Получение и применение гиббереллинов при диабете

Изобретение относится к области медицины и касается способа лечения диабета и его осложнений и связанных заболеваний путем введения пациенту гиббереллинов формулы 1, противодиабетического агента, включающего гиббереллины формулы 1, способа получения противодиабетического агента, способа получения гиббереллинов формулы 1 и применения соединений формулы 1 для изготовления противодиабетического агента. Изобретение обеспечивает нормализацию уровня глюкозы в плазме. 8 н. и 29 з.п. ф-лы, 1 табл.

 

Настоящее изобретение относится к применению соединений формулы (1) (гиббереллинов) и их производных для лечения диабета, его осложнений и связанных состояний, включая ожирение, микро- и макрососудистые заболевания, нефропатию, невропатию, заболевания глаз, диабетические язвы и т.п., и их применению для получения фармацевтических композиций или лекарственных средств для лечения данных состояний. Данное изобретение способствует нормализации уровня глюкозы в плазме и других физиологических состояний.

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к использованию группы соединений, известных как гиббереллины, и их производных для получения фармацевтической композиции для лечения диабета и связанных состояний, а также к способу лечения данных и других состояний путем введения гиббереллинов и/или их фармацевтически приемлемых солей или сложных эфиров, включая сложные эфиры гликозидов, активные эфиры или лактоны. Более того, данное изобретение относится к изготовлению и применению лекарственного средства для лечения диабета и связанных с ним состояний. Кроме того, применение гиббереллинов и их производных, особенно при введении перорально, инъекционно, при помощи трансдермальных пластырей или путем ингаляции, может служить заменой лечения инсулином и/или производными его фрагментов и/или ИФР (IGF) (инсулиноподобные факторы роста) или в качестве выбора для комбинированной терапии с инсулином, производными его фрагментов, ИФР, ростовыми факторами или другими фармацевтически совместимыми противодиабетическими агентами для лечения диабета и связанных состояний.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Данное изобретение относится к новому применению гиббереллинов в ветеринарии и лечении людей. В частности, данное изобретение касается фармацевтических композиций, содержащих гиббереллины, и их применения для лечения диабета, включая диабет типа 1 и типа 2, и их осложнений и связанных состояний, включая ожирение, микро- и макрососудистые заболевания, нефропатию, невропатию, заболевания глаз, диабетические язвы и т.п.

Гиббереллины представляют собой ряд природных соединений, которые известны как регуляторы роста растений с широким применением в растительном мире [1]. Также их выделяют из продуктов обмена веществ некоторых микроорганизмов, таких как Gibberella fujikuroi [2]. Гиббереллины, особенно гибберелловая кислота (гиббереллин А₃) и ее смесь с гиббереллином А₄ и/или гиббереллином А₇, которые являются коммерчески доступными, широко применяются в сельском хозяйстве для увеличения роста некоторых фруктов (клубники и винограда) и овощей (помидоров, капусты и цветной капусты), а также в качестве пищевой добавки при солодовании ячменя [3].

[1]. J. MacMillian, et al. "Isolation and Structure of Gibberellin From Higher Plants". Adv. Chem. Ser 28, 18-24, (1961).

[2].

(a) P.J. Curtis et al. Chem. & Ind. (London) 1066, (1954).

(b) B.E. Cross, J. Chem. Soc. 4670, (1954).

(c) P.W. Brian et al, U.S. 2,842,051.

(d) C.T. Calam et al, U.S. 2,950,288.

(e) A.J. Birch et al, U.S. 2,977,285.

[3].

(a) M. Devlin, Plant Physiology, New York, Reinhold, (1966).

(b) P.W. Brian et al. Plant Physiol, 5,669 (1955).

(c) A.K Mehta et al, J. Hostic Sci 4,167 (1975).

(d) R.J. Weavor, Adv. Chem. Ser 28, 89 (1961).

(e) F.G. Gustafson, Plant Physical 35, 521 (1960).

(f) Fed. Reg. 25, 2162 (1960).

Гиббереллин А₃ и его смесь с гиббереллином А₄ и/или А₇ может быть получена путем ферментации микроорганизмов, таких как Gibberella fujikuroi. Неочищенные соединения могут быть выделены и очищены для получения кристаллического продукта высокой чистоты. Другие производные гиббереллина могут быть получены полусинтетическим путем из гиббереллина А₃ или путем полного синтеза, который хорошо документирован [4].

[4]. (a) The Merck Index, 12, 4426, цитированная в нем литература.

(b) Furber M., et al., "New Synthesis Pathways From Gibberellins to Autheridiogens Isolated From the Fern Genus Anemia", J. of Org. Chem. vol 55, No. 15, 4860-4870 (1990).

(c) Mander L. N., et al., "C-18 hydroxylation of Gibberellins", J. C. S., Perkin Trans. 1 (17), 2893-2894 (2000).

(d)Pour M. et al., "Synthesis of 3,12-Dihydroxy-9,15-Cyclo Gibberellins", Tetrahedron 54(45), 13833-13850 (1998).

(e) Liu J. P. et al., "A General Protocol For the Hydroxylation of C-14 in Gibberellins Synthesis of 14-Beta-hydroxy-Gibberellin A₁ Methyl Ester", Tetrahedron 54(38), 11637-11650 (1998).

(f) Pour M, et al., "Synthetic and Structural Studies on Novel Gibberellins", Pure and Applied Chemistry 70(2), 351-354 (1998); "Synthesis of 12-Hydroxy-9,15-Cyclo-Gibberellins", Tetrahedron Letters, 39(14), 1991-1994 (1998); Australian J. of Chemistry 50(4), 289-299 (1997).

(g) King G. R. et al., "A New and Efficient Strategy for the Total Synthesis of Polycyclic Diterpenoids - The Preparation of Gibberellins (+/-)-GA₁₀₃ and (+/-)-GA₇₃", J. Am. Chem. Soc. 119(16), 3828-3829 (1997).

(h) Mander L. N., "Synthesis of 12-Hydroxy-C-20-Giebberellin from Gibberellin A₃", Tetrahedron 53(6), 2137-2162 (1997) и цитированная в нем литература.

Кроме того, экстракция и выделение различных гиббереллинов из различных растений, ростков, фруктов и семян также широко описано [5].

[5].

(a) Pearce D.W., et al., Phytochemistry, 59(6), 679-687 (2002).

(b) Chang S. T., et al., Physiologia Plantarum, 112(3), 429-432 (2001).

(c) Nakayama M. et al., Phytochemistry, 57(5), 749-758 (2001); 48 (4), 587-593 (1998).

(d) Blake P.S., et al., Phytochemistry, 55 (8), 887-890 (2000); 53 (4), 519-528 (2000).

(e) Koshioka M., et al., J. of the Japanese Society for Horticultural Science, 68 (6), 1158-1160 (1999); 67 (6), 866-871 (1998).

(f) Mander L.N. et al., Phytochemistry, 49 (8), 2195-2206 (1998); 49 (6), 1509-1515 (1998).

(g) Wynne G. et al., Phytochemistry, 49 (7), 1837-1840 (1998).

Гиббереллины ранее применяли в качестве противовоспалительных препаратов, для лечения простатита и псориаза, лечения опухолей и для заживления ран и язв [6].

[6].

