Способ получения гидрокортизона и ацётата'

 

0пНСАННЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Сова Советски»

Социалистически»

Республик

Зависимое от авт. свидетельства №

Заявлено 19.1.1971 (№ 1621 324431-16) М. Кл. С 12d 1,3/ОО

А 61k 17/12 с присоединением заявки ¹

Приоритет

Комитет по делам изобретений и открытий при Совете Министров

СССР

Опубликовано 15.11.1973. Бюллетень № 11

Дата опубликования описания 21.IV.1973

УДК 615.45:615,361..45 (088.8) Авторы изобретения Г. М. Могильницкий, Л. А. Краснова, Г. К. Скрябин, К. А. Кощеенко, Н. Н. Суворов, В. М. Рыжкова, Л. В. Соколова, В. Ф. Шнер и Ф. Я. Лейбельман

Институт биохимии и физиологии микроорганизмов АН СССР и Всесоюзный научно-исследовательский химико-фармацевтический институт им. С. Орджоникидзе

° Ъ

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГИДРОКОРТИЗОНА И АЦETATA

КОРТИЗОНА

Изобретение относится к микробиологическим методам, получения гормональных препаратов и касается способа получения гидрокортизона и ацетата кортизона.

Известен способ получения тидрокортизона и эпигидрокортизона, являющегося исходным веществом для получения ацетата кортизона химическими методами, путем микробиологического превращения 21-ацетата вещества «S»

Рейхштейна при помощи микроорганизмов, выращенных в питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли.

Однако этот способ весьма продолжителен и связан со значительными затруднениями при выделении чистых препаратов.

Цель изобретения — ускорение и упрощение процесса.

Это достигается тем, что трансформацию осуществляют,при помощи мицелия гриба

TieghemeIla orchidie,,âûðàùåííoãî на среде, содержащей в качестве источника углерода дисахарид, например, сахарозу; исходный стероид вносят однократно в растворителе, например, этаноле; по завершении процесса трансформации гидрокортизон выделяют известными приемами; образовавшийся маслообразный осадок обрабатывают хлороформом и содержащиеся в нем стероиды превращают известным методами в ацетат кортизона.

Мицелнй берут в количестве 5 — 6 г/л среды в пересчете на воздушно-сухой вес и в возрасте, соответствующем последней трети фазы экспоненциального роста и началу фазы затухающего роста. Этанол берут в количестве

3,8 — 3,9% .к объему среды при концентрации исходного стероида 0,5 г/л.

Пример. Культуру гриба Tieghemella

orchidis шт. 233 поддерживают при комнатной

10 температуре на скошенном сусле-агаре во флаконах. При пересеве гриб выращивают

12 — 14 дней при 26 — 28 С, а затем 6 — 8 дней при комнатной температуре. Споры гриба смывают с .поверхности агара 100 лтл сте15 рильной воды и споровой суспензией (в 1 л л

2,4.10 спор) из двух флаконов, засевают среду в ферментере емкостью 32 л с 12 — 15 л среды М2«, содержащей, г/л: 20 (сухой вес) кукурузного экстракта, 30,0:сахарозы, 1,0

20 NH4NO3., 3,0 (ХН4) НР04, 0,2 MgS0, 0,04

FeSO4 7Н О и 10 л водопроводной воды.

Среду стерилизуют при 0,8 атх 30 мин; рН после стерилизации 5,2 — 5,5. Культуру выращивают в течение 20 — 22 час, при 28 С и по25 даче воздуха 1,4 л на 1 л среды в 1 мин, Число оборотов мешалки 150 об/лтин. Полученный инокулят в количестве 10 — 12 л вносят в ферментер емкостью 300 л со 120 — 130 л среды

М2 н IIpOBÎäÿò вторх ю kkkl0KI ;III ök!þ и ри том

30 же режиме ферментацпи. Через 18 — 20 час

3702 29

Составпгель С. Щенева

Текред Е. Борисова

Редактор Д. Пинчук

Корректоры: В. Петрова и Е. Давыдкина

Заказ !015/5 Изд. М 274 Тираж 467 Подписное

ЦНИИПИ Комитета по делам изобретений и открытий при Совете Министров СССР

Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Типография, пр. Сапунова, 2 мицелий отфильтровывают и отмытый от питательной среды водой (рН 7,0 — 7,2) используют для процесса трансформации ацетата вещества «S». Рейхштейна, которую проводят в том же ферменте, 5

