Способ выделения гиббереллина из культуральной жидкости гриба fusarium mon1liforme

 

0 П И С А Н И E i 287968

Союз Советских

Социалистических

Республик

Зависимое от авт. свидетельства . м

Заявлено 18Л .1966 (№ 1076749 30-15) с присоединением заявки хс 1096846, 30-15

Приоритет

Опубликовано ОЗ.XII.1970, Бюллетень ¹ 36

Дата опубликования описания 23.!1.1971

Кл, 16, 15

Комитет по делам изобретений и открытий при Совете Мииистров

СССР. с1ПК С 05d ДК 631.811,98:631,812 (088.8) Авторы изобретения

Заявители

Г. С. Муромцев, Ю. С. Раковский, P. Л. Крутова и 3. Н. Пер

Курганский завод медицинских препаратов и Всесоюзный нау исследовательский институт фитопатологии

1

СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ГИББЕРЕЛЛИНА ИЗ КУЛЪТУРАЛЬНОЙ

ЖИДКОСТИ ГРИБА FUSARIUM MONILIFORME

Изобретение относится к способам получения гормональных препаратов — регуляторов роста растений, в особенности, к способам выделения этих веществ из микробных .культур и, в частности, к способам выделения гиббереллинов из культуральных жидкостей мицелиального гриба.

Препарат гиббереллина, применяемый в качестве стимулятора роста растений, представляет собой смесь гибберелл ннов, основным из которых является гибберелловая кислота (ГК) . Эти вещества получают путем микробного синтеза, выделяя их из культуральной жидкости гриба-продуцента Fusarium гпоп1 forme.

Известны способы выделения гиббереллинов из культуральной жидкости, основанные на адсорбции активным углем, экстрагировании из фильтрата жидкой культуры и ионном обмене.

Известные способы выделения гиббереллина из культуральной жидкости неудобны тем, что они требуют применения большого количества взрыво- и огнеопасных органических растворителей на первых стадиях производственного процесса, использования больших количеств сравнительно дорогостоящи или дефицитных сорбентов, высокие энергетические затраты при сушке больших объемов водных растворов.

Предложено выделение гиббереллина oc) ществлять,путем его осаждения ионами дву«или трехвалентного железа (Ге+, F+++) в присутствии ионов хлора (Cl †).

Ионы двух- и трехвалентного железа при значения«рН 3 — 3,5 переводят гибоерелловую кислоту пз водного раствора в осадок, который легко отделяется фильтрованием.

Для осаждения гпббереллинов пригодна лю10 бая соль железа, в частности, дешевые и недефицитные хлористое (Fe С1 ) и хлорное железо (Ге С1з).

В культуральную жидкость вносят хлористый барий. после чего отделяют мицелий, на15 пример. фильтрованием. В полученный фильтрат вносят хлорное железо ii хлористой натрий, растворяют перемешиванием и доводят реакцию раствора до рН 3,2 — 3,4. Выпавший осадок отделяют фильтрованием. Осадок

20 представляет собой копплексное соединение гпббереллина с «лорным железом и может быть использован либо путем непосредственного применения в сельском хозяйстве, либо для получения кристаллического гиббереллп25 на.

При применении его в сельском хозяйстве осадок сушат. размельчают и выпускают с завода в впдс порошка с маркой «технический гиббереллин:>, а прп получении кристалличе30 ского гиббереллина осадок обраоатывают

287968

Схема получения кристаллического гиббереллина

Культуральная жидкость — 5",>-ный раствор ВаС12 (5 ll от объема культуральной жидкости) Мицелий (не утилизируется) фильтрация

Нативный раствор осаждение комплекса и фильтрация

Фильтрат (не утилизируется) Влажный комплекс/осадок

Осадок (не утилизируется) разложение комплекса, промывка п фильтрация

Щелочной концентрат подкисление и экстракцпя

Этилацетатный экстракт сушка

Сухой этилацетатный экстракт очистка углем

Очищенный этилацетатный экстракт вакуум-концентрирование

Гиббереллин кристаллический

Отработанный водный раствор (не утилизируется) СаС1, 3 — 4 /о (об, вес) Высоленная вода (не утилизируется) I",о активного угля марки А

Отработанный уголь (нс утилизируется) Отгон этилацетата (на экстракцию) се промывают водопроводной водой (30 л, 20% к ооъему культуральной жидкости), фильтрат н промывки собирают в чугунный эмалированный сборник емкостью 2000 л. К полученному фильтрату культуральной жидкости в количестве 1550 л с содержанием гиббереллина 1250 л1г/л добавляют 5,8 кг технического хлорного железа (из расчета 3 г 100% -ного хлорного железа на 1 г гиббереллина) и

77,5 кг пищевой поваренной соли (из расчета 5 вес. % соли на обьем фильтрата).

Фильтрат перемешивают до растворения добавленных солей, доводят 20%-ным раствором едкого патра рН до 3,2 — 3,4 и выдерживают 1 час. Выпавший осадок отфильтровывают на рамном фильтре-прессе, фильтрующий материал-бельтинг и бязь по одному слою. По окончании фильтрования осадок па,прессе продувают сжатым воздухом и выгружают.

20 Полученный комплексный осадок, содер>кащий гиббереллин и другие примеси, сушат на калориферной сушилке при 70 — 80 С и размалывают на шаровой мельнице (можно на микромельнице) . Получают светло-коричневый

25 порошок, содержащий 109,5 кг/г гнббереллина. Выход гиббереллина от ис:одного составляет 81%.