(a) U.S. 4424232 1/1984 Parkinson

(b) French 2597339 10/1987

(c) U.S. 5487899 1/1996 Davis

(d) U.S. 5580857 12/1996 Oden

(e) AUS. 695054 11/1998 Wu

(f) U.S. 6121317 9/2000 Wu

Исследование в статье Davis и Maro (J Am Podiatr Med Assoc 1989, 79:24-26) рассматривает эффекты гибериллинов на воспаление у мышей с индуцированным диабетом. Эта животная модель была выбрана только из-за плохого излечения мышей и воспалительных реакций. Davis и Maro нашли, что экстракт Aloe vera и гиббереллин, или гиббереллин-подобное вещество, имеют схожие противовоспалительные активности. В частности, это исследование было направлено на изучение природы компонента Aloe vera, ответственного за его противовоспалительную активность.

В настоящее время авторы обнаружили возможность применения гиббереллина или его производных для лечения диабета, включая диабет типа 1 и типа 2, и связанных с ним состояний.

Описание изобретения

К настоящему моменту в лаборатории авторами обнаружено, что гиббереллины обладают свойствами фактора роста млекопитающих (такого как ИФР (IGF), ЭФР (EGF)).

Результаты экспериментов (примеры 3 и 4) позволяют предположить, что гиббереллины, которые образуются растениями и микроорганизмами, действуют как связующие вещества широкого спектра, которые связываются с рядом рецепторов факторов роста. Они отличаются от факторов роста, обнаруженных у животных, каждый из которых имеет высокую аффинность к специфическому рецептору. Это является результатом эволюции. Биологические системы растений и микроорганизмов вырабатывают биологические субстанции, действующие на более широкой основе (менее специфично), чем таковые у более сложных форм жизни, таких как животные.

Так как гиббереллины являются более мелкими молекулами, чем факторы роста, связывание гиббереллинов с рецепторами факторов роста, вероятно, является более слабым. При низком уровне факторов роста, гиббереллины связываются со свободными рецепторами факторов роста и стимулируют рост клеток и другие функции. В данных условиях, гиббереллины выполняют функции факторов роста. При нормальном уровне факторов роста, факторы роста легче связываются со своими рецепторами из-за их большей аффинности к таким рецепторным сайтам. Объемность данных факторов роста не оставляет пространства или оставляет очень мало места в рецепторных сайтах, с которым могут связаться гиббереллины. Это приводит к тому, что гиббереллины являются неэффективными, когда факторы роста с достаточной связывающей аффинностью присутствуют в достаточных количествах. Данный механизм обеспечивает очень хороший профиль действия гиббереллинов в качестве заменителя или сенсибилизатора для факторов роста, включая ИФР, тогда как присутствие избытка гиббереллинов не вмешивается в нормальное функционирование данных факторов роста.

Сахарный диабет представляет собой хроническое заболевание, проявляющееся гипергликемией и нарушениями липидного и белкового обмена. Согласно данным Американской Ассоциации Диабета, более чем 13 миллионов людей в США страдают диабетом, и каждый год обнаруживаются около 650000 новых случаев. Внедрение инсулина и препаратов сульфонилмочевины представляют собой важные вехи в лечении сахарного диабета. Инсулиноподобный фактор роста-1 (ИФР-1 (IGF-1)), молекула со структурной гомологией к инсулину, имеет свой собственный специфичный рецептор, рецептор ИФР типа-1, посредством которого он вызывает ряд метаболических эффектов, которые являются сходными с инсулином. Открытие активного участка человеческого фактора роста, ответственного за инсулиноподобные эффекты молекулы, привело к разработке новых противодиабетических пептидных агентов. Кроме того, факторы роста являются полипептидами, которые регулируют репликацию, дифференцировку и метаболический гомеостаз клеток. Они усиливают рост и/или выживаемость нейронов. В доклинических испытаниях лечения различных неврологических расстройств, включая диабетические невропатии, ИФР-2 повышал скорость регенерации нерва. Кроме того, повышенные внутриклеточные концентрации цАМФ усиливают глюкозозависимую секрецию инсулина панкреатическими β-клетками. Было обнаружено, что гиббереллины увеличивают активность аденилат- и гуанилатциклазы, так что внутриклеточные концентрации цАМФ и цГМФ могут быть увеличены путем введения гиббереллинов для усиления, в свою очередь, глюкозозависимой секреции инсулина панкреатическими β-клетками. Следовательно, гиббереллины могут иметь применение при лечении диабета.

Результаты экспериментов на животных (примеры 5 и 6) показали, что у крыс с диабетом, леченных 5 мг/кг гиббереллина А₃ или смесью А₃ и А₄ или А₇, уровень глюкозы сыворотки возвращался к нормальному, так же как и их масса тела. Таким образом, было показано, что гиббереллины могут быть эффективными при лечении диабета.

Токсичность гиббереллина А₃ для млекопитающих является чрезвычайно низкой. Острая пероральная ЛД₅₀ для крыс и мышей составила 6,3 г/кг [7а] и >15 г/кг [7b] соответственно. В экспериментах с 90-дневным кормлением, уровень с отсутствием эффекта для крыс и собак составил >1 г/кг/день [7b]. Он не вызывает раздражения кожи и глаз [7b]. Не было обнаружено свидетельств канцерогенности [7c]. Классификации: Таблица 5 Классов Токсичности по ВОЗ (продукты наименее опасного класса, не имеющие большой опасности при обычном применении); Класс Токсичности III по EPA (вторая наименее опасная классификация).

[7].

(a) NTP Chemical Repository,

http://ntpserver.niehs.nih.gov/htdocs/CHEM_H&S/NTP_CHEM7/ Radian77-06-5.html

(b) The Agrochemicals Handbook, Royal Society of Chemistry, August 1991.

(c) Gold L. S., Slone T. H., Ames B. N. (2001), Pesticide Residues in Food and Cancer Risk: A Critical Analysis, Publications from the Carcinogenic Potency Project, in Handbook of Pesticide Toxicity, Second Edition, (R. Krieger, ed.), Academic Press.

Следовательно, один аспект настоящего изобретения относится к применению соединений формулы (1) (гиббереллинов) или их производных для лечения диабета и его осложнений и связанных состояний, включающих ожирение, микро- и макрососудистые заболевания, нефропатию, невропатию, заболевания глаз, диабетические язвы и т.п. В другом аспекте изобретения предлагается фармацевтическая композиция для лечения диабета и связанных состояний, включая ожирение, микро- и макрососудистые заболевания, нефропатию, невропатию, заболевания глаз, диабетические язвы и т.п., причем указанная фармацевтическая композиция содержит гиббереллины и/или их фармацевтически приемлемые соли или сложные эфиры.