В качестве среды используют 110 л водопроводной воды,,в которую вносят 2,5 — 3,5 гмг синтомицина, 5 — б г/л мицелия гриба и 55 г

21-ацетата вещества «S» Рейхштейна в виде

0,05%-ного раствора в этаноле. Общее количество этанола в среде составляет 3,8 — 3,9%.

Трансф ормацию проводят при тех же условиях, что и выращивание культуры гриба.

Продолжительность процесса составляет

10 — 14 час и контролируется хроматографией па бумаге до исчезновения исходного вещсства, Культуральную жидкость фильтруют, экстрагируют хлористым метиленом, растворитель удаляют в вакууме, и растворяют остаток. в 98 мл дихлорэтана. го

К раствору добавляют 98 мл 10 /, раствора хлористого кальция в абсолютном спирте и 196 мл воды, через 48 час (5 С) отфильтровывают осадок.

Такую очи стку повторяют еще 2 раза и получают 32 г сольвата гидрокортизона (52,2",о от теоретического количества). Для получения очищенного препарата полученный сольват растворяют в 3,2 л горячего этилацетата, обрабатывают углем, фильтруют, у паривают З0 в вакууме до 100 мл и отфильтровывают. Выход очищенного препарата 26 г. После выделения сольвата гидрокортизона в объединенных маточных растворах отделяют дихлорэтановый слой, водный слой трижды обрабатыва- 55 ют этилацетатом, и из об.ьединенного органическо о экстракта удаляют в вакууме раствоpHTeë ь.

Остаток кипятят 10 мин с 50 мл хлороформа и через 24 час отфильтровывают 13,3 г вещест- 40 ва,; одержащего, %. 47,7 эпигидрокортизона, 2,85 гидрокортизона и б — 7 кортизона. Осадок при 60 С растворяют в 65 мл ледяной уксусной кислоты, добавляют при 20 С 3,7 г ацетата бария и 29 мл уксусного ангидрида, выдер- 45 живают 5 час при 25 — 26 С, обрабатывают углем и при 0 С по каплям прибавляют 2 л воды. Смесь моноацетатов эпигидрокортизона отфильтровывают, из фильтрата эистраицией хлористым метиленом выделяют дополнительное Нх количество и ооьединенный продукт (11,78 г) растворяют в 84 мл ацетона. Раствор фильтруют, добавляют при 25 С 15,8 мл раствора Килиони, через 30 мин охлаждают до 20 С, выливают при 0 в 850 мл воды, через 30 мик отфильтровывают и сушат.

Технический, продукт inepeкристаллизовывают из 170 мл спирта, получая 7,75 г ацетата кортизона (13,6 /о от теоретического количества).

Предмет изобретения

1. Способ получения гидрокортизона и ацетата кортизона путем микробиологического превращения 21-ацетата вещества «S» Рейхштейна при,помощи микроорганизма, выращенного в питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, отличающийся тем, что, с целью ускорения и упрощения процесса, трансформацию осуществляют при помощи .мицелия гриба Tieghemella orchidis, выращенного на среде, содержащей в качестве источника углерода дисахарид, например, сахарозу, исходный стероид вносят однократно в растворителе, например, этаноле,,по завершении процесса трансформации гидрокортизон выделяют известными приемами, образовавший ся маслообразный осадок обрабатывают хлороформом, и содержащиеся в нем стероиды превращают известными методами в ацетат кортизона.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что мицелий берут в количестве 5 — 6 г/л среды в пересчете на воздушно-сухой вес.

3. Способ по п, 1, отличающийся тем, что мицелий берут в возрасте, соответствующем последней трети фазы экспоненциального роста и началу фазы затухающего роста.

4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что этанол берут в количестве 3,8 — 3,9% к объему среды при концентрации исходного стероида

0,5 г/л.