Пример 3. Получение кристаллического гиббереллина. К 5,1 л фильтрата культураль30 ной жидкости с содержанием гиббереллина

1690 иг/л (всего 8,6 г гиббереллина) добавляют 25,8 г технического хлорного железа (из р".счета 3 г 100 /ц-ного FeC13 на 1 г гиббереллина) и 255 г пищевой поваренной соли (из

35 расчета 5 вес., соли на объем фильтрата).

Фильтрат пере. .;ешивают до»астзорения добив Ie!Iklk.!õ солей, доводят аммиаком pI I до

3,2 — 3,4 и выдерживают 1 час. Выпавший осадок отфильтровывают на воронке Бюхневодньгм аммиаком, нерастворившуюся часть осадка удаляют фильтрованием. Раствор, представляющий собой водно-аммиачный концентрат гиббереллина, подкисляют до рН 2,0—

2,2, и .гиббереллин экстрагируют этилацетатом. Этилацетатный концентрат сушат хлористым кальцием, очищают активным углем и упаривают под вакуумом до выделения кристаллов гибберелли на.

Пример 1. Осаждение гибберелловой кислоты из водных растворов солями железа.

Раствор кристаллического гиббереллина в воде разделяют на части по 500 нл и осаждают различньгми солями железа при рН 3,2 — 3,4, Количество каждой соли определяют из расчета 1 г содержащегося в ней железа на 1 г гиббереллина.

Берут соли хлорного железа FeCI азотнокислое железо Ре(ХОз)з, сернокислое железо

Feq(SO4), хлористого железа ГеС21 и сернокислого железа FeSO4. После добавления солей, перемешивания и доведения рН до 3,2—

3,4 выдерживают 2 час. Выпавший осадок отделяют на воронке Бюхнера (фильтровальная бумага), сушат и взвешивают.

Исходный раствор, осадок и маточник анализируют на содержание гиббереллина фотоколориметричеоким способом с предварительной очисткой бутанолом.

Пример 2. Получение технического,препарата †комплексно соединения гиббереллпна с железом.

К 1500 л культуральной жидкости с содержанием гиббереллина 1477 нг/л (в ферментеРе на 3 л4в) добавлЯют 75 лл 5с/о-ного Раствора хлористого бария (5 /о от объема культуральной жидкости). Смесь выдерживают

30 мин и отфильтровывают на рамном фильтрпрессе (F — 2,8 и- ). Мицелий на фильтро-пре.—

FeCI3 3 г иа I г ГК, NaCI 5О/О-пый (об. вес.) р; "вора

2,5О<>-ный раствор Х11.,ОН (2",ь-иый раство ) Х11,01 I нп промывку) НСI до рН 2,0 — 2,2, этилацетат

287968

Предмет изобретения

Корректор А. П. Васильева

Реп; к!ор В. Чулкова

Изгь М 58 Заказ 100/9 Тираж 480 Подписное

11НИИП11 Комитета по елам изобретений и открытий при Совете Министров СССР

Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5 т носоаФия, пр. Сапунова, 2 под вакуумом через два слоя фильтроваль-! бумаги. Полученный после фильтрования

)ой осадок (вес 178 г, содержание гиббе-! лина 45 ха/г) подвергают разложению пудобавле! иЯ 300 в1,! 2,5о/о-ного водного 5

:твора ам„ èàêà (иs расчета получения . твора гиббереллина с,концентрацией

)00 мг/г) и тщательно перемешивают 1 час. окончании перемешивания осадок отдеот на воронке Бюхнера и промывают на 10 онке 200 л!л 2 /p íÎ! Î водного аммиака

1ловина от об.ьема фильтрованной смеси—

>ло 400 мл).

Основной концентрат гиббереллина

15 лл с концентрацией 19000 лг/л) и смыв 15

)О мл с концентрацией 4250 мг/л) объедиот, подкисляют крепкой соляной кислотой рН 2 — 2,2 и подвергают экстрагированию лацетатом. На первую, вторую и третью тракцию берут по 0,2 объема этилацетата 20 объема водного гиббереллина, а на послеющие экстракции — по 0,1 объема.

Экстрагирование ведут до тех пор, пока соржание гиббереллина в водном растворе не ижается до 500 — 700 л!г/л. Полученный этил- 25 етатный экстракт (440 !!л с концентрацией

)520 мг/л) сушат безводным х:IOpHcTbDI льцием, а затем очищают активным углем. я этого к экстракту добавляют 1 /о (об.

=.) щелочного угля марки А, перемешивают 30 мин и отфильтровывают на воронке Бюхра через два слоя фильтровальной бумаги.

Высушенный и очищенный этилацетатный концентрат упаривают под вакуумом прп

45 С до выпадения кристаллов. которые ромывают сухим этилацетатом и сушат. В результате получают:кристаллы гпббереллина (2.66 г с содержанием активного нач л;

855 .иг/г). Точка плавления препарата 215—

217 С.

1, Способ выделения гиббереллина из культуральной жидкости гриба Fusarium moIIilif01mp., включающий ее фильтрацию и извлечение гибберелли:a из фильтрата, при кислых значения.: рН, огличаюи(ийся тем, что, с целью упрощения процесса, гиббереллпн выделяют путем осаждения его ионами двух- или трехвалентпого железа (Fe++, ге++-}-) в присутствии ионов хлора (Сl †).

2. Способ по п. 1, отличающ!!йся тем, что осадок обрабатывают разбавленным водным аммиаком или другими щелочами; нерастворившуюся часть отбрасывают и из полученного водно-щелочного раствора гиббереллин извлекают этилацетатом и кристаллизуют известными способами.

3. Способ по п. 1, отличаюшайся тем, что, с целью получения технического препарата, осадок отделяют, сушат и размалывают.

Приоритет по и. 3 от 5 августа 1966 г.