Гиббереллины имеют следующую формулу:

Формула (1)

где

R¹ представляет собой H или группу -O-R²⁰, где R²⁰ представляет собой H, гликозилированную простую эфирную группу (простой эфир гликозида), C_1-6 алкильную группу или R¹ вместе с R² или R¹⁰ образует связь (C₁-C₂ или C₁-C₁₀ двойную связь соответственно);

R² представляет собой H или группу -O-R²¹, где R²¹ представляет собой H, гликозилированную простую эфирную группу (простой эфир гликозида), или вместе с R⁴ образует связь (лактон) или R² вместе с R¹ или R³ образует связь (C₁-C₂ или C₂-C₃ двойную связь соответственно);

R³ представляет собой H, =О или -O-R²², где R²² представляет собой H, гликозилированную простую эфирную группу (простой эфир гликозида), или R³ вместе с R² образует связь (C₂-C₃ двойную связь);

R⁴ представляет собой OH или -OR²³, где R²³ является незамещенным или замещенным C_1-20 алкилом, аллилом, арилом, арилалкилом, амидином, -NR²⁴R²⁵ или ненасыщенным или насыщенным кольцом, содержащим один или более гетероатомов, выбираемых из группы, состоящей из азота, кислорода и серы; R²⁴ и R²⁵ могут быть одинаковыми или различными, и представляют собой водород или C_1-20 алкил, аллил, арил, арилалкил или ненасыщенное или насыщенное кольцо, содержащее один или более гетероатомов, выбираемых из группы, состоящей из азота, кислорода и серы; или R⁴ вместе с R²¹ или R²⁸ образует связь (лактон);

R⁵ представляет собой H или группу гликозилированного сложного эфира (сложный эфир гликозида) или незамещенные или замещенные (например, галогенированные) C_1-20 алкиловые сложные эфиры, аллиловые сложные эфиры, ариловые сложные эфиры, арилалкиловые сложные эфиры, активные сложные эфиры (такие как фенациловый сложный эфир, пивалоиловый сложный эфир);

R⁶ представляет собой H или OH или вместе с R⁷ образует связь (C₁₁-C₁₂ двойную связь);

R⁷ представляет собой H, =О или -O-R²⁶, где R²⁶ представляет собой H или гликозилированную простую эфирную группу (простой эфир гликозида), или R⁷ вместе с R⁶ образует связь (C₁₁-C₁₂ двойную связь);

R⁸ представляет собой H, гидроксил, меркаптан или галоген (например F, Cl), аминогруппу, азидогруппу, NR²⁴R²⁵, незамещенный или замещенный (например, галогенированный) C_1-20 алкил, аллил, арил или арилалкил или -OR²⁷, где R²⁷ представляет собой гликозилированную простую эфирную группу (простой эфир гликозида);

R⁹ представляет собой H или OH или вместе с R¹⁵ образует связь (C₉-C₁₅ связь);

R¹⁰ представляет собой H, CH₃, CHO, COOH или гликозилированный сложный эфир (сложный эфир гликозида) указанной COOH, CH₂O-R²⁸ или -OR²⁸, где R²⁸ представляет собой H или вместе с R⁴ образует связь (лактон) или R¹⁰ вместе с R¹ образует связь (C₁-C₁₀ двойную связь);

R¹¹ представляет собой H или OH или отсутствует;

R¹² представляет собой CH₃, CH₂OH, COOH или гликозилированный сложный эфир (сложный эфир гликозида) указанной COOH;

R¹³ представляет собой метилен или двухвалентный гетероатом или NR²⁹, где R²⁹ представляет собой NHR³⁰ или OR³⁰, где R³⁰ является H или C_1-20 алкилом, арилом, алкиларилом; и присутствует двойная связь между C₁₆ и R¹³, когда R¹¹ отсутствует; или R¹³ представляет собой H, OH, CH₃, CHO, CH₂X, где X является галогеном (например, F, Cl); CHNR²⁹, где R²⁹ представляет собой NHR³⁰ или OR³⁰, где R³⁰ представляет собой H или C_1-20 алкил, арил, алкиларил, когда R¹¹ является H или OH; при условии, что когда R¹¹ является OH, R¹³ не является OH;

R¹⁴ представляет собой H или OH;

R¹⁵ представляет собой H или вместе с R⁹ образует связь (C₉-C₁₅ связь).

Фармацевтически приемлемые производные, включая лактоны, сложные эфиры и соли соединений формулы (1), включают их соли щелочных металлов (например, Na⁺, K⁺), соли щелочноземельных металлов (например, Ca²⁺, Mg²⁺), соли металлов (например, Zn²⁺, Al³⁺) и соли аммония, органические основания (такие как лидокаин, или NR¹⁶R¹⁷R¹⁸R¹⁹, где R¹⁶, R¹⁷, R¹⁸, R¹⁹, которые могут быть одинаковыми или различными, представляют собой водород, C_1-20 алкил, алканол, арил).

Пунктирная линия вместе со сплошной линией показывает, что двойная связь может быть расположена между двумя из трех атомов углерода, соединенными пунктирной и сплошной линиями; при условии, что двойная связь отсутствует, если R¹¹ представляет собой OH-группу.

Так как формула (1) соответствует правилам главной валентности, это приводит к следующим дополнительным условиям:

R¹ и R² не могут образовывать связь, если R¹⁰ и R¹ и/или R² и R³ образуют связь; R¹⁰ и R¹ не могут образовывать связь, если R¹⁰ и R²³ образуют связь; R² и R¹ или R² и R³ не могут образовывать связь, если R⁴ и R²¹ образуют связь.

В случае гиббереллина А₃, R¹ вместе с R² образует связь (С₁-C₂ двойную связь); R³ представляет собой β-OH, R⁴ вместе с R²⁸ образуют связь (лактон); R⁵, R⁶, R⁷ и R⁹ являются водородом, R⁸ представляет собой OH, R¹¹ отсутствует, R¹² представляет собой метил; R¹³ представляет собой метилен, присутствует двойная связь между C₁₆ и R¹³; R¹⁴ и R¹⁵ являются водородом.

Наиболее легко доступным гиббереллином является гиббереллин А₃ и его смесь с гиббереллином А₄ и/или гиббереллином А₇, получаемая при ферментации Gibberella fujikuroi. Хотя способы выделения и очистки гиббереллинов, включающие экстракцию растворителем и хроматографию, опубликованы, как упомянуто в разделе ″предпосылки изобретения″, до настоящего момента является необходимым простой и эффективный способ выделения и очистки. Данное изобретение предлагает практический способ крупномасштабного получения гиббереллина А₃, включающий стадии инкубации гиббереллин-продуцирующего штамма микроорганизма в ферментационной среде до тех пор, пока концентрация гиббереллинов не достигнет около 3000 мкг/мл среды с последующим

(а) доведением рН ферментационной среды до 6,5-7,0 и фильтрованием для получения на фильтре осадка мицелия микроорганизма и фильтрата;

(b) промыванием осадка на фильтре водой и объединением промывных вод с фильтратом для образования водного раствора;

(с) концентрированием водного раствора;

(d) смешиванием водного раствора с органическим растворителем при температуре от 5 до 10°С и доведением рН смеси до менее чем 2,0;

(e) предоставлением смеси возможности разделиться на водную фазу и первую органическую фазу, и удаление первой органической фазы;

(f) реэкстрагированием водной фазы по стадии (f) с помощью органического растворителя для получения второй органической фазы;

(g) объединением первой и второй органической фаз и концентрированием для образования концентрированного органического раствора;

(h) нагреванием концентрированного органического раствора при 60-70°С в течение 3-4 часов при перемешивании, до прекращения осаждения твердого вещества;

(i) охлаждением концентрированного органического раствора до комнатной температуры и фильтрованием для получения осадка;

(j) промыванием осадка в холодном органическом растворителе и высушиванием для получения не совсем белого сухого остатка, содержащего около 80% гиббереллина А₃, около 4% гиббереллина А₄ и около 4% гиббереллина А₇.

