Способ определения изоэлектрической точки белка

 

Е

О п А Н И Е

ИЗОБРЕТЕНИЯ

Союз Советских

Социалистических

Республик

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Зависимое от авт. свидетельства 4

Заявлено 06.111.1970 (№ 1412161/31-16) с присоединением заявки ¹

Приоритет

Опубликовано 13Х.1971. Бюллетень ¹ 16

Дата опубликования описания 8.VI.1971

МПК G 01п 27/26

Комитет по делам изобретений и открытий при Совете Министров

СССР

УДК 612.398.12(088,8) Автор изобретения

Ю, Я. Гофман

Заявитель

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ИЗОЭЛЕКТРИЧЕСКОЙ ТОЧКИ БЕЛКА

Изобретение относится к биохимии и относится к способам определения изоэлектрической точки белка.

В известном способе определения изоэлектрической точки белка по его электрофоретической подвижности последьпою измеряют при различных значениях рН методом подвижной границы. Однако этот способ связан - необходимостью предварительного выделения белка в гомогенном состоянии и требует его 10 сравнительно большого расхода. При этом исследование занимает много времени, весьма сложно и предусматривает использование дорогостоящей аппаратуры.

По предлагаемому способу для определения 15 изоэлектриечских точек смеси белков используют электрофорез в электрически нейтральном акриламидном геле.

Для получения геля необходимое количество мономеров, например акриламида и N,Х - 20 метиленбисакриламида, растворяют в электрофоретическом буферном растворе или в воде, добавляют 0,05 об. ч. 0,01%-ного водного раствора рибофлавина и столько же 0,4%ного водного раствора сульфита натрия. Смесь 25 заливают в форму для полимеризации и освещают люминесцентными лампами в течение

10 мин. После выдерживания в электрофоретическом буфере подготовленный гель (в том случае, когда гель готовили из водного раст- 30 вора мономеров) покрывают полиэтиленовой пленкой и накладывают на его концы мостики из тонкой хроматографической бумаги, увлажненные электрофоретическим буферным раствором. На мостики предварительно надевают полиэтиленовые чехлы таким образом, чтобы на геле находился участок мостика длиной 1 — 2 лл. В имеющийся в геле канал, получение которого обеспечивается выполнением формы для полимеризации, вносят раствор исследуемого белка в электрофоретическом буферном растворе, помещают гель в

i стройство для электрофореза и включают ток. Условия электрофореза определяются свойствами исследуемого белка. По окончаHhH электрофореза гель помещают на 15 мин в смесь метанола, воды и уксусной кислоты (5:5:1), затем окрашивают в течение 15—

30 яин 0,25% раствором кумасси бриллиантового синего R в смеси метанола, воды и уксусной кислоты. Окрашенныи гель ополаскивают 4% -ной уксусной кислотой, переносят на полоску хроматографической бумаги и помещают в ячейку для электрофоретического отмывания в 4%-ной уксусной кислоте. Отмывание проводят 5 — 6 пин при 28 — 30 в так, чтобы гель находился на стороне, обращенной к аноду.

Если анализируемый белок достаточно растворим в своеи изоэлектрической точке и

303581

Составитель В. А. Таратута

Редактор Г, Бялобжеская Техред А. А. Камышникова Корректоры: Н. В. Воробьева и Е. В. Исакова аказ 1750/4 Изд. М 728 Тираж 473 Подписное

ЦНИИПИ Комитета по делам изобретений и открытии при Совете Министров СССР

Москва, 7К-ЗЗ, Раушская наб., д, 4!5

Типография, пр. Сапунова, 2 дает при электрофорезе четкую зону, то изоэлектрическая точка такого белка равна рН, при котором зона белка располагается симметрично по отно цению к каналу, в который сн был помещен (по обе стороны от этого ка- 5 нала). Если растворимость анализируемого белка в изоэлектрической точке недостаточна, то измеряют миграцию и выбирают гели, в которых миграция белка минимальна, равна по величине и противоположна по направ- 10 лению. Значения рН, при которых наблюдалась такая миграция, представляют собой крайние точки интервала рН, середина которого соответствует искомой изоэлектрической точке. 15

Пример. Берут электрически нейтральный гель, представляющий собой сополимер акриламида и N,N -метиленбисакриламида (19: 1) при общей концентрации мономеров

4,8 /о. Для анализа берут несколько пласти- 20 нок геля толщиной 1,5 мм с внутренним сквозным каналом сечением 0,5х 1 мл1. Пластинки пропитывают натрий-ацетатным буферным раствором с ионной силой 0,01, но с различными значениями рН (от 4 80 до 25

4,86). Каждую пластинку помещают в форму для электрофореза, покрывают полиэтиленовой пленкой, накладывают на концы бумажные мостики и вносят по 4 — 5 лисл 0,05 — 0,1 /о раствора сывороточного альбумина быка.

Форму устанавливают на края электродных сосудов так, чтобы мостики погрузились в буферный раствор, и проводят электрофорез при каждом значении pII в течение 20 мин при силе тока 3 ма на пластинку и температуре 20 С. После электрофореза гель помещают на 15 мин в смесь метанола, воды и уксусной кислоты и затем окрашивают 0,25% раствором кумассии бриллиантового синего Я в смеси метанола, воды и уксусной кислоты.

После ополаскивания 4 -ной уксусной кислотой пластинки переносят на полоски хроматографической бумаги и помещают их в ячейку для электрофоретического отмывания на 5—

6 мин.. При электрофорезе в геле с рН 4,83 альбумин дает зону, располагающуюся симметрично по отношению к стартовому каналу. Это значение рН и соответствует изоэлектрической точке.

Предмет изобретения

Способ определения изоэлектрической точки белка, отличающийся тем, что, с целью определения изоэлектрических точек смеси белков, используют электрофорез в электрически нейтральном акриламидном геле.