фиксацию иксодового клеща в 5% забуференном формалине, вскрытие хитинового покрова иксодового клеща с дорсальной стороны при помощи бытового лезвия, проводка материала при помощи изопропилового спирта в течение 2,5 часов, а также при помощи горячего гомогенезированного парафина, растопленного в термостате при температуре 57°С, дальнейшая гистологическая нарезка клещей на микротоме толщиной среза 5-7 мкм, с последующей окраской гемотоксилином и эозином по стандартной гистологической методике.