Необязательно, данное изобретение дополнительно включает стадии:

(k) растворения не совсем белого сухого остатка в смеси 32,6% метанола, 2,2% воды и 65,2% ацетона для получения раствора гиббереллина;

(l) разбавления раствора гиббереллина смесью 10:1 органического растворителя и воды;

(m) фильтрования разбавленного раствора гиббереллина и концентрирования фильтрата выпариванием в вакууме;

(n) нагревания концентрата до температуры 60-80°С в течение 2-3 часов при перемешивании, охлаждения до комнатной температуры и фильтрования для получения твердого кристаллического осадка;

промывания осадка холодным этилацетатом и высушивания для получения кристаллов гиббереллина с чистотой >95%.

Кроме того, описаны способы получения солей и сложных эфиров гиббереллина. В частности, данное изобретение включает способ получения натриевой соли гиббереллина, включающий стадии:

(a) растворение гиббереллина А₃ в метаноле;

(b) добавление раствора гиббереллина к эквимолярному водному раствору NaHCO₃;

(c) выпаривание смешанных растворов досуха для получения твердого остатка;

(d) растворение остатка в воде и лиофилизация для получения натриевой соли гиббереллина А₃.

Данное изобретение к тому же включает способ получения цинковой соли гиббереллина, включающий дополнительные стадии растворения натриевой соли гиббереллина А₃ в воде, пропускания раствора через колонку, наполненную цинковой йон-обменной смолой, промывания колонки водой, сбора и объединения эффлюента и промывных вод и удаления воды для получения цинковой соли гиббереллина А₃.

К тому же изобретение включает способ получения этилового сложного эфира гиббереллина, включающий стадии:

(a) растворение гиббереллина А₃ в смеси с соотношением 50:1 ацетона с водой;

(b) смешивание раствора гиббереллина А₃ с эквимолярными количествами триэтиламина и этилхлорформиата и одной десятой молярного количества N-метилморфолина и перемешивание при -15°С в течение 20 минут;

(c) разбавление полученной смеси с безводным этанолом и перемешивание при комнатной температуре;

(d) выпаривание разбавленной смеси досуха и распределение остатка между этилацетатом и водой в соотношении 6:1;

(e) отделение этилацетатного слоя, промывание 2% HCl, затем водой, затем 5% NaHCO₃, затем водой и выпаривание досуха при пониженном давлении для получения этилового сложного эфира гиббереллина А₃.

Ниже указанные ссылки на соединения формулы (1) включают соединения формулы (1) и их фармацевтически приемлемые производные, включая их соли, сложные эфиры и лактоны.

Фармацевтически приемлемые композиции соединений формулы (1) также могут быть получены путем объединения их с одним или более другими активными ингредиентами, например инсулином, инсулиноподобными полипептидами, производными фрагментов инсулина, ИФР, фрагментами ИФР, факторами роста или другими фармацевтически совместимыми противодиабетическими агентами для лечения диабета и связанных состояний.

Соединения формулы (1) обладают активностью инсулина и инсулиноподобных агонистов и/или сенсибилизаторов для лечения диабета, его осложнений и связанных состояний, включая ожирение, микро- и макрососудистые заболевания, нефропатию, невропатию, заболевания глаз, диабетические язвы и т.п. Следовательно, в следующем аспекте изобретения предлагаются соединения формулы (1) для применения в качестве активного терапевтического агента при лечении диабета и связанных состояний.

В следующем аспекте изобретения предлагается способ получения фармацевтической композиции, включающей объединение соединения формулы (1) и/или его производных с фармацевтически приемлемым носителем.

В дальнейшем аспекте изобретения предлагается способ лечения диабета и связанных состояний у животных, включая людей, включающий введение эффективного количества соединений формулы (1).

Также в следующем аспекте данного изобретения предлагается применение соединений формулы (1) для изготовления фармацевтической композиции для лечения диабета и связанных состояний.

Количество соединений формулы (1), требующееся для применения при лечении диабета и связанных состояний, варьируется в зависимости от режима введения, природы состояния, которое лечат, возраста и состояния животного или пациентов-людей и, в конечном счете, определяется лечащим ветеринаром или врачом.

Как правило, подходящая доза находится в диапазоне от около 0,1 мкг до 100 мг/кг массы тела в день, предпочтительно в диапазоне от 50 мкг до 200 мг/кг/день.

Лечение предпочтительно начинают после развития или в момент возникновения диабета и продолжают, пока оно является необходимым. Также является возможным применение соединений формулы (1) в качестве профилактического лечения.

Подходящим режимом лечения является введение 1-4 раза в сутки, и оно продолжается пока является необходимым. В качестве альтернативы, в случае применения композиции с продолжительным высвобождением, лечение можно проводить один раз в 2 дня 1 неделю.

Необходимая доза может быть представлена как однократной дозой, так и разделенными дозами, вводимыми через соответствующие интервалы, например, как две, три, четыре или более отдельных доз в день.

Соединения формулы (1) обычно вводят в единичной дозированной форме, например, содержащей 0,1-500 мг активного ингредиента на единичную дозированную форму. Хотя представляется возможным для применения в терапии вводить соединения формулы (1) в виде неочищенного химического продукта, предпочтительным является присутствие активного ингредиента в виде фармацевтической композиции.

Следовательно, данное изобретение, кроме того, предлагает фармацевтическую композицию, содержащую соединения формулы (1) или их фармацевтически приемлемые производные вместе с одним или более фармацевтически приемлемыми носителями и, необязательно, другими терапевтическими и/или профилактическими ингредиентами. Носители(ь) должны быть «приемлемыми», в смысле, являться совместимыми с другими ингредиентами композиции и не быть вредными для получающего их пациента.

Фармацевтические композиции включают таковые, подходящие для перорального, ректального, назального, местного (включая буккальное и сублингвальное), вагинального или парентерального (включая внутримышечное, внутрикожное, подкожное и внутривенное) введения или в форме, подходящей для введения в желудочно-кишечный тракт, или в форме, подходящей для введения в дыхательный тракт (включая носовые проходы), например, путем ингаляции или инсуффляции, или для внутрикожной или подкожной имплантации, или трансдермального пластыря. Композиции могут быть, при возможности, представлены в отдельных дозированных единицах и могут быть изготовлены любыми способами, известными в области фармации. Все способы включают стадию объединения активного ингредиента с жидкими носителями или мелко измельченными твердыми носителями или обоими, и затем, при необходимости, придание формы продукта в желаемой композиции.

Фармацевтические композиции, подходящие для перорального введения, могут быть представлены в виде отдельных единиц, таких как капсулы, облатки или таблетки, каждая из которых содержит заранее определенное количество активного ингредиента; в виде порошка или гранул; в виде раствора, суспензии или эмульсии. Активный ингредиент также может быть представлен в виде болюса, лекарственной кашки или пасты. Таблетки и капсулы для перорального введения могут содержать обычные эксципиенты, такие как связующие вещества, наполнители, лубриканты, дезинтегранты или смачивающие агенты. Таблетки могут быть покрыты оболочкой в соответствии с методами, хорошо известными в области техники. Жидкие композиции для перорального введения могут быть в форме, например, водных или масляных суспензий, растворов, эмульсий, сиропов или эликсиров, или могут быть представлены в виде сухого продукта для разведения водой или другими подходящими растворителями перед применением. Такие жидкие композиции могут содержать обычные дополнительные вещества, такие как суспендирующие агенты, эмульгирующие агенты, безводные растворители (которые могут включать пищевые масла), или консерванты.

Соединения формулы (1) также могут быть составлены в композицию для парентерального введения (например, путем инъекции, например, болюсной инъекции или продолжительной инфузии) и могут быть представлены в единичной дозированной форме в ампулах, заранее заполненных шприцах, инфузионных системах малого объема или многодозовых контейнерах с добавленным консервантом. Данные композиции могут иметь такие формы как суспензии, растворы или эмульсии в масляных или водных растворителях и могут содержать агенты композиции, такие как суспендирующие, стабилизирующие и/или диспергирующие агенты. В качестве альтернативы, активный ингредиент может быть в форме порошка, полученного путем асептического выделения из стерильного твердого вещества или путем лиофилизации из раствора, для восстановления перед применением подходящим растворителем, например стерильной, свободной от пирогенов водой.

Для местного введения в кожу соединения формулы (1) могут быть составлены в композицию в виде мазей, кремов или лосьонов или в виде трансдермального пластыря. Мази и кремы могут, например, быть изготовлены на водной или масляной основе с добавлением подходящих загустителей и/или желирующих агентов. Лосьоны могут быть изготовлены на водной или масляной основе и обычно также содержат один или более из эмульгирующих агентов, стабилизирующих агентов, диспергирующих агентов, суспендирующих агентов, загустителей или красящих веществ.

Для местного введения в полость рта соединения формулы (1) могут быть изготовлены в виде лепешек, содержащих активный ингредиент в ароматизирующей основе, обычно сахарозе и гуммиарабике или трагаканте; пастилки, содержащей активный ингредиент в инертной основе, такой как желатин и глицерин или сахароза и гуммиарабик; и ополаскивателей для полости рта, включающих активный ингредиент в подходящем жидком носителе.

Для вагинального введения композиции могут быть представлены в виде пессариев, тампонов, кремов, гелей, паст, пен или спреев, содержащих в добавлении к активному ингредиенту такие носители, которые известны в области техники, как подходящие.

Для ректального введения предпочтительными являются порционные суппозитории, где носитель является твердым веществом. Подходящие носители включают масло какао и другие материалы, обычно используемые в области техники, и суппозитории обычно могут быть изготовлены путем смешивания активного соединения с размягченным или расплавленным носителем(ями), с последующим охлаждением и помещением в формы.

Для введения в дыхательный тракт (включая интраназальное введение) соединения формулы (1) могут вводиться посредством любых способов и композиций, применяемых в области техники для введения в дыхательный тракт.

Таким образом, как правило, соединения формулы (1) могут вводиться в форме раствора или суспензии или в виде сухого порошка.

Растворы и суспензии предпочтительно являются водными, например, изготовленными только на воде (например, стерильной или воде, свободной от пирогенов) или на воде и физиологически приемлемом растворителе (например, этаноле, пропиленгликоле и полиэтиленгликолях, таких как PEG 400).

Такие растворы или суспензии могут, кроме того, содержать другие эксципиенты, например консерванты (такие как хлорид бензалкония), солюбилизирующие агенты/поверхностно-активные вещества, такие как полисорбаты (например, Tween 80, Span 80, хлорид бензалкония), буферы, агенты регулирования изотоничности (например, хлорид натрия), усилители абсорбции и усилители вязкости. Суспензии могут, кроме того, содержать суспендирующие агенты (например, микрокристаллическую целлюлозу, карбоксиметилцеллюлозу натрия).

Растворы или суспензии наносят непосредственно в полость носа при помощи обычных средств, например при помощи капельницы, пипетки или спрея. Композиции могут быть представлены в однократной дозе или многодозовой форме. В последнем случае, желательно обеспечить средство для дозирования. В случае капельницы или пипетки, это может быть выполнено пациентом, путем введения соответствующего, заранее определенного объема раствора или суспензии. В случае спрея, это может быть достигнуто, например, при помощи дозирующего распылительного насоса.

Для введения в дыхательный тракт также могут применяться аэрозольные композиции, в которых соединения формулы (1) помещают в герметичную упаковку с подходящим газом-вытеснителем, таким как хлорфторуглерод (ХФУ (CFC)), например дихлордифторметан, трихлорфторметан или дихлортетрафторэтан, диоксид углерода или другим подходящим газом. Аэрозоль также обычно может содержать поверхностно-активное вещество, такое как лецитин. Доза лекарства может контролироваться путем применения дозирующего клапана.

В качестве альтернативы, соединения формулы (1) могут быть представлены в форме сухого порошка, например смеси порошков данного соединения с подходящим порошком-основой, таким как лактоза, крахмал, производные крахмала, такие как гидроксипропилметилцеллюлоза и поливинилпирролидон (PVP). Обычно порошок-носитель образует гель в полости носа. Порошковая композиция может быть представлена в единичной дозированной форме, например в капсулах или картриджах, например в желатиновых или блистерных упаковках, из которых порошок может вводиться посредством ингалятора.

В композициях, предназначенных для введения в дыхательный тракт, включая интраназальные композиции, соединение обычно имеет небольшой размер частиц, например порядка 5 микрон или меньше. Такой размер частиц может быть получен при помощи средств, известных в области техники, например, путем микронизации.

Для введения в желудочно-кишечный тракт соединения формулы (1) или фармацевтически приемлемые производные могут вводиться при помощи любых способов и композиций, применяемых в области техники для введения в желудочно-кишечный тракт.

При желании могут использоваться композиции, способные обеспечивать продолжительное высвобождение активного ингредиента.

Соединения формулы (1) также могут применяться в комбинации с другими терапевтическими агентами, например противодиабетическими агентами, такими как инсулин, ИФР или обезболивающими, антигипертензивными агентами, седативными, снотворными, липидснижающими агентами, противоинфекционными агентами и т.д. Следовательно, данное изобретение в следующем аспекте предлагает комбинацию, включающую соединения формулы (1) или их фармацевтически приемлемые производные с другими терапевтически активными агентами.

Комбинации, упомянутые выше, обычно могут быть представлены для применения в форме фармацевтической композиции и, следовательно, такие композиции, включающие комбинации, описанные выше, вместе с фармацевтически приемлемыми носителями составляют следующий аспект изобретения.

Отдельные компоненты таких комбинаций могут вводиться последовательно или одновременно в отдельных или комбинированных фармацевтических композициях.

Когда соединения формулы (1) применяют со вторым терапевтическим агентом, активным при лечении диабета и связанных состояний, доза каждого соединения может быть такой же или отличной от таковой, применяемой тогда, когда каждое соединение применяется отдельно. Соответствующие дозы являются хорошо известными специалисту в данной области.

Соединения формулы (1) и их фармацевтически приемлемые производные могут быть получены любыми способами, известными в данной области для получения соединений аналогичной структуры.

Настоящее изобретение далее описано следующими примерами, которые приведены только с целью иллюстрации, и не должны восприниматься как ограничивающие изобретение.

Пример 1. Ферментация, выделение и очистка гиббереллинов.

(a) Ферментация: штамм Gibberella fujikuroi, продуцирующий гиббереллин А₃, А₄ и А₇, инокулировали и выращивали в среде, содержащей 100 г глюкозы, 100 г сахарозы, 2,5 г NH₄NO₃, 0,25 г KH₂PO₄, 0,2 г MgSO₄, 0,01 г FeSO₄˙7H₂O, 0,03 г ZnSO₄˙7H₂O, 0,1 г KCl, 10 г пептона, 3 г CaCO₃, 1000 мл H₂O, при 28°С в течение 3-4 дней. Затем его переносили в среду продуцирования, содержащую 1000 г глюкозы, 100 г пептона, 24 г NH₄NO₃, 100 г KH₂PO₄, 20 г MgSO₄˙7H₂O, 20 г FeSO₄˙7H₂O, 1,5 г Na₂B₄O₇˙10H₂O, 8 г CuSO₄˙7H₂O, 0,7 г (NH₄)₆Mo₇O₂₄˙4H₂O, 20 литров H₂O при рН 4,5 при 28°С в течение 8-10 дней. Когда продуцирование гиббереллинов достигало пика (˜3000 мкг/мл среды), ферментацию останавливали.

(b) Выделение: Ферментационную среду (18 литров) доводили до рН 6,5-7,0 при помощи 10% NaOH, затем фильтровали.

Осадок на фильтре (мицелий) промывали 4 л H₂O. Фильтрат и промывные воды объединяли и выпаривали в вакууме до объема 2 л. Концентрат перемешивали при 5-10°С с этилацетатом (5 л) и доводили до рН 1,5 при помощи 6Н HCl. Затем разделяли два слоя. Нижний водный слой реэкстрагировали этилацетатом (2 л). Органические экстракты объединяли и промывали водой (2 л), затем выпаривали до 400 мл. Концентрат перемешивали и нагревали при 60-70°С в течение 3-4 часов до тех пор, пока не переставал выпадать осадок. После охлаждения до комнатной температуры суспензию фильтровали. Твердое вещество промывали холодным этилацетатом и высушивали для получения гиббереллина А₃ и смеси А₄/А₇ в виде не совсем белого твердого вещества. Смесь содержала ˜80% А₃, ˜4% А₄ и ˜4% А₇.

(с) Очистка: 10 г смеси гиббереллина А₃ и А₄/А₇, как упомянуто выше, растворяли в смеси 15 мл метанола, содержащего 1 мл H₂O, и 30 мл ацетона. Раствор разбавляли 100 мл этилацетата, содержащего 10 мл H₂O. Смесь фильтровали. Фильтрат выпаривали в вакууме до объема около 80 мл. Смесь перемешивали и нагревали при 60-80°С в течение 2-3 часов, затем охлаждали до комнатной температуры. Затем фильтровали. Твердое вещество промывали холодным этилацетатом и высушивали для получения гиббереллина А₃ с >95% чистотой в виде белого кристалла (6,3 г).

MC: 391(M-1+2Na)⁺ 369(M+23)⁺ 329(M+1-H₂O)⁺

Пример 2. Получение солей и сложных эфиров гиббереллина А₃

(a) Получение натриевой соли гиббереллина А₃: раствор 346 мг (1 ммоль) гиббереллина А₃ растворяли в 1,5 мл метанола, добавляли к раствору NaHCO₃ (84 мг, 1 ммоль) в 2 мл H₂O. Всю смесь выпаривали при пониженном давлении досуха. Затем остаток растворяли в воде (2 мл) и лиофилизировали для получения натриевой соли гиббереллина А₃ в виде белого твердого вещества с количественным выходом.

(b) Получение цинковой соли гиббереллина А₃: 100 мг натриевой соли гиббереллина А₃ растворяли в 10 мл воды, затем пропускали через колонку (20 мл) со смолой Dowex 50 в цинковой ионной форме. Затем колонку промывали 30 мл H₂O. Эффлюент и промывные воды объединяли и выпаривали в вакууме до небольшого объема, затем лиофилизировали для получения цинковой соли гиббереллина А₃ в виде белого твердого вещества с количественным выходом.

(с) Получение этилового сложного эфира гиббереллина А₃: 346 мг (1 ммоль) гиббереллина А₃ растворяли в смеси ацетона (10 мл) и воды (0,2 мл). К смеси при -20°С добавляли триэтиламин (100 мг, 1 ммоль), N-метилморфолин (10 мг, 0,1 ммоль), этилхлорформат (108 мг, 1 ммоль). Смесь перемешивали при -15°С в течение 20 минут, затем разбавляли безводным этанолом (10 мл). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи, затем выпаривали досуха. Затем остаток распределяли между этилацетатом (30 мл) и водой (5 мл). Органический слой отделяли и последовательно промывали 2% HCl (5 мл), водой (5 мл), 5% NaHCO₃ (5 мл х 2), водой (5 мл), затем выпаривали при пониженном давлении досуха для получения бесцветного твердого этилового сложного эфира гиббереллина А₃ (319 мг, 85%) МС 375(М+1)⁺.

Пример 3.

(а) Эффект гиббереллина А₃ на рост клеток по сравнению с ЭФР (EGF) in vitro.

Проводили эксперименты с культурой клеток человеческой кожи, используя среду для кератиноцитов. В каждую ячейку засевали 1500 клеток. Инкубацию проводили при 37°С в течение пяти дней. Далее показаны эксперименты:

Эксперимент	Среда	Результаты
3.1	Идеальная среда для кератиноцитов (содержащая ЭФР)	Очень хороший рост (скорость деления клеток = 100)
3.2	Идеальная среда для кератиноцитов (содержащая ЭФР) плюс гиббереллин А3 (5 мкг/мл)	Очень хороший рост (скорость деления клеток = 100)
3.3	Среда для кератиноцитов, не содержащая ЭФР	Плохой рост
3.4	Среда для кератиноцитов, не содержащая ЭФР, но содержащая гиббереллин А3 (5 мкг/мл)	Очень хороший рост (скорость деления клеток = 100)

Эксперименты 3.1 и 3.3 показали, что ЭФР (эпидермальный фактор роста) является необходимым для роста клеток. Эксперимент 2 показал, что присутствие как ЭФР, так и гиббереллина А₃ не оказывало совокупного эффекта на скорость роста клеток. Эксперимент 4 показал, что гиббереллин А₃ сам по себе может стимулировать рост клеток так же эффективно, как и ЭФР.

(b) Эффект гиббереллина А₃ сравнивали с ИФР в отношении роста культуры клеток с применением ИФР-1 вместо ЭФР для экспериментов, упомянутых в (а). Результаты были сходными с результатами в (а).

Пример 4.

Эффект смеси гиббереллина А₃ с гиббереллинами А₄ и/или А₇ сравнивали с эффектом ИФР-1 на рост клеток in vitro. Результаты были сходными с таковыми в примере 3(b).

Пример 5. Эффект гиббереллина А₃ на крыс с диабетом.

Методы:

Крыс-самцов линии Wistar (290-330 г) взвешивали и слегка анестезировали (4% галотана, 2:1 O₂/N₂O) так, чтобы уровни глюкозы в крови могли быть измерены в образце из хвостовой вены с применением глюкометра Precision Q.I.D. Затем индуцировали диабет однократной инъекцией в хвостовую вену стрептозотоцина (STZ, 60 мг/кг), который разводили непосредственно перед применением в цитратном буфере (50 мМ лимонная кислота и 50 мМ тринатриевый цитрат; рН 4,5). Эквивалентный объем цитратного буфера вводили крысам контрольной группы, подобранной по возрасту.

В течение эксперимента крыс помещали в клетки в группах по двое. Температуру в клетках животных поддерживали на уровне 20°С (±2°С) с 12-часовым циклом свет/темнота, и крысам разрешали свободный доступ к еде и воде.

Этическое одобрение всех экспериментов было получено от Фармакологического Этического комитета по Животным.

Введение лекарств и протокол ежедневного мониторинга:

Через 48 часов после введения STZ (60 мг/кг) забирали образцы глюкозы крови, и животных с уровнем глюкозы крови больше или равно 16 мМ расценивали как животных с диабетом. Затем крыс случайным образом делили на группы.

Применяли медленнодействующий инсулин Ленте Монотард и натриевую соль гиббереллина, изготавливаемую, как требуется, непосредственно перед применением в дистиллированной воде.

Данные об уровне глюкозы в крови получали через 2 часа или 5 часов после введения лекарств(а) каждые три дня. Результаты представлены ниже:

№ группы	Ежедневное введение	Уровень глюкозы в крови (ммоль) после 20-го дня	Изменение массы тела на 30-й день
2 часа	5 часов
1	Инсулин 4 Ед/крысу (подкожно)	4-5	3-5	+ 8%
2	Инсулин 2 Ед/крысу (подкожно)	15-18	14-16	- 8%
3	Гиббереллин А3 5 мг/кг (подкожно) + 2 Ед инсулина/крысу (подкожно)	4-6	Не определено	+ 10%
4	Гиббереллин А3 5 мг/кг (внутрибрюшинно) + 2 Ед инсулина/крысу (подкожно)	4-5	4-6	+ 12%
5	Гиббереллин А3 5 мг/кг (перорально) + 2 Ед инсулина/крысу (подкожно)	не определено	4-6	+ 10%

Пример 6. Эффект смеси гиббереллина А₃ и А₄/А₇ на крыс с диабетом.

Протокол данного эксперимента является таким же, как и в примере 5, однако применяли смесь гиббереллина А₃ и А₄/А₇ вместо гиббереллина А₃. Результаты не отличались от таковых в примере 5.

1. Способ лечения диабета и его осложнений и связанных состояний, включая ожирение, микро- и макрососудистые заболевания, нефропатию, невропатию и заболевания глаз, включающий введение соединений формулы (1) (гиббереллинов)

где R¹ представляет собой Н или группу -О-R²⁰, где R²⁰ представляет собой Н, гликозилированную простую эфирную группу (простой эфир гликозида), C_1-6алкильную группу или R¹ вместе с R² или R¹⁰ образует связь (C₁-C₂ или C₁-С₁₀ двойную связь соответственно);

R² представляет собой Н или группу -О-R²¹, где R²¹ представляет собой Н, гликозилированную простую эфирную группу (простой эфир гликозида), или вместе с R⁴ образует связь (лактон), или R² вместе с R¹ или R³ образует связь (C₁-C₂ или С₂-С₃ двойную связь соответственно);

R³ представляет собой Н, =О или -О-R²², где R²² представляет собой Н, гликозилированную простую эфирную группу (простой эфир гликозида), или R³ вместе с R² образует связь (С₂-С₃ двойную связь);

R⁴ представляет собой ОН или -OR²³, где R²³ является незамещенным или замещенным C_1-20 алкилом, аллилом, арилом, арилалкилом, амидином, -NR²⁴R²⁵ или ненасыщенным или насыщенным кольцом, содержащим один или более гетероатомов, выбираемых из группы, состоящей из азота, кислорода и серы; R²⁴ и R²⁵ могут быть одинаковыми или различными и представляют собой водород или C_1-20алкил, аллил, арил, арилалкил или ненасыщенное или насыщенное кольцо, содержащее один или более гетероатомов, выбираемых из группы, состоящей из азота, кислорода и серы; или R⁴ вместе с R²¹ или R²⁸ образует связь (лактон);

R⁵ представляет собой Н, или группу гликозилированного сложного эфира (сложный эфир гликозида), или незамещенные или замещенные C_1-20 алкиловые сложные эфиры, аллиловые сложные эфиры, ариловые сложные эфиры, арилалкиловые сложные эфиры, активные сложные эфиры;

R⁶ представляет собой Н или ОН или вместе с R⁷ образует связь (C₁₁-C₁₂ двойную связь);

R⁷ представляет собой Н, =О или -О-R²⁶, где R²⁶ представляет собой Н или гликозилированную простую эфирную группу (простой эфир гликозида), или R⁷ вместе с R⁶ образует связь (C₁₁-C₁₂ двойную связь);

R⁸ представляет собой Н, гидроксил, меркаптан или галоген, аминогруппу, азидогруппу, NR²⁴R²⁵, незамещенный или замещенный C_1-20 алкил, аллил, арил или арилалкил или -OR²⁷, где R²⁷ представляет собой гликозилированную простую эфирную группу (простой эфир гликозида);

R⁹ представляет собой Н или ОН или вместе с R¹⁵ образует связь (C₉-C₁₀ связь);

R¹⁰ представляет собой Н, СН₃, СНО, СООН или гликозилированный сложный эфир (сложный эфир гликозида) указанной СООН, СН₂О-R²⁸ или -OR²⁸, где R²⁸ представляет собой Н, или вместе с R⁴ образует связь (лактон) или R¹⁰ вместе с R¹ образует связь (C₁-С₁₀ двойную связь);

R¹¹ представляет собой Н или ОН или отсутствует;

R¹² представляет собой СН₃, СН₂ОН, СООН или гликозилированный сложный эфир (сложный эфир гликозида) указанной СООН;

R¹³ представляет собой метилен, или двухвалентный гетероатом, или NR²⁹, где R²⁹ представляет собой NHR³⁰ или OR³⁰, где R³⁰ является Н или C_1-20 алкилом, арилом, алкиларилом; и присутствует двойная связь между C₁₆ и R¹³, когда R¹¹ отсутствует; или R¹³ представляет собой Н, ОН, СН₃, СНО, СН₂Х, где Х является галогеном, CHNR²⁹, где R²⁹ представляет собой NHR³⁰ или OR³⁰, где R³⁰ представляет собой Н или C_1-20 алкил, арил, алкиларил, когда R¹¹ является Н или ОН; при условии, что когда R¹¹ является ОН, R¹³ не является ОН;

R¹⁴ представляет собой Н или ОН;

R¹⁵ представляет собой Н или вместе с R⁹ образует связь (С₉-C₁₅ связь),

и/или их фармацевтически приемлемых производных, включая лактоны, гликозиды, сложные эфиры, активные сложные эфиры и их соли, пациенту, нуждающемуся в этом.

2. Способ по п.1, где осложнения и связанные с диабетом состояния являются одним или более из ожирения, микро- и макрососудистых заболеваний, нефропатии, невропатии, заболеваний глаз.

3. Способ по п.1, где гиббереллинами является гиббереллин А₃.

4. Способ по п.1, где гиббереллинами является смесь гиббереллина А₃ и гиббереллина А₄ и/или гиббереллина А₇.

5. Способ по п.1, где фармацевтически приемлемыми производными являются соли, включая соли щелочных металлов, соли щелочноземельных металлов, металлы и соли аммония или органические основания.

6. Способ по п.5, где органическими основаниями являются лидокаин или NR¹⁶R¹⁷R¹⁸R¹⁹, где R¹⁶, R¹⁷, R¹⁸, R¹⁹, которые могут быть одинаковыми или различными, представляют собой водород или замещенные или незамещенные C_1-20 алкиловые, алканоловые или арильные группы.

7. Способ по п.1, где фармацевтически приемлемыми производными являются лактоны, гликозиды или сложные эфиры и активные сложные эфиры.

8. Способ лечения диабета и связанных состояний, включая ожирение, микро- и макрососудистые заболевания, нефропатию, невропатию и заболевания глаз, включающий введение эффективного количества соединения формулы (1) (гиббереллинов) и их фармацевтически приемлемых производных пациенту, нуждающемуся в этом.

9. Способ по п.8, где гиббереллинами является гиббереллин А₃.

10. Способ по п.8, где гиббереллинами является смесь гиббереллина А₃ и гиббереллина А₄ и/или гиббереллина А₇.

11. Способ лечения диабета и связанных состояний, включая ожирение, микро- и макрососудистые заболевания, нефропатию, невропатию и заболевания глаз, включающий введение соединений формулы (1) (гиббереллинов) или их фармацевтически приемлемых производных, как определено в п.1, в комбинации с веществами, выбираемыми из группы, состоящей из инсулина, активных производных его фрагментов, ИФР, факторов роста.

12. Способ по п.1 для лечения диабета типа 1 и указанных связанных с ним состояний.

13. Способ по п.1 для лечения диабета типа 2 и указанных связанных с ним состояний.

14. Способ по п.1 для лечения инсулинрезистентного диабета.

15. Противодиабетический агент, содержащий соединение формулы (1) и/или его производные в качестве активного ингредиента, вместе с фармацевтически приемлемым носителем.

16. Противодиабетический агент по п.15, где агентом является лекарственное средство, подходящее для введения врачом.

17. Противодиабетический агент, содержащий соединение формулы (1) в качестве активного ингредиента, вместе с фармацевтически приемлемыми носителями или эксципиентами, где агент представляет композицию медленного высвобождения.

18. Противодиабетический агент по п.15, где агент предназначен для перорального введения.

19. Противодиабетический агент по п.15, где агент предназначен для ингаляционного введения.

20. Противодиабетический агент по п.15, где агент предназначен для трансдермального введения.

21. Противодиабетический агент по п.15, где агент предназначен для парентеральной инъекции.

22. Противодиабетический агент по п.15, где агент предназначен для местного, ректального или вагинального введения.

23. Противодиабетический агент по любому из пп.15-17, где производное формулы (1) выбирают из группы, состоящей из лактонов, сложных эфиров, солей щелочных металлов, солей щелочноземельных металлов, солей переходных металлов, солей аммония и органических оснований.

24. Противодиабетический агент по п.23, где производным является натриевая соль соединения формулы (1).

25. Противодиабетический агент по п.23, где производным является цинковая соль соединения формулы (1).

26. Противодиабетический агент по п.23, где производным является сложный этиловый эфир соединения формулы (1).

27. Применение соединения формулы (1) и/или его производных при изготовлении противодиабетического агента для применения при лечении диабета и связанных состояний, включая ожирение, микро- и макрососудистые заболевания, нефропатию, невропатию и заболевания глаз.

28. Способ получения противодиабетического агента по п.15, включающий объединение соединения формулы (1) и/или его производных с фармацевтически приемлемым носителем.

29. Способ получения гиббереллинов, включая гиббереллин А₃, включающий стадии:

(a) инкубация гиббереллин-продуцирующего штамма микроорганизма в ферментационной среде;

(b) доведение рН ферментационной среды до рН 6,5-7,0 и фильтрование для получения на фильтре осадка мицелия микроорганизма и фильтрата;

(c) промывание осадка на фильтре водой и объединение промывных вод с фильтратом для образования водного раствора;

(d) концентрирование водного раствора;

(e) смешивание водного раствора с органическим растворителем при температуре 5-10°С и доведение рН смеси до менее 2,0;

(f) предоставление возможности смеси разделиться на водную фазу и первую органическую фазу и удаление первой органической фазы;

(g) реэкстрагирование водной фазы со стадии (f) органическим растворителем для получения второй органической фазы;

(h) объединение первой и второй органических фаз и концентрирование для образования концентрированного органического раствора;

(i) нагревание концентрированного органического раствора при 60-70°С в течение 3-4 ч при перемешивании, пока не закончится осаждение твердого вещества;

(j) охлаждение концентрированного органического раствора до комнатной температуры и фильтрование для получения осадка;

(k) промывание осадка в холодном органическом растворителе и высушивание для получения не совсем белого твердого вещества, содержащего около 80% гиббереллина А₃, около 4% гиббереллина А₄ и около 4% гиббереллина А₇.

30. Способ по п.29, включающий дополнительные стадии:

(l) растворение не совсем белого твердого вещества в смеси 32,6% метанола, 2,2% воды и 65,2% ацетона для получения раствора гиббереллина;

(m) разбавление раствора гиббереллина смесью 10:1 органического растворителя и воды;

(n) фильтрование разбавленного раствора гиббереллина и концентрирование фильтрата выпариванием в вакууме;

(о) нагревание концентрата до температуры 60-80°С в течение 2-3 ч при перемешивании, охлаждение до комнатной температуры и фильтрование для получения твердого кристаллического осадка;

(р) промывание осадка холодным органическим растворителем и высушивание для получения кристаллов гиббереллина А₃.

31. Способ по п.29, где гиббереллин-продуцирующим штаммом микроорганизма является Gibberella fujikuroi.

32. Способ по п.29, где концентрирование растворов на стадиях (d) и (h) достигают при помощи выпаривания в вакууме.

33. Способ по п.29, где органическим растворителем является этилацетат.

34. Способ по п.30, где органическим растворителем является этилацетат.

35. Способ по п.30, включающий дополнительные стадии:

(q) растворение гиббереллина А₃ в метаноле;

(r) добавление раствора гиббереллина к эквимолярному водному раствору NaHCO₃;

(s) выпаривание смешанных растворов досуха для получения твердого остатка;

(t) растворение остатка в воде и лиофилизация для получения натриевой соли гиббереллина А₃.

36. Способ по п.35, включающий дополнительные стадии растворения натриевой соли гиббереллина А₃ в воде, пропускания раствора через колонку, заполненную цинковой ион-обменной смолой, промывание колонки водой, сбор и объединение эффлюента и промывных вод и удаление воды для получения цинковой соли гиббереллина А₃.

37. Способ по п.30, включающий дополнительные стадии:

(q) растворение гиббереллина А₃ в смеси с соотношением 50:1 ацетона и воды;

(r) смешивание раствора гиббереллина А₃ с эквимолярными количествами триэтиламина и этилхлорформата и одной десятой молярного количества N-метилморфолина и перемешивание при -15°С в течение 20 мин;

(s) разбавление полученной смеси безводным этанолом и перемешивание при комнатной температуре;

(t) выпаривание разведенной смеси досуха и распределение остатка между этилацетатом и водой в соотношении 6:1;

(u) отделение слоя этилацетата, промывание 2% HCl, затем водой, затем 5% NaHCO₃, затем водой и выпаривание при пониженном давлении досуха для получения этилового сложного эфира гиббереллина А